CN115997015A - 具有杀伤开关的供体t细胞 - Google Patents

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Abstract

所公开的方法一般涉及预防、治疗、遏制、控制或以其它方式减轻T细胞疗法的副作用，该T细胞疗法被设计成加速免疫重建、诱导移植物抗恶性肿瘤效应、和/或靶向肿瘤细胞。在一些实施方案中，本公开提供了包括适于敲除HPRT的组分的递送媒介物。在一些实施方案中，递送媒介物包括gRNA分子和内切核酸酶，例如Cas蛋白。在一些实施方案中，gRNA分子靶向HPRT 1基因的外显子2、3、或8内的位置。

Description

具有杀伤开关的供体T细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年6月26日提交的美国临时专利申请No.63/044,697的申请日的权益，其公开内容据此全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开一般涉及基因疗法，特别是造血干细胞和/或淋巴细胞，如用表达载体转导的T细胞。本公开还涉及如通过CRISPR-Cas***的基因编辑。
背景技术
异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是血液恶性肿瘤和血细胞遗传性障碍(如镰状细胞病)的治愈性疗法。与allo-HSCT相关联的挑战包括鉴定适当的供体细胞来源。尽管相合血缘供体(MRD)和相合无血缘供体(MUD)提供了相关风险较低的HSC来源，但与几乎每个人都有直系供体(通常是父母或同胞)的单倍体相同的供体的可用性相比，这些供体的可用性显著降低。然而，对于allo-HSCT，存在着与使用单倍体相同的供体相关联的并发症，最显著的是有可能发展出移植物抗宿主病(GvHD)，这仍然是成功的allo-HSCT的障碍。据信经历allo-HSCT的患者中约有一半发展出GvHD而需要治疗，并且超过10％的患者可能因其死亡。GvHD呈现为涉及包括胃肠道、皮肤、粘膜、肝和肺在内的多个器官***的异质症状。免疫抑制药物充当着预防和减少GvHD的核心策略。目前，采用皮质类固醇对GvHD的皮质类固醇标准治疗取得的成功非常有限，因为许多患者发展出类固醇抵抗型疾病。关于在急性和慢性GvHD的治疗中哪些构成了最佳二线和三线方法尚无明确的共识(参见Jamil,M.O.&Mineishi,S.Int J Hematol(2015)101:452)。
为了降低GvHD发展的风险，单倍体相同的移植物通常是T细胞衰竭的。然而，供体T细胞的缺乏使移植受者免疫受损，并且可导致移植患者的致死感染率提高。此外，最近的工作显示，除了在CD4+和CD8+T细胞植入所需的延长时间段内提供T细胞免疫(多至2年)以外，供体T细胞的存在还显著改善供体细胞植入，从而减少对重复HSCT的潜在需求。
在allo-HSCT恶性环境中，由供体T细胞的存在提供的益处包括抗肿瘤活性、或移植物抗肿瘤(GVT)效应(也称为移植物抗白血病-GVL)。在1990年，首次报道了在患有慢性髓性白血病(CML)的患者中的供体淋巴细胞输注(DLI)导致在HSCT后复发后的疾病缓解。在DLI之前，HSCT后复发的患者很可能死于其疾病，而少数患者将接受第二次移植。在CML中成功后，DLI随后用于其它血液恶性肿瘤，如急性白血病和骨髓瘤。因此，一项重大的挑战涉及GVT效应的适当平衡，该效应既负责实现持续缓解，但也负责与GvHD相关联的毒性。
发明内容
修饰人类干细胞的基因疗法策略为治愈许多人类疾病带来广阔的前景。据信直到开发出使GvHD最小化且同时维持供体T细胞的积极贡献的方法，才能实现allo-HSCT的全部治疗潜能。
本公开的第一方面是一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，该方法包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；以及(c)向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞群。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞，优选地人原代T细胞。在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用HSC移植物。在一些实施方案中，HSC移植物在施用经修饰淋巴细胞群之前、同时、或之后施用。
在一些实施方案中，指导RNA分子靶向HPRT1基因的外显子3内的序列。在一些实施方案中，指导RNA分子靶向HPRT1基因的外显子8内的序列。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少91％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少92％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少93％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少94％序列同一性。
在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ IDNO:40-44和46-56中的任一者具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子包含SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者。
在一些实施方案中，内切核酸酶包含Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
在一些实施方案中，用病毒递送媒介物、非病毒递送媒介物，和/或通过物理方法来转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞。在一些实施方案中，物理方法选自显微注射和电穿孔。
在一些实施方案中，非病毒递送媒介物是纳米胶囊。在一些实施方案中，纳米胶囊任选地包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，纳米胶囊包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，至少一个靶向部分靶向人间充质干细胞CD标记中的任一种，包括CD29、CD44、CD90、CD49a-f、CD51、CD73(SH3)、CD105(SH2)、CD106、CD166和Stro-1标记。在一些实施方案中，至少一个靶向部分靶向T细胞标记。在一些实施方案中，T细胞标记选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127、FoxP3和CD44。在一些实施方案中，T细胞标记是CD3。在一些实施方案中，T细胞标记是CD28。
在一些实施方案中，与一个或多个共刺激部分的共刺激可用于活化靶细胞，包括T细胞。在一些实施方案中，共刺激可通过活化一种或多种细胞表面标记，包括但不限于CD28、ICOS、CTLA4、PD1、PD1H和BTLA来实现。在一些实施方案中，共刺激部分是抗体。
在一些实施方案中，病毒递送媒介物是表达载体，并且其中表达载体包括编码内切核酸酶的第一核酸序列以及编码指导RNA分子的第二核酸。在一些实施方案中，表达载体是慢病毒表达载体。
在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约70％。在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约75％。在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约80％。在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约85％。在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约90％。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞，优选地人原代T细胞。在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约95％。
在一些实施方案中，正选择包括使生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞群与嘌呤类似物接触。在一些实施方案中，嘌呤类似物是6-TG。在一些实施方案中，嘌呤类似物是6-巯嘌呤(6-MP)。在一些实施方案中，嘌呤类似物的量在约1至约15μg/mL的范围内。在一些实施方案中，正选择包括使所生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞群与嘌呤类似物(例如量在约1至约15μg/mL的范围内)和别嘌呤醇两者接触。
在一些实施方案中，至少约70％的经修饰淋巴细胞群对二氢叶酸还原酶抑制剂敏感。在一些实施方案中，至少约80％的经修饰淋巴细胞群对二氢叶酸还原酶抑制剂敏感。在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用一个或多个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂(例如，两个或更多个剂量、三个或更多个剂量、四个或更多个剂量等)。在一些实施方案中，二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。
在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞群以单次推注施用。在一些实施方案中，将多剂量的经修饰淋巴细胞群施用于患者(例如，两个或更多个剂量、三个或更多个剂量、四个或更多个剂量等)。在一些实施方案中，多剂量的每个剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约240×106个细胞/kg。在一些实施方案中，总剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约730×106个细胞/kg。
在本公开的第二方面中是一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，该方法包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)靶向位于约134475181至约134475364之间(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)或约134498608至约134498684之间(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的染色体X内的序列的指导RNA分子转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；以及(c)向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞群体。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞，优选地人原代T细胞。在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用HSC移植物。在一些实施方案中，HSC移植物在施用经修饰淋巴细胞群之前、同时、或之后施用。
在一些实施方案中，指导RNA分子靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。在一些实施方案中，指导RNA分子与位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约14个核苷酸至约30个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约16个核苷酸至约28个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约23个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约25个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，指导RNA分子靶向位于基于GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。在一些实施方案中，指导RNA分子与位于基于GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约14个核苷酸至约30个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约16个核苷酸至约28个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约23个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约25个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少91％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少92％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少93％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少94％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子基因与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子包含SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者。
在一些实施方案中，内切核酸酶包含Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
在一些实施方案中，用病毒递送媒介物、非病毒递送媒介物，和/或通过物理方法来转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞。在一些实施方案中，物理方法选自显微注射和电穿孔。
在一些实施方案中，非病毒递送媒介物是纳米胶囊。在一些实施方案中，纳米胶囊包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，至少一个靶向部分靶向人间充质干细胞CD标记中的任一种，包括CD29、CD44、CD90、CD49a-f、CD51、CD73(SH3)、CD105(SH2)、CD106、CD166和Stro-1标记。在一些实施方案中，至少一个靶向部分靶向T细胞标记。在一些实施方案中，T细胞标记选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127、FoxP3和CD44。在一些实施方案中，T细胞标记是CD3。在一些实施方案中，T细胞标记是CD28。
在一些实施方案中，与一个或多个共刺激部分的共刺激可用于活化靶细胞，包括T细胞。在一些实施方案中，共刺激可通过活化一种或多种细胞表面标记，包括但不限于CD28、ICOS、CTLA4、PD1、PD1H和BTLA来实现。在一些实施方案中，共刺激部分是抗体。
在一些实施方案中，病毒递送媒介物是表达载体，并且其中表达载体包括编码内切核酸酶的第一核酸序列以及编码指导RNA分子的第二核酸。在一些实施方案中，表达载体是慢病毒表达载体。
在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约70％。在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约75％。在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约80％。在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约85％。在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约90％。
在一些实施方案中，正选择包括使所生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞群与嘌呤类似物接触。在一些实施方案中，嘌呤类似物是6-TG。在一些实施方案中，嘌呤类似物是6-MP。在一些实施方案中，嘌呤类似物的量在约1至约15μg/mL的范围内。在一些实施方案中，正选择包括使所生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞群与嘌呤类似物和别嘌呤醇两者接触。
在一些实施方案中，至少约70％的经修饰淋巴细胞对二氢叶酸还原酶抑制剂敏感。在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用一个或多个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂。在一些实施方案中，二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。
在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞以单次推注施用。在一些实施方案中，将多剂量的经修饰淋巴细胞施用于患者。在一些实施方案中，多剂量的每个剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约240×106个细胞/kg。在一些实施方案中，总剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约730×106个细胞/kg。
在本公开的第三方面中是一种在对其有治疗需要的患者中治疗血液学癌症的方法，该方法包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；(c)通过向患者施用HSC移植物来诱导至少部分移植物抗恶性肿瘤效应；以及(d)在检测到残留疾病或疾病复发后，向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞群。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞，优选地人原代T细胞。
在一些实施方案中，指导RNA分子靶向位于基于GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。在一些实施方案中，指导RNA分子与位于基于GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约14个核苷酸至约30个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约16个核苷酸至约28个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约23个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约25个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，指导RNA分子靶向位于基于GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。在一些实施方案中，指导RNA分子与位于基于GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约14个核苷酸至约30个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约16个核苷酸至约28个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约23个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约25个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少91％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少92％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少93％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少94％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子基因与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子包含SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者。
在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
在一些实施方案中，用病毒递送媒介物、非病毒递送媒介物，或者通过物理方法来转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞。在一些实施方案中，物理方法选自显微注射和电穿孔。
在一些实施方案中，非病毒递送媒介物是纳米胶囊。在一些实施方案中，纳米胶囊包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，至少一个靶向部分靶向人间充质干细胞CD标记中的任一种，包括CD29、CD44、CD90、CD49a-f、CD51、CD73(SH3)、CD105(SH2)、CD106、CD166和Stro-1标记。在一些实施方案中，至少一个靶向部分靶向T细胞标记。在一些实施方案中，T细胞标记选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127、FoxP3和CD44。在一些实施方案中，T细胞标记是CD3。在一些实施方案中，T细胞标记是CD28。
在一些实施方案中，与一个或多个共刺激部分的共刺激可用于活化靶细胞，包括T细胞。在一些实施方案中，共刺激可通过活化一种或多种细胞表面标记，包括但不限于CD28、ICOS、CTLA4、PD1、PD1H和BTLA来实现。在一些实施方案中，共刺激部分是抗体。
在一些实施方案中，病毒递送媒介物是表达载体，并且其中表达载体包括编码内切核酸酶的第一核酸序列以及编码指导RNA分子的第二核酸。在一些实施方案中，表达载体是慢病毒表达载体。
在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT 1基因表达水平降低至少约70％。在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT 1基因表达水平降低至少约80％。在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT 1基因表达水平降低至少约90％。
在一些实施方案中，正选择包括使所生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞群与嘌呤类似物接触。在一些实施方案中，嘌呤类似物是6-TG。在一些实施方案中，嘌呤类似物是6-MP。在一些实施方案中，嘌呤类似物的量在约1至约15μg/mL的范围内。在一些实施方案中，正选择包括使所生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞群与嘌呤类似物和别嘌呤醇两者接触。
在一些实施方案中，至少约70％的经修饰淋巴细胞对二氢叶酸还原酶抑制剂敏感。在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用一个或多个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂。在一些实施方案中，二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。
在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞以单次推注施用。在一些实施方案中，将多剂量的经修饰淋巴细胞施用于患者。在一些实施方案中，多剂量的每个剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约240×106个细胞/kg。在一些实施方案中，总剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约730×106个细胞/kg。
在本公开的第四方面中是一种用HPRT缺陷型淋巴细胞治疗患者的方法，该方法包括以下步骤：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使分离的淋巴细胞与(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子接触；(c)使HPRT缺陷型淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂；(d)在造血干细胞移植后，向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞的制剂；以及(e)任选地，在患者发展移植物抗宿主病(GvHD)后，施用二氢叶酸还原酶抑制剂。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞，优选地人原代T细胞。
在一些实施方案中，二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。在一些实施方案中，正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂包含嘌呤类似物。在一些实施方案中，嘌呤类似物是6-TG。在一些实施方案中，6-TG的量在约1至约15μg/mL的范围内。
在一些实施方案中，指导RNA分子靶向位于基于GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。在一些实施方案中，指导RNA分子与位于基于GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约14个核苷酸至约30个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约16个核苷酸至约28个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约23个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约25个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，指导RNA分子靶向位于基于GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。在一些实施方案中，指导RNA分子与位于基于GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约14个核苷酸至约30个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约16个核苷酸至约28个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约23个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约25个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少91％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少92％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少93％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少94％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子基因与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子包含SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者。
在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
在一些实施方案中，用病毒递送媒介物、非病毒递送媒介物，或者通过物理方法来转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞。在一些实施方案中，物理方法选自显微注射和电穿孔。
在一些实施方案中，非病毒递送媒介物是纳米胶囊。在一些实施方案中，纳米胶囊包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，至少一个靶向部分靶向人间充质干细胞CD标记中的任一种，包括CD29、CD44、CD90、CD49a-f、CD51、CD73(SH3)、CD105(SH2)、CD106、CD166和Stro-1标记。在一些实施方案中，至少一个靶向部分靶向T细胞标记。在一些实施方案中，T细胞标记选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127、FoxP3和CD44。在一些实施方案中，T细胞标记是CD3。在一些实施方案中，T细胞标记是CD28。
在一些实施方案中，与一个或多个共刺激部分的共刺激可用于活化靶细胞，包括T细胞。在一些实施方案中，共刺激可通过活化一种或多种细胞表面标记，包括但不限于CD28、ICOS、CTLA4、PD1、PD1H和BTLA来实现。在一些实施方案中，共刺激部分是抗体。
在一些实施方案中，病毒递送媒介物是表达载体，并且其中表达载体包括编码内切核酸酶的第一核酸序列以及编码指导RNA分子的第二核酸。在一些实施方案中，表达载体是慢病毒表达载体。
在一些实施方案中，制剂以单次推注施用。在一些实施方案中，将多剂量的制剂施用于患者。在一些实施方案中，制剂的每个剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约240×106个细胞/kg。在一些实施方案中，制剂的总剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约730×106个细胞/kg。
在本公开的第五方面中是包括经修饰淋巴细胞的制剂用于向对其有治疗需要的受试者提供淋巴细胞输注益处的用途，其中包括经修饰淋巴细胞的制剂通过如下方式生成：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使分离的淋巴细胞与(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子接触，以提供基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；以及(c)使HPRT缺陷型淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞，优选地人原代T细胞。在一些实施方案中，受试者在造血干细胞移植后需要治疗。
在一些实施方案中，指导RNA分子靶向位于基于GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。在一些实施方案中，指导RNA分子与位于基于GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约14个核苷酸至约30个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约16个核苷酸至约28个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约23个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约25个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，指导RNA分子靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。在一些实施方案中，指导RNA分子与位于基于GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约14个核苷酸至约30个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约16个核苷酸至约28个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约23个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约25个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少91％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少92％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少93％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少94％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子基因与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子包含SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者。
在本公开的第六方面中是一种试剂盒，该试剂盒包含：(i)与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA分子；以及(ii)Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少91％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ IDNO:40-61中的任一者具有至少92％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ IDNO:40-61中的任一者具有至少93％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ IDNO:40-61中的任一者具有至少94％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ IDNO:40-61中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ IDNO:40-61中的任一者具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ IDNO:40-61中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ IDNO:40-61中的任一者具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ IDNO:40-61中的任一者具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子包含SEQID NO:40-61中的任一者。
在本公开的第七方面中是一种试剂盒，该试剂盒包含：(i)指导RNA分子，该指导RNA分子靶向位于基于GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列，以及(ii)Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。在一些实施方案中，指导RNA分子与位于基于GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。在一些实施方案中，指导RNA分子与位于基于GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约90％互补。在一些实施方案中，指导RNA分子与位于基于GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约95％互补。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约16个核苷酸至约28个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约23个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约25个核苷酸的长度。
在本公开的第八方面中是一种试剂盒，该试剂盒包含：(i)指导RNA分子，该指导RNA分子靶向位于基于GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列，以及(ii)Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。在一些实施方案中，指导RNA分子与位于基于GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。在一些实施方案中，指导RNA分子与位于基于GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约90％互补。在一些实施方案中，指导RNA分子与位于基于GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约95％互补。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约16个核苷酸至约28个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约23个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约25个核苷酸的长度。
在本公开的第九方面中是一种纳米胶囊，该纳米胶囊包含(i)与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA分子；以及(ii)Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少91％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少92％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少93％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少94％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA具有SEQ IDNO:40-61中的任一者。
在一些实施方案中，纳米胶囊包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，至少一个靶向部分靶向T细胞标记。在一些实施方案中，T细胞标记选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127或FoxP3和CD44。在一些实施方案中，T细胞标记是CD3。在一些实施方案中，T细胞标记是CD28。
在一些实施方案中，纳米胶囊包含聚合物壳。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊由两种不同的带正电荷的单体、至少一种中性单体，以及交联剂构成。
在本公开的第十方面中是一种用纳米胶囊转染的宿主细胞，该纳米胶囊包含(i)与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA分子；以及(ii)Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少91％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少92％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少93％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少94％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA具有SEQ IDNO:40-61中的任一者。在一些实施方案中，纳米胶囊包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，至少一个靶向部分靶向T细胞标记。在一些实施方案中，T细胞标记选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127、FoxP3和CD44。在一些实施方案中，T细胞标记是CD3。在一些实施方案中，T细胞标记是CD28。
在一些实施方案中，纳米胶囊包含聚合物壳。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊由两种不同的带正电荷的单体、至少一种中性单体，以及交联剂构成。在一些实施方案中，宿主细胞是原代T淋巴细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是CEM细胞。
在本公开的第十一方面中是经修饰淋巴细胞的制剂用于在造血干细胞移植后向对其有治疗需要的受试者提供淋巴细胞输注益处的用途，其中经修饰淋巴细胞的制剂通过如下方式生成：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使分离的淋巴细胞与纳米胶囊接触，该纳米胶囊包含(i)与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA分子；和(ii)Cas蛋白；以及(c)使HPRT缺陷型淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂。在一些实施方案中，Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少91％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少92％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少93％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少94％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA具有SEQ ID NO:40-61中的任一者。在一些实施方案中，纳米胶囊包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，至少一个靶向部分靶向T细胞标记。在一些实施方案中，T细胞标记选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127、FoxP3和CD44。在一些实施方案中，T细胞标记是CD3。在一些实施方案中，T细胞标记是CD28。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞，优选地人原代T细胞。
在一些实施方案中，纳米胶囊包含聚合物壳。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊由两种不同的带正电荷的单体、至少一种中性单体，以及交联剂构成。
在本公开的第十二方面中是一种试剂盒，该试剂盒包含：(a)纳米胶囊，该纳米胶囊包含(i)与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA分子；和(ii)Cas蛋白，以及(b)二氢叶酸还原酶抑制剂。在一些实施方案中，二氢叶酸还原酶抑制剂是MTX或MPA。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少91％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少92％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少93％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少94％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA具有SEQ ID NO:40-61中的任一者。
在本公开的第十三方面中是一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，该方法包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)与SEQ IDNO:40-61中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；以及(c)在施用HSC移植物后，向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞群。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少91％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少92％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少93％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少94％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA包含SEQ ID NO:40-61中的任一者。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞，优选地人原代T细胞。在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用HSC移植物。在一些实施方案中，HSC移植物在施用经修饰淋巴细胞群之前、同时、或之后施用。
在本公开的第十四方面中是一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，该方法包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子2、外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；以及(c)向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞群。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞，优选地人原代T细胞。在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用HSC移植物。在一些实施方案中，HSC移植物在施用经修饰淋巴细胞群之前、同时、或之后施用。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少95％序列同一性。
在一些实施方案中，指导RNA靶向外显子2的序列。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA靶向外显子3的序列。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:50-54中的任一者具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:50-54中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA靶向外显子8的序列。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:55-56中的任一者具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:55-56中的任一者具有至少95％序列同一性。
在本公开的第十五方面中是一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，该方法包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子2内的序列的指导RNA分子转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；以及(c)向患者施用HSC移植物；(d)在施用HSC移植物后，向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞群。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ IDNO:45和57-61中的任一者具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少91％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少92％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少93％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少94％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQID NO:45和57-61中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少99％序列同一性。
在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:57。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:60。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:61。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞，优选地人原代T细胞。
在一些实施方案中，用病毒递送媒介物、非病毒递送媒介物，和/或通过物理方法来转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞。在一些实施方案中，物理方法选自显微注射和电穿孔。
在一些实施方案中，非病毒递送媒介物是纳米胶囊。在一些实施方案中，纳米胶囊任选地包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，纳米胶囊包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，至少一个靶向部分靶向人间充质干细胞CD标记中的任一种，包括CD29、CD44、CD90、CD49a-f、CD51、CD73(SH3)、CD105(SH2)、CD106、CD166和Stro-1标记。在一些实施方案中，至少一个靶向部分靶向T细胞标记。在一些实施方案中，T细胞标记选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127、FoxP3和CD44。在一些实施方案中，T细胞标记是CD3。在一些实施方案中，T细胞标记是CD28。
在一些实施方案中，与一个或多个共刺激部分的共刺激可用于活化靶细胞，包括T细胞。在一些实施方案中，共刺激可通过活化一种或多种细胞表面标记、包括但不限于CD28、ICOS、CTLA4、PD1、PD1H和BTLA来实现。在一些实施方案中，共刺激部分是抗体。
在一些实施方案中，病毒递送媒介物是表达载体，并且其中表达载体包括编码内切核酸酶的第一核酸序列以及编码指导RNA分子的第二核酸。在一些实施方案中，表达载体是慢病毒表达载体。
在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约70％。在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约75％。在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约80％。在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约85％。在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约90％。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞，优选地人原代T细胞。在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约95％。
在一些实施方案中，正选择包括使所生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞群与嘌呤类似物接触。在一些实施方案中，嘌呤类似物是6-TG。在一些实施方案中，嘌呤类似物是6-巯嘌呤(6-MP)。在一些实施方案中，嘌呤类似物的量在约1至约15μg/mL的范围内。在一些实施方案中，正选择包括使所生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞群与嘌呤类似物(例如量在约1至约15μg/mL的范围内)和别嘌呤醇两者接触。
在一些实施方案中，至少约70％的经修饰淋巴细胞群对二氢叶酸还原酶抑制剂敏感。在一些实施方案中，至少约80％的经修饰淋巴细胞群对二氢叶酸还原酶抑制剂敏感。在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用一个或多个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂(例如，两个或更多个剂量、三个或更多个剂量、四个或更多个剂量等)。在一些实施方案中，二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。
在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞群以单次推注施用。在一些实施方案中，将多剂量的经修饰淋巴细胞群施用于患者(例如，两个或更多个剂量、三个或更多个剂量、四个或更多个剂量等)。在一些实施方案中，多剂量的每个剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约240×106个细胞/kg。在一些实施方案中，总剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约730×106个细胞/kg。
在本公开的第十六方面中是一种在对其有治疗需要的患者中治疗血液学癌症的方法，该方法包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子2内的序列的指导RNA分子转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；(c)通过向患者施用HSC移植物来诱导至少部分移植物抗恶性肿瘤效应；以及(d)在检测到残留疾病或疾病复发后，向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞群。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞，优选地人原代T细胞。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9蛋白。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少91％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少92％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少93％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少94％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少99％序列同一性。
在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:57。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:60。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:61。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞，优选地人原代T细胞。
在本公开的第十七方面中是一种用HPRT缺陷型淋巴细胞治疗患者的方法，该方法包括以下步骤：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使分离的淋巴细胞与(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子2内的序列的指导RNA分子接触；(c)使HPRT缺陷型淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂；(d)在造血干细胞移植后，向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞的制剂；以及(e)任选地，在患者发展移植物抗宿主病(GvHD)后，施用二氢叶酸还原酶抑制剂。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞，优选地人原代T细胞。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9蛋白。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少91％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少92％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少93％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少94％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少99％序列同一性。
在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:57。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:60。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:61。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞，优选地人原代T细胞。
在本公开的第十八方面中是经修饰淋巴细胞的制剂用于在造血干细胞移植后向对其有治疗需要的受试者提供淋巴细胞输注益处的用途，其中经修饰淋巴细胞的制剂通过如下方式生成：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使分离的淋巴细胞与(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子2内的序列的指导RNA分子接触，以提供基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；以及(c)使HPRT缺陷型淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞，优选地人原代T细胞。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9蛋白。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少91％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少92％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少93％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少94％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少99％序列同一性。
在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:45。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:57。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:58。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:59。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:60。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:61。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞，优选地人原代T细胞。
本公开的第十九方面是一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，该方法包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134473409至约134473460之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列的指导RNA分子来转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；(c)向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞群。在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用HSC移植物。在一些实施方案中，HSC移植物在施用经修饰淋巴细胞群之前、同时、或之后施用。在一些实施方案中，指导RNA分子与位于基于基因组构建物GRCh38的约134473409至约134473460之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约14个核苷酸至约30个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。
在本公开的第二十方面中是一种试剂盒，该试剂盒包含：(i)指导RNA分子，该指导RNA分子靶向位于基于GRCh38的约134473409至约134473460之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列，以及(ii)Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。在一些实施方案中，指导RNA分子与位于基于GRCh38的约134473409至约134473460之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。在一些实施方案中，指导RNA分子与位于基于GRCh38的约134473409至约134473460之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约90％互补。在一些实施方案中，指导RNA分子与位于基于GRCh38的约134473409至约134473460之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约95％互补。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约16个核苷酸至约28个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约21个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约22个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约23个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约24个核苷酸的长度。在一些实施方案中，所靶向的序列具有约25个核苷酸的长度。
在本公开的第二十一方面中是一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，该方法包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT1基因的外显子2、外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；以及(c)向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞群。
在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用HSC移植物。在一些实施方案中，HSC移植物在施用经修饰淋巴细胞群之前、同时、或之后施用。
在一些实施方案中，指导RNA分子靶向HPRT 1基因的外显子2内的序列。在一些实施方案中，指导RNA分子靶向HPRT 1基因的外显子3内的序列。在一些实施方案中，指导RNA分子靶向HPRT 1基因的外显子8内的序列。
在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:45和57-61中的任一者。
在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子3之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:41-44、46和50-51中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子3之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:41-44、46和50-51中的任一者具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子3之一内的序列的指导RNA分子包含SEQ ID NO:41-44、46和50-51中的任一者。
在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:47-49、46、55和56中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子8之一内的序列的指导RNA分子与SEQ ID NO:47-49、46、55和56中的任一者具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子8之一内的序列的指导RNA分子包含SEQ ID NO:47-49、46、55和56中的任一者。
在一些实施方案中，指导RNA分子与位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。在一些实施方案中，指导RNA分子靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。
在一些实施方案中，内切核酸酶包含Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
在一些实施方案中，用病毒递送媒介物、非病毒递送媒介物，或者通过物理方法来转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞。在一些实施方案中，物理方法选自显微注射和电穿孔。在一些实施方案中，非病毒递送媒介物是纳米胶囊，任选地其中纳米胶囊包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，病毒递送媒介物是表达载体，并且其中表达载体包括编码内切核酸酶的第一核酸序列以及编码指导RNA分子的第二核酸。在一些实施方案中，表达载体是慢病毒表达载体。
在一些实施方案中，与未转染的供体淋巴细胞相比，基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约70％，优选地降低至少约80％，更优选地降低至少约90％。
在一些实施方案中，正选择包括使所生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞群与嘌呤类似物接触，优选地其中嘌呤类似物选自6-TG和6-MP。在一些实施方案中，嘌呤类似物的量在约1至约15μg/mL的范围内。在一些实施方案中，正选择包括使所生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞群与嘌呤类似物和别嘌呤醇两者接触。
在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用一个或多个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂，优选地其中二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。
在一些实施方案中，群体修饰的淋巴细胞以单次推注或以多剂量施用。在一些实施方案中，多剂量的每个剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约240×106个细胞/kg。在一些实施方案中，总剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约730×106个细胞/kg。
在本公开的第二十二方面中是一种用HPRT缺陷型淋巴细胞治疗患者的方法，该方法包括以下步骤：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使分离的淋巴细胞与(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子2、外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子接触；(c)使HPRT缺陷型淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂；(d)在造血干细胞移植后，向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞的制剂；以及(e)任选地，在患者发展移植物抗宿主病(GvHD)后，施用二氢叶酸还原酶抑制剂。在一些实施方案中，二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。
在本公开的第二十三方面中是经修饰淋巴细胞的制剂用于向对其有治疗需要的受试者提供淋巴细胞输注益处的用途，其中经修饰淋巴细胞的制剂通过如下方式生成：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使分离的淋巴细胞与包含(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT1基因的外显子2、外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子接触，以提供基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；以及(c)使HPRT缺陷型淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂。在一些实施方案中，受试者在造血干细胞移植后需要治疗。在一些实施方案中，指导RNA分子靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子2的指导RNA分子包含SEQ ID NO:45和57-61中的任一者。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子3的指导RNA分子与SEQ ID NO:41-44、46和50-51中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子3的指导RNA分子包含SEQ ID NO:41-44、46和50-51中的任一者。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子8的指导RNA分子与SEQ ID NO:47-49、55和56中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，靶向HPRT 1基因的外显子8的指导RNA分子包含SEQ ID NO:47-49、55和56中的任一者。
在本公开的第二十四方面中是一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，该方法包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)与SEQ IDNO:40-61中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；以及(c)向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞群。在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用HSC移植物。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA包含SEQ ID NO:40-61中的任一者。
在本公开的第二十五方面中是一种试剂盒，该试剂盒包含：(i)与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少95％序列同一性的指导RNA分子；以及(ii)Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。
在本公开的第二十六方面中是一种试剂盒，该试剂盒包含：(i)指导RNA分子，该指导RNA分子靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列，以及(ii)Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。
与其它“关闭开关”方法相比，根据所公开的方法处理的造血细胞(包括T细胞)不需要表达“***基因”。相反，所公开的方法提供了内源性基因的敲低或敲除，不会在血液学细胞中引起不期望的效应，并且总体上具有优异的结果。申请人提出，鉴于根据本文所述的方法的基因修饰的细胞的离体6-TG化学选择，可以提供HSC(或淋巴细胞)群以向受试者施用，其允许经由给予二氢叶酸还原酶抑制剂(例如，甲氨蝶呤(MTX))在体内定量消除细胞。此外，与未引入“杀伤开关”的疗法相比，根据所公开的方法的治疗提供了供体T细胞的潜在更高剂量和更积极的疗法。另外，使用二氢叶酸还原酶抑制剂来调节经修饰T细胞的数量在临床上与治疗GvHD的现有方法(即，其中使用MTX来帮助缓解未接受所公开的经修饰T细胞的患者中的GvHD症状)相容。
申请人进一步提出，与用单纯疱疹病毒胸苷激酶基因转导的供体淋巴细胞相比，根据所公开的方法的治疗减轻了这样的局限性：包括导致细胞消除的免疫原性，并且排除未来输注的可能性(参见Zhou X,Brenner MK,"Improving the safety of T-Celltherapies using an inducible caspase-9gene,"Exp Hematol.2016年11月；44(11):1013-1019，其公开内容据此全文以引用方式并入本文)。而且，申请人提出，本方法允许更昔洛韦用于GvHD以外的并发临床病症，而不导致HSV-tk供体淋巴细胞的不期望清除(例如，当利用当前描述的方法时，将不排除施用更昔洛韦来控制CMV感染，这在allo-HSCT环境中是常见的)。
附图说明
图1示出了使T细胞与适于敲低HPRT的表达载体或者与包括被配置成敲除HPRT的有效载荷(例如，Cas蛋白和gRNA)的纳米胶囊接触的一般方法。该图进一步示出可以激活杀伤开关，如在观察到经修饰T细胞治疗的副作用的事件中。
图2示出了sh734(另参见SEQ ID NO:1)的二级结构和理论一级DICER切割位点(箭头)。二级结构具有约-30.9kcal/mol的MFE值。
图3示出了sh616(另参见SEQ ID NO:5)的二级RNA结构和最小自由能(dG)。
图4示出了sh211(另参见SEQ ID NO:6)的二级RNA结构和最小自由能(dG)。
图5示出了sh734的修饰形式(sh734.1)(另参见SEQ ID NO:7)。二级结构具有-36.16kcal/mol的MFE值。
图6示出了人工miRNA734(111nt)的从头设计。5'和3'DROSHA靶位点以及5'和3'DICER切割位点由二级结构中的箭头指示(另参见SEQ ID NO:8)。
图7示出了人工miRNA211(111nt)的从头设计(另参见SEQ ID NO:9)。
图8示出了嵌入miRNA-3G骨架(衍生自天然miRNA16-2结构的第三代miRNA支架)中的sh734(另参见SEQ ID NO:11)。
图9示出了嵌入miRNA-3G骨架(衍生自天然miRNA16-2结构的第三代miRNA支架)中的sh211(另参见SEQ ID NO:10)。
图10示出了人7sk启动子突变。示出了相对于TATA盒(高的细方框)而言，引入到7sk启动子中的顺式远侧序列增强子(DSE)和近侧序列增强子(PSE)元件(长的宽方框)中的突变(箭头)和缺失。这些突变及其它突变描述于Boyd,D.C.,Turner,P.C.,Watkins,N.J.,Gerster,T.&Murphy,S.Functional Redundancy of Promoter Elements EnsuresEfficient Transcription of the Human 7SK Gene in vivo,Journal of MolecularBiology 253,677-690(1995)，其公开内容据此全文以引用方式并入本文。
图11是示出制备经修饰T细胞和向对其有需要的患者施用那些经修饰T细胞的步骤的流程图。
图12A和12B描绘了用6-TG对经修饰细胞(经由LV转导的HPRT敲低或者经由CRISPR/Cas9纳米胶囊敲除)的成功离体选择和扩增。这些初始的初步实验在K562细胞(人永生化髓性白血病细胞系)中执行(rsh7-GFP＝用于敲低HPRT的HPRT/GFP慢病毒载体的短发夹；纳米RNP-HPRT＝用于敲除HPRT的CRISPR/Cas9核糖核蛋白纳米胶囊)。图12A示出了用shHPRT-GFP载体以MOI＝5(感染复数)＝5转导的K562细胞可以用6-TG进行离体选择，以在10天内达到超过95％细胞携载shHPRT的状态。图12B示出了经由CRISPR RNP纳米胶囊得到的HPRT敲除细胞在600nM或900nM的6-TG下在10天内也可达到总群体的95％以上。这些数据表明通过6-TG化学选择产生高含量的基因修饰细胞的可行性。
图13A示出了用6-TG(离体)对CEM细胞正选择的效应。
图13B示出了在6-TG处理下CEM细胞的HPRT敲除群体从第3天至第17天增加。
图14A和14B示出了用MTX对K562细胞负选择的效应。
图15A和15B示出了用MTX或MPA对CEM细胞负选择的效应。
图16示出了用MTX对K562细胞负选择的效应。
图17示出了脱氧胸苷三磷酸(dTTP)合成的从头路径。
图18示出了在6-TG存在下HPRT缺陷型细胞的选择。
图19A是示出制备经修饰T细胞以及在干细胞移植后向患者施用那些经修饰T细胞的步骤的流程图，使得患者的免疫***可至少部分地重建。
图19B是示出制备经修饰T细胞以及施用那些经修饰T细胞的步骤的流程图。
图20是示出制备经修饰T细胞以及在干细胞移植后向患者施用那些经修饰T细胞的步骤的流程图，使得经修饰T细胞有助于诱导GVM效应。
图21是示出制备经修饰T细胞(HRPT缺陷型CAR-T细胞)以及向对其有需要的患者施用那些经修饰T细胞的步骤的流程图。
图22示出了HPRT相对表达水平，并且进一步示出了可用嘌呤类似物选择HPRT缺陷型细胞的截断值。
图23阐明了示出检测在靶和脱靶效应的各种指导RNA的表。
图24提供了描绘在HPRT敲除Jurkat细胞中发光相对6-TG浓度的图。
图25提供了HPRT敲除和野生型Jurkat细胞的蛋白质印迹，其中肌动蛋白用作蛋白质对照。
图26阐明了绿色荧光蛋白(GFP)相对于HPRT敲除存活优势的图，其中该图提供了相对于时间的活细胞百分比。
图27提供了相对于HPRT敲除细胞的来自GFP荧光激活细胞分选(FACS)的数据。
图28提供了阐明确定野生型Jurkat细胞的甲氨蝶呤(MTX)剂量反应的图，其中该图显示活细胞的百分比。
图29提供了示出确定HPRT敲除和野生型Jurkat细胞的甲氨蝶呤剂量反应的图，其中该图示出了剂量反应相对甲氨蝶呤浓度的变化。
图30A提供了对应于用慢病毒载体TL20cw-7SK/sh734-UbC/GFP转导的HPRT敲低Jurkat T细胞的FACS数据。
图30B提供了对应于用慢病毒载体TL20cw-UbC/GFP-7SK/sh734转导的HPRT敲低Jurkat T细胞的FACS数据。
图31提供了示出用慢病毒载体TL20cw-7SK/sh734-UbC/GFP或TL20cw-UbC/GFP-7SK/sh734转导的HPRT敲低CEM细胞的6-TG选择的图。
图32示出根据本公开的一些实施方案的慢病毒载体内包括的元件。该图还示出了某些元件相对于其它元件的相对方向。例如，与UbC驱动的GFP相比，7sk驱动的sh734元件可以朝向相同方向或相反方向。此外，该图示出了7sk驱动的sh734元件可位于其它载体元件的上游或下游，例如UbC驱动的GFP的上游或下游。
图33提供了在用四种载体之一转导后表达GFP的细胞的百分比的图。
图34示出了由两组gRNA靶向的外显子(如具有SEQ ID NO:25-39的那些(“第1轮”)与具有SEQ ID NO:40-49的那些(“第2轮”))。
图35A示出了具有SEQ ID NO:40-49的gRNA的Interference of CRISPREdits(ICE)评分(即，CRISPER编辑效率)。
图35B示出了具有SEQ ID NO:40-49的gRNA的ICE评分(即，CRISPER编辑效率)。
图36示出了不同浓度的6-TG中用8种不同gRNA转染的CEM细胞的活力。
图37阐明了示出修饰CEM细胞的步骤的工作流程。
图38示出了电穿孔后72小时用八种不同的gRNA之一转染的CEM细胞的6-TG剂量反应。当与野生型(“WT”)相比时，指导RNA通常显示对6-TG提高的抗性。
图39阐明了用八种不同gRNA之一转染的CEM细胞的电穿孔后72小时的蛋白质印迹结果。蛋白质印迹结果与ICE评分相关性良好。蛋白质印迹的下面一组提供了抗-β肌动蛋白对照。
图40A示出了根据本文所述的方法暴露于6-TG后经修饰CEM细胞的选择。在10微摩尔6-TG选择后1周的CEM细胞。6-TG仍成功地选择编辑评分较低的细胞。
图40B示出了根据本文所述的方法在6-TG选择的CEM细胞中的6-TG剂量反应。所有经修饰细胞均显示对高剂量6-TG的抗性。
图41阐明了根据本文所述的方法用6-TG正选择的CEM细胞的72小时的蛋白质印迹结果。用6-TG成功地选择了HPRT敲除群体。
图42和43示出了根据本文所述的方法在6-TG选择的CEM细胞中的MTX剂量反应。
图44阐明了示出修饰原代T细胞的步骤的工作流程。
图45A描绘了使用靶向HPRT 1基因的外显子3的gRNA修饰的T细胞(例如，在包括靶向HPRT1基因的外显子3的gRNA的RNP存在下电穿孔的T细胞)中的6-TG剂量反应。
图45B描绘了使用靶向HPRT 1基因的外显子8的gRNA修饰的T细胞(例如，在包括靶向HPRT1基因的外显子8的gRNA的RNP存在下电穿孔的T细胞)中的6-TG剂量反应。
图45C描绘了在没有RNP的情况下电穿孔的原代T细胞。
图46示出了用靶向HPRT1基因的外显子3或外显子8的RNP编辑的T细胞电穿孔72小时后的蛋白质印迹结果。
图47A示出了根据本文所述的方法用6-TG对经修饰原代T细胞(例如，用包括靶向HPRT1的外显子3的gRNA的RNP修饰的那些)的选择。图47A示出了经修饰细胞的成功选择。
图47B示出了根据本文所述的方法用6-TG对经修饰原代T细胞(例如，用包括靶向HPRT 1的外显子8的gRNA的RNP修饰的那些)的选择。图47B示出了经修饰细胞的成功选择。
图48示出了6-TG选择后的蛋白质印迹结果，例如使用图47A和47B的选择的T细胞。
图49A示出了6-TG选择的原代T细胞(例如，用包括靶向HPRT1基因的外显子3的gRNA的RNP修饰的那些原代T细胞)中的MTX剂量反应。
图49B示出了6-TG选择的原代T细胞(例如，用包括靶向HPRT1基因的外显子3的gRNA的RNP修饰的那些原代T细胞)中的MTX剂量反应。
序列表
使用如37C.F.R.1.822所定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码显示本文所附的核酸和氨基酸序列。序列表作为ASCII文本文件提交，名为“Calimmune-097WO_ST25.txt”，创建于2021年6月25日，30Kb，其以引用方式并入本文。
具体实施方式
定义
还应当理解，除非明确地相反指示，否则在本文所要求保护的包括超过一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不必限于所叙述方法的步骤或动作的顺序。
如本文所用，单数术语“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代，除非上下文另外明确指出。类似地，词语“或”旨在包括“和”，除非上下文另外明确指出。
如本文在说明书和权利要求书中所用，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应理解为意指选自要素列表中的任何一个或多个要素的至少一个要素，但是不必包括要素列表内具体列出的每个和每一个要素中的至少一个，并且不排除要素列表中要素的任何组合。该定义还允许除了短语“至少一个”所涉及的要素列表内具体标识的要素以外的要素可以任选地存在，无论与那些具体标识的要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等效地“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)在一个实施方案中可指至少一个(任选地包括超过一个)A而不存在B(并任选地包括除B以外的要素)；在另一个实施方案中指至少一个(任选地包括超过一个)B而不存在A(并任选地包括除A以外的要素)；在又一个实施方案中指至少一个(任选地包括超过一个)A，以及至少一个(任选地包括超过一个)B(和任选地包括其它元素)；等。
如本文所用，术语“包含(comprising)”、“包括(including)”、“具有(having)”等可互换使用并且具有相同含义。类似地，“包含(comprises)”、“包括(includes)”、“具有(has)”等可互换使用并且具有相同的含义。具体地，每个术语应被解释为开放式术语含义“至少以下”，并且也被解释为不排除额外的特征、限制、方面等。因此，例如，“具有组件a、b和c的装置”意味着该装置至少包括组件a、b和c。类似地，短语：“涉及步骤a、b和c的方法”意味着该方法至少包括步骤a、b和c。此外，虽然本文可以以特定顺序概述步骤和过程，但是技术人员将认识到排序步骤和过程可以变化。
如本文在说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或者“和/或”应被解释为包括性的，即包括多个要素或要素列表中的至少一个，而且还包括多于一个，以及任选地额外未列出的项目。只有明确地相反指示术语，如“仅其中一个”或“恰好其中一个”，或者当在权利要求中使用时，“由……组成”将指包括多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般来讲，当前面是排他性术语时，如本文所用，术语“或”应仅解释为指示排他性替代形式(即，“一个或另一个但不是两个”)，如“任一”、“其中一个”、“仅其中一个”或“恰好其中一个”。当在权利要求中使用时，“基本上由……组成”应具有其在专利法领域中使用的普通含义。
如本文所用，术语“施用(administer)”或“施用(administering)”意指向有治疗需要的受试者(例如，人类患者)提供组合物、配制物、或特定试剂，包括本文所述的那些。
如本文所用，术语“Cas蛋白”是指RNA指导的核酸酶，其包含Cas蛋白或其片段。Cas蛋白也可称为CRISPR(规律间隔成簇短回文重复序列)相关核酸酶。CRISPR是适应性免疫***，提供针对可移动遗传元件(病毒、转座因子和接合质粒)的保护。CRISPR簇含有间隔区、与先行可移动元件互补的序列，以及靶侵入核酸。CRISPR簇被转录并加工成CRISPR RNA(crRNA)。Cas蛋白包括但不限于Cas9蛋白、由Cas9直系同源物编码的Cas9样蛋白、Cas9样合成蛋白、Cpf1蛋白、由Cpf1直系同源物编码的蛋白、Cpf1样合成蛋白、C2c1蛋白、C2c2蛋白、C2c3蛋白，以及它们的变体和修饰形式。Cas蛋白的另外实例包括但不限于Cpf1、C2c1、C2c3、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b和Cas13c、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、C2c1、C2c3、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b和Cas13c。
在一些实施方案中，Cas蛋白是2类CRISPR相关蛋白。如本文所定义，“2类CRISPR-Cas***”是指以单一蛋白质作为效应复合体(如Cas9)发挥作用的CRISPR-Cas***。如本文所定义，“2类II型CRISPR-Cas***”是指在其cas基因中包含Cas9基因的CRISPR-Cas***。“2类II-A型CRISPR-Cas***”是指包含cas9和Csn2基因的CRISPR-Cas***。“2类ll-B型CRISPR-Cas***”是指包含cas9和cas4基因的CRISPR-Cas***。“2类ll-C型CRISPR-Cas***”是指包含Cas9基因但既不包含Csn2又不包含Cas4基因的CRISPR-Cas***。“2类V型CRISPR-Cas***”是指在其cas基因中包含cas12基因(Cas12a、12b或12c基因)的CRISPR-Cas***。“2类VI型CRISPR-Cas***”是指在其Cas基因中包含Cas13基因(Cas13a、13b或13c基因)的CRISPR-Cas***。每种野生型Cas蛋白与一种或多种同源多核苷酸(最典型地RNA)相互作用以形成核蛋白复合体(最典型地核糖核蛋白复合体)。额外的Cas蛋白描述于Haft等人,"A Guild of45CRISPR-Associated(Cas)Protein Families and Multiple CRISPR/Cas Subtypes Exist in Prokaryotic Genomes,PLoS Comput.Biol.,2005年11月；1(6):e60。在一些实施方案中，Cas蛋白是修饰Cas蛋白，例如，本文所鉴定的任何Cas蛋白的修饰变体。
如本文所用，术语“Cas9”或“Cas9蛋白”是指这样的酶(野生型或重组体)：它可表现出由携带靶多核苷酸的互补序列的CRISPR RNA(crRNA)指导的最小内切核酸酶活性(例如，切割多核苷酸内的磷酸二酯键)。Cas9多肽是本领域已知的，并且包括来自多种生物来源中的任一种的Cas9多肽，包括例如原核来源如细菌和古生菌。细菌Cas9包括放线菌门(Actinobacteria)(例如内氏放线菌(Actinomyces naeslundii))Cas9、产水菌门(Aquificae)Cas9、拟杆菌门(Bacteroidetes)Cas 9、衣原体门(Chlamydiae)Cas9、绿弯菌门(Chloroflexi)Cas9、蓝细菌(Cyanobacteria)Cas9、迷踪菌门(Elusimicrobia)Cas9、纤维杆菌门(Fibrobacteres)Cas9、厚壁菌门(Firmicutes)Cas9(例如产脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Cas9、无害李斯特菌(Listeria innocua)Cas9、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)Cas9、变异链球菌(Streptococcus mutans)Cas9和屎肠球菌(Enterococcus faecium)Cas9)、梭杆菌门(Fusobacteria Cas9)、变形菌门(Proteobacteria)(例如脑膜炎奈瑟菌(Neisseriameningitides)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)和红嘴鸥弯曲杆菌(lari))Cas9、螺旋体门(Spirochaetes)(例如齿垢密螺旋体(Treponema denticola))Cas9等。古生菌Cas9包括广古菌门(Euryarchaeota)Cas9(例如海沼甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)Cas9)等。多种Cas9和相关多肽是已知的，并且综述于例如Makarova等人,(2011)NatureReviews Microbiology 9:467-477，Makarova等人,(2011)Biology Direct 6:38，Haft等人,(2005)PLOS Computational Biology I:e60和Chylinski等人,(2013)RNABiology 10:726-737；K.Makarova等人,An updated evolutionary classification of CRISPR-Cassystems.(2015)Nat.Rev.Microbio.13:722-736；和B.Zetsche等人,Cpf1 is a singleRNA-guided endonuclease of a class 2CRISPR-Cas system.(2015)Cell.163(3):759-771。
其它Cas9多肽包括土拉热弗朗西丝氏菌新凶手亚种(Francisella tularensissubsp.novicida)Cas9、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)Cas9、鸡败血支原体(mycoplasma gallisepticum str.F)Cas9、Nitratifractor salsuginis str DSM16511Cas9、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)Cas9、肠道罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)Cas9、Neisseria cinera Cas9、重氮营养葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)Cas9、固氮螺菌属(Azospirillum)B510 Cas9、Spaerochaeta globus str.Buddy cas9、柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)Cas9、Fluviicola taffensis Cas9、嗜粪拟杆菌(Bacteroides coprophilus)Cas9、运动支原体(mycoplasma mobile)Cas9、香肠乳杆菌(lactobacillus farciminis)Cas9、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)Cas9、约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)Cas9、伪中间型葡萄球菌(Staphlococcus pseudintermedius)Cas9、龈沟产线菌(filifactoralocis)Cas9、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)Cas9、嗜肺军团菌str.巴黎(Legionella pneumophila str.Paris)Cas9、沃兹沃思萨特氏菌(Sutterellawadsworthensis)Cas9和白喉棒杆菌(Corynebacter diptheriae)Cas9。术语“Cas9”包括任何Cas9家族的Cas9多肽，包括Cas9的任何同种型。超出本文具体陈述或提供的那些的各种Cas9同源物、直系同源物和变体的氨基酸序列是本领域已知的且可公开获得，在本领域的技术人员的范围内，并因此在本公开的精神和范围内。
如本文所用，术语“Cas12”或“Cas12蛋白”是指任何Cas12蛋白，包括但不限于Cas12蛋白，如Cas12a、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e。在一些实施方案中，Cas12蛋白具有与功能性Cas12蛋白，特别是来自氨基酸球菌属(Acidaminococcus sp)菌株BV3L6的Cas12a/Cpf1蛋白(Uniprot登录：U2UMQ6；Uniprot登录名称：CS12A_ACISB)或来自土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)的Cas12a/Cpf1蛋白(Uniprot登录：A0Q7Q2；Uniprot登录名称：CS12A_FRATN)的氨基酸序列至少85％(或至少90％、或至少95％、或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％)相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，Cas12蛋白可以是与自然界中存在的蛋白质基本上相同的Cas12多肽、或与自然界中存在的Cas12蛋白具有至少85％序列同一性(或至少90％序列同一性、或至少95％序列同一性、或至少96％序列同一性、或至少97％序列同一性、或至少98％序列同一性、或至少99％序列同一性)且具有基本上相同的生物活性的Cas12多肽。Cas12a蛋白的实例包括但不限于FnCas12a、AsCas12a、LbCas12a、Lb5Cas12a、HkCas12a、OsCas12a、TsCas12a、BbCas12a、BoCas12a或Lb4Cas12a；Cas12a优选地为LbCas12a。Cas12b蛋白的实例包括但不限于AacCas12b、Aac2Cas12b、AkCas12b、AmCas12b、AhCas12b、AcCas12b。
如本文所用，短语“有效量”是指本文所述的组合物或配制物的量，它将引起研究人员、兽医、医生或其它临床医师所寻求的组织、***、动物、或人的诊断、生物学或医学反应。
如本文所用，术语“电穿孔”是指这样的技术：向细胞施加电场以便增加细胞膜的渗透性，从而允许化学品、小分子、蛋白质、核酸等引入细胞中。
如本文所用，术语“表达盒”是指载体内的一个或多个基因序列，其可表达RNA，并且在一些实施方案中后续表达蛋白质。表达盒包含至少一种启动子和至少一种所关注的基因。在一些实施方案中，表达盒包括至少一种启动子、至少一种所关注的基因，以及至少一种编码用于表达的分子(例如RNAi)的额外核酸序列。在一些实施方案中，表达盒在载体内按位置和顺序定向，使得表达盒中的核酸可在转化细胞(例如转导的干细胞)中转录为RNA，并且在必要时翻译成蛋白质或多肽，经历活性所需的适当翻译后修饰，并且通过靶向适当的细胞内区室或分泌到细胞外区室而易位到生物活性的适当区室。在一些实施方案中，盒的3'和5'端适于容易地***到载体中，例如，其在每个末端具有限制性内切核酸酶位点。
如本文所用，术语“功能性核酸”是指具有通过与编码蛋白质的转录物直接相互作用而降低蛋白质表达的能力的分子。siRNA分子、核酶和反义核酸构成示例性的功能性核酸。
如本文所用，术语“基因”广泛地指与生物功能相关联的DNA的任何区段。基因涵盖序列，包括但不限于编码序列、启动子区、顺式调控序列、作为用于调节蛋白的特异性识别序列的非表达DNA区段、有助于基因表达的非表达DNA区段、设计成具有期望参数的DNA区段、或它们的组合。
如本文所用，术语“基因沉默”意在描述基因、转录物和/或多肽产物表达的下调、敲低、降解、抑制、遏制、阻遏、阻止、或降低。基因沉默和干扰也描述阻止mRNA转录物翻译成多肽。在一些实施方案中，通过降解mRNA转录物或阻断mRNA翻译来阻止、抑制、或降低翻译。
如本文所用，术语“基因表达”是指由DNA序列产生生物活性多肽的细胞过程。
如本文所用，术语“基因组构建物”是指人基因组参考的连续“形式”。最新的人参考基因组构建物命名为GRCh38(基因组研究联盟人构建物38(Genome ResearchConsortium human build 38))，但通常称为Hg38(人基因组构建物38)。
如本文所用，术语“指导RNA(guide RNA)”或“gRNA”是指能够指导具有核酸酶活性的CRISPR效应子靶向并切割特定靶核酸的RNA分子。
如本文所用，术语“造血细胞移植物(hematopoietic cell transplant)”或“造血细胞移植(hematopoietic cell transplantation)”是指骨髓移植、外周血干细胞移植、脐静脉血移植、或多能造血干细胞的任何其它来源。同样，术语“干细胞移植物”或“移植物”是指包含与药学上可接受的载体接触(例如，悬浮于其中)的干细胞的组合物。这样的组合物能够通过导管施用于受试者。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指使用本公开的方法修饰的细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是表达载体可在其中表达的哺乳动物细胞。合适的哺乳动物宿主细胞包括但不限于人细胞、鼠细胞、非人灵长类细胞(例如恒河猴细胞)、人祖细胞或干细胞、293细胞、HeLa细胞、D17细胞、MDCK细胞、BHK细胞和Cf2Th细胞。在某些实施方案中，包含本公开的表达载体的宿主细胞是造血细胞，如造血祖细胞/干细胞(例如，CD34阳性造血祖细胞/干细胞)、单核细胞、巨噬细胞、外周血单核细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、或树突细胞。用本公开的表达载体转导的造血细胞(例如CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和/或单核细胞/巨噬细胞)可以是同种异体的、自体同源的、或来自匹配的同胞。在一些实施方案中，造血祖细胞/干细胞是CD34阳性的，并且可从患者的骨髓或外周血中分离。在一些实施方案中，用如本文所述的表达载体转导分离的CD34阳性造血祖细胞/干细胞(和/或本文所述的其它造血细胞)。
如本文所用，术语“次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶”或“HPRT”是指由HPRT1基因(参见例如SEQ ID NO:12)编码的参与嘌呤代谢的酶。HPRT1位于X染色体上，因此在雄性中以单拷贝存在。HPRT1编码转移酶，该转移酶通过将5-磷酸核糖基从5-磷酸核糖基-1-焦磷酸转移至嘌呤而催化次黄嘌呤向单磷酸肌苷以及鸟嘌呤向单磷酸鸟苷转化。该酶主要用于从降解的DNA中挽救嘌呤以用于重新合成嘌呤。
如本文所用，术语“***缺失”是指以***和缺失的混合命名的突变。它是指两个等位基因之间的长度差异，其中无法知道该差异最初是由序列***还是序列缺失引起的。如果***/缺失的核苷酸数量不能被三整除，并且它出现在蛋白质编码区中，则其也是移码突变(移码突变通常将导致突变后读取的密码子编码不同的氨基酸)。
如本文所用，术语“慢病毒”是指能够感染***和非***细胞的逆转录病毒属。慢病毒的几个实例包括HIV(人类免疫缺陷病毒：包括HIV 1型和HIV 2型)，即人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体；维斯纳梅迪病毒(visna-maedi)，其在绵羊中引起脑炎(维斯纳)或肺炎(梅迪)，山羊关节炎脑炎病毒，其在山羊中引起免疫缺陷、关节炎和脑病；马传染性贫血病毒，其在马中引起自身免疫性溶血性贫血和脑病；猫免疫缺陷病毒(FIV)，其在猫中引起免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(BIV)，其在牛中引起***病、淋巴细胞增多症和可能的中枢神经***感染；和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，其在类人灵长类中引起免疫缺陷和脑病。
如本文所用，术语“慢病毒载体”用于表示衍生自慢病毒且用于经由转导将遗传物质转移到细胞中的任何形式的核酸。该术语涵盖慢病毒载体核酸(如DNA和RNA)、这些核酸的包封形式，以及病毒载体核酸包装在其中的病毒颗粒。
如本文所用，术语“淋巴细胞”是指脊椎动物免疫***中的白细胞的一种或多种亚型，包括T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞。技术人员将理解，T细胞(也称为T淋巴细胞或CD3+T淋巴细胞)可基于其特定功能进行表征，即辅助性/效应(CD4 T细胞)、细胞毒性(CD8T细胞)、记忆、调节性和γδ(gamma delta)T细胞。技术人员将进一步理解，T细胞的类型可通过细胞表面标记的类型和分布加以区分。以举例的方式，T细胞亚群可通过细胞表面标记CD4和CD8连同CC趋化因子受体7(CCR7)和CD45RA加以区分。这样的亚群可以通过其它细胞表面标记的表达来进一步区分。例如，幼稚T细胞、效应记忆(EM)、中枢记忆(CM)和效应T细胞子群可以通过CCR7和CD45RA表达以及其它标记来进一步定义。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是B细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是自然杀伤细胞(NK)。在一些实施方案中，淋巴细胞是原代人T细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是CD3+T细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是CD4+T细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是HLA-DR+T细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是αβT细胞。在一些实施方案中，淋巴细胞是γδT细胞。
如本文所用，术语“敲低(knock down)”或“敲低(knockdown)”在用于涉及RNAi对基因表达的效应时意指基因表达的水平受抑制，或者降低至在基本相同的条件下但不存在RNAi情况下检测时通常所观察到的水平以下。
如本文所用，术语“敲除(knock-out)”或“敲除(knockout)”是指内源性基因表达的部分或完全遏制。这通常通过缺失基因的一部分或者通过用第二序列替换一部分来实现，但也可由对基因的其它修饰引起，如终止密码子的引入、关键氨基酸的突变、内含子连接点(junction)的移除等。因此，“敲除”构建体是在引入细胞中时导致细胞中内源性DNA编码的多肽或蛋白质的表达被遏制(部分或完全)的核酸序列，如DNA构建体。在一些实施方案中，“敲除”包括突变，如点突变、***、缺失、移码、或错义突变。
如本文所用，术语“显微注射”是指通过将微量移液管***所关注的细胞中来将化学品、小分子、蛋白质、核酸等引入单个细胞中的技术。
如本文所用，术语“感染复数”或“MOI”意指试剂(例如，噬菌体或更通常病毒、细菌)与感染靶标(例如细胞)的比率。例如，当涉及到用病毒颗粒接种的一群细胞时，感染复数或MOI是在限定空间中存在的病毒颗粒数量与靶细胞数量的比率。
如本文所用，术语“微细胞”是指由二***期间细胞***与DNA分离的协调紊乱所产生的细菌细胞的无核形式。微细胞不同于其它小囊泡，这些小囊泡在某些情况下自发生成并释放，并且与微细胞相反，不是由于特定基因重排或游离基因表达。本公开的微细胞是由在二***期间细胞***与DNA分离的协调紊乱所产生的大肠杆菌(E.coli)或其它细菌细胞的无核形式。原核染色体复制与涉及中间细胞隔膜的形成的正常二***有关。在例如大肠杆菌中，微基因(如minCD)的突变可消除细胞***期间细胞极处隔膜形成的抑制，从而导致产生正常子代细胞和无核微细胞。参见de Boer等人,1992；Raskin&de Boer,1999；Hu&Lutkenhaus,1999；Harry,2001.微细胞不同于其它小囊泡，这些小囊泡在某些情况下自发生成并释放，并且与微细胞相反，不是由于特定基因重排或游离基因表达。为了实施本公开，期望微细胞具有完整的细胞壁(“完整的微细胞”)。除了微操纵子突变之外，在影响隔膜形成的一系列其它基因重排或突变后也生成无核微细胞，例如在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中的divIVB1中。参见Reeve和Cornett,1975；Levin等人,1992。微细胞也可在参与细胞***/染色体分离的蛋白质的基因表达水平紊乱后形成。例如，minE的过表达导致极性***以及微细胞的产生。类似地，染色体较少的微细胞可由染色体分离中的缺陷所致，例如，枯草芽孢杆菌中的smc突变(Britton等人,1998)、枯草芽孢杆菌中的spoOJ缺失(Ireton等人,1994)、大肠杆菌中的mukB突变(Hiraga等人,1989)，以及大肠杆菌中的parC突变(Stewart和D'Ari,1992)。基因产物可反式供应。当由高拷贝数质粒过表达时，例如，CafA可增强细胞***速率并且/或者抑制复制后的染色体分配(Okada等人,1994)，导致形成连结细胞和无核微细胞(Wachi等人,1989；Okada等人,1993)。微细胞可以由革兰氏阳性或革兰氏阴性来源的任何细菌细胞制备。
如本文所用，术语“突变的”是指序列(如核苷酸或氨基酸序列)相对于天然、野生型、标准、或参考形式的相应序列(即非突变序列)的变化。突变基因可导致突变基因产物。突变基因产物与非突变基因产物的区别在于一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，导致突变基因产物的突变基因可以与相应的非突变核苷酸序列具有约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、或更大的序列同一性。
如本文所用，术语“纳米胶囊”是指具有包封一种或多种组分(例如一种或多种蛋白质和/或一种或多种核酸)的壳(例如聚合物壳)的纳米颗粒。在一些实施方案中，纳米胶囊具有小于或等于约200纳米(nm)，例如约1至200nm、或约5至约200nm、或约10至约150nm、或15至100nm、或约15至约150nm、或约20至约125nm、或约50至约100nm、或约50至约75nm的平均直径。在其它实施方案中，纳米胶囊具有约10nm至约20nm、约20至约25nm、约25nm至约30nm、约30nm至约35nm、约35nm至约40nm、约40nm至约45nm、约45nm至约50nm、约50nm至约55nm、约55nm至约60nm、约60nm至约65nm、约70至约75nm、约75nm至约80nm、约80nm至约85nm、约85nm至约90nm、约90nm至约95nm、约95nm至约100nm、或约100nm至约110nm的平均直径。在一些实施方案中，纳米胶囊被设计成在约1小时、或约2小时、或约3小时、或约4小时、或约5小时、或约6或约12小时、或约1天、或约2天、或约1周、或约1个月内降解。在一些实施方案中，纳米胶囊的表面可具有约1至约15毫伏(mV)的电荷(如在标准磷酸盐溶液中所测量)。在其它实施方案中，纳米胶囊的表面可具有约1至约10mV的电荷。
如本文所用，术语“带正电荷的单体”或“阳离子单体”是指具有净正电荷(即+1、+2、+3)的单体。在一些实施方案中，带正电荷的单体是包括带正电荷的基团的单体。如本文所用，术语“带负电荷的单体”或“阴离子单体”是指具有净负电荷(即-1、-2、-3)的单体。在一些实施方案中，带负电荷的单体是包括带负电荷的基团的单体。如本文所用，术语“中性单体”是指具有净中性电荷的单体。
如本文所用，术语“聚合物”定义为包括均聚物、共聚物、互穿网络和低聚物。因此，术语聚合物可在本文中与术语均聚物、共聚物、互穿聚合物网络等互换使用。术语“均聚物”定义为衍生自单一物类的单体的聚合物。术语“共聚物”定义为衍生自超过一种物类的单体的聚合物，包括通过两种单体物类共聚获得的共聚物、由三种单体物类获得的那些(“三元共聚物”)、由四种单体物类获得的那些(“四元共聚物”)等。术语“共聚物”进一步定义为包括无规共聚物、交替共聚物、接枝共聚物和嵌段共聚物。如通常使用的术语，共聚物包括互穿聚合物网络。术语“无规共聚物”定义为包含大分子的共聚物，其中在链中的任何给定位点处存在给定单体单元的概率与相邻单元的性质无关。在无规共聚物中，单体单元的顺序分布遵循伯努利统计。术语“交替共聚物”定义为包含大分子的共聚物，其包括交替顺序的两种物类的单体单元。
如本文所用，术语“交联剂”是指在两个或更多个分子链、结构域、或其它部分之间提供连接(例如，分子内连接或分子间连接)的键或部分。在一些实施方案中，交联剂是这样的分子：在分子链之间形成连接以形成连接分子。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指核酸表达控制序列(如启动子、信号序列、增强子或转录因子结合位点的阵列)与第二核酸序列之间的功能性连接，其中当适当的分子(例如，转录激活蛋白)与表达控制序列结合时，表达控制序列影响对应于第二序列的核酸的转录和/或翻译。
如本文所用，术语“启动子”是指RNA聚合酶所结合的多核苷酸(DNA或RNA)的识别位点。RNA聚合酶启动并转录与启动子可操作连接的多核苷酸。在一些实施方案中，在哺乳动物细胞中可操作的启动子包含位于转录起始位点上游大约25至30个碱基处的富AT区，和/或转录开始上游70至80个碱基处存在的另一序列(即其中N可为任何核苷酸的CNCAAT区)。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体或赋形剂”是指可用于制备药物配制物的载体或赋形剂，它通常是安全的、无毒的，并且既不是生物学上也不是其他方面不期望的，并且包括对于兽医用途以及人类药物用途可接受的载体或赋形剂。
如本文所用，术语“逆转录病毒”是指具有RNA基因组的病毒，该RNA基因组通过逆转录病毒逆转录酶逆转录成整合到宿主细胞基因组中的cDNA拷贝。逆转录病毒载体和制备逆转录病毒载体的方法在本领域中是已知的。简而言之，为了构建逆转录病毒载体，将编码所关注基因的核酸***到病毒基因组中来代替某些病毒序列以产生复制缺陷型病毒。为了产生病毒体，构建了含有gag、pol和env基因但不含LTR和包装组分的包装细胞系(Mann等人,Cell,第33卷:153-159,1983)。当含有cDNA的重组质粒连同逆转录病毒LTR和包装序列引入该细胞系中时，包装序列允许重组质粒的RNA转录物包装到病毒颗粒中，然后分泌到培养基中。然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地浓缩，并用于基因转移。
如本文所用，术语“siRNA”或“小干扰RNA”是指由约十个核苷酸至几十个核苷酸构成的短双链RNA，它诱导RNAi(RNA干扰)，即诱导靶mRNA的降解，或者经由靶mRNA的切割来抑制靶基因的表达。RNA干扰(“RNAi”)是在许多真核生物体中保守的基因表达的转录后抑制的方法，并且它是指这样的现象：其中由具有与靶基因的mRNA同源的序列的有义RNA以及具有与之互补的序列的反义RNA构成的双链RNA被引入细胞等中，使得其可选择性地诱导靶基因的mRNA降解或者可抑制靶基因的表达。RNAi由存在于细胞中的短(即，少于约30个核苷酸)双链RNA分子诱导(Fire A.等人,Nature,391:806-811,1998)。当siRNA引入细胞中时，具有与siRNA互补的核苷酸序列的靶基因的mRNA的表达受到抑制。
如本文所用，术语“小发夹RNA”或“shRNA”是指包含反义区、环部分以及有义区的RNA分子，其中有义区具有与反义区碱基配对以形成双链体茎的互补核苷酸。在转录后加工之后，通过由作为RNase III家族成员的酶介导的切割事件，小发夹RNA转化为小干扰RNA。如本文所用，短语“转录后加工”是指在转录后发生并且例如由酶和/或Drosha介导的mRNA加工。
如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，如人、小鼠或灵长类。通常，哺乳动物是人(智人)。
如本文所用，术语“基本HPRT缺陷型(substantially HPRT deficient)”及其变体是指其中HPRT1基因表达的水平降低至少约50％的细胞，例如宿主细胞。在一些实施方案中，HPRT1基因表达水平降低至少约55％。在一些实施方案中，HPRT1基因表达水平降低至少约60％。在一些实施方案中，HPRT1基因表达水平降低至少约65％。在一些实施方案中，HPRT1基因表达水平降低至少约70％。在一些实施方案中，HPRT1基因表达水平降低至少约75％。在一些实施方案中，HPRT1基因表达水平降低至少约80％。在一些实施方案中，HPRT1基因表达水平降低至少约85％。在一些实施方案中，HPRT1基因表达水平降低至少约90％。在一些实施方案中，HPRT1基因表达水平降低至少约95％。在其它实施方案中，残留HPRT1基因表达为至多约40％。在其它实施方案中，残留HPRT1基因为至多约35％。在其它实施方案中，残留HPRT1基因表达为至多约30％。在其它实施方案中，残留HPRT1基因表达为至多约25％。在其它实施方案中，残留HPRT1基因表达为至多约20％。在其它实施方案中，残留HPRT1基因表达为至多约15％。在其它实施方案中，残留HPRT1基因表达为至多约10％。
如本文所用，术语“转导(transduce)”或“转导(transduction)”是指借助于感染而非转染，使用病毒或逆转录病毒载体递送一个或多个基因。例如，逆转录病毒载体(经修饰逆转录病毒，用作将核酸引入细胞中的表达载体)携带的抗HPRT1基因可以通过感染和前病毒整合来转导到细胞中。因此，“转导的基因”是经由慢病毒或载体感染和前病毒整合而引入细胞中的基因。病毒载体(例如“转导载体”)将基因转导到“靶细胞”或宿主细胞中。
如本文所用，术语“转染”是指通过非病毒方法将裸DNA引入细胞中的过程。
如本文所用，术语“转导”是指使用病毒载体将外源DNA引入细胞的基因组中。
如本文所用，关于特定病症的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”或“治疗(treat)”是指获得期望的药理学和/或生理学效应。该效应就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，并且/或者就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的副作用而言可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖对受试者(特别是人)的疾病或障碍的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病或障碍在可能易患疾病但尚未诊断患有疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病或障碍，即阻止其发展；和(c)缓和或缓解疾病或障碍，即，引起疾病或障碍消退并且/或者缓和一种或多种疾病或障碍症状。“治疗”还可涵盖试剂的递送或疗法的施用以便提供药理学效应，即使在不存在疾病、障碍或病症的情况下也是如此。术语“治疗”在一些实施方案中用于指施用本公开的化合物以减轻宿主，优选地哺乳动物受试者，更优选地人的疾病或障碍。因此，术语“治疗”可包括预防障碍在宿主中发生，特别是当宿主易于获得疾病但尚未诊断患有疾病时；抑制障碍；并且/或者缓解或逆转障碍。就本公开的方法涉及预防障碍而言，应理解术语“预防”不要求疾病状态被完全阻遏。相反，如本文所用，术语预防是指技术人员鉴定易患障碍的群体的能力，使得本公开的化合物的施用可在疾病发作之前发生。该术语并不意味着疾病状态必须完全避免。
如本文所用，术语“载体”是指能够介导另一核酸分子进入(例如转移、转运等)细胞的核酸分子。转移的核酸通常连接至(例如***到)载体核酸分子中。载体可包括指导自主复制的序列，或者可包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。对于本领域的普通技术人员显而易见的是，除了介导转移的核酸进入的一个或多个核酸之外，病毒载体还可包括各种病毒组分。许多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲性化合物缔合的多核苷酸、质粒，以及病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)等。
表达载体
在一些实施方案中，本公开提供了包括至少一种用于表达的核酸序列的表达载体(例如慢病毒表达载体)。在一些实施方案中，表达载体包括第一核酸序列，该第一核酸序列编码设计成敲低HPRT1基因或以其它方式实现HPRT1基因表达降低的试剂。在一些实施方案中，HPRT1基因表达降低80％或更多。
在一些实施方案中，本公开提供了一种表达载体，该表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2、5、6和7中的任一者的序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，shRNA具有与SEQ ID NO:2、5、6和7中的任一者的序列具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，shRNA具有与SEQ ID NO:2、5、6和7中的任一者的序列具有至少97％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6和7中的任一者的核酸序列。在一些实施方案中，敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)的shRNA是表达载体中唯一用于表达的转基因。
在一些实施方案中，提供了一种表达载体，该表达载体基本上由第一表达控制序列组成，该第一表达控制序列与作为用于表达的转基因的第一核酸序列可操作地连接，第一核酸序列编码敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)的shRNA，其中shRNA与SEQID NO:2、5、6和7中的任一者的序列具有至少90％同一性。特别地，在一些实施方案中，提供了一种表达载体，该表达载体基本上由作为唯一用于表达的转基因的第一核酸序列组成，第一核酸序列编码敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)的shRNA，其中shRNA与SEQID NO:2、5、6和7中的任一者的序列具有至少90％同一性。
在另一些方面，提供了一种表达载体，该表达载体包含与作为转基因的第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2、5、6和7中的任一者的序列具有至少90％同一性，其中第一核酸序列是唯一用于表达的元件。特别地，在一些实施方案中，提供了一种表达载体，该表达载体包含作为唯一用于表达的转基因的第一核酸序列，第一核酸序列编码敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2、5、6和7中的任一者的序列具有至少90％同一性。
在一些实施方案中，表达载体是自失活慢病毒载体。在其它实施方案中，表达载体是逆转录病毒载体。慢病毒基因组通常由5'长末端重复序列(LTR)、gag基因、pol基因、env基因、附属基因(nef、vif、vpr、vpu)和3'LTR组成。病毒LTR分为三个区，称为U3、R和U5。U3区含有增强子和启动子元件。U5区含有聚腺苷酸化信号。R(重复)区隔开U3和U5区，并且R区的转录序列出现在病毒RNA的5'和3'端两者。参见例如"RNA Viruses:A PracticalApproach"(Alan J.Cann编辑,Oxford University Press,(2000))；ONarayan和Clements(1989)J.Gen.Virology,第70卷:1617-1639；Fields等人(1990)Fundamental VirologyRaven Press.；Miyoshi H,Blamer U,Takahashi M,Gage F H,Verma IM.(1998)J Virol.,第72卷(10):8150 7，以及美国专利No.6,013,516。用于感染HSC的慢病毒载体的实例描述于以下出版物中，其各自全文据此以引用方式并入本文：Evans等人,Hum Gene Ther.,第10卷:1479-1489,1999；Case等人,Proc Natl Acad Sci USA,第96卷:2988-2993,1999；Uchida等人,Proc Natl Acad Sci USA,第95卷:11939-11944,1998；Miyoshi等人,Science,第283卷:682-686,1999；和Sutton等人,J.Virol.,第72卷:5781-5788,1998。
在一些实施方案中，表达载体是经修饰慢病毒，并因此能够感染***和非***细胞。在一些实施方案中，经修饰慢病毒基因组缺乏用于病毒复制所需的慢病毒蛋白的基因，从而防止不期望的复制，如靶细胞中的复制。在一些实施方案中，在重组逆转录病毒或慢病毒的产生期间，在包装细胞系中以反式提供经修饰基因组复制所需的蛋白质。
在一些实施方案中，表达载体包含来自慢病毒的5'和3'长末端重复序列(LTR)的序列。在一些实施方案中，载体包含来自慢病毒的5'LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的失活或自失活3'LTR。在一些实施方案中，LTR序列是HIV LTR序列。
慢病毒表达载体的额外组分(以及合成和/或产生这样的载体的方法)公开于美国专利申请公开No.2018/0112220中，其公开内容全文据此以引用方式并入本文。在一些实施方案中，慢病毒表达载体包含与SEQ ID NO:16具有至少90％同一性的TL20c骨架。在一些实施方案中，慢病毒表达载体包含与SEQ ID NO:16具有至少95％同一性的TL20c骨架。在一些实施方案中，慢病毒表达载体包含与SEQ ID NO:17具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，慢病毒表达载体包含与SEQ ID NO:17具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，慢病毒表达载体包含WPRE元件或Rev应答元件中的至少一种(分别参见例如SEQ ID NO:18和19)。
在一些实施方案中，本文设想的慢病毒载体可以是整合的或非整合的(也称为整合缺陷型慢病毒)。如本文所用，术语“整合缺陷型慢病毒”或“IDLV”是指具有缺乏将病毒基因组整合到宿主细胞基因组中的能力的整合酶的慢病毒。在一些应用中，整合慢病毒载体的使用可以避免整合慢病毒诱导的潜在***诱变。整合缺陷型慢病毒载体通常通过使慢病毒整合酶基因突变或者通过修饰LTR的附着序列而生成(参见例如Sarkis等人,Curr.Gene.Ther.,6:430-437(2008))。慢病毒整合酶由HIV-1Pol区编码，并且该区域不能缺失，因为它编码其它关键活性，包括逆转录、核输入，以及病毒颗粒装配。改变整合酶蛋白的pol中的突变属于如下两类之一：仅选择性影响整合酶活性的那些(I类)；或具有多效性效应的那些(II类)。贯穿整合酶蛋白的N和C末端和催化核心区的突变生成了影响多种功能(包括颗粒形成和逆转录)的II类突变。I类突变限制了它们对催化活性、DNA结合、线性游离基因加工和整合酶多聚化的影响。最常见的I类突变位点是在整合酶的催化核心处的三联体残基，包括D64、D116和E152。每种突变已显示有效地抑制整合——整合频率比正常整合载体的整合频率低多至四个对数，同时维持NILV的转基因表达。用于抑制整合的另一种替代方法是分别在5'和3'LTR的末端处的U3区的12个碱基对区内或者U5区的11个碱基对区内的整合酶DNA附着位点(LTR att位点)中引入突变。这些序列包括保守的末端CA二核苷酸，其在整合酶介导的末端加工后暴露出来。保守的CA/TG二核苷酸处的单或双突变导致整合频率降低多至三到四个对数；然而，它保留了有效病毒转导的所有其它必需功能。
在一些实施方案中，载体是腺相关病毒(AAV)载体。如本文所用，术语“腺相关病毒(AAV)载体”意指含有AAV载体基因组(其又包含本文所提及的第一和第二表达盒)的AAV病毒颗粒。这意在包括所有血清型的AAV载体，优选地AAV-1至AAV-9，更优选地AAV-1、AAV-2、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9，以及它们的组合。由不同血清型的组合产生的AAV载体可称为杂合AAV载体。在一个实施方案中，AAV载体选自AAV-1、AAV-2、AAV-4、AAV-5和AAV-6，以及它们的组合。在一个实施方案中，AAV载体是AAV-5载体。在一个实施方案中，AAV载体是包含AAV-2反向末端重复序列(ITR)的AAV-5载体。本公开还设想包含天然存在的病毒蛋白(例如，一种或多种衣壳蛋白)的变体的AAV载体。
实现HPRT1基因敲低的组分
在一些实施方案中，编码设计成敲低HPRT1基因的试剂的核酸序列是RNA干扰剂(RNAi)。在一些实施方案中，RNAi试剂是shRNA、微RNA、或它们的杂合体。
RNAi
在一些实施方案中，表达载体包含编码RNAi的第一核酸序列。RNA干扰是通过复杂的多步酶促过程(例如，涉及序列特异性双链小干扰RNA(siRNA)的过程)引发同源转录物的降解来使基因表达在转录后沉默的方法。RNAi途径的简化模型基于两个步骤，每步均涉及核糖核酸酶。在第一步中，通过RNase II酶DICER和Drosha将引发RNA(dsRNA或miRNA初级转录物)加工成短干扰RNA(siRNA)。在第二步中，将siRNA载入效应复合体RNA诱导沉默复合体(RISC)中。siRNA在RISC装配期间解旋，并且单链RNA与mRNA靶标杂交。据信基因沉默是RNase H酶Argonaute(Slicer)对靶向mRNA进行溶核降解的结果。如果siRNA/mRNA双链体含有错配，则mRNA不被切割。相反，基因沉默是翻译抑制的结果。
在一些实施方案中，RNAi试剂是抑制性或沉默性核酸。如本文所用，“沉默性核酸”是指能够与特定序列相互作用以抑制基因表达的任何多核苷酸。沉默性核酸的实例包括RNA双链体(例如siRNA、shRNA)、锁核酸(“LNA”)、反义RNA、编码siRNA或shRNA的有义和/或反义序列的DNA多核苷酸、DNA酶、或核酶。技术人员将理解，基因表达的抑制不必一定是来自特定列举序列的基因表达，并且可以是例如来自受该特定序列控制的序列的基因表达。
构建干扰RNA的方法在本领域中是已知的。例如，干扰RNA可以由两个独立的寡核苷酸装配而成，其中一条链是有义链且另一条是反义链，其中反义链和有义链是自身互补的(即，每条链包含与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；如其中反义链和有义链形成双链体或双链结构)；反义链包含与靶核酸分子或其部分(即不期望的基因)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，并且有义链包含对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。或者，干扰RNA可以由单个寡核苷酸装配而成，其中自身互补的有义和反义区借助于一个或多个基于核酸或基于非核酸的接头连接。干扰RNA可以是具有双链体、不对称双链体、具有自身互补的有义和反义区的发夹或不对称发夹二级结构的多核苷酸，其中反义区包含与单独的靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。干扰RNA可以是具有两个或更多个环结构以及包含自身互补的有义和反义区的茎的环状单链多核苷酸，其中反义区包含与靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，且有义区具有对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列，并且其中环状多核苷酸可在体内或体外加工以生成能够介导RNA干扰的活性siRNA分子。
在一些实施方案中，干扰RNA编码区编码具有有义区、反义区和环区的自身互补RNA分子。当表达时，这种RNA分子有利地形成“发夹”结构，并且在本文中称为“shRNA”。在一些实施方案中，环区的长度通常在约2至约10个核苷酸之间(仅作为实例，参见SEQ ID NO:20)。在其它实施方案中，环区的长度为约6至约9个核苷酸。在一些实施方案中，有义区和反义区的长度为约15至约30个核苷酸。在转录后加工之后，通过由作为RNase III家族成员的酶DICER介导的切割事件，小发夹RNA转化为siRNA。siRNA然后能够抑制与其享有同源性的基因的表达。进一步细节由以下描述：参见Brummelkamp等人,Science 296:550-553,(2002)；Lee等人,Nature Biotechnol.,20,500-505,(2002)；Miyagishi和Taira,NatureBiotechnol 20:497-500,(2002)；Paddison等人,Genes&Dev.16:948-958,(2002)；Paul,Nature Biotechnol,20,505-508,(2002)；Sui,Proc.Natl.Acad.Sd.USA,99(6),5515-5520,(2002)；和Yu等人,Proc NatlAcadSci USA 99:6047-6052,(2002)，其公开内容据此全文以引用方式并入本文中。
shRNA
在一些实施方案中，第一核酸序列编码靶向HPRT1基因的shRNA。在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:1(本文称为“sh734”)具有至少90％同一性的序列。在另一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的序列。在进一步实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:1具有至少96％同一性的序列。在进一步实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:1具有至少97％同一性的序列。在甚至进一步实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:1具有至少98％同一性的序列。在还进一步实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:1具有至少99％同一性的序列。在其它实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有SEQ ID NO:1的核酸序列。
在一些实施方案中，可以修饰SEQ ID NO:1的核酸序列。在一些实施方案中，修饰包括：(i)引入hsa-miR-22环序列(例如CCUGACCCA)(SEQ ID NO:21)；(ii)添加5'–3'核苷酸间隔区，如具有两个或三个核苷酸的间隔区(例如TA)；(iii)5'起始修饰，如添加一个或多个核苷酸(例如G)；和/或(iv)将两个核苷酸5'和3'添加到茎和环(例如5'A和3'T)。一般来讲，第一代shRNA被加工成小RNA的异质混合物，并且已显示前体转录物的积聚在体内诱导序列依赖性和非依赖性的非特异性脱靶效应。因此，基于当前对DICER加工和特异性的理解，应用这样的设计规则：其设计成最优化sh734的结构以及DICER持续合成能力和效率(另参见Gu,S.,Y.Zhang,L.Jin,Y.Huang,F.Zhang,M.C.Bassik,M.Kampmann和M.A.Kay.2014.Weak base pairing in both seed and 3′regions reduce RNAi off-targets and enhances si/shRNAdesigns.Nucleic Acids Research 42:12169-12176)。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的核酸序列可以通过将两个核苷酸5'和3'(例如，分别为G和C)添加到发夹环(SEQ ID NO:20)来修饰，从而将引导链的长度从约19个核苷酸延长至约21个核苷酸，并用hsa-miR-22环CCUGACCCA(SEQ ID NO:21)替换该环，以提供SEQ ID NO:2的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的序列。在其它实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的序列。在其它实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:2具有至少96％同一性的序列。在其它实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ IDNO:2具有至少97％同一性的序列。在其它实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:2具有至少98％同一性的序列。在其它实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:2具有至少99％同一性的序列。在另一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:2的序列。据信，与SEQ ID NO:1相比，由SEQ ID NO:2编码的shRNA实现类似的HPRT敲低。同样，据信通过经由SEQ ID NO:2编码的shRNA的表达来敲低HPRT而呈现基本HPRT缺陷的细胞允许使用硫鸟嘌呤类似物(例如，6-TG或6-MP)进行选择。
在一些实施方案中，存在于载体内的RNAi编码核酸分子，如与SEQ ID NO:3或SEQID NO:4之一具有至少90％序列同一性的核酸分子。在一些实施方案中，存在于载体内的RNAi编码核酸分子，如与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之一具有至少95％序列同一性的核酸分子。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之一具有至少90％序列同一性的核酸分子存在于宿主细胞的细胞质中。
在一些实施方案中，本公开提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包括至少一种与SEQID NO:3或SEQ ID NO:4之一具有至少90％序列同一性的核酸分子。在一些实施方案中，本公开提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包括至少一种与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之一具有至少95％序列同一性的核酸分子。在一些实施方案中，本公开提供了一种宿主细胞，该宿主细胞包括至少一种具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之一的核酸分子。
在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ IDNO:5(本文也称为“shHPRT 616”)具有至少80％同一性的序列。在其它实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:5具有至少90％的同一性的序列。在另一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因shRNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:5具有至少95％的同一性的序列。在进一步实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:5具有至少96％同一性的序列。在进一步实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:5具有至少97％同一性的序列。在甚至进一步实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:5具有至少98％同一性的序列。在还进一步实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:5具有至少99％同一性的序列。在其它实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:5的序列(另参见图3)。
在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ IDNO:6(本文也称为“shHPRT 211”)具有至少80％同一性的序列。在其它实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的序列。在另一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因shRNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:6具有至少95％同一性的序列。在进一步实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:6具有至少96％同一性的序列。在进一步实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:6具有至少97％同一性的序列。在甚至进一步实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:6具有至少98％同一性的序列。在还进一步实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:6具有至少99％同一性的序列。在其它实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:6的序列(另参见图4)。
在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:7(本文也称为“shHPRT 734.1”)具有至少80％同一性的序列(另参见图5)。在其它实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:7具有至少90％同一性的序列。在另一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因shRNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:7具有至少95％同一性的序列。在进一步实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:7具有至少96％同一性的序列。在进一步实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:7具有至少97％同一性的序列。在甚至进一步实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:7具有至少98％同一性的序列。在还进一步实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有与SEQ IDNO:7具有至少99％同一性的序列。在其它实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:7的序列(另参见图5)。
微RNA
微RNA(miR)是一类转录后调控其靶基因表达的非编码RNA。据信这些单链分子与其它蛋白形成miRNA介导沉默复合体(miRISC)，所述其它蛋白结合其靶mRNA的3'非翻译区(UTR)以防止其在细胞质中的翻译。
在一些实施方案中，shRNA序列被嵌入微RNA二级结构中(“基于微RNA的shRNA”)。在一些实施方案中，靶向HPRT的shRNA核酸序列被嵌入微RNA二级结构内。在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA靶向HPRT内的编码序列以实现HPRT表达的敲低，据信这等同于利用靶向HPRT的shRNA而无随之产生的途径饱和以及细胞毒性或脱靶效应。在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA是从头人工微RNA shRNA。这样的基于从头微RNA的shRNA的产生描述于Fang,W.&Bartel,David P.The Menu of Features that Define Primary MicroRNAs andEnable De Novo Design of MicroRNAGenes.Molecular Cell 60,131-145，其公开内容据此全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:8具有至少80％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:8具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:8具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:8具有至少96％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:8具有至少97％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:8具有至少98％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:8具有至少99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA具有SEQ ID NO:8的序列(“miRNA734-Denovo”)(另参见图6)。SEQ ID NO:8的RNA形式具有SEQ ID NO:22。
在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:9具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:9具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:9具有至少96％同一性的序列。在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:9具有至少97％同一性的序列。在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:9具有至少98％同一性的序列。在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA具有与SEQ ID NO:9具有至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，基于微RNA的shRNA具有SEQ ID NO:9的核酸序列(“miRNA211-Denovo”)(另参见图7)。SEQ ID NO:9的RNA形式具有SEQ ID NO:23。
在其它实施方案中，基于微RNA的shRNA是第三代miRNA支架修饰的miRNA 16-2(下文为“miRNA-3G”)(参见例如图8和9)。这样的miRNA-3G分子的合成描述于Watanabe,C.,Cuellar,T.L.&Haley,B."Quantitative evaluation of first,second,and thirdgeneration hairpin systems reveals the limit of mammalian vector-based RNAi,"RNA Biology 13,25-33(2016)，其公开内容据此全文以引用方式并入本文)。
在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:10具有至少80％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:10具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:10具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:10具有至少96％同一性的序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:10具有至少97％同一性的序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:10具有至少98％同一性的序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQID NO:10具有至少99％同一性的序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有SEQ ID NO:10的核酸序列(“miRNA211-3G”)(另参见图9)。
在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:11具有至少80％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:11具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:11具有至少96％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:11具有至少97％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:11具有至少98％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，miRNA-3G具有与SEQ ID NO:11具有至少99％同一性的核酸序列。在其它实施方案中，miRNA-3G具有SEQ ID NO:11的核酸序列(“miRNA734-3G”)(另参见图8)。
在一些实施方案中，sh734 shRNA适于模拟具有17个核苷酸碱基对茎和4个核苷酸环的miRNA-451(参见SEQ ID NO:24)结构(miR-451调控药物转运蛋白P-糖蛋白)。值得注意的是，该结构不需要由DICER加工。据信前451mRNA结构由Ago2切割，并随后由聚(A)-特异性核糖核酸酶(PARN)切割，以生成成熟miRNA-451结构模拟物。据信Ago-shRNA模拟内源性miR-451的结构，并且可具有不依赖于DICER的优势。这据信限制了随从链(passenger)负载的脱靶效应，具有可变的3'-5'核酸外切活性(23-26nt成熟)(参见Herrera-Carrillo,E.和B.Berkhout.2017.DICER-independent processing of small RNAduplexes:mechanisticinsights and applications.Nucleic Acids Res.45:10369-10379)。还据信存在着利用shRNA的替代的DICER非依赖性加工的优势，包括有效降低单一RNAi活性指导物的脱靶效应、没有细胞RNAi DICER机制的饱和，并且较短的RNA双链体不太可能触发先天性RIG-I应答。
RNAi的替代形式
作为引入RNAi的替代形式，在一些实施方案中，表达载体可包括编码结合信使RNA(mRNA)中的位点的反义寡核苷酸的核酸序列。本公开的反义寡核苷酸与编码蛋白质的核酸特异性杂交，并且干扰蛋白质的转录或翻译。在一些实施方案中，反义寡核苷酸靶向DNA并干扰其复制和/或转录。在其它实施方案中，反义寡核苷酸与RNA特异性杂交，所述RNA包括前mRNA(即前体mRNA，其为mRNA的未成熟单链)和mRNA。这样的反义寡核苷酸可以例如影响RNA易位到蛋白质翻译位点、由RNA向蛋白质的翻译、产生一种或多种mRNA种类的RNA剪接，以及RNA可能参与或促进的催化活性。这种干扰的总体效应是调节、降低、或抑制靶蛋白表达。
在一些实施方案中，表达载体引入编码外显子跳跃剂或外显子跳跃转基因的核酸序列。如本文所用，短语“外显子跳跃转基因”或“外显子跳跃剂”是指编码可生成外显子跳跃的反义寡核苷酸的任何核酸。“外显子跳跃”是指在蛋白质产生期间，在前mRNA水平被跳跃和移除的外显子。据信反义寡核苷酸可干扰外显子内的剪接位点或调控元件。尽管存在遗传突变，这可导致截短的部分功能性蛋白质。一般来讲，反义寡核苷酸可以是突变特异性的，并且结合至前信使RNA中的突变位点以诱导外显子跳跃。
外显子跳跃转基因编码可导致外显子跳跃的试剂，并且这样的试剂是反义寡核苷酸。尽管存在遗传突变，反义寡核苷酸可干扰外显子内的剪接位点或调控元件以导致截短的部分功能性蛋白质。额外地，反义寡核苷酸可以是突变特异性的，并且结合至前信使RNA中的突变位点以诱导外显子跳跃。用于外显子跳跃的反义寡核苷酸在本领域中是已知的，且通常称为AON。这样的AON包括小核RNA(“snRNA”)，它是一类被限定于核内并参与剪接或其它RNA加工反应的小RNA分子。反义寡核苷酸、设计它们的方法和相关产生方法的实例公开于例如美国公开No.20150225718、20150152415、20150140639、20150057330、20150045415、20140350076、20140350067和20140329762，其公开内容据此全文以引用方式并入本文中。
在一些实施方案中，本公开的表达载体包括编码外显子跳跃剂的核酸，该外显子跳跃剂在HPRT表达期间导致外显子跳跃或者引起HPRT复制突变(例如，外显子4中的复制突变)(参见Baba S等人,Novel mutation in HPRT1 causing a splicing error withmultiple variations.Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids.2017年1月2日；36(11):1-6，其公开内容据此全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，可以通过剪接体反式剪接，用修饰的突变序列替换HPRT，从而促进HPRT。在一些实施方案中，这(1)需要突变的编码区来替换靶RNA中的编码序列，(2)5'或3'剪接位点，和/或(3)结合结构域，即，反义寡核苷酸序列，其与靶HPRT RNA互补。在一些实施方案中，需要所有三种组分。
启动子
各种启动子可用于驱动引入所公开的表达载体内的每种核酸序列的表达。例如，编码RNAi(例如抗HPRT shRNA)的第一核酸序列可以由选自Pol III启动子或Pol II启动子之一的第一启动子表达。同样，并且作为另一个实例，编码用于下调HPRT的基于微RNA的shRNA的第一核酸序列可以由选自Pol III启动子或Pol II启动子之一的第一启动子表达。在一些实施方案中，启动子可以是如本领域的普通技术人员已知的组成型启动子或诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子包括HIV LTR的至少一部分(例如TAR)。
合适启动子的非限制性实例包括但不限于RNA聚合酶I(pol I)、聚合酶II(polII)或聚合酶III(pol III)启动子。所谓的“RNA聚合酶III启动子”或“RNA pol III启动子”或“聚合酶III启动子”或“pol III启动子”意指在其细胞中的天然环境下与RNA聚合酶III缔合或相互作用以转录其可操作连接的基因的任何无脊椎动物、脊椎动物、或哺乳动物启动子(例如人、鼠、猪、牛、灵长类、猿等)，或者将在所选宿主细胞中与RNA聚合酶III相互作用以转录可操作连接的核酸序列的其天然或工程化的任何变体。适用于本公开的表达载体的RNApol III启动子包括但不限于人U6、小鼠U6和人H1等。
pol II启动子的实例包括但不限于Ef1α、CMV和泛素。其它特异性pol II启动子包括但不限于锚蛋白启动子(Sabatino DE等人,Proc Natl Acad Sd USA.(24):13294-9(2000))、血影蛋白启动子(Gallagher PG等人,J Biol Chem.274(10):6062-73,(2000))、转铁蛋白受体启动子(Marziali G等人,Oncogene.21(52):7933-44,(2002))、带3蛋白/阴离子转运蛋白启动子(Frazar TF等人,MoI Cell Biol(14):4753-63,(2003))、带4.1启动子(Harrison PR等人,Exp Cell Res.155(2):321-44,(1984))、BcI-Xl启动子(Tian C等人,Blood 15；101(6):2235-42(2003))、EKLF启动子(Xue L等人,Blood.103(11):4078-83(2004).Epub 2004年2月5日)、ADD2启动子(Yenerel MN等人,Exp Hematol.33(7):758-66(2005))、DYRK3启动子(Zhang D等人,Genomics 85(1):117-30(2005))、SOCS启动子(SarnaMK等人,Oncogene 22(21):3221-30(2003))、LAF启动子(To MD等人,bit J Cancer l；115(4):568-74,(2005))、PSMA启动子(Zeng H等人,JAndrol(2):215-21,(2005))、PSA启动子(Li HW等人,Biochem Biophys Res Commun 334(4):1287-91,(2005))、Probasin启动子(Zhang J等人,145(l):134-48,(2004).Epub 2003年9月18日)、ELAM-I启动子/E-选择素(Walton T等人,Anticancer Res.18(3A):1357-60,(1998))、突触蛋白启动子(Thiel G等人,ProcNatl Acad Sd USA.,88(8):3431-5(1988))、Willebrand因子启动子(Jahroudi N,Lynch DC.MoI Cell-5zo/.14(2):999-1008,(1994))、FLTl(Nicklin SA等人,Hypertension 38(l):65-70,(2001))、Tau启动子(Sadot E等人,JMoI Biol.256(5):805-12,(1996))、酪氨酸酶启动子(Lillehammer T等人,Cancer Gene Ther.(2005))、胰腺衍生因子启动子(Burkhardt BR等人,Biochim Biophys Acta.(2005))、神经元特异烯醇化酶启动子(Levy YS等人,JMolNeurosci.21(2):121-32,(2003))、hTERT启动子(Ito H等人,HumGene Ther16(6):685-98,(2005))、HRE应答元件(Chadderton N等人,IntJRadiat OncolBiol Phys.62(l):2U-22,(2005))、lck启动子(Zhang DJ等人,J Immunol.174(11):6725-31,(2005))、MHCII启动子(De Geest BR等人,Blood.101(7):2551-6,(2003),Epub 2002年11月21日)和CDl Ic启动子(Lopez-Rodriguez C等人,J Biol Chem.272(46):29120-6(1997))。
在一些实施方案中，驱动设计成敲低HPRT的试剂的表达的启动子是RNA pol III启动子。在一些实施方案中，驱动设计成敲低HPRT的试剂的表达的启动子是7sk启动子(例如7SK人7S K RNA启动子)。在一些实施方案中，7sk启动子具有由ACCESSION AY578685(智人细胞系HEK-293 7SK RNA启动子区，完整序列，ACCESSION AY578685)提供的核酸序列。
在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:14具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:14具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:14具有至少96％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:14具有至少97％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:14具有至少98％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:14具有至少99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有SEQ ID NO:14中所示的核酸序列。
在一些实施方案中，与7sk启动子相比，所利用的7sk启动子在其核酸序列中包含至少一个突变和/或缺失。合适的7sk启动子突变描述于Boyd,D.C.,Turner,P.C.,Watkins,N.J.,Gerster,T.&Murphy,S.Functional Redundancy of Promoter Elements EnsuresEfficient Transcription of the Human 7SK Gene in vivo.Journal of MolecularBiology 253,677-690(1995)，其公开内容据此全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，7sk启动子中的功能性突变或缺失是在顺式调控元件中进行的，以调控启动子驱动的转基因(包括sh734)的表达水平。所述突变用于建立由Pol III启动子驱动的sh734表达水平之间的相关性，并引入功能性以在存在6-TG和/或6-MP疗法以及长期稳定性和安全性情况下经历稳定选择。7sk启动子突变的位置描绘于图10中。
在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:15具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:15具有至少96％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:15具有至少97％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:15具有至少98％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:15具有至少99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有SEQ ID NO:15所示的核酸序列。
在其它实施方案中，启动子是组织特异性启动子。可使用的组织特异性启动子的几个非限制性实例包括lck(参见例如Garvin等人,MoI.Cell Biol.8:3058-3064,(1988)和Takadera等人,MoI.Cell Biol.9:2173-2180,(1989))、肌细胞生成素(Yee等人,Genes andDevelopment 7:1277-1289(1993))和thyl(Gundersen等人,Gene 113:207-214,(1992))。
可操作地连接至启动子的核酸序列的组合的非限制性实例列于下表中：
<![CDATA[<u>编号</u>]]> <![CDATA[<u>启动子类型</u>]]> <![CDATA[<u>启动子</u>]]> <![CDATA[<u>shRNA</u><u>SEQ</u><u>ID</u><u>NO:</u>]]>
1 Pol III 7sk 1
2 Pol III 具有单一突变的突变体7sk 1
3 Pol III 具有两个突变的突变体7sk 1
4 Pol III 具有三个突变的突变体7sk 1
5 Pol III H1 1
6 Pol II EF1a 5
7 Pol II EF1a 6
8 Pol II EF1a 7
载体的产生
在一些实施方案中，将表达盒(如包含适于敲低HPRT的核酸序列的表达盒)***表达载体(如慢病毒表达载体)中，以提供具有至少一种用于表达的转基因的载体。在一些实施方案中，慢病毒表达载体可选自pTL20c、pTL20d、FG、pRRL、pCL20、pLKO.1puro、pLKO.1、pLKO.3G、Tet-pLKO-puro、pSico、pLJM1-EGFP、FUGW、pLVTHM、pLVUT-tTR-KRAB、pLL3.7、pLB、pWPXL、pWPI、EF.CMV.RFP、pLenti CMV Puro DEST、pLenti-puro、pLOVE、pULTRA、pLJM1-EGFP、pLX301、pInducer20、pHIV-EGFP、Tet-pLKO-neo、pLV-mCherry、pCW57.1、pLionII、pSLIK-Hygro和pInducer10-mir-RUP-PheS。在其它实施方案中，慢病毒表达载体可选自AnkT9W载体、T9Ank2W载体、TNS9载体、lentiglobin HPV569载体、lentiglobin BB305载体、BG-1载体、BGM-1载体、d432βAγ载体、mLAβΔγV5载体、GLOBE载体、G-GLOBE载体、βAS3-FB载体、V5载体、V5m3载体、V5m3-400载体、G9载体和BCL11A shmir载体。在一些实施方案中，慢病毒表达载体可选自pTL20c、pTL20d、FG、pRRL和pCL20。在又一些其它实施方案中，慢病毒表达载体是pTL20c。
在一些实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:13具有至少95％序列同一性的核酸序列。在其它实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:13具有至少96％序列同一性的核酸序列。在其它实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:13具有至少97％序列同一性的核酸序列。在其它实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:13具有至少98％序列同一性的核酸序列。在另一些实施方案中，表达盒包含与SEQ ID NO:13具有至少99％序列同一性的核酸序列。在进一步实施方案中，表达盒具有SEQ ID NO:13的核酸序列。
在一些实施方案中，质粒具有与SEQ ID NO:17具有至少90％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，质粒具有与SEQ ID NO:17具有至少95％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，质粒具有与SEQ ID NO:17具有至少96％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，质粒具有与SEQ ID NO:17具有至少97％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，质粒具有与SEQ ID NO:17具有至少98％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，质粒具有与SEQ ID NO:17具有至少98％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，质粒具有SEQ ID NO:17的核酸序列。
在一些实施方案中，质粒包括TL20病毒骨架，该TL20病毒骨架具有与SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，质粒包括TL20病毒骨架，该TL20病毒骨架具有与SEQ ID NO:16具有至少95％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，质粒包括TL20病毒骨架，该TL20病毒骨架具有与SEQ ID NO:16具有至少96％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，质粒包括TL20病毒骨架，该TL20病毒骨架具有与SEQ IDNO:16具有至少97％序列同一性的核酸序列的TL20病毒主链。在一些实施方案中，质粒包括TL20病毒骨架，该TL20病毒骨架具有与SEQ ID NO:16具有至少98％序列同一性的核酸序列的TL20病毒主链。在一些实施方案中，质粒包括TL20病毒骨架，该TL20病毒骨架具有与SEQID NO:16具有至少99％序列同一性的核酸序列的TL20病毒主链。在一些实施方案中，质粒包括TL20病毒骨架，该TL20病毒骨架具有SEQ ID NO:16的核酸序列。
在一个或多个实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列可以以相对于其它载体元件的不同方向***表达载体中(例如，比较图32之间的7sk启动子的方向)。例如，与转基因(如实施例中所述的UbC驱动的GFP)相比，7sk驱动的sh734元件可以朝向相同方向或相反方向。在另一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列可以***表达载体的不同位置中，即，其它载体元件的上游或下游，例如UbC驱动的GFP的上游或下游。据信7sk表达盒相对于其它载体元件的不同位置和/或方向可以增强sh734的表达。
在一些实施方案中，7sk/sh734表达盒位于相对于其它载体元件(如UbC驱动的GFP)的上游。
在一些实施方案中，7sk/sh734表达盒位于相对于其它载体元件(如UbC驱动的GFP)的下游。
在一些实施方案中，7sk/sh734表达盒和其它载体元件(如UbC驱动的GFP)朝向相同方向。
在一些实施方案中，7sk/sh734表达盒和其它载体元件(如UbC驱动的GFP)朝向相反方向。
在一些实施方案中，相对于其它载体元件(如UbC驱动的GFP)，7sk/sh734表达盒朝向正向。
在一些实施方案中，相对于其它载体元件(如UbC驱动的GFP)，7sk/sh734表达盒朝向反向。
在一些实施方案中，相对于其它载体元件(如UbC驱动的GFP)，7sk/sh734表达盒位于上游并朝向正向。
在一些实施方案中，相对于其它载体元件(如UbC驱动的GFP)，7sk/sh734表达盒位于上游并朝向反向。
在一些实施方案中，相对于其它载体元件(如UbC驱动的GFP)，7sk/sh734表达盒位于下游并朝向正向。
在一些实施方案中，相对于其它载体元件(如UbC驱动的GFP)，7sk/sh734表达盒位于下游并朝向反向。
下调HPRT或敲除HPRT的试剂的物理和非病毒递送
在一些实施方案中，设计成敲低或敲除HPRT1基因的试剂(包括包含RNAi的表达构建体)可通过物理方法递送。在一些实施方案中，物理方法选自显微注射和电穿孔。电穿孔是向细胞施加电场以便增加细胞膜的渗透性，从而允许化学品、小分子、蛋白质、核酸等引入细胞中的技术。显微注射是通过将微量移液管***所关注的细胞中来将化学品、小分子、蛋白质、核酸等引入单个细胞中的技术。显微注射提供了受控的递送剂量以及向一个或多个亚细胞位置的靶向递送。
在一些实施方案中，(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子通过电穿孔或显微注射引入淋巴细胞。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少91％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少92％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少93％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少94％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ IDNO:40-44和46-56中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子包含SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者的序列。
在一些实施方案中，(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子2之一内的序列的指导RNA分子通过电穿孔或显微注射引入淋巴细胞。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少91％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少92％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少93％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少94％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少96％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少99％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA包含SEQ ID NO:45和57-61中的任一者的序列。
在一些实施方案中，通过一种或多种物理方法递送的内切核酸酶包含Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
在一些实施方案中，设计成敲低或敲除HPRT1基因的试剂(包括包含RNAi的表达构建体)可以通过非病毒递送媒介物递送。在一些实施方案中，非病毒递送媒介物是纳米胶囊或其它非病毒递送媒介物。在一些实施方案中，(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子经由非病毒递送媒介物(如纳米胶囊)引入淋巴细胞。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ IDNO:40-44和46-56中的任一者具有至少99％序列同一性。
在一些实施方案中，(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子2之一内的序列的指导RNA分子经由非病毒递送媒介物(如纳米胶囊)引入淋巴细胞。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少98％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少99％序列同一性。
在一些实施方案中，经由非病毒递送媒介物递送的内切核酸酶包含Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
物理递送或通过非病毒递送媒介物对试剂的递送代表了借助于来自表达载体的表达的RNAi或其它试剂来实现HPRT(例如HPRT 1)下调的替代方案。如本文进一步所描述，有可能使用纳米胶囊或一种或多种物理方法(如电穿孔)递送反义RNA、设计用于外显子跳跃的寡核苷酸、或基因编辑机制。
一般来讲，纳米胶囊是表现出典型核-壳结构的囊泡***，其中活性分子被限定在聚合物膜或包衣包围的贮库或腔体中。在一些实施方案中，典型的纳米胶囊的壳由聚合物膜或包衣制成。在一些实施方案中，纳米胶囊源自可生物降解或可生物侵蚀的聚合物材料，即，纳米胶囊是可生物降解和/或可侵蚀的聚合物纳米胶囊。例如，将用于敲低和/或敲除的组分包封在纳米胶囊内，该纳米胶囊包含一种或多种可生物降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊由两种不同的带正电荷的单体、至少一种中性单体，以及交联剂构成。在一些实施方案中，纳米胶囊是可酶促降解的纳米胶囊。在一些实施方案中，纳米胶囊由单一蛋白质核和通过肽交联的薄聚合物壳组成。在一些实施方案中，可以选择纳米胶囊，使得它是可特异性识别的，并且能够被蛋白酶切割。在一些实施方案中，可切割的交联剂包括作为蛋白酶或另一种酶的底物的肽序列或结构。
纳米胶囊的实例包括但不限于美国专利No.9,782,357中描述的那些；美国专利申请公开No.2017/0354613和2015/0071999中描述的那些；以及PCT公开No.WO2016/085808和WO2017/205541中描述的那些，其公开内容据此全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，前述出版物中描述的纳米胶囊可被修饰成携带和/或包封用于敲低和/或敲除的组分，例如Cas蛋白和/或gRNA。其它合适的纳米胶囊、其合成方法和/或包封方法进一步公开于美国专利公开No.2011/0274682中，其公开内容据此全文以引用方式并入本文。PCT公开No.WO2013/138783、WO2013/033717和WO2014/093966中描述了可被修饰成携带和/或包封用于实现HPRT的敲低或敲除的组分的另一些合适的纳米胶囊，其公开内容据此全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，纳米胶囊适于在体内靶向特定细胞类型(例如，T细胞、CD34造血干细胞和祖细胞)。例如，纳米胶囊可包括一个或多个与聚合物纳米胶囊偶联的靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分将聚合物纳米胶囊递送至特定的细胞类型，其中细胞类型选自免疫细胞、血细胞、心肌细胞、肺细胞、视细胞、肝细胞、肾细胞、脑细胞、中枢神经***的细胞、外周神经***细胞、癌细胞、病毒感染的细胞、干细胞、皮肤细胞、肠细胞和/或听细胞。在一些实施方案中，靶向部分是抗体。
在一些实施方案中，纳米胶囊还包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，纳米胶囊包含2至6个靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分是抗体。.在一些实施方案中，靶向部分靶向CD117、CD10、CD34、CD38、CD45、CD123、CD127、CD135、CD44、CD47、CD96、CD2、CD4、CD3和CD9标记中的任一种。在一些实施方案中，靶向部分靶向人间充质干细胞CD标记中的任一种，包括CD29、CD44、CD90、CD49a-f、CD51、CD73(SH3)、CD105(SH2)、CD106、CD166和Stro-1标记。在一些实施方案中，靶向部分靶向人工血干细胞CD标记中的任一种，包括CD34、CD38、CD45RA、CD90和CD49。
在一些实施方案中，至少一个靶向部分靶向T细胞标记。在一些实施方案中，T细胞标记选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127或FoxP3和CD44。在一些实施方案中，T细胞标记是CD3。在一些实施方案中，T细胞标记是CD28。
在一些实施方案中，与一个或多个共刺激部分的共刺激可用于活化靶细胞，包括T细胞。在一些实施方案中，共刺激可通过活化一种或多种细胞表面标记、包括但不限于CD28、ICOS、CTLA4、PD1、PD1H和BTLA来实现。在一些实施方案中，共刺激部分是抗体。
技术人员将理解，免疫细胞可依赖于第二信号来活化免疫应答(即共刺激)。例如，T细胞可能需要两种刺激来完全活化免疫应答。在一些实施方案中，与一个或多个共刺激部分的共刺激可用于活化靶细胞，包括T细胞。在一些实施方案中，共刺激可通过活化一种或多种细胞表面标记、包括但不限于CD28、ICOS、CTLA4、PD1、PD1H和BTLA来实现。在一些实施方案中，共刺激部分是抗体。
适于这样的纳米胶囊的有效载荷包括靶向HPRT的合成寡核苷酸、shRNA、miRNA以及Ago-shRNA。在一些实施方案中，有效载荷可以在Pol III或Pol II驱动的启动子盒中表达。
在其它实施方案中，用于下调HPRT的试剂可以配制在生物纳米胶囊内，该生物纳米胶囊是由基因工程化微生物产生的纳米尺寸胶囊。在一些实施方案中，生物纳米胶囊是病毒蛋白衍生或修饰的病毒蛋白衍生的颗粒，如病毒表面抗原颗粒(例如，乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)颗粒)。在其它实施方案中，生物纳米胶囊是包含脂质双层膜以及病毒蛋白衍生或修饰的病毒蛋白衍生的颗粒(如病毒表面抗原颗粒)的纳米尺寸胶囊。这样的颗粒可以从真核细胞如酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞中纯化。胶囊的尺寸可以在约10nm至约500nm的范围内。在其它实施方案中，胶囊的尺寸可以在约20nm至约250nm的范围内。在另一些实施方案中，胶囊的尺寸可以在约80nm至约150nm的范围内。
反义RNA
反义RNA(asRNA)是与细胞内转录的信使RNA(mRNA)链互补的单链RNA。不受任何特定理论的束缚，据信可以将反义RNA引入细胞中，以通过与互补mRNA碱基配对和物理阻碍翻译机制来抑制互补mRNA的翻译。换句话讲，反义RNA是表现出与特定mRNA的互补关系的单链RNA分子。
反义RNA可以用于基因调节并特异性靶向用于蛋白质合成的mRNA分子。反义RNA可以与互补mRNA物理配对并结合，从而抑制mRNA在翻译机制中被加工的能力。在一些实施方案中，硫代磷酸修饰的反义寡核苷酸可用于靶向HPRT mRNA编码区内的序列。如上所述，可以使用靶向纳米颗粒将这些寡核苷酸递送至特定细胞群和解剖部位细胞。
外显子跳跃
如本文所述，外显子跳跃可用于在HPRT1基因内产生导致HPRT缺陷的缺陷。在一些实施方案中，寡核苷酸(包括经修饰寡核苷酸)可借助于纳米胶囊进行递送，该寡核苷酸被设计成靶向未剪接的HPRT mRNA并介导活性所需的内含子的过早终止或跳跃。可以引入HPRT复制突变，例如外显子4中的复制突变(参见Baba S等人,"Novel mutation in HPRT1causing a splicing error with multiple variations,"Nucleosides NucleotidesNucleic Acids.2017年1月2日；36(1):1-6)，以引起HPRT蛋白的剪接错误和功能失活。通过剪接体反式剪接用经修饰突变序列替换HPRT是敲低HPRT的潜在治疗策略。据信这需要(1)突变的编码区来替换靶RNA中的编码序列，(2)5'或3'剪接位点，和(3)结合结构域，例如，反义寡核苷酸序列，其与靶RNA互补。
可以对寡核苷酸进行结构修饰，使得它们是核酸酶抗性的。在一些实施方案中，寡核苷酸具有修饰骨架或非天然的核苷间键。这样的具有修饰骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子的那些和在骨架中不具有磷原子的那些。在一些实施方案中，在其核苷间骨架中不具有磷原子的经修饰寡核苷酸也可以认为是寡核苷酸。在其它实施方案中，寡核苷酸被修饰成使得核苷酸单元的糖和核苷间键(即骨架)均被新基团替换。保留碱基单位以与适当的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物(即显示具有优异的杂交特性的寡核苷酸模拟物)被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖-骨架被含酰胺的骨架，特别是氨乙基甘氨酸骨架替换。核碱基保留，并且直接或间接地与骨架的酰胺部分的氮杂氮原子结合。经修饰寡核苷酸还可含有一个或多个取代的糖部分。寡核苷酸还可包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。某些核碱基特别可用于增加本公开的寡聚化合物的结合亲和力。这些包括但不限于5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性提高约0.6至约1.2℃，并且是目前优选的碱基取代，甚至更特别地当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
敲除HPRT的基因编辑
本公开还提供了用于敲除HPRT1的组合物。作为非限制性实例，可以用靶向HPRT的CRISPR/Cas(例如靶向HPRT的CRISPR/Cas9 RNP)、用靶向HPRT的CRISPR/Cas12aRNP或者用靶向HPRT的CRISPR/Cas12b RNP处理分离的细胞(例如，原代T淋巴细胞)。
如本文所提供的“核糖核蛋白复合体”是指包括核蛋白和核糖核酸的复合体或颗粒。如本文所提供的“核蛋白”是指能够结合核酸(例如RNA、DNA)的蛋白质。当核蛋白结合核糖核酸时，它被称为“核糖核蛋白”。核蛋白与核糖核酸之间的相互作用可以是直接的，例如通过共价键，或者是间接的，例如通过非共价键(例如，静电相互作用(例如离子键、氢键、卤素键)、范德华相互作用(例如，偶极-偶极、偶极诱导的偶极、伦敦色散力)、环堆积(pi效应)、疏水相互作用等)。
在一些实施方案中，核糖核蛋白包括与核糖核酸非共价结合的RNA结合基序。例如，RNA结合基序中带正电荷的芳族氨基酸残基(例如，赖氨酸残基)可以与RNA的负磷酸核酸骨架形成静电相互作用，从而形成核糖核蛋白复合体。核糖核蛋白的非限制性实例包括核糖体、端粒酶、RNAseP、hnRNP、CRISPR相关蛋白9(Cas9)和小核RNP(snRNP)。
在一些实施方案中，核糖核蛋白可以是酶。在一些实施方案中，核糖核蛋白是内切核酸酶。因此，在一些实施方案中，核糖核蛋白复合体包括内切核酸酶和核糖核酸。在一些实施方案中，内切核酸酶是CRISPR相关蛋白9。在一些实施方案中，内切核酸酶是CRISPR相关蛋白12a。在一些实施方案中，内切核酸酶是CRISPR相关蛋白12b。
在一些实施方案中，核糖核酸是指导RNA。指导RNA或指导RNA分子的实例包括SEQID NO:25-39中的任一者或SEQ ID NO:40-61中的任一者。在一些实施方案中，指导RNA包括一种或多种RNA分子(例如，与靶序列互补的crRNA；以及充当核酸酶的结合支架的tracrRNA)。
在一些实施方案中，gRNA包括与靶序列(例如，染色体X内的靶序列、具有HPRT 1基因的靶序列、HPRT 1基因的外显子2内的靶序列、外显子3内的靶序列、或HPRT 1基因的外显子8内的靶序列)或其一部分互补的核苷酸序列。如本文所提供的靶序列是指由细胞表达的核酸序列。在一些实施方案中，靶核酸序列是外源性核酸序列。在一些实施方案中，靶序列是内源性核酸序列。在一些实施方案中，靶序列构成细胞基因的一部分。因此，在一些实施方案中，指导RNA与细胞基因或其片段互补。
在一些实施方案中，指导RNA与靶核酸序列约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。在一些实施方案中，指导RNA与细胞基因的序列约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。在一些实施方案中，指导RNA结合细胞基因序列。
在一些实施方案中，指导RNA的互补序列与靶序列具有至少约50％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA的互补序列与靶序列具有至少约55％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA的互补序列与靶序列具有至少约60％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA的互补序列与靶序列具有至少约65％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA的互补序列与靶序列具有至少约70％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA的互补序列与靶序列具有至少约75％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA的互补序列与靶序列具有至少约80％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA的互补序列与靶序列具有至少约85％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA的互补序列与靶序列具有至少约90％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA的互补序列与靶序列具有至少约95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA的互补序列与靶序列具有至少约96％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA的互补序列与靶序列具有至少约97％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA的互补序列与靶序列具有至少约98％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA的互补序列与靶序列具有至少约99％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA的互补序列包含靶序列。
在一些实施方案中，本公开提供了包括靶向人次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因(SEQ ID NO:12)内的序列的指导RNA的组合物。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向人染色体X内约134460145至约134500668范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物(例如，此前已知的基因组构建物或未来的基因组构建物)中的等同位置)的序列。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134460145至约134500668范围内的位置(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)处的序列，并且其中所靶向的序列具有约14至约28个连续碱基对范围内的长度。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134460145至约134500668范围内的位置(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)处的序列，并且其中所靶向的序列具有约15至约26个连续碱基对范围内的长度。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134460145至约134500668范围内的位置(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)处的序列，并且其中所靶向的序列具有约16至约24个连续碱基对范围内的长度。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134460145至约134500668范围内的位置(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)处的序列，并且其中所靶向的序列具有约17至约22个连续碱基对范围内的长度。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134460145至约134500668范围内的位置(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)处的序列，并且其中所靶向的序列具有约18至约22个连续碱基对范围内的长度。虽然染色体X内的位置在本文中参考基因组参***人构建物38(Genome Reference Consortium Human Build 38，GRCh38)，但本领域的技术人员将理解，这些参考位置可以转置为替代的人基因组构建物或组装体中的等同位置。
在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134460145至约134500668之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134460145至约134500668之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134460145至约134500668之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少96％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134460145至约134500668之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少97％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134460145至约134500668之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134460145至约134500668之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少99％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在染色体X内约134460145至约134500668之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列的互补序列与SEQ ID NO:25-39中的任一者或者与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少90％同一性。在一些实施方案中，在染色体X内约134460145至约134500668之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列的互补序列与SEQ ID NO:25-39中的任一者或者与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少91％同一性。在一些实施方案中，在染色体X内约134460145至约134500668之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列的互补序列与SEQ ID NO:25-39中的任一者或者与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少92％同一性。在一些实施方案中，在染色体X内约134460145至约134500668之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列的互补序列与SEQ ID NO:25-39中的任一者或者与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少93％同一性。在一些实施方案中，在染色体X内约134460145至约134500668之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列的互补序列与SEQ ID NO:25-39中的任一者或者与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少94％同一性。在一些实施方案中，在染色体X内约134460145至约134500668之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列的互补序列与SEQ ID NO:25-39中的任一者或者与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少95％同一性。
在一些实施方案中，在染色体X内约134460145至约134500668之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列的互补序列与SEQ ID NO:25-39中的任一者或者与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少96％同一性。在一些实施方案中，在染色体X内约134460145至约134500668之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列的互补序列与SEQ ID NO:25-39中的任一者或者与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少97％同一性。在一些实施方案中，在染色体X内约134460145至约134500668之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列的互补序列与SEQ ID NO:25-39中的任一者或者与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少98％同一性。在一些实施方案中，在染色体X内约134460145至约134500668之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列的互补序列与SEQ ID NO:25-39中的任一者或者与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少99％同一性。
在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向人染色体X内约134475181至约134475364范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的序列。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134475181至约134475364范围内的位置(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)处的序列，并且其中所靶向的序列具有约14至约28个连续碱基对范围内的长度。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134475181至约134475364范围内的位置(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)处的序列，并且其中所靶向的序列具有约15至约26个连续碱基对范围内的长度。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134475181至约134475364范围内的位置(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)处的序列，并且其中所靶向的序列具有约16至约24个连续碱基对范围内的长度。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134475181至约134475364范围内的位置(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)处的序列，并且其中所靶向的序列具有约17至约24个连续碱基对范围内的长度。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134475181至约134475364范围内的位置处的序列，并且其中所靶向的序列具有约18至约24个连续碱基对范围内的长度。
在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134475181至约134475364之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134475181至约134475364之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134475181至约134475364之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少96％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134475181至约134475364之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少97％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134475181至约134475364之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134475181至约134475364之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少99％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向人染色体X内约134498608至约134498684范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的序列。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134498608至约134498684范围内的位置(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)处的序列，并且其中所靶向的序列具有约14至约28个连续碱基对范围内的长度。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134498608至约134498684范围内的位置(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)处的序列，并且其中所靶向的序列具有约15至约26个连续碱基对范围内的长度。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134498608至约134498684范围内的位置(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)处的序列，并且其中所靶向的序列具有约16至约24个连续碱基对范围内的长度。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134498608至约134498684范围内的位置(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)处的序列，并且其中所靶向的序列具有约17至约24个连续碱基对范围内的长度。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134498608至约134498684范围内的位置(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)处的序列，并且其中所靶向的序列具有约18至约24个连续碱基对范围内的长度。
在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134498608至约134498684之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134498608至约134498684之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134498608至约134498684之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少96％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134498608至约134498684之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少97％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134498608至约134498684之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134498608至约134498684之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少99％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:25-39中的任一者具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:25-39中的任一者具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDSNO:25-39中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:25-39中的任一者具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:25-39中的任一者具有至少97％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:25-39中的任一者具有至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有包含SEQ IDS NO:25-39中的任一者的核苷酸序列。
在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向人染色体X内约134473409至约134473460范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的序列。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134473409至约134473460范围内的位置(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)处的序列，并且其中所靶向的序列具有约14至约28个连续碱基对范围内的长度。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134473409至约134473460范围内的位置(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)处的序列，并且其中所靶向的序列具有约15至约26个连续碱基对范围内的长度。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134473409至约134473460范围内的位置(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)处的序列，并且其中所靶向的序列具有约16至约24个连续碱基对范围内的长度。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134473409至约134473460范围内的位置(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)处的序列，并且其中所靶向的序列具有约17至约24个连续碱基对范围内的长度。在一些实施方案中，组合物包括指导RNA，该指导RNA靶向染色体X内约134473409至约134473460范围内的位置(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)处的序列，并且其中所靶向的序列具有约18至约24个连续碱基对范围内的长度。
在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134473409至约134473460之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134473409至约134473460之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134473409至约134473460之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少96％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134473409至约134473460之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少97％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134473409至约134473460之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，组合物包括gRNA，该gRNA具有与位于染色体X内约134473409至约134473460之间的范围内的位置处(基于基因组构建物GRCh38或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置)的靶序列具有至少99％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:40-56中的任一者具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:40-56中的任一者具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDSNO:40-56中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:40-56中的任一者具有至少91％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:40-56中的任一者具有至少92％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:40-56中的任一者具有至少93％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:40-56中的任一者具有至少94％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:40-56中的任一者具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:40-56中的任一者具有至少96％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:40-56中的任一者具有至少97％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:40-56中的任一者具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:40-56中的任一者具有至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有包含SEQ IDS NO:40-56中的任一者的核苷酸序列。
在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:57-61中的任一者具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:57-61中的任一者具有至少85％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDSNO:57-61中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:57-61中的任一者具有至少95％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:57-61中的任一者具有至少96％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:57-61中的任一者具有至少97％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:57-61中的任一者具有至少98％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有与SEQ IDS NO:57-61中的任一者具有至少99％序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，指导RNA具有包含SEQ IDS NO:57-61中的任一者的核苷酸序列。
在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少85％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少91％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少92％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少93％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少94％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少95％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少96％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少97％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少98％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少99％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有包含SEQ ID NO:25-39中的任一者的核苷酸的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有包含SEQ ID NO:25的核苷酸的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有包含SEQ ID NO:26的核苷酸的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有包含SEQ ID NO:27的核苷酸的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有包含SEQID NO:28的核苷酸的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有包含SEQ ID NO:29的核苷酸的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有包含SEQ ID NO:30的核苷酸的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有包含SEQ ID NO:31的核苷酸的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有包含SEQ ID NO:32的核苷酸的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有包含SEQ ID NO:33的核苷酸的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有包含SEQ ID NO:34的核苷酸的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有包含SEQ ID NO:35的核苷酸的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有包含SEQ ID NO:36的核苷酸的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有包含SEQ ID NO:37的核苷酸的指导RNA。
在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少85％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少91％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少92％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少93％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少94％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少95％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少96％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少97％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少98％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少99％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas9，并且核糖核酸是具有包含SEQ ID NO:40-49中的任一者的核苷酸的指导RNA。
在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少85％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少91％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少92％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少93％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少94％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少95％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少96％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少97％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少98％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少99％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有包含SEQ ID NO:25-39中的任一者的核苷酸的指导RNA。
在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少85％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少91％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少92％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少93％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少94％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少95％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少96％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ IDNO:40-49中的任一者具有至少97％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少98％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少99％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有包含SEQ ID NO:40-49中的任一者的核苷酸的指导RNA。
在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:50-61中的任一者具有至少85％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:50-61中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:50-61中的任一者具有至少91％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:50-61中的任一者具有至少92％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:50-61中的任一者具有至少93％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:50-61中的任一者具有至少94％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:50-61中的任一者具有至少95％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:50-61中的任一者具有至少96％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ IDNO:50-61中的任一者具有至少97％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:50-61中的任一者具有至少98％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:50-61中的任一者具有至少99％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12a，并且核糖核酸是具有包含SEQ ID NO:40-49中的任一者的核苷酸的指导RNA。
在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少85％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少91％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少92％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少93％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少94％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少95％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少96％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少97％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少98％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少99％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有包含SEQ ID NO:25-39中的任一者的核苷酸的指导RNA。
在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少85％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少91％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少92％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少93％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少94％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少95％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少96％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ IDNO:40-49中的任一者具有至少97％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少98％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少99％序列同一性的核苷酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，内切核酸酶是Cas12b，并且核糖核酸是具有包含SEQ ID NO:40-49中的任一者的核苷酸的指导RNA。
宿主细胞
本公开还提供了一种包含本公开的新型表达载体的宿主细胞。“宿主细胞”或“靶细胞”意指用本公开的组合物(例如表达载体或纳米胶囊)转化(即转导或转染)的细胞。在一些实施方案中，在用编码适于敲低HPRT的核酸的表达载体转导之后，宿主细胞呈现为基本HPRT缺陷型。在其它实施方案中，在用包括设计成实现HPRT敲除的组分的纳米胶囊转染之后，宿主细胞呈现为基本HPRT缺陷型。用表达载体转导宿主细胞以敲低HPRT或者用纳米胶囊转染宿主细胞以敲除HPRT的方法描述于共同未决的美国专利申请No.：16/038,643，其公开内容据此全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，宿主细胞是分离的和/或纯化的。
在一些实施方案中，宿主细胞是表达载体可在其中表达的哺乳动物细胞。合适的哺乳动物宿主细胞包括但不限于人细胞、鼠细胞、非人灵长类细胞(例如恒河猴细胞)、人祖细胞或干细胞、293细胞、HeLa细胞、D17细胞、MDCK细胞、BHK细胞和Cf2Th细胞。在某些实施方案中，包含本公开的表达载体的宿主细胞是造血细胞，如造血祖细胞/干细胞(例如，CD34阳性造血祖细胞/干细胞)、单核细胞、巨噬细胞、外周血单核细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、或树突细胞。
本公开的用表达载体转导或者用纳米胶囊转染的造血细胞(例如CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和/或单核细胞/巨噬细胞)可以是同种异体的、自体同源的、或来自匹配的同胞。在一些实施方案中，造血祖细胞/干细胞是CD34阳性的，并且可从患者的骨髓或外周血中分离。在一些实施方案中，用如本文所述的表达载体转导分离的CD34阳性造血祖细胞/干细胞(和/或本文所述的其它造血细胞)。
在一些实施方案中，经修饰宿主细胞与药学上可接受的载体组合。在一些实施方案中，宿主细胞或转导的宿主细胞用PLASMA-LYTE A(例如，用于静脉内施用的无菌的、无热原等渗溶液；其中一升PLASMA-LYTE A的离子浓度为140mEq钠、5mEq钾、3mEq镁、98m Eq氯化物、27mEq乙酸盐和23mEq葡糖酸盐)。在其它实施方案中，将宿主细胞或转导的宿主细胞配制于PLASMA-LYTE A的溶液中，该溶液包含约8％至约10％的二甲亚砜(DMSO)。在一些实施方案中，每mL包括PLASMA-LYTE A和DMSO的配制物存在少于约2×107个宿主细胞/转导的宿主细胞。
在一些实施方案中，在用根据本公开的表达载体转导之后，宿主细胞呈现为基本HPRT缺陷型。在一些实施方案中，HPRT1基因表达水平降低至少约80％。据信具有20％或更少残留HPRT1基因表达的细胞对嘌呤类似物如6-TG或6-MP敏感，允许用嘌呤类似物对它们进行选择(参见例如图22)。在一些实施方案中，宿主细胞包括与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中的至少一者具有至少90％同一性的核酸分子。在一些实施方案中，宿主细胞包括与SEQID NO:3或SEQ ID NO:4中的至少一者具有至少95％同一性的核酸分子。在一些实施方案中，宿主细胞包括包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中的至少一者的核酸分子。
在一些实施方案中，可以通过使宿主细胞在体外、离体、或体内与本公开的表达载体以及一种或多种增加转导效率的化合物接触来增加宿主细胞的转导。例如，在一些实施方案中，增加转导效率的一种或多种化合物是刺激***素EP受体信号传导途径的化合物，即，与不存在一种或多种化合物时***素EP受体下游的细胞信号传导活性相比，增加与一种或多种化合物接触的细胞中***素EP受体下游的细胞信号传导活性的一种或多种化合物。在一些实施方案中，增加转导效率的一种或多种化合物是***素EP受体配体，包括但不限于***素E2(PGE2)、或其类似物或衍生物。在其它实施方案中，增加转导效率的一种或多种化合物包括但不限于RetroNectin(重组人纤连蛋白片段的63kD片段，购自Takara)；Lentiboost(膜密封泊洛沙姆，购自Sirion Biotech)、硫酸鱼精蛋白、环孢菌素H和雷帕霉素。在另一些实施方案中，增加转导效率的一种或多种化合物包括泊洛沙姆(例如泊洛沙姆F127)。
在一些实施方案中，通过使宿主细胞与包含从宿主细胞敲除HPRT1基因的组分的组合物接触来制备宿主细胞。在一些实施方案中，敲除HPRT1基因的组分包含内切核酸酶(例如，Cas9、Cas12a、或Cas12b)以及与SEQ ID NO:25-39或SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少85％序列同一性的指导RNA分子。在一些实施方案中，敲除HPRT1基因的组分包含内切核酸酶(例如，Cas9、Cas12a、或Cas12b)以及与SEQ ID NO:25-39或SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA分子。在一些实施方案中，敲除HPRT1基因的组分包含内切核酸酶(例如，Cas9、Cas12a、或Cas12b)以及与SEQ ID NO:25-39或SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少91％序列同一性的指导RNA分子。在一些实施方案中，敲除HPRT1基因的组分包含内切核酸酶(例如，Cas9、Cas12a、或Cas12b)以及与SEQ ID NO:25-39或SEQID NO:40-61中的任一者具有至少92％序列同一性的指导RNA分子。在一些实施方案中，敲除HPRT1基因的组分包含内切核酸酶(例如，Cas9、Cas12a、或Cas12b)以及与SEQ ID NO:25-39或SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少93％序列同一性的指导RNA分子。在一些实施方案中，敲除HPRT1基因的组分包含内切核酸酶(例如，Cas9、Cas12a、或Cas12b)以及与SEQ IDNO:25-39或SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少94％序列同一性的指导RNA分子。在一些实施方案中，敲除HPRT1基因的组分包含内切核酸酶(例如，Cas9、Cas12a、或Cas12b)以及与SEQ ID NO:25-39或SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少95％序列同一性的指导RNA分子。在一些实施方案中，敲除HPRT1基因的组分包含内切核酸酶(例如，Cas9、Cas12a、或Cas12b)以及与SEQ ID NO:25-39或SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少96％序列同一性的指导RNA分子。在一些实施方案中，敲除HPRT1基因的组分包含内切核酸酶(例如，Cas9、Cas12a、或Cas12b)以及与SEQ ID NO:25-39或SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少97％序列同一性的指导RNA分子。在一些实施方案中，敲除HPRT1基因的组分包含内切核酸酶(例如，Cas9、Cas12a、或Cas12b)以及与SEQ ID NO:25-39或SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少98％序列同一性的指导RNA分子。在一些实施方案中，敲除HPRT 1基因的组分包含内切核酸酶(例如，Cas9、Cas12a、或Cas12b)以及与SEQ ID NO:25-39或SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少99％序列同一性的指导RNA分子。在一些实施方案中，敲除HPRT1基因的组分包含内切核酸酶(例如Cas9、Cas12a、或Cas12b)以及包含SEQ ID NO:25-39或SEQ ID NO:40-61中的任一者的指导RNA分子。
药物组合物
本公开还提供了包含一种或多种如本文所公开的表达载体和/或非病毒递送媒介物(例如纳米胶囊)的组合物，包括药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含有效量的至少一种如本文所述的表达载体和/或非病毒递送媒介物以及药学上可接受的载体。例如，在某些实施方案中，药物组合物包含有效量的表达载体以及药学上可接受的载体。本领域的技术人员可基于如受试者体型、体重、年龄、健康状态、性别、种族和病毒滴度等因素容易地确定有效量。
本公开的另一方面是一种药物组合物，该药物组合物包含(a)表达载体，包括编码靶向HPRT1基因的shRNA的核酸序列；以及(b)药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物配制成乳剂。在一些实施方案中，药物组合物配制在胶束内。在一些实施方案中，药物组合物包封在聚合物内。在一些实施方案中，药物组合物包封在脂质体内。在一些实施方案中，药物组合物包封在微细胞或纳米胶囊内。
在一些实施方案中，药物组合物包含(a)纳米胶囊群，每粒纳米胶囊包括适于敲除HPRT的有效载荷(例如Cas9蛋白、Cas12a蛋白、Cas12b蛋白和/或gRNA，如SEQ ID NO:25-39中的任一者的gRNA)；以及(b)药学上可接受的载体。在一些实施方案中，纳米胶囊是聚合物纳米胶囊。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊还包含至少一个靶向部分以促进核糖核蛋白或核糖核蛋白复合体递送至特定类型的细胞。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊聚合物是可侵蚀的或可生物降解的。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊包括pH敏感***联剂。在一些实施方案中，至少一个靶向部分靶向T细胞标记。在一些实施方案中，T细胞标记选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127或FoxP3和CD44。在一些实施方案中，T细胞标记是CD3。在一些实施方案中，T细胞标记是CD28。
在一些实施方案中，药物组合物包含(a)纳米胶囊群，每粒纳米胶囊包括适于敲除HPRT的有效载荷(例如Cas9蛋白、Cas12a蛋白、Cas12b蛋白和/或gRNA，如与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少90％序列同一性、至少91％序列同一性、至少92％序列同一性、至少93％序列同一性、至少94％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性、至少99％序列同一性的gRNA)；以及(b)药学上可接受的载体。在一些实施方案中，纳米胶囊是聚合物纳米胶囊。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊还包含至少一个靶向部分以促进核糖核蛋白或核糖核蛋白复合体递送至特定类型的细胞。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊聚合物是可侵蚀的或可生物降解的。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊包括pH敏感***联剂。在一些实施方案中，至少一个靶向部分靶向T细胞标记。在一些实施方案中，T细胞标记选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127或FoxP3和CD44。在一些实施方案中，T细胞标记是CD3。在一些实施方案中，T细胞标记是CD28。
在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊具有约50nm至约250nm范围内的尺寸。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊具有小于或等于约200纳米(nm)的平均直径。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊具有约1至200nm的平均直径。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊具有约5至约200nm的平均直径。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊具有约10至约150nm、或15至100nm的平均直径。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊具有约15至约150nm的平均直径。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊具有约20至约125nm的平均直径。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊具有约50至约100nm的平均直径。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊具有约50至约75nm的平均直径。在一些实施方案中，纳米胶囊的表面可具有约1至约15毫伏(mV)的电荷(如在标准磷酸盐溶液中所测量)。在其它实施方案中，纳米胶囊的表面可具有约1至约10mV的电荷。
短语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当施用于动物或人时不产生不利的、过敏的、或其它不良反应的分子实体和组合物。例如，表达载体可以与药学上可接受的载体一起配制。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括溶剂、缓冲剂、溶液、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等，它们可接受用于配制药物，如适于施用于人的药物。用药物载体配制化合物的方法在本领域中是已知的，并且描述于例如Remington's Pharmaceutical Science(第17版,Mack Publishing Company,Easton,Pa.1985)；和Goodman&Gillman's:The Pharmacological Basis of Therapeutics(第11版,McGraw-Hill Professional,2005)；其各自的公开内容据此全文以引用方式并入本文。
在一些实施方案中，药物组合物可以包含任何浓度的本文所公开的任何表达载体、纳米胶囊、或组合物，该浓度允许所施用的沉默核酸实现约0.1mg/kg至约1mg/kg范围内的浓度。在一些实施方案中，药物组合物可包含按药物组合物的总重量计约0.1％至约99.9％的量的表达载体。在一些实施方案中，药物组合物可包含按药物组合物的总重量计约0.1％至约90％的量的表达载体。适于包含在任何药物组合物内的药学上可接受的载体包括水、缓冲水、盐水溶液(例如生理盐水或平衡盐水溶液，如Hank's或Earle's平衡溶液)、甘氨酸、透明质酸等。药物组合物可配制用于肠胃外施用，如静脉内、肌内或皮下施用。用于肠胃外施用的药物组合物可包含药学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散液、悬浮液或乳液以及用于重构成无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、溶剂、稀释剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羟甲基纤维素以及它们的混合物、植物油(如橄榄油)、可注射有机酯(例如油酸乙酯)。
药物组合物可配制用于口服施用。用于口服施用的固体剂型可包括例如片剂、糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂。在这样的固体剂型中，组合物可包含至少一种药学上可接受的载体，如柠檬酸钠和/或磷酸二钙和/或填充剂或增量剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；粘结剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和***胶；湿润剂，如甘油；崩解剂，如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、硅酸盐和碳酸钠；润湿剂，如乙酰醇、单硬脂酸甘油酯；吸收剂，如高岭土和膨润土；和/或润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠以及它们的混合物。用于口服给药的液体剂型可包括例如药学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。液体剂型可包括惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和/或乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(例如棉籽油、玉米油、胚芽油、蓖麻油、橄榄油、芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，以及它们的混合物。
药物组合物可包含渗透增强剂以增强它们的递送。渗透增强剂可包括脂肪酸，如油酸、月桂酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、reclineate、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、辛酸、花生四烯酸、1-单癸酸甘油酯、单和双甘油酯以及它们的生理学上可接受的盐。组合物还可包括螯合剂，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(例如水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸盐、高香草酸盐(homovanilate))。
药物组合物可包含包封形式的本文所公开的任何表达载体。例如，表达载体可以被可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯、聚(原酸酯)和聚(酸酐)包封，或者可以被包封在脂质体中或分散在微乳剂内。脂质体可以是例如脂质体或脂质体载体。在另一实例中，组合物可在无核细菌微细胞之中或之上包含本文所公开的表达载体(Giacalone等人,CellMicrobiology 2006,8(10):1624-33)。本文所公开的表达载体可以与纳米颗粒组合。
稳定的生产者细胞系
本公开的另一方面是用于生成病毒滴度的稳定生产者细胞系，其中稳定生产者细胞系衍生自GPR、GPRG、GPRT、GPRGT、或GPRT-G包装细胞系之一。在一些实施方案中，稳定生产者细胞系衍生自GPRT-G细胞系。在一些实施方案中，稳定生产者细胞系通过如下方式生成：(a)通过至少将编码抗HPRT shRNA的核酸序列克隆到重组质粒中来合成表达载体(即，合成的载体可为本文所述的载体中的任一种)；(b)从合成的载体生成DNA片段；(c)由(i)从合成的载体生成的DNA片段，和(ii)衍生自抗生素抗性盒质粒的DNA片段形成多联阵列；(d)用所形成的多联阵列转染包装细胞系之一；以及(e)分离稳定生产者细胞系。形成稳定生产者细胞系的额外方法公开于2016年5月12日提交的国际申请No.PCT/US2016/031959，其公开内容据此全文以引用方式并入本文。
试剂盒
在一些实施方案中是包含表达载体或含有如本文所述的表达载体的组合物的试剂盒。试剂盒可包括容器，其中容器可以是包含口服或肠胃外剂型的表达载体或组合物的瓶，每个剂型包含单位剂量的表达载体。试剂盒可包含标签等，其指示根据本文所述的方法对受试者进行的治疗。同样，在其它实施方案中是包含组合物的试剂盒，该组合物包含含有如本文所述适于敲除HPRT的有效载荷的纳米胶囊群。
在一些实施方案中，试剂盒可包括额外的活性剂。额外的活性剂可容纳在与容纳载体或包含载体的组合物的容器分开的容器中。例如，在一些实施方案中，试剂盒可包含一个或多个剂量的嘌呤类似物(例如6-TG或6-MP)和任选地给予用于调理和/或化学选择的嘌呤类似物的说明书(如本文进一步描述的那些步骤)。在其它实施方案中，试剂盒可包含一个或多个剂量的MTX或MPA以及任选地给予用于如本文所述的负选择的MTX或MPA的说明书。
基本HPRT缺陷型淋巴细胞(“经修饰淋巴细胞”)的制备
在本公开的一个方面是一种产生HPRT缺陷型淋巴细胞，例如T细胞(本文也称为“经修饰淋巴细胞”或“经修饰T细胞”)的方法。参考图11，首先从供体收集宿主细胞，即淋巴细胞(例如T细胞)(步骤110)。在造血干细胞(HSC)也从供体收集的实施方案中，可以从收集HSC移植物的同一供体或不同供体收集淋巴细胞，例如T细胞。在这些实施方案中，可以在与用于HSC移植物的细胞相同的时间或不同的时间收集细胞。在一些实施方案中，从相同的动员后外周血HSC收获物中收集细胞。在一些实施方案中，这可为CD34阴性级分(按照供体移植物护理标准收集的CD34阳性细胞)，或者CD34阳性HSC移植物的一部分(如果设想祖T细胞移植物)。
技术人员将理解，可以通过任何方式收集细胞。例如，可以通过血液分离术、白细胞除去术、或仅通过简单的静脉取血来收集细胞。在与用于修饰的细胞同时收集HSC移植物的实施方案中，将HSC移植物冷冻保存，以便允许留出时间来操作和测试收集的淋巴细胞，例如T细胞。T细胞的非限制性实例包括T辅助性T细胞(例如Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Tfh)、调节性T细胞、自然杀伤T细胞、γδT细胞和细胞毒性淋巴细胞(CTL)。
收集细胞后，分离淋巴细胞，例如T细胞(步骤120)。可以通过本领域的普通技术人员已知的任何方式从收集的细胞聚集体中分离淋巴细胞，例如T细胞。例如，可以经由CD3微珠和MACS分离***(Miltenyi Biotec)从收集的细胞中分离CD3+细胞。据信CD3标记在所有T细胞上表达，并且与T细胞受体相关。据信约70％至约80％的人外周血淋巴细胞和约65％–85％的胸腺细胞是CD3+。在一些实施方案中，用CD3微珠磁性标记CD3+细胞。然后，将细胞悬浮液加载到置于MACS分离器磁场中的MACS柱上。磁性标记的CD3+细胞保留在柱上。未标记的细胞穿过，并且该细胞级分的CD3+细胞已耗竭。从磁场中移除柱后，磁性保留的CD3+细胞可以作为正选择的细胞级分被洗脱。
或者，可以经由IBA life sciences CD62L Fab Streptamer分离试剂盒从收集的细胞中分离CD62L+T细胞。通过正选择执行人CD62L+T细胞的分离。用磁性CD62L FabStreptamers标记PBMC。在强磁体中分离标记的细胞，其中它们向磁体一侧的管壁迁移。收集该CD62L阳性细胞级分，通过在强磁体中加入生物素从所有标记试剂中释放细胞。磁性Streptamers向管壁迁移，无标记细胞保留在上清液中。通过洗涤移除生物素。所得的细胞制剂高度富集了CD62L+T细胞，纯度超过90％。不需要耗竭步骤且不需要柱。
在替代的实施方案中，在步骤120不分离淋巴细胞，例如T细胞，而是将在步骤110收集的细胞聚集体用于后续修饰。虽然在一些实施方案中，细胞聚集体可用于后续修饰，但在一些情况下，修饰方法可以是总细胞聚集体内的特定细胞群特异性的。这能够以多种方式完成；例如，通过靶向性基因载体递送将遗传修饰靶向特定细胞类型，或者通过将例如抗HPRT的shRNA的表达靶向特定细胞类型(即T细胞)。
在分离T细胞后，处理T细胞以降低HPRT活性(步骤130)，即，降低HPRT1基因的表达。例如，T细胞可处理成使得它们具有约50％或更少的残留HPRT1基因表达、约45％或更少的残留HPRT1基因表达、约40％或更少的残留HPRT1基因表达、约35％或更少的残留HPRT1基因表达、约30％或更少的残留HPRT1基因表达、约25％或更少的残留HPRT1基因表达、约20％或更少的残留HPRT1基因表达、约15％或更少的残留HPRT1基因表达、约10％或更少的残留HPRT1基因表达、或约5％或更少的残留HPRT1基因表达。
可以根据几种方法修饰淋巴细胞，例如T细胞。在一些实施方案中，可以通过用如本文所述的编码靶向HPRT1基因的shRNA的表达载体(例如慢病毒载体)转导来修饰T细胞。例如，表达载体可包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2、5、6和7中的任一者的序列具有至少90％同一性。作为另一个实例，表达载体可包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:8、9、10和11中的任一者的序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，表达载体包封在纳米胶囊内。
在一些实施方案中，表达载体可包括编码内切核酸酶的第一核酸序列以及编码指导RNA的第二核酸序列。在一些实施方案中，第一核酸序列编码Cas9。在一些实施方案中，第一核酸序列编码Cas12a。在一些实施方案中，第一核酸序列编码Cas12b。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少91％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少92％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ IDNO:25-39中的任一者具有至少93％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少94％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少95％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少96％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少97％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ IDNO:25-39中的任一者具有至少98％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少99％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码具有SEQ ID NO:25-39中的任一者的指导RNA。
在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少91％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少92％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少93％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少94％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少95％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少96％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少97％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少98％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少99％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，第二核酸序列编码具有SEQ ID NO:40-61中的任一者的指导RNA。
在一些实施方案中，淋巴细胞(例如T细胞)可通过用内切核酸酶和指导RNA转染进行修饰。在一些实施方案中，淋巴细胞(例如T细胞)可通过用包括内切核酸酶和指导RNA的颗粒转染进行修饰。在一些实施方案中，淋巴细胞(例如T细胞)可通过用包括适于敲除HPRT的有效载荷的纳米胶囊转染来修饰，即，基因编辑方法可以用于敲除HPRT。在一些实施方案中，淋巴细胞(例如T细胞)可通过用包括适于敲除HPRT的有效载荷的靶向纳米胶囊转染来修饰，即，基因编辑方法可以用于敲除HPRT。
例如，可以用如本文所述的靶向HPRT的CRISPR/Cas9 RNP、CRISPR/Cas12a RNP、或CRISPR/Cas12b RNP处理T细胞。在一些实施方案中，纳米胶囊可包括与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA。在其它实施方案中，纳米胶囊可包括与SEQID NO:25-39中的任一者具有至少95％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，纳米胶囊可包括与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA。在其它实施方案中，纳米胶囊可包括与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少95％序列同一性的指导RNA。
在步骤130修饰T细胞后，选择和/或扩增HPRT缺陷型T细胞群(步骤140)。在一些实施方案中，培养物可同时选择和扩增具有增强的植入能力的细胞(例如，中枢记忆或T干细胞表型)。在一些实施方案中，培养期少于14天。在一些实施方案中，培养期少于7天。
在一些实施方案中，选择和扩增细胞的步骤包括用鸟苷类似物抗代谢物(例如6-硫鸟嘌呤(6-TG)、6-巯嘌呤(6-MP)、或咪唑硫嘌呤(AZA))离体处理HPRT缺陷型(或基本HPRT缺陷型)淋巴细胞(例如T细胞)群。在一些实施方案中，在6-硫鸟嘌呤(“6-TG”)存在下培养淋巴细胞(例如T细胞)，从而杀死在步骤130未修饰的细胞。6-TG是可以干扰细胞中dGTP生物合成的鸟嘌呤类似物。可将Thio-dG在复制期间引入DNA中代替鸟嘌呤，并且当引入时，通常变成甲基化。这种甲基化可干扰正确的错配DNA修复，并可导致细胞周期停滞和/或引发凋亡。由于其对快速***细胞的毒性，6-TG已经在临床上用于治疗患有某些类型的恶性肿瘤的患者。在6-TG的存在下，HPRT是负责将6-TG整合到细胞中的DNA和RNA中的酶，导致正确的多核苷酸合成和代谢的阻断(参见图18)。另一方面，挽救途径在HPRT缺陷型细胞中被阻断(参见图18)。因此，细胞使用从头途径进行嘌呤合成(参见图17)。然而，在HPRT野生型细胞中，细胞使用挽救途径，并且在HPRT存在下将6-TG转化为6-TGMP。6-TGMP通过磷酸化转化为硫鸟嘌呤二磷酸(TGDP)和硫鸟嘌呤三磷酸(TGTP)。同时，经由酶核糖核苷酸还原酶形成脱氧核糖类似物。鉴于6-TG具有高细胞毒性，其可以用作选择剂以杀死具有功能性HPRT酶的细胞。
然后将所生成的HPRT缺陷型细胞与嘌呤类似物离体接触。对于敲低方法，据信在细胞中仍然可能存在残留的HPRT，并且HPRT敲低细胞可以耐受一定范围的嘌呤类似物，但在高剂量/量下会被杀死。在该情况下，用于离体选择的嘌呤类似物的浓度在约15μM至约200nM的范围内。在一些实施方案中，用于离体选择的嘌呤类似物的浓度在约10μM至约50nM的范围内。在一些实施方案中，用于离体选择的嘌呤类似物的浓度在约5μM至约50nM的范围内。在一些实施方案中，浓度在约2.5μM至约10nM的范围内。在其它实施方案中，浓度在约2μM至约5nM的范围内。在另一些实施方案中，浓度在约1μM至约1nM的范围内。
对于敲除方法，据信可以从HPRT敲除细胞中完全消除或几乎完全消除HPRT，并且所生成的HPRT缺陷型细胞将对嘌呤类似物高度耐受。在一些实施方案中，在这种情况下，用于离体选择的嘌呤类似物的浓度在约200μM至约5nM的范围内。在一些实施方案中，在这种情况下，用于离体选择的嘌呤类似物的浓度在约100μM至约20nM的范围内。在一些实施方案中，浓度在约80μM至约10nM的范围内。在其它实施方案中，浓度在约60μM至约10nM的范围内。在另一些实施方案中，浓度在约40μM至约20nM的范围内。
在其它实施方案中，细胞的修饰(例如通过HPRT的敲低或敲除)可有效到足以使得不需要对HPRT缺陷型细胞进行离体选择，即，不需要用6-TG或其它类似化合物进行选择。
在一些实施方案中，将所生成的HPRT缺陷型细胞与嘌呤类似物和别嘌呤醇接触，别嘌呤醇是黄嘌呤氧化酶(XO)的抑制剂。通过抑制XO，更多可用的6-TG被HPRT代谢。当6-TG被HPRT代谢时，其形成6-TGN，这是对细胞有毒的代谢物(6-TGN涵盖单磷酸酯(6-TGMP)、二磷酸酯(6-TGDP)和三磷酸酯(6-TGTP))(参见图14)(参见例如Curkovic等人,Lowallopurinol doses are sufficient to optimize azathioprine therapy ininflammatory bowel disease patients with inadequate thiopurine metaboliteconcentrations.Eur J Clin Pharmacol.2013年8月；69(8):1521-31；Gardiner等人,Allopurinol might improve response to azathioprine and 6-mercaptopurine bycorrecting an unfavorable metabolite ratio.J Gastroenterol Hepatol.2011年1月；26(1):49-54；Seinen等人,The effect of allopurinol and low-dose thiopurinecombination therapy on the activity of three pivotal thiopurine metabolizingenzymes:results from a prospective pharmacological study.J CrohnsColitis.2013年11月；7(10):812-9；和Wall等人,Addition of Allopurinol forAltering Thiopurine Metabolism to Optimize Therapy in Patients withInflammatory Bowel Disease.Pharmacotherapy.2018年2月；38(2):259-270，每者的公开内容据此全文以引用方式并入本文)。
在一些实施方案中，在引入嘌呤类似物之前将别嘌呤醇引入到所生成的HPRT缺陷型细胞。在其它实施方案中，在引入嘌呤类似物的同时将别嘌呤醇引入到所生成的HPRT缺陷型细胞。在另一些实施方案中，在引入嘌呤类似物之后将别嘌呤醇引入到所生成的HPRT缺陷型细胞。
在选择和扩增后，测试经修饰淋巴细胞(例如T细胞)产物。在一些实施方案中，根据标准释放来测试经修饰淋巴细胞(例如T细胞)产物(例如活性、支原体、活力、稳定性、表型等；参见Molecular Therapy:Methods&Clinical Development第4卷,2017年3月,92-101，其公开内容据此全文以引用方式并入本文)。
在其它实施方案中，测试经修饰淋巴细胞(例如T细胞)产物对二氢叶酸还原酶抑制剂(例如MTX或MPA)的敏感性。据信二氢叶酸还原酶抑制剂(包括MTX和MPA两者)抑制嘌呤的从头合成，但具有不同的作用机制。例如，据信MTX竞争性抑制二氢叶酸还原酶(DHFR)，这是一种参与四氢叶酸(THF)合成的酶。DHFR催化二氢叶酸转化为活性四氢叶酸。DNA合成所需的胸腺嘧啶核苷的从头合成需要叶酸。而且，叶酸是嘌呤和嘧啶碱基生物合成所必需，因此合成会受到抑制。麦考酚酸(MPA)是肌苷-5′-单磷酸脱氢酶(IMPDH)(即由肌苷-5'-单磷酸(IMP)从头合成鸟苷-5'-单磷酸(GMP)所必需的酶)的有效、可逆、非竞争性的抑制剂。
因此，二氢叶酸还原酶抑制剂(包括MTX或MPA两者)抑制DNA、RNA、胸苷酸和蛋白质的合成。MTX或MPA通过抑制DHFR阻断从头途径。在HPRT-/-细胞中，不存在挽救或从头途径功能，导致没有嘌呤合成，因此细胞死亡。然而，HPRT野生型细胞具有功能性挽救途径，它们的嘌呤合成发生并且细胞存活。在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞(例如T细胞)是基本HPRT缺陷型。在一些实施方案中，至少约70％的经修饰淋巴细胞(例如T细胞)群对MTX或MPA敏感。在一些实施方案中，至少约75％的经修饰淋巴细胞(例如T细胞)群对MTX或MPA敏感。在一些实施方案中，至少约80％的经修饰淋巴细胞(例如T细胞)群对MTX或MPA敏感。在一些实施方案中，至少约85％的经修饰淋巴细胞(例如T细胞)群对MTX或MPA敏感。在其它实施方案中，至少约90％的经修饰淋巴细胞(例如T细胞)群对MTX或MPA敏感。在另一些实施方案中，至少约95％的经修饰淋巴细胞(例如T细胞)群对MTX或MPA敏感。在另一些实施方案中，至少约97％的经修饰淋巴细胞(例如T细胞)群对MTX或MPA敏感。
在一些实施方案中，可使用替代试剂来代替MTX或MPA，包括但不限于利巴韦林(ribavarin)(IMPDH抑制剂)；VX-497(IMPDH抑制剂)(参见Jain J,VX-497:a novel,selective IMPDH inhibitor and immunosuppressive agent,J Pharm Sci.2001年5月；90(5):625-37)；洛美曲索(DDATHF，LY249543)(GAR和/或AICAR抑制剂)；噻吩类似物(LY254155)(GAR和/或AICAR抑制剂)、呋喃类似物(LY222306)(GAR和/或AICAR抑制剂)(参见Habeck等人,A Novel Class of Monoglutamated Antifolates Exhibits Tight-binding Inhibition of Human Glycinamide Ribonucleotide Formyltransferase andPotent Activity against Solid Tumors,Cancer Research 54,1021-2026,1994年2月)；DACTHF(GAR和/或AICAR抑制剂)(参见Cheng等人,Design,synthesis,and biologicalevaluation of 10-methanesulfonyl-DDACTHF,10-methanesulfonyl-5-DACTHF,and10-methylthio-DDACTHF as potent inhibitors of GAR Tfase and the de novo purinebiosynthetic pathway；Bioorg Med Chem.2005年5月,16；13(10):3577-85)；AG2034(GAR和/或AICAR抑制剂)(参见Boritzki等人,AG2034:a novel inhibitor of glycinamideribonucleotide formyltransferase,Invest New Drugs.1996；14(3):295-303)；LY309887(GAR和/或AICAR抑制剂)((2S)-2-[[5-[2-[(6R)-2-氨基-4-氧代-5,6,7,8-四氢-1H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基]乙基]噻吩-2-羰基]氨基]戊二酸)；力比泰(LY231514)(GAR和/或AICAR抑制剂)(参见Shih等人,LY231514,a pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-basedantifolate that inhibits multiple folate-requiring enzymes,Cancer Res.1997年3月15日；57(6):1116-23)；dmAMT(GAR和/或AICAR抑制剂)、AG2009(GAR和/或AICAR抑制剂)；呋咯地辛(Immucillin H，BCX-1777；商品名Mundesine和Fodosine)(嘌呤核苷磷酸化酶[PNP]抑制剂)(参见Kicska等人,Immucillin H,a powerful transition-state analoginhibitor of purine nucleoside phosphorylase,selectively inhibits human Tlymphocytes(T-cells),PNAS,2001年4月10日.98(8)4593-4598)；和immucillin-G(嘌呤核苷磷酸化酶[PNP]抑制剂)。
鉴于根据步骤110至140产生的经修饰T细胞对MTX或MPA的敏感性，MTX或MPA(或另一种二氢叶酸还原酶抑制剂)可用于选择性消除如本文所述的HPRT缺陷型细胞。在一些实施方案中，MTX或MPA的类似物或衍生物可以取代MTX或MPA。MTX的衍生物描述于美国专利No.5,958,928和PCT公开No.WO/2007/098089中，其公开内容据此全文以引用方式并入本文。
治疗方法
在一些实施方案中，将根据步骤110至140制备的经修饰淋巴细胞(例如T细胞)施用于患者(步骤150)。在一些实施方案中，将经修饰淋巴细胞(例如T细胞)(或如本文所述的CAR T细胞或TCR T细胞)以单次施用(例如，单次推注，或例如在设定的时间段内施用，以及例如在约1至4小时或更久内输注)提供给患者。在其它实施方案中，进行经修饰淋巴细胞(例如T细胞)的多次施用。如果施用多剂量的经修饰淋巴细胞(例如T细胞)，则每个剂量可以相同或不同(例如，递增剂量、递减剂量)。
在一些实施方案中，经修饰T细胞的剂量的量基于CD3阳性T细胞含量/kg受试者体重来确定。在一些实施方案中，经修饰T细胞的总剂量在约0.1×106/kg体重至约730×106/kg体重的范围内。在其它实施方案中，经修饰T细胞的剂量在约1×106/kg体重至约500×106/kg体重的范围内。在另一些实施方案中，经修饰T细胞的剂量在约1×106/kg体重至约400×106/kg体重的范围内。在进一步实施方案中，经修饰T细胞的剂量在约1×106/kg体重至约300×106/kg体重的范围内。在还进一步实施方案中，经修饰T细胞的剂量在约1×106/kg体重至约200×106/kg体重的范围内。
当提供多剂量时，给予频率可在约1周至约36周的范围内。同样，在提供多剂量的情况下，经修饰T细胞的每个剂量在约0.1×106/kg体重至约240×106/kg体重的范围内。在其它实施方案中，经修饰T细胞的每个剂量在约0.1×106/kg体重至约180×106/kg体重的范围内。在其它实施方案中，经修饰T细胞的每个剂量在约0.1×106/kg体重至约140×106/kg体重的范围内。在其它实施方案中，经修饰T细胞的每个剂量在约0.1×106/kg体重至约100×106/kg体重的范围内。在其它实施方案中，经修饰T细胞的每个剂量在约0.1×106/kg体重至约60×106/kg体重的范围内。其它给予策略描述于Gozdzik J等人,Adoptive therapywith donor lymphocyte infusion after allogenic hematopoietic SCT in pediatricpatients,Bone Marrow Transplant,2015年1月；50(1):51-5，其公开内容据此全文以引用方式并入本文。
经修饰淋巴细胞(例如T细胞)可以单独地或作为总体治疗策略的一部分施用。在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞(例如T细胞)在HSC移植物后施用，如HSC移植后约2至约4周。例如，在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞(例如T细胞)在施用HSC移植物后施用，以助于预防或减轻移植后免疫缺陷。据信经修饰淋巴细胞(例如T细胞)可提供短期(例如，约3至约9个月)的免疫重建和/或保护。作为另一个实例，并且在其它实施方案中，经修饰淋巴细胞(例如T细胞)作为癌症疗法的一部分施用，以助于诱导移植物抗恶性肿瘤(GVM)效应或移植物抗肿瘤(GVT)效应。作为另一个实例，经修饰T细胞是CAR-T细胞或TCR修饰的T细胞，其是HPRT缺陷型的，并且其作为癌症治疗策略的一部分施用。本文更详细地描述了根据这些治疗途径中的每一种施用经修饰淋巴细胞(例如T细胞)。当然，技术人员将理解，任何潜在病症的其它治疗可以发生在施用经修饰淋巴细胞(例如T细胞)之前、之后或同时。
向患者施用淋巴细胞(例如T细胞)可导致不希望的副作用，包括本文所叙述的那些。例如，移植物抗宿主病可以在用淋巴细胞(包括经修饰T细胞(例如经由敲低或敲除HPRT))治疗患者后发生。在本公开的一些方面，在施用经修饰淋巴细胞(例如T细胞)后，在步骤150，监测患者的任何副作用的发作，包括但不限于GvHD。如果出现任何副作用，如GvHD(或GvHD的症状)，在步骤160将MTX或MPA施用于患者(体内)以除去经修饰淋巴细胞(例如T细胞)的至少一部分，以致力于抑制、减少、控制、或以其它方式减轻副作用，例如GvHD。在一些实施方案中，MTX或MPA以单剂量施用。在其它实施方案中，施用MTX和/或MPA的多剂量。
据信，鉴于本公开的经修饰淋巴细胞(例如T细胞)(一旦离体选择并施用于患者或哺乳动物受试者)对二氢叶酸还原酶抑制剂(包括MTX或MPA两者)的敏感性，其可以充当可调节的“开”/“关”开关。可调节开关允许通过向出现任何副作用的患者施用MTX来在体内选择性杀伤经修饰淋巴细胞(例如T细胞)的至少一部分，调节免疫***重建。这种可调节开关可以通过在MTX施用后向患者进一步施用经修饰淋巴细胞(例如T细胞)来进一步调节，以允许在副作用减少或以其它方式减轻后进一步的免疫***重建。同样，可调节开关允许如果出现任何副作用，通过施用MTX来在体内选择性杀伤经修饰淋巴细胞(例如T细胞)的至少一部分，调节移植物抗恶性肿瘤效应。同样，一旦副作用减少或以其它方式减轻，可以通过随后向患者进一步给予经修饰淋巴细胞(例如T细胞)的等分试样来微调GVM效应。这种相同的原理适用于CAR-T细胞疗法或用TCR修饰的T细胞的疗法，其中同样可通过MTX施用将CAR-T细胞或TCR修饰的T细胞选择性地开/关。有鉴于此，本领域的普通技术人员将理解，任何监督患者治疗的医学专业人员可以平衡免疫***重建和/或GVM效应，同时避免副作用或将副作用保持在可容忍或可接受的范围内。凭借以上，可以增强患者治疗，同时减轻副作用。
在一些实施方案中，所施用的MTX的量在约2mg/m2/输注至约100mg/m2/输注的范围内。在一些实施方案中，所施用的MTX的量在约2mg/m2/输注至约90mg/m2/输注的范围内。在一些实施方案中，所施用的MTX的量在约2mg/m2/输注至约80mg/m2/输注的范围内。在一些实施方案中，所施用的MTX的量在约2mg/m2/输注至约70mg/m2/输注的范围内。在一些实施方案中，所施用的MTX的量在约2mg/m2/输注至约60mg/m2/输注的范围内。在一些实施方案中，所施用的MTX的量在约2mg/m2/输注至约50mg/m2/输注的范围内。在一些实施方案中，所施用的MTX的量在约2mg/m2/输注至约40mg/m2/输注的范围内。在一些实施方案中，所施用的MTX的量在约2mg/m2/输注至约30mg/m2/输注的范围内。在一些实施方案中，所施用的MTX的量在约20mg/m2/输注至约20mg/m2/输注的范围内。在一些实施方案中，所施用的MTX的量在约2mg/m2/输注至约10mg/m2/输注的范围内。在一些实施方案中，所施用的MTX的量在约2mg/m2/输注至约8mg/m2/输注的范围内。在其它实施方案中，所施用的MTX的量在约2.5mg/m2/输注至约7.5mg/m2/输注的范围内。在另一些实施方案中，所施用的MTX的量为约5mg/m2/输注。在另一些实施方案中，所施用的MTX的量为约7.5mg/m2/输注。
在一些实施方案中，进行2至6次输注，并且输注可各自包含相同剂量或不同剂量(例如，递增剂量、递减剂量等)。在一些实施方案中，可以每周或每两个月进行施用。
在另一些实施方案中，MTX的量滴定施用成使得不受控制的副作用(例如GvHD)得到解决，同时保留至少一些经修饰淋巴细胞(例如T细胞)，以及它们对重建免疫***、靶向癌症、或诱导GVM效应的伴随效应。就这一点而言，据信仍然可被认识到经修饰淋巴细胞(例如T细胞)的至少一些益处，同时改善副作用，例如GvHD。在一些实施方案中，在用MTX治疗后，即在消除、遏制、或控制副作用(例如GvHD)后，施用额外的经修饰淋巴细胞(例如T细胞)。
在一些实施方案中，受试者在施用经修饰淋巴细胞(例如T细胞)之前接受一定剂量的MTX，以便控制或预防HSC移植后的副作用。在一些实施方案中，在施用经修饰淋巴细胞(例如T细胞)之前停止现有的MTX治疗，然后在用经修饰淋巴细胞(例如T细胞)治疗后副作用发作时，以相同或不同的剂量(并使用相同或不同的给予计划表)继续。就这一点而言，技术人员可以根据需要并且与医疗行业已知的护理标准一致地施用MTX。
额外的治疗策略
图19A和B示出了一种在症状发作时减少、遏制、或控制GvHD的方法。最初，在步骤210从供体收集细胞。可以从提供HSC用于移植的同一供体(参见步骤260)或从不同供体收集细胞。然后，从收集的细胞中分离淋巴细胞(步骤220)并进行处理，使得它们成为HPRT缺陷型(步骤230)(即，经由敲低或敲除HPRT)。本文阐述了处理分离的细胞的方法。为了达到基本HPRT缺陷型的经修饰淋巴细胞群(例如T细胞)，将处理的细胞正选择并扩增(步骤240)，如本文所述。然后将经修饰淋巴细胞(例如T细胞)储存备用。在接受HSC移植物之前(步骤260)，按照护理标准用清髓性调理治疗患者(步骤250)(例如高剂量调理辐射、化疗和/或用嘌呤类似物治疗)；或低剂量调理辐射、化疗和/或用嘌呤类似物治疗)。在一些实施方案中，在用调理方案治疗后约24至约96小时用HSC移植物治疗患者(步骤260)。
图20示出了一种在症状发作时减少、遏制、或控制GvHD的方法。最初，在步骤310从供体收集细胞。可以从提供HSC用于移植的同一供体(参见步骤335)或从不同供体收集细胞。然后，从收集的细胞中分离淋巴细胞(步骤320)并进行处理，使得它们成为HPRT缺陷型(步骤330)。本文阐述了处理分离的细胞的方法。为了达到基本HPRT缺陷型的经修饰淋巴细胞群(例如T细胞)，将处理的细胞选择并扩增(步骤340)，如本文所述。然后将经修饰淋巴细胞(例如T细胞)储存备用。可以在癌症出现和分期时根据患者可用的护理标准(例如，辐射和/或化疗，包括生物制剂)治疗患有癌症(例如血液学癌症)的患者(步骤315)。患者也可以是HSC移植的候选者，如果这样，则实施调理方案(步骤325)(例如，通过高剂量调理辐射或化疗)。据信对于恶性肿瘤，在一些实施方案中，希望完全或尽可能接近完全地“清除”血液***，从而杀伤尽可能多的恶性细胞。这种调理方案的目的是集中治疗癌细胞，从而使癌症复发不太可能，使免疫***失活以减少干细胞移植物排斥的机会，并使供体细胞能够进入骨髓。在一些实施方案中，调理包括施用环磷酰胺、阿糖胞苷(AraC)、依托泊苷、美法仑、白消安、或高剂量全身辐射中的一种或多种。然后用同种异体HSC移植物治疗患者(步骤335)。在一些实施方案中，同种异体HSC移植物诱导至少部分GVM、GVT、或GVL效应。移植后，监测患者(步骤350)的残留或复发疾病。如果这种残留或复发的疾病本身出现，则将经修饰淋巴细胞(例如T细胞)(在步骤340产生)施用于患者(步骤360)，从而可以诱导GVM、GVT、或GVT效应。经修饰淋巴细胞(例如T细胞)可以在若干次施用的疗程内以单次施用输注。在一些实施方案中，在HSC移植物后约1天至约21天施用经修饰淋巴细胞(例如T细胞)。在一些实施方案中，在HSC移植物后约1天至约14天施用经修饰T细胞。在一些实施方案中，在HSC移植物后约1天至约7天施用经修饰淋巴细胞(例如T细胞)。在一些实施方案中，在HSC移植物后约2天至约4天施用经修饰淋巴细胞(例如T细胞)。在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞(例如T细胞)与HSC移植物同时或在HSC移植物的数小时内(例如HSC移植物后1、2、3或4小时)施用。
本公开的另一方面是通过向对其有治疗需要的患者施用经修饰CAR T细胞来治疗患有癌症的患者的方法，经修饰CAR T细胞是HPRT缺陷型。图21示出一种治疗患有癌症的患者并随后减少、遏制、或控制任何有害副作用的方法。最初，在步骤410从供体收集细胞。然后，从收集的细胞中分离淋巴细胞(步骤420)并修饰以提供HPRT缺陷型的CAR T细胞。
实施例
实施例1——用6-TG选择的HPRT敲低与敲除
在第零(0)天，将K562细胞用包括设计成敲低HPRT的核酸序列和编码绿荧光蛋白(GFP)的核酸序列的表达载体转导(MOI＝1/2/5)；或者用包括CRISPR/Cas9和用于敲除HPRT的sgRNA的纳米胶囊转染(100ng/5×104个细胞)。从第3天至第14天，向培养基中添加6-TG。每3至4天更新培养基。在流式仪上分析GFP，并且用T7E1测定分析***缺失％。图12A示出了在6-TG处理下，转导的K562细胞的GFP+群体从第3天至第14天增加；而GFP+群体在没有处理的情况下几乎是稳定的。图12B示出了在用6-TG处理下，K562细胞的HPRT敲除群体从第3天至第14天增加，并且与300/600nM的6-TG剂量相比，更高剂量(900nM)的6-TG导致更快的选择。应当指出的是，在300nM的6-TG相同浓度下，从第3天至第14天，与HPRT敲低细胞(MOI＝1)相比，在HPRT敲除细胞上6-TG选择过程发生得更快。敲低与敲除之间的差异可以由与通过敲除方法完全消除HPRT相比，通过RNAi敲低方法的一些水平的残留HPRT来解释(另参见图22)。因此，与HPRT敲低细胞相比，据信HPRT敲除细胞对6-TG具有高得多的耐受性，并且据信在较高剂量的6-TG(900nM)下生长得更快。
在第0天，将CEM细胞用包括设计成敲低HPRT的核酸序列和编码绿荧光蛋白的核酸序列的表达载体转导，或者用包括CRISPR/Cas9和针对HPRT的sgRNA的纳米胶囊转染。从第3天至第17天，向培养基中添加6-TG。每3至4天更新培养基。在流式仪上分析GFP，并且用T7E1测定分析***缺失％。图13A示出了在6-TG处理下，转导的K562细胞的GFP+群体从第3天至第17天增加，而GFP+群体几乎稳定无增加。图13B显示了在6-TG处理下，CEM细胞的HPRT敲除群体从第3天至第17天增加，并且与300/600nM的6-TG剂量相比，较高剂量(900nM)的6-TG导致更快的选择。应当指出的是，在相同浓度的6-TG下，从第3天至第17天，6-TG选择过程在HPRT敲除细胞上发生得比HPRT敲低细胞(MOI＝1)更快。
实施例2——用MTX或MPA进行负选择
从第0天至第14天，在具有或不具有MTX的情况下培养转导或转染的K562细胞(如来自实施例1的那些)。每3至4天更新培养基。在流式仪上分析GFP，并且通过T7E1测定分析***缺失％。图14A显示了在0.3μM的MTX处理下，转导的K562细胞的GFP-群体减少。另一方面，在不具有MTX情况下，细胞群是稳定的。图14B示出了与HPRT敲低群体相比，在用0.3μM的MTX处理下，以更快的速度消除转染的K562细胞。
从第0天至第14天，在具有或不具有MTX的情况下培养转导或转染的CEM细胞(如来自实施例1的那些)。每3至4天更新培养基。在流式仪上分析GFP，并且通过T7E1测定分析***缺失％。图15A显示了在1μM的MPA或0.3μM的MTX或10μM的MPA处理下，转导的K562的GFP-群体减少，而未处理组的细胞群是稳定的。图15B示出了在1μM的MPA或0.3μM的MTX或10μM的MPA的处理下，以更快的速度消除CEM细胞的HPRT敲除群体。
实施例3——用MTX对K562细胞进行负选择
将K562细胞用以下转导：(i)稀释因子为16的TL20cw-GFP病毒汤，(ii)稀释因子为16的TL20cw-Ubc/GFP-7SK/sh734病毒汤(其顺序编码GFP和设计用于敲低HPRT的shRNA)；或(iii)稀释因子为16的TL20cw-7SK/sh734-UBC/GFP病毒汤(其顺序编码设计用于敲低HPRT的shRNA和GFP)(参见图16)。还通过稀释因子为1024的TL20cw-7SK/sh734-UBC/GFP病毒汤(其编码核酸，该核酸编码设计用于敲低HPRT的shRNA)转导K562细胞(也显示于图16)。转导后三天，用含有0.3μM的MTX的培养基培养所有细胞。如图16所示，从大于90％的GFP+群体开始，GFP或GFP-sh734转导的细胞没有显示GFP+群体的减少，而sh734-GFP-转导的细胞显示GFP+群体的取消选择(deselection)(在高稀释(1024)和低稀释(16)水平两者下)。测量sh734-GFP转导的细胞和GFP-sh734转导的细胞的每个载体拷贝数(VCN)的相对sh734表达。结果表明甲氨蝶呤只能取消选择用sh734-高表达慢病毒载体(TL20cw-7SK/sh734-UBC/GFP)而非用sh734-低表达慢病毒载体(TL20cw-UBC/GFP-7SK/sh734)转导的细胞。本实施例展示了不同的载体设计(甚至具有相同shRNA的那些)对shRNA发夹的表达有影响，并且可用于确定是否可通过用MTX处理来选择转导的细胞。
实施例4——经修饰T细胞的转染/转导、选择和扩增
使用源于散装血沉棕黄包(Australian Red Cross Blood Service)的外周血单核细胞(PBMC)进行原代人T细胞纯化，使得富集足够数量的T细胞用于下游应用。将剩余的细胞冷冻保存用于未来的T细胞功能分析，如评估应答同种异体抗原的T细胞增殖。在体外用固定化抗CD3和重组人(rh)IL-2刺激纯化T细胞(按照目前公开的方案Prommersberger等人,Antibody-Based CAR T Cells Produced by Lentiviral Transduction,CurrentProtocols,2020年3月,e93,https://doi.org/10.1002/cpim.93)48小时，然后用慢病毒转导，或者用含DNA的纳米颗粒转染，用于HPRT1基因的修饰。培养这些经修饰T细胞(2-3天)，然后在rhIL-2存在下进一步扩增多至14天。在整个培养条件中，收集样品用于评估已成功经历基因修饰的细胞的比例，如通过检测荧光示踪剂(例如GFP)以及用于检测HPRT1基因表达水平的定量RT-PCR(qPCR)所测定。
在基因修饰后14天，使用6-硫鸟嘌呤(6-TG)进行基因修饰的T细胞的选择，以评估负选择所有未经修饰的T细胞所需的剂量。6-TG剂量的滴定还将允许评估对该选择方法的潜在供体依赖性敏感性，以及这可能如何与已知的对嘌呤类似物的TPMT基因型依赖性敏感性相关。6-TG剂量滴定的研究也用于评估基于shRNA表达水平的剂量-窗口可变性的可能性。选择后，通过用各种细胞因子组合(IL-2/IL-7/IL-15/IL-21)的选择来扩增经修饰T细胞。最后，经由使用甲氨蝶呤测试扩增的T细胞群对“杀伤开关”活化的敏感性。
实施例5——经修饰人原代T细胞的功能评估
使用体外方法评估经修饰T细胞的功能能力，以了解基因修饰和培养条件的潜在后果。对培养物内的T细胞亚型比例进行表型分析，包括评估幼稚T细胞、效应T细胞亚型、记忆T细胞亚型、调节性T细胞等，并且包括细胞表面T细胞标记(如CD3/CD4/CD7/CD8/CD25/CD27/CD28/CD45RA/RO/CD56/CD62L/CD127或FoxP3和CD44)。还使用流式细胞术评估作为延长培养条件的结果的T细胞耗竭的潜在发生。使用T细胞增殖和细胞因子释放测定来评估基因修饰的T细胞与病毒肽反应的功能能力。据信这种对来自病毒如埃巴病毒(Epstein BarrVirus，EBV)和巨细胞病毒(CMV)的病毒肽的功能性反应特别相关，因为这些是在免疫抑制情况下再活化的主要病毒，并且对于临床中的患者相关。
最后，使用体外增殖测定来评估每个供体修饰的T细胞培养物对冷冻保存的(并基因分型的)单倍体相同的供体PBMC的同种异体反应性。这设计成模拟和测量移植背景下的潜在同种异体反应性。在这种背景下还可评估基因修饰的T细胞库内调节性T细胞区室的功能能力。
实施例6——甲氨蝶呤给予后“残留”基因修饰的T细胞群的表型和功能表征
对诱导杀伤开关和消退病症(如GvHD或CRS)后受者内存在的剩余基因修饰细胞的能力的理解是基因修饰细胞以适当数量和相关功能扩增和重建的能力。因此，理解随后适当的可扩增能力和功能活性的供体细胞耗竭的最低阈值水平是重要的。第三方进行的临床试验显示，杀伤开关激活导致在2小时内体内供体T细胞>99％耗竭竭，并且在24-48小时内发生GvHD和CRS症状的消退。此外，受者中剩余的<1％的经修饰细胞能够重新扩增而不导致GvHD或CRS的再活化。假设杀伤开关的激活导致活跃扩增的供体同种异体反应性T细胞优先死亡，因此导致可能导致GvHD/CRS复发的T细胞库的耗竭。对重新扩增的细胞的离体分析显示，剩余的库能够识别病毒抗原并对其作出反应，指示受者不会免疫受损。此外，这些试验中的受者到100天保持无病状态，在该有限的随访期之后尚无数据可用。最后，如果由于供体细胞相关的并发症而需要在以后使这些细胞耗竭，则确定残留/重新扩增的群体是否在第二轮时仍然容易受到杀伤开关诱导的影响。
实施例7——小鼠模型中的体内概念验证研究
将进行动物研究以探究经修饰T细胞在GvHD抗性和GvHD敏感性人源化NSG小鼠中的体内行为和特性。初始研究旨在评价经修饰T细胞中的T细胞植入以及MTX诱导的“杀伤开关”功能。这些研究会在GvHD抗性小鼠中进行。后续研究旨在建立GvHD的小鼠模型，提供测试“杀伤开关”的临床相关的体内环境。随着对T细胞剂量、分布和功能的清楚理解，连同对MTX反应性的理解，在接受白血病攻击的GvHD敏感性小鼠中进行体内POC研究。将显示可以通过触发MTX“杀伤开关”来操纵经修饰T细胞以最小化GvHD，同时维持增强GVT反应的能力。
实施例8——了解T细胞剂量、移植、分布、存活和甲氨蝶呤敏感性
用不同剂量的经修饰T细胞移植MHC KO NSG小鼠(GvHD-抗性)，以便建立用于持续移植的最佳T细胞剂量。在不同的时间点，分析T细胞在淋巴和非淋巴器官中的分布。
使用如本文所指出确定的最佳T细胞剂量(i)，在植入后用不同剂量的甲氨蝶呤处理小鼠二十四至四十八小时。在设计成理解经修饰T细胞消除得有多快的分析时程中，测定淋巴和非淋巴器官中剩余T细胞的数量。
开始平行研究，以探究经修饰T细胞移植物的寿命和这些T细胞随时间推移的MTX敏感性。使接受最佳剂量的经修饰T细胞的小鼠变老六个月，然后触发MTX诱导的“杀伤开关”。在先前确定的最佳分析时间测定淋巴和非淋巴器官中剩余T细胞的数量。将显示当在稍后的时间点触发时，经修饰T细胞对MTX“杀伤开关”的反应可多好，如在迟发性急性或慢性GvHD中的情况。
实施例9——GvHD小鼠模型的建立和表征以及经修饰T细胞移植物的分析
为了引发GvHD，在调理后2-24h内，用最佳剂量的经修饰T细胞移植辐射调理的NSG小鼠。根据已发表的文献，在这些小鼠中在约第25天GvHD发展(监测的身体姿势、活动、毛皮和皮肤状况以及体重减轻)，在约第55天达到疾病终点(>20％体重减轻，伴有GvHD的临床症状)。如果疾病进展显著更慢或更具侵袭性，则可分别测试高于和低于最佳剂量(基于文献，大约106-107个T细胞)的T细胞剂量。
采用最优化的T细胞剂量和疾病动力学，将在时程分析中探究T细胞植入。不同器官的T细胞接种是GvHD的特征，这将在我们的模型中进行探究。通过所观察到的GvHD的发作和严重程度来确定时程分析时间点。
当在淋巴器官中可清楚地检测到经修饰T细胞时，分析T细胞(CD4+和CD8+)功能性。用各种刺激物(例如PMA、CD3/CD28)体外刺激T细胞，并分析表型、增殖、细胞因子产生和离体抗肿瘤细胞毒性。特异性分析T细胞对病毒肽例如CMV、EBV&FLU(Proimmune ProMixCEF肽库)反应的能力，作为它们对潜伏病毒再活化反应能力的量度。
实施例10——GvHD模型中甲氨蝶呤诱导“杀伤开关”的激活
按照先前确定的最佳条件辐射NSG小鼠并用经修饰T细胞移植。在GvHD的急性或慢性期，向小鼠施用不同剂量的MTX，包括最佳剂量。每周测定外周血中经修饰T细胞的百分比，直到实验结束。监测GvHD的发展以确认是否可从发展进行性疾病中拯救小鼠。对经修饰T细胞在各种器官中的浸润进行定量，以了解全身水平GvHD的严重程度。
实施例11－GVT/GvHD小鼠模型中经修饰T细胞POC
按照先前确定的最佳条件辐射NSG小鼠并用经修饰T细胞移植。在辐射后二十四小时内，小鼠将接受一定剂量的P815 H2-Kd细胞系以建立白血病。预先转导P815细胞以表达GFP，用于体内生物分布和肿瘤生长评估。在GvHD发作时，用最佳剂量的MTX治疗小鼠，并且监测疾病进展以及白血病负荷直到实验结束。
实施例12——HPRT敲除指导RNA
图23和下表阐述了各种指导RNA，检测它们的在靶和脱靶效应。选择“IDT-4”(SEQID NO:36)作为先导gRNA用于其余的敲除实验，如本文所述的那些。SEQ ID NO:39(“NatPaper”)源于Yoshioka,S.等人,(2016).Development of a mono-promoter-drivenCRISPR/Cas9 system in mammalian cells.Scientific Reports,5,18341，其公开内容据此全文以引用方式并入本文。
Figure BDA0004016322230000831
Figure BDA0004016322230000841
实施例13——HPRT靶向敲除对6-TG的抗性
方法
将Jurkat细胞用含有指导RNA(gRNA；GS-4；命名为IDT-4)以及Cas9和tracrRNA的核糖核蛋白(RNP)复合体电穿孔。使用荧光激活细胞分选(FACS)纯化已证实经由tracr RNA用gRNA转染的细胞，随后培养72小时。然后向转导的培养细胞施用增加浓度的6-硫鸟嘌呤(6-TG)以评估抗性。野生型(未经修饰)Jurkat细胞用作对照。
结果
发光(ATP检测)用来评估细胞活力。IDT-4修饰的细胞展示对增加剂量的6-TG(测试多至10uM)的抗性。未经修饰的Jurkat细胞(野生型)显示随着6-TG浓度的增加，细胞活力降低(参见图24)。
还使用蛋白质印迹分析未经修饰(WT)和IDT-4修饰的Jurkat细胞的HPRT蛋白(参见图25)。未经修饰Jurkat细胞(WT)显示可检测水平的预期尺寸(25kDA)的HPRT，而IDT-4修饰的细胞具有不可检测水平的HPRT。肌动蛋白检测(下面一组)用作蛋白上样对照。
实施例14——长期细胞活力/存活
方法
将HPRT敲除Jurkat细胞(用指导RNAIDT-4修饰；如实施例1所述；命名为HPRT-/-)与修饰为单独表达GFP的Jurkat细胞(WT GFP)以大约相等的比例混合在一起。
将细胞在标准培养条件下培养18天，然后再评估培养物中GFP+细胞的比例。
结果
在第18天，细胞的GFP比例基本上类似于第1天(参见图26)，随着时间的推移，GFP+野生型细胞的起始比例没有显著变化(参见图27)，这指示出缺乏HPRT蛋白的细胞没有存活优势或劣势。这进一步确认在6-TG存在下修饰细胞的存活优势是由于不存在活性HPRT酶。
实施例15——HPRT敲除Jurkat细胞—甲氨蝶呤敏感性
方法&结果
(A)MTX剂量反应
将Jurkat细胞(未经修饰；WT)与增加浓度的甲氨蝶呤(MTX)一起培养以确定杀伤WT细胞所需的MTX剂量窗口(参见图28)。选择0.00625至0.025μM MTX的剂量范围用于HPRT敲除(IDT-4修饰的)Jurkat细胞的后续评估。
(B)HPRT敲除MTX剂量反应
将HPRT敲除(IDT-4修饰)Jurkat细胞对MTX的剂量反应与未经修饰Jurkat细胞(WT)进行比较以确定对MTX的敏感性(参见图29)。当培养5天时，与野生型细胞相比，HPRT敲除(IDT-4修饰)Jurkat细胞展示出对浓度为0.00625和0.0125μM的MTX的敏感性增加。
实施例16——HPRT敲低Jurkat细胞
方法
将Jurkat T细胞用慢病毒载体(A)TL20cw-7SK/sh734-UbC/GFP或(B)TL20cw-UbC/GFP-7SK/sh734修饰。使用1ml未稀释的含病毒的培养基(VCM)连同8ng/ml的聚凝胺，通过在室温下以2,500rpm离心90分钟，然后在37℃下孵育60分钟，用相应的慢病毒载体转导Jurkat细胞。然后，在转导并移除VCM后将细胞培养4天，然后使用流式细胞术测定转导效率(GFP阳性细胞)。
结果
Jurkat细胞在旋转接种后第4天展示出高转导效率，sh734-GFP(参见图30A)在第4天导致76.2％ GFP+细胞，而GFP-sh734病毒(参见图30B)导致77.2％ GFP+细胞。将经修饰Jurkat细胞置于6-TG选择(10uM，基于先前评估野生型未经修饰的Jurkat细胞对6-TG的敏感性而生成的数据)下3天。选择方案导致每个修饰细胞系增加至87％(参见图30A)和90％(参见图30B)GFP+细胞，指示未经修饰细胞的死亡和含sh734细胞的存活提高。
实施例17——HPRT敲低CEM T细胞
方法
将CEM T细胞用慢病毒载体TL20cw-7SK/sh734-UbC/GFP(sh734-GFP)和TL20cw-UbC/GFP-7SK/sh734(GFP-sh734)修饰。
用1ml未稀释的含病毒的培养基(VCM)连同10ng/ml聚凝胺，通过在室温下以2,500rpm离心90分钟，然后在37℃下孵育60分钟，旋转感染CEM细胞。4天后通过流式细胞术测定GFP+细胞的比例。转导效率相对低。
用5uM 6-TG使经修饰CEM细胞经受6-TG选择，总共17天。通过6-TG成功地选择含有sh734的细胞，在sh734-GFP的情况下增加至28.8％ GFP+，在GFP-sh734的情况下增加至42.4％ GFP+，指示这些细胞与非转导细胞相比具有存活优势(参见图31)。
实施例18——载体产生—HPRT敲低
通过将包含7SK/sh734的表达盒***pTL20cw载体中来制备候选载体(参见例如图32)。具体地，生成了下表中列出的包含短发夹的载体。
<![CDATA[<u>载体</u>]]> <![CDATA[<u>7SK/sh734的相对位置/取向</u>]]>
TL20cw-7SK/sh734-UbC/GFP 上游/正向
TL20cw-r7SK/sh734-UbC/GFP 上游/反向
TL20cw-UbC/GFP-7SK/sh734 下游/正向
TL20cw-UbC/GFP-r7SK/sh734 下游/反向
实施例19——转导/转染
将K562或Jurkat细胞用包括设计成敲低HPRT的核酸序列和编码绿荧光蛋白(GFP)的核酸序列的表达载体转导(MOI为0.1-5)；或者用包含CRISPR/Cas9和针对HPRT的sgRNA的纳米胶囊转染(100ng/5×104个细胞)。
实施例20——HPRT的敲低和6-TG抗性
在转导/转染后第3或4天，将6-TG储备溶液添加到含有转导/转染的K562或Jurkat细胞的培养基中。直至第14天或更久，6-TG维持在最终浓度，例如对于K562细胞为300nM，且对于Jurkat细胞为2.5uM。每3至4天更新培养基。在流式仪上分析GFP，通过VCN ddPCR测定分析VCN，并且用T7E1测定分析***缺失％。在下表中提供图33中的结果。
Figure BDA0004016322230000861
实施例21——HPRT敲除指导RNA
下表阐明了所研究的各种指导RNA分子，如本文中实施例22-29中所述。
gRNA# sgRNA指导物和PAM SEQ ID NO: 对应HPRT 1靶标
gRNA 12 GCCCCCCTTGAGCACACAGAGGG 40 外显子4
gRNA 13 AGCCCCCCTTGAGCACACAGAGG 41 外显子3
gRNA 15 GATGTGATGAAGGAGATGGGAGG 42 外显子3
gRNA 16 CTGATAAAATCTACAGTCATAGG 43 外显子3
gRNA 17 GTAGCCCTCTGTGTGCTCAAGGG 44 外显子3
gRNA 18 TTATGCTGAGGATTTGGAAAGGG 45 外显子2
gRNA 19 GTGCTTTGATGTAATCCAGCAGG 46 外显子3
gRNA 20 TGAAGTATTCATTATAGTCAAGG 47 外显子8
gRNA 21 TATCCTACAACAAACTTGTCTGG 48 外显子8
gRNA 22 GAAGTATTCATTATAGTCAAGGG 49 外显子8
实施例22——用于指导RNA选择的计算机(In Silico)方法
基于计算机测试开发指导RNA。特别地，计算机设计策略使用以下方法得到第二代gRNA：
(i)通过使用由(University of California Santa Cruz)UCSC基因组学研究所收集的数据和注释来鉴定基因中的靶向外显子
(a)Pfam中注释的基因结构域
(b)进化保守性评分PhyloP；和
(c)导致HPRT1功能丧失的ClinVar数据库中的临床变型
(ii)用已公开的方法预测在靶效率
(a)Azimuth
(b)CHOPCHOP
(c)CRISPOR
(d)CCTop
(e)CRISTA
(iii)用已公开的方法预测移码敲除概率
(a)Out-of-Frame分数
(b)Lindel
(c)inDelphi
(iv)用已公开的方法预测脱靶位点
(a)Elevation(与Azimuth相同资料)
(b)CHOPCHOP(如上CHOPCHOP)
(c)Cas-OFFinder
(v)使用以下中的注释对脱靶严重程度进行评级
(a)ClinVar数据库(如1c中)
(b)OncoKB(网页)
基于所进行的计算机测试，申请人鉴定了十个靶向HPRT 1的外显子3或8的指导RNA用于进一步分析(参见例如SEQ ID NO:40-49)。图34示出了用本公开的指导RNA靶向的HPRT 1内的外显子，其中“第2轮”指导RNA包括具有SEQ ID NO:40-49的那些。
HPRT1外显子3和8在人基因组形式GRCh38上的坐标如下所示(染色体，开始，结束)：
chrX 134475181 134475364 HPRT1_外显子_3
chrX 134498608 134498684 HPRT1_外显子_8
虽然染色体X内的位置在本文中参考基因组参***人构建物38(GenomeReference Consortium Human Build 38，GRCh38)，但本领域的技术人员将理解，这些参考位置可以转置为替代的人基因组构建物或组装体中的等同位置。
使用Sanger测序数据的Synthego的Interference CRISPREditing(ICE)工具用作计算机设计策略的一部分，并且这种分析的结果示于图35A和35B(其中gRNA12至gRNA22对应于SEQ ID NO:40-49(参见实施例21)；并且其中gRNA23至gRNA34对应于SEQ ID NO:50-61)。
实施例23——CEM细胞中的筛选和验证
在Jurkat细胞系(n＝1)中筛选来自实施例21的最佳候选指导RNA，并在CEM细胞系(n＝2)中验证。例如，将Jurkat细胞用含有指导RNA连同Cas9和tracrRNA的核糖核蛋白(RNP)复合体(例如，包括具有SEQ ID NO:40-49中的任一者的指导RNA的RNP)电穿孔。Jurkat细胞系和CEM细胞系的方法和分析是相同的(另参见图37)。在电穿孔后，在不同浓度的6-TG下测量细胞活力(参见图36)。下表提供了***缺失和敲除(KO)评分。
Figure BDA0004016322230000881
Figure BDA0004016322230000882
Figure BDA0004016322230000891
***缺失百分比——编辑效率(具有非野生型序列的库的百分比)，如通过将编辑的迹线与对照迹线进行比较来确定。在ICE算法中，提出潜在的编辑结果，并使用线性回归拟合至所观察的数据。
敲除评分——表示具有移码或21+bp***缺失的细胞的比例。该评分对于有兴趣了解有多少贡献的***缺失可能导致靶基因的功能性敲除(KO)的人是有用的量度。
实施例24——使用针对HPRT1的指导RNA修饰的CEM T细胞显示对6-硫鸟嘌呤的抗 性
将CEM T细胞白血病细胞用含有内部设计并从Integrated DNA Technologies(IDT)获得的指导RNA(参见实施例21)连同Cas9和tracrRNA的核糖核蛋白(RNP)复合体电穿孔(1600V，10ms脉冲宽度，3个脉冲，通过使用Neon Transfection***)。使用荧光激活细胞分选(FACS)纯化已证实经由使用tracr RNA(电穿孔后24小时)用gRNA转染的细胞，之后再培养72小时，然后评估与野生型(未经修饰的)CEM细胞相比在用增加浓度的6-硫鸟嘌呤(6-TG)攻击时的细胞存活。
与其它修饰的细胞相比，指导物21修饰的细胞展示出对6-TG攻击的中等抗性(参见图38)。经修饰细胞显示出在增加剂量的6-TG(测试多至40μM)下存活；而未经修饰CEM细胞显示细胞活力降低。这些数据指示经修饰细胞对6-TG的毒性效应具有增加的抗性。
ICE评分示于下表中。指导物15、18和21显示有效的编辑；而指导物19显示零编辑。
Figure BDA0004016322230000892
未经修饰和经修饰CEM细胞也被用来分离蛋白质和使用蛋白质印迹检测HPRT蛋白质(图39，上图)。未经修饰Jurkat细胞(WT)显示可检测水平的预期尺寸(25kDA)的HPRT，而经修饰细胞具有不可检测水平的HPRT(指导物12、13、15、17和22)或与野生型相比HPRT蛋白水平降低的迹象(指导物15、18、19和21)。肌动蛋白检测(图39，下图)用作蛋白质上样对照。
实施例25——可成功地用6-硫鸟嘌呤选择使用针对HPRT1的指导RNA修饰的CEM T 细胞
将CEM T细胞白血病细胞用含有内部设计并从Integrated DNA Technologies(IDT)获得的指导RNA(参见实施例21)连同Cas9和tracrRNA的核糖核蛋白(RNP)复合体电穿孔(1600V，10ms脉冲宽度，3个脉冲，通过使用Neon Transfection***)。使用荧光激活细胞分选(FACS)纯化证实经由使用tracr RNA(电穿孔后24小时)用gRNA转染的细胞，然后在10μM 6-TG中培养1周，每48-72小时补充新鲜的6-TG。
该时间点的细胞活力分析显示，与野生型(WT)细胞相比，经修饰CEM对6-TG具有抗性，其中先前展示具有可检测HPRT蛋白表达的指导物(参见图40A指导物15、18、19、21；加框)显示更多的可变活力。在10uM 6-TG存在下10天后，每48-72小时补充新鲜的6-TG，用增加浓度的6-硫鸟嘌呤(6-TG)攻击每个细胞系，并将细胞活力与野生型(未经修饰的)CEM细胞进行比较(参见图40B)。6-TG选择的经修饰细胞均显示出在增加剂量的6-TG(多至40μM)下存活；而未经修饰CEM细胞显示细胞活力降低，在40uM时大约10％活力。
实施例26——使用针对HPRT1的指导RNA修饰的CEM T细胞通过蛋白质印迹显示 HPRT蛋白的损失
将CEM T细胞白血病细胞用含有内部设计并从Integrated DNA Technologies(IDT)获得的指导RNA(gRNA；图例)连同Cas9和tracrRNA的核糖核蛋白(RNP)复合体电穿孔(1600V，10ms脉冲宽度，3个脉冲，通过使用Neon Transfection***)。使用荧光激活细胞分选(FACS)纯化证实经由使用tracr RNA(电穿孔后24小时)用gRNA转染的细胞，然后在10uM6-TG存在下培养10天，每48-72小时补充新鲜的6-TG。
在选择期后，从各细胞中提取蛋白质并用于HPRT蛋白的基于蛋白质印迹的检测。β-肌动蛋白的检测用作蛋白上样对照(肌动蛋白抗体(ACTBD11B7):sc-81178.SantaCruz)。使用抗HPRT抗体(抗HPRT抗体(ab245397)Abcam)进行的HPRT检测显示在大约25kDA处存在条带，其对应于HPRT蛋白的预期尺寸。用指导物12、13、17和22修饰的CEM细胞显示，HPRT蛋白在电穿孔的72小时内是不可检测的(-)，并且在6-TG选择(10uM；+)10天后仍然不可检测。用指导物15、18、19和21修饰的CEM细胞在电穿孔后72小时具有可检测水平的HPRT蛋白，但与野生型细胞相比有所降低。在选择10天后，这些CEM系中的每个均显示出受限至不可检测水平的HPRT，指示通过6-TG成功选择了经修饰细胞(参见图41)。
实施例27——使用针对HPRT1的指导RNA修饰的CEM T细胞展示对甲氨蝶呤的改变 的敏感性
将由靶向HPRT1基因的8个指导RNA修饰的CEM T细胞白血病细胞在10μM 6-TG存在下培养1周，每48-72小时补充新鲜的6-TG。在选择期和确认HPRT蛋白减少后，在胸腺嘧啶核苷16μM(T1895 Sigma)存在下，在3天内测试CEM细胞对一定剂量范围的嘌呤从头合成途径的甲氨蝶呤(MTX)的敏感性。
与野生型细胞相比，所有系显示对0.05um MTX的敏感性增加(参见图42)。在0.5μMMTX下细胞的活力(图43)展示出虽然60％的野生型(WT)细胞是活的，但是CRISPR/Cas9修饰的CEM细胞显示出活细胞比例降低约20％至约50％，这取决于修饰的细胞系，表明经修饰细胞的敏感性增加，以及在这些细胞中成功地诱导杀伤开关。
实施例28——与未经修饰细胞相比使用针对HPRT1的指导RNA修饰的原代人T细胞 显示对6-TG的抗性
图44示出根据本公开的一个实施方案修饰原代T细胞的方法。图45A-45C示出在根据本文所述的修饰方法修饰原代T细胞后七天的6-TG剂量反应。具体地，图45A和45B示出了外显子3(指导RNA 13)和外显子8(指导RNA21)的靶向。标号“#9”和“#10”表示T细胞编号和UT对照(不具有RNP情况下电穿孔)。图45C示出了用增加浓度的6-TG(第4天)测试的来自供体#9和供体#10的未经修饰细胞。观察到经修饰原代T细胞对低剂量的6-TG非常敏感。ICE评分如下所示。电穿孔后72小时的蛋白质印迹示于图46(将较低的蛋白质水平加载到凝胶上；对于指导RNA 21观察到残留的HPRT蛋白；“#9”和“#10”表示T细胞供体编号和UT对照，即不具有RNP情况下的电穿孔)。
Figure BDA0004016322230000911
经由密度离心，从Australian Red Cross Blood供体样本(n＝2)中分离外周血单核细胞(PBMC)。在细胞因子白介素(IL)-2的存在下，经由T细胞受体(CD3)和共刺激分子CD28，使用导致细胞刺激的TransAct试剂(Miltenyi Biotech；按照制造商的方案)来刺激所得的细胞。在细胞刺激后第4天，将细胞用含有指导RNA(gRNA)13或21连同Cas9的核糖核蛋白(RNP)复合体电穿孔(1600V，10ms脉冲宽度，3个脉冲，通过使用Neon Transfection***)，然后使细胞再悬浮于含有IL-2的培养基中，使用TransAct重复刺激。到第7天，确定原始混合的PBMC群体主要是CD3+T细胞(流式细胞术；数据未显示)。
然后，将细胞在1uM 6-TG存在下培养约7天和约12天，每约2天至约3天补充6-TG。在每个这些时间点，评估细胞与未处理(UT)对照相比的活细胞比例。该数据表明，虽然来自两个供体(供体#9，图47A；供体#10，图47B，其中#9和#10表示T细胞供体编号和UT对照(在不具有RNP情况下电穿孔))的野生型(WT)未经修饰细胞在第8天和第13天显示出降低的活力，但两种指导物修饰的原代人T细胞显示出增加的活力，表明对6-TG的效应的增加的抗性。在两个样本中，就活细胞的比例而言，指导物13表现超过指导物21，表明HPRT1基因的靶向不太有效，并且这分别与约43％和约1％的敲除效率相关联(ICE评分)。图48中描绘的蛋白质印迹显示6-TG处理能够选择HPRT敲除群体。
实施例29——使用针对HPRT1的指导RNA修饰的原代人T细胞展示对甲氨蝶呤 (MTX)的敏感性增加
在胸腺嘧啶核苷16μM存在下，使原代人T细胞经受一定剂量范围的MTX持续2天并评估细胞活力，该原代人T细胞使用靶向HPRT1基因的指导RNA修饰，并随后用1μM 6-TG在选择压力下放置12天，每2至3天补充6-TG。与野生型未经修饰的细胞(UT)相比，用指导物13和21修饰的原代人T细胞展示出对MTX增加的敏感性，表明杀伤开关诱导(参见图49A和49B，其示出WT与经修饰细胞之间对MTX敏感性的差异，并且其中“#9”和“#10”表示T细胞供体编号和UT对照(不具有RNP情况下的电穿孔))。
实施例30——HPRT敲除指导RNA
如以上实施例22中所述，本申请人进一步鉴定了靶向HPRT 1的外显子2、3或8的指导RNA(参见例如SEQ ID NO:50-61)。
将使用Sanger测序数据的Synthego的Interference CRISPREditing(ICE)工具用作计算机设计策略的一部分。下表阐明了靶向HPRT 1的各种指导RNA分子。
Figure BDA0004016322230000921
Figure BDA0004016322230000931
#染色体X内的位置在本文中参考基因组参***人构建物38(GRCh38)。
在一些实施方案中，用于敲除HPRT1基因的组分包含Cas12a以及SEQ ID NO:50-61的指导RNA分子。
额外的实施方案
在第一额外的实施方案中是一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，该方法包括：由供体样本生成HPRT缺陷型淋巴细胞；离体正选择HPRT缺陷型淋巴细胞，以提供经修饰淋巴细胞群；向患者施用HSC移植物；在施用HSC移植物后，向患者施用经修饰淋巴细胞群；以及任选地，如果出现副作用，则施用甲氨蝶呤(MTX)。在一些实施方案中，所治疗的患者受益于接受T细胞以对抗感染，支持植入，以及预防疾病复发。此外，如果发生GvHD，则可通过施用一个或多个剂量的MTX来移除T细胞。
在一些实施方案中，HPRT缺陷型淋巴细胞通过敲除HPRT1基因生成，如通过用包括适于敲除HPRT的有效载荷(例如，包括具有SEQ ID NO:25-39中任一者的序列的指导RNA的有效载荷)的纳米胶囊群体转染淋巴细胞。在其它实施方案中，HPRT缺陷型淋巴细胞通过敲低HPRT1基因生成，如通过用包括编码RNA干扰剂的核酸序列的表达载体(例如，编码具有SEQ ID NO:1、2和5-11中任一者的序列的shRNA的核酸)转导淋巴细胞。在一些实施方案中，正选择包括使所生成的HPRT缺陷型淋巴细胞与嘌呤类似物(例如，6-硫鸟嘌呤(6-TG)、6-巯嘌呤(6-MP)、或硫唑嘌呤(AZA))接触。在一些实施方案中，正选择包括使所生成的HPRT缺陷型淋巴细胞与嘌呤类似物和第二试剂(例如别嘌呤醇)接触。在一些实施方案中，嘌呤类似物是6-TG。在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞以单次推注施用。在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞以多剂量施用。在一些实施方案中，每个剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约240×106个细胞/kg。在一些实施方案中，在诊断GvHD后任选地施用MTX。在一些实施方案中，所施用的MTX的量在约2mg/m2/输注至约8mg/m2/输注的范围内。在一些实施方案中，MTX以滴定剂量施用。
据信本公开的方法经由编码有利于嘌呤再循环利用的酶次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)的基因的修饰来利用嘌呤挽救途径。经由基因敲除或基因敲低抑制HPRT表达使得经修饰细胞仅依赖于嘌呤从头生物合成途径来存活。在未经修饰的细胞中，递送的嘌呤类似物6-硫鸟嘌呤(6-TG)通过HPRT转化，最终导致6-硫鸟嘌呤核苷酸(6-TGN)积聚，其经由几种机制(包括在S期的期间向DNA中引入)对细胞呈毒性。在基因修饰的细胞中抑制HPRT酶以及后续用6-TG(一种已经用于治疗各种白血病以及严重炎性疾病的药物)治疗为这些细胞提供了相对于未经修饰细胞的存活优势，并因此提供了借以在体外并可能在体内选择经修饰细胞的机制。此外，在这些HPRT酶缺陷型细胞中，如用甲氨蝶呤(MTX)对嘌呤从头生物合成途径的抑制导致细胞凋亡(由于也是一种非功能性嘌呤挽救途径)，从而提供另一种批准的药物可借以用作经修饰细胞中的“杀伤开关”诱导剂的机制。
在第二额外的实施方案中是一种包括减少或消除造血干细胞(“HSC”)中HPRT表达的组分的组合物。在一些实施方案中，HSC是淋巴样细胞。在一些实施方案中，淋巴样细胞是T细胞。在一些实施方案中，组合物包括实现HPRT1基因敲低的第一组分。在其它实施方案中，组合物包括实现HPRT1基因敲除的第一组分。在一些实施方案中，组合物包括慢病毒表达载体，该慢病毒表达载体包括编码适于敲低HPRT1基因的试剂(例如RNA干扰剂(RNAi))的第一核酸。在一些实施方案中，可将慢病毒表达载体引入纳米胶囊(如适于靶向HSC的纳米胶囊)内。
在第三额外的实施方案中是一种表达载体，该表达载体包括编码RNAi的核酸序列以实现HPRT的敲低。在一些实施方案中，慢病毒表达载体适于产生可选择遗传修饰的细胞，如HSC。在一些实施方案中，可将离体转导的HSC施用于需要治疗的患者。在一些实施方案中，编码RNAi的核酸编码靶向HPRT1的小发夹核糖核酸分子(“shRNA”)。在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的序列，并且其中第一核酸序列可操作地连接至7sk启动子或其突变的变体。在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的序列，并且其中第一核酸序列可操作地连接至7sk启动子或其突变的变体。在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:1具有至少97％同一性的序列，并且其中第一核酸序列可操作地连接至7sk启动子或其突变的变体。在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有SEQ ID NO:1的序列，并且其中第一核酸序列可操作地连接至7sk启动子或其突变的变体。
在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ IDNO:2具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:2具有至少97％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有SEQ ID NO:2的序列。
在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ IDNO:5、6和7中的任一者具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:5、6和7中的任一者具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:5、6和7中的任一者具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有与SEQ ID NO:5、6和7中的任一者具有至少97％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的shRNA的第一核酸序列具有SEQ ID NO:5、6和7中的任一者的序列。
在一些实施方案中，第一核酸序列可操作地连接至Pol III启动子。在一些实施方案中，Pol III启动子是智人细胞系HEK-293 7sk RNA启动子(参见例如SEQ ID NO:14)。在一些实施方案中，Pol III启动子是与SEQ ID NO:14相比在其核酸序列中包括单个突变的7sk启动子。在一些实施方案中，Pol III启动子是与SEQ ID NO:14相比在其核酸序列中包括多个突变的7sk启动子。在一些实施方案中，Pol III启动子是与SEQ ID NO:14相比在其核酸序列中包括缺失的7sk启动子。在一些实施方案中，Pol III启动子是与SEQ ID NO:14相比在其核酸序列中包括突变和缺失两者的7sk启动子。在一些实施方案中，第一核酸序列可操作地连接至与SEQ ID NO:14具有至少95％同一性的启动子。在一些实施方案中，第一核酸序列可操作地连接至与SEQ ID NO:14具有至少97％同一性的启动子。在一些实施方案中，第一核酸序列可操作地连接至与SEQ ID NO:14具有至少98％同一性的启动子。在一些实施方案中，第一核酸序列可操作地连接至与SEQ ID NO:14具有至少99％同一性的启动子。在一些实施方案中，第一核酸序列可操作地连接至具有SEQ ID NO:14的启动子。
在第四额外的实施方案中是一种慢病毒表达载体，该慢病毒表达载体包含编码靶向HPRT1基因的基于微RNA的shRNA的核酸序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的基于微RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:8、9、10和11中的任一者具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的基于微RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:8、9、10和11中的任一者具有至少90％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的基于微RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:8、9、10和11中的任一者具有至少95％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的基于微RNA的shRNA的核酸序列具有与SEQ ID NO:8、9、10和11中的任一者具有至少97％同一性的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的基于微RNA的shRNA的核酸序列具有SEQ ID NO:8、9、10和11中的任一者的序列。在一些实施方案中，编码靶向HPRT1基因的基于微RNA的shRNA的核酸序列可操作地连接至Pol III或Pol II启动子，包括本文所述的任何那些。
在第五额外的实施方案中是一种多核苷酸序列，该多核苷酸序列包括(a)编码靶向HPRT的shRNA的第一部分；以及(b)编码第一启动子的第二部分，该第一启动子驱动编码靶向HPRT的shRNA的序列的表达。在一些实施方案中，多核苷酸还包含(c)编码中央聚嘌呤序列元件的第三部分；和(d)编码Rev应答元件(SEQ ID NO:19)的第四部分。在一些实施方案中，多核苷酸序列还包含WPRE元件(例如，包含SEQ ID NO:18的WPRE元件)。在一些实施方案中，多核苷酸序列还包含绝缘子。
在第六额外的实施方案中是用表达载体转导或者用纳米胶囊转染的HSC(例如CD34+HSC)，该表达载体或纳米胶囊各自包括设计用于降低HPRT表达的试剂(例如，用于敲低HPRT的RNAi)。在一些实施方案中，HSC是T细胞。在一些实施方案中，转导的HSC构成细胞治疗产品，其可施用于对其有治疗需要的受试者，例如，受益于接受细胞(如可离体扩增的T细胞)以对抗感染、支持植入，以及预防疾病复发的经转导的HSC治疗的患者。
在第七额外的实施方案中是用任一种表达载体转导的宿主细胞，并且其中宿主细胞是HPRT缺陷型的。在一些实施方案中，宿主细胞是T细胞。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:1的序列具有至少95％同一性。
在第八额外的实施方案中是一种包含宿主细胞的药物组合物，其中宿主细胞用药学上可接受的载体或赋形剂配制。在一些实施方案中，宿主细胞是通过用表达载体转导宿主细胞而衍生的HPRT缺陷型宿主细胞。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQID NO:1的序列具有至少95％同一性。
在第九额外的实施方案中是一种生成HPRT缺陷型细胞的方法，该方法包括：用表达载体转导宿主细胞群，以及通过使转导的宿主细胞群与至少嘌呤类似物接触来正选择HPRT缺陷型细胞。在一些实施方案中，嘌呤类似物选自6-TG和6-巯嘌呤。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:1的序列具有至少95％同一性。
在第十额外的实施方案中是一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，该方法包括：由供体样本生成HPRT缺陷型淋巴细胞，其中HPRT缺陷型淋巴细胞通过用表达载体转导供体样本内的淋巴细胞而生成；离体正选择HPRT缺陷型淋巴细胞，以提供经修饰淋巴细胞群；向患者施用HSC移植物；在施用HSC移植物后，向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞群；以及任选地，如果出现副作用，则施用二氢叶酸还原酶抑制剂。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:1的序列具有至少95％同一性。
在第十一额外的实施方案中是一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，该方法包括：由供体样本生成HPRT缺陷型淋巴细胞，其中HPRT缺陷型淋巴细胞通过用表达载体转导供体样本内的淋巴细胞而生成；离体正选择HPRT缺陷型淋巴细胞，以提供经修饰淋巴细胞群；以及在施用HSC移植物的同时或之后，向患者施用经修饰淋巴细胞群。在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用一个或多个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:1的序列具有至少95％同一性。
在第十二额外的实施方案中是一种在对其有治疗需要的患者中治疗血液学癌症的方法，该方法包括：由供体样本生成HPRT缺陷型淋巴细胞，其中HPRT缺陷型淋巴细胞通过用表达载体转导供体样本内的淋巴细胞而生成；离体正选择HPRT缺陷型淋巴细胞，以提供经修饰淋巴细胞群；通过向患者施用HSC移植物来诱导至少部分移植物抗恶性肿瘤效应；以及在检测到残留疾病或疾病复发后，向患者施用经修饰淋巴细胞群。在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用至少一个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂，以抑制GvHD或CRS中的至少一种症状。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:1的序列具有至少95％同一性。
在第十三额外的实施方案中是一种用次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)缺陷型淋巴细胞治疗患者的方法，该方法包括以下步骤：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)用表达载体转导分离的淋巴细胞；(c)使转导的分离的淋巴细胞暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂；(d)在造血干细胞移植后，向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞的制剂；以及(e)任选地，在患者发展移植物抗宿主病(GvHD)后，施用甲氨蝶呤或麦考酚酸。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:1的序列具有至少95％同一性。
在第十四额外的实施方案中是一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，该方法包括：由供体样本生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞，其中基本HPRT缺陷型淋巴细胞通过用包括内切核酸酶和靶向HPRT的gRNA的递送媒介物来转染供体样本内的淋巴细胞而生成；离体正选择基本HPRT缺陷型淋巴细胞，以提供经修饰淋巴细胞群；向患者施用HSC移植物；在施用HSC移植物后，向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞群；以及任选地，如果出现副作用，则施用MTX。
在第十五额外的实施方案中是一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，该方法包括：由供体样本生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞，其中基本HPRT缺陷型淋巴细胞通过用包括Cas蛋白(例如Cas9、Cas12a、Cas12b)和靶向HPRT1基因的gRNA的递送媒介物来转染供体样本内的淋巴细胞而生成；离体正选择基本HPRT缺陷型淋巴细胞，以提供经修饰淋巴细胞群；向患者施用HSC移植物；在施用HSC移植物后，向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞群；以及任选地，如果出现副作用，则施用MTX。
在第十六额外的实施方案中是一种用表达载体转导的淋巴细胞，该表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列具有至少97％同一性。在一些实施方案中，shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列。在一些实施方案中，淋巴细胞在用表达载体转导后呈现为基本HPRT缺陷型。在一些实施方案中，淋巴细胞是T细胞。
在本公开的第十七额外的实施方案中是一种表达载体，该表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2、5、6和7中的任一者的序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，shRNA具有与SEQ ID NO:2、5、6和7中的任一者的序列具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，shRNA具有与SEQ ID NO:2、5、6和7中的任一者的序列具有至少97％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6和7中的任一者的核酸序列。
在一些实施方案中，第一表达控制序列包含Pol III启动子或Pol II启动子。在一些实施方案中，Pol III启动子是7sk启动子、突变的7sk启动子、H1启动子、或EF1a启动子。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:14具有至少95％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:14具有至少97％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子包含SEQ ID NO:14的核酸序列。在一些实施方案中，突变的7sk启动子具有与SEQ ID NO:15具有至少95％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，突变的7sk启动子具有与SEQ ID NO:15具有至少97％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，突变的7sk启动子包含SEQ ID NO:15的核酸序列。
在本公开的第十八额外的实施方案中是一种表达载体，该表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:8、9、10和11中的任一者的序列具有至少90％序列同一性。在一些实施方案中，shRNA具有与SEQ ID NO:8、9、10和11中的任一者的序列具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，shRNA具有与SEQ ID NO:8、9、10和11中的任一者的序列具有至少97％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，shRNA具有SEQ ID NO:8、9、10和11中的任一者的核酸序列。
在一些实施方案中，第一表达控制序列包含Pol III启动子或Pol II启动子。在一些实施方案中，Pol III启动子是7sk启动子、突变的7sk启动子、H1启动子、或EF1a启动子。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:14具有至少95％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子具有与SEQ ID NO:14具有至少97％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，7sk启动子包含SEQ ID NO:14的核酸序列。在一些实施方案中，突变的7sk启动子具有与SEQ ID NO:15具有至少95％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，突变的7sk启动子具有与SEQ ID NO:15具有至少97％序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中，突变的7sk启动子包含SEQ ID NO:15的核酸序列。
在本公开的第十九额外的实施方案中是一种用表达载体转导的宿主细胞，该表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列具有至少97％同一性。在一些实施方案中，shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列。在一些实施方案中，宿主细胞在用表达载体转导后呈现为基本HPRT缺陷型。在一些实施方案中，宿主细胞是淋巴细胞，例如T细胞。
在本公开的第二十额外的实施方案中是一种包含宿主细胞的药物组合物，其中宿主细胞用药学上可接受的载体或赋形剂配制，宿主细胞用表达载体转导，该表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列具有至少97％同一性。在一些实施方案中，shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列。在一些实施方案中，宿主细胞在用表达载体转导后呈现为基本HPRT缺陷型。在一些实施方案中，宿主细胞是淋巴细胞，例如T细胞。
在本公开的第二十一额外的实施方案中是一种生成基本HPRT缺陷型细胞的方法，该方法包括：用表达载体转导宿主细胞群，以及通过使转导的宿主细胞群与至少嘌呤类似物接触来正选择HPRT缺陷型细胞。在一些实施方案中，嘌呤类似物选自6-硫鸟嘌呤(6-TG)和6-巯嘌呤。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2和5-11中的任一者的序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ IDNO:2和5-11中的任一者的序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2和5-11中的任一者的序列具有至少97％同一性。在一些实施方案中，shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列。
在本公开的第二十二额外的实施方案中是一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，该方法包括：由供体样本生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞，其中基本HPRT缺陷型淋巴细胞通过用表达载体转导供体样本内的淋巴细胞而生成；离体正选择基本HPRT缺陷型淋巴细胞，以提供经修饰淋巴细胞群；向患者施用HSC移植物；在施用HSC移植物后，向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞群；以及任选地，如果出现副作用，则施用二氢叶酸还原酶抑制剂。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2和5-11中的任一者的序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2和5-11中的任一者的序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2和5-11中的任一者的序列具有至少97％同一性。在一些实施方案中，shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列。
在一些实施方案中，二氢叶酸还原酶抑制剂选自甲氨蝶呤(MTX)或麦考酚酸(MPA)。在一些实施方案中，正选择包括使所生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞与嘌呤类似物接触。在一些实施方案中，嘌呤类似物是6-TG。在一些实施方案中，6-TG的量在约1至约15μg/mL的范围内。
在一些实施方案中，正选择包括使所生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞与嘌呤类似物和别嘌呤醇两者接触。在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞以单次推注施用。在一些实施方案中，将多剂量的经修饰淋巴细胞施用于患者。在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞的每个剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约240×106个细胞/kg。在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞的总剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约730×106个细胞/kg。
在本公开的第二十三额外的实施方案中是一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，该方法包括：由供体样本生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞，其中基本HPRT缺陷型淋巴细胞通过用表达载体转导供体样本内的淋巴细胞而生成；离体正选择基本HPRT缺陷型淋巴细胞，以提供经修饰淋巴细胞群；以及在施用HSC移植物的同时或之后，向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞群。在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用一个或多个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2和5-11中的任一者的序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2和5-11中的任一者的序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2和5-11中的任一者的序列具有至少97％同一性。在一些实施方案中，shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列。
在一些实施方案中，二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。在一些实施方案中，正选择包括使所生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞与嘌呤类似物接触。在一些实施方案中，嘌呤类似物是6-TG。在一些实施方案中，6-TG的量在约1至约15μg/mL的6-TG的范围内。在一些实施方案中，正选择包括使所生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞与嘌呤类似物和别嘌呤醇两者接触。在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞以单次推注施用。在一些实施方案中，将多剂量的经修饰淋巴细胞施用于患者。在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞的每个剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约240×106个细胞/kg。在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞的总剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约730×106个细胞/kg。
在本公开的第二十四额外的实施方案中是一种在对其有治疗需要的患者中治疗血液学癌症的方法，该方法包括：由供体样本生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞，其中基本HPRT缺陷型淋巴细胞通过用表达载体转导供体样本内的淋巴细胞而生成；离体正选择基本HPRT缺陷型淋巴细胞，以提供经修饰淋巴细胞群；通过向患者施用HSC移植物来诱导至少部分移植物抗恶性肿瘤效应；以及在检测到残留疾病或疾病复发后，向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞群。在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用至少一个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂，以抑制GvHD或CRS中的至少一种症状。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2和5-11中的任一者的序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2和5-11中的任一者的序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2和5-11中的任一者的序列具有至少97％同一性。在一些实施方案中，shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列。
在一些实施方案中，二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。在一些实施方案中，正选择包括使所生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞与嘌呤类似物接触。在一些实施方案中，嘌呤类似物是6-TG。在一些实施方案中，6-TG的量在约1至约15μg/mL的范围内。在一些实施方案中，正选择包括使所生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞与嘌呤类似物和别嘌呤醇两者接触。在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞以单次推注施用。在一些实施方案中，将多剂量的经修饰淋巴细胞施用于患者。在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞的每个剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约240×106个细胞/kg。在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞的总剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约730×106个细胞/kg。
在本公开的第二十五额外的实施方案中是一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，该方法包括：由供体样本生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞，其中基本HPRT缺陷型淋巴细胞通过用包括适于敲除HPRT的组分的递送媒介物来转染供体样本内的淋巴细胞而生成；离体正选择基本HPRT缺陷型淋巴细胞，以提供经修饰淋巴细胞群；向患者施用HSC移植物；在施用HSC移植物后，向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞群；以及任选地，如果出现副作用，则施用MTX。
在一些实施方案中，适于敲除HPRT的组分包含与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，适于敲除HPRT的组分包含与SEQ IDNO:25-39中的任一者具有至少95％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，适于敲除HPRT的组分包含靶向选自SEQ ID NO:25-39的核酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，适于敲除HPRT的组分包含Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。在一些实施方案中，适于敲除HPRT的组分包含与SEQ IDNO:25-39中的任一者具有至少90％同一性的指导RNA，以及Cas蛋白(例如，Cas9蛋白、Cas12a蛋白、或Cas12b蛋白)。在一些实施方案中，适于敲除HPRT的组分包含与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少95％同一性的指导RNA，以及Cas蛋白(例如，Cas9蛋白、Cas12a蛋白、或Cas12b蛋白)。在一些实施方案中，递送媒介物是纳米胶囊。在一些实施方案中，递送媒介物是包含一个或多个靶向部分的纳米胶囊。
在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用一个或多个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂。在一些实施方案中，二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。在一些实施方案中，正选择包括使所生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞与嘌呤类似物接触。在一些实施方案中，嘌呤类似物是6-TG。在一些实施方案中，6-TG的量在约1至约15μg/mL的范围内。在一些实施方案中，正选择包括使所生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞与嘌呤类似物和别嘌呤醇两者接触。
在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞以单次推注施用。在一些实施方案中，将多剂量的经修饰淋巴细胞施用于患者。在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞的每个剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约240×106个细胞/kg。在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞的总剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约730×106个细胞/kg。
在本公开的第二十六额外的实施方案中是一种在对其有治疗需要的患者中治疗血液学癌症的方法，该方法包括：由供体样本生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞，其中基本HPRT缺陷型淋巴细胞通过用包括适于敲除HPRT的组分的递送媒介物来转染供体样本内的淋巴细胞而生成；离体正选择基本HPRT缺陷型淋巴细胞，以提供经修饰淋巴细胞群；通过向患者施用HSC移植物来诱导至少部分移植物抗恶性肿瘤效应；以及在检测到残留疾病或疾病复发后，向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞群。
在一些实施方案中，适于敲除HPRT的组分包含与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，适于敲除HPRT的组分包含与SEQ IDNO:25-39中的任一者具有至少95％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，适于敲除HPRT的组分包含靶向选自SEQ ID NO:25-39的核酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，适于敲除HPRT的组分包含Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。在一些实施方案中，适于敲除HPRT的组分包含与SEQ IDNO:25-39中的任一者具有至少90％同一性的指导RNA，以及Cas蛋白(例如，Cas9蛋白、Cas12a蛋白、或Cas12b蛋白)。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。在一些实施方案中，适于敲除HPRT的组分包含与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少95％同一性的指导RNA，以及Cas蛋白(例如，Cas9蛋白、Cas12a蛋白、或Cas12b蛋白)。在一些实施方案中，递送媒介物是纳米胶囊。在一些实施方案中，递送媒介物是包含一个或多个靶向部分的纳米胶囊。
在一些实施方案中，该方法还包括向患者施用至少一个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂，以抑制GvHD或CRS中的至少一种症状。在一些实施方案中，二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。在一些实施方案中，正选择包括使所生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞与嘌呤类似物接触。在一些实施方案中，嘌呤类似物是6-TG。在一些实施方案中，6-TG的量在约1至约15μg/mL的范围内。在一些实施方案中，正选择包括使所生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞与嘌呤类似物和别嘌呤醇两者接触。在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞以单次推注施用。在一些实施方案中，将多剂量的经修饰淋巴细胞施用于患者。在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞的每个剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约240×106个细胞/kg。在一些实施方案中，经修饰淋巴细胞的总剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约730×106个细胞/kg。
在本公开的第二十七额外的实施方案中是一种用次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)缺陷型淋巴细胞治疗患者的方法，该方法包括以下步骤：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)用表达载体转导分离的淋巴细胞；(c)使转导的分离的淋巴细胞暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂；(d)在造血干细胞移植后，向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞的制剂；以及(e)任选地，在患者发展移植物抗宿主病(GvHD)后，施用甲氨蝶呤或麦考酚酸。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQID NO:2和5-11中的任一者的序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2和5-11中的任一者的序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2和5-11中的任一者的序列具有至少97％同一性。在一些实施方案中，shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列。
在一些实施方案中，二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。在一些实施方案中，正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂包含嘌呤类似物。在一些实施方案中，嘌呤类似物是6-TG。在一些实施方案中，6-TG的量在约1至约15μg/mL的范围内。
在本公开的额外实施方案中是一种用HPRT缺陷型淋巴细胞治疗患者的方法，该方法包括以下步骤：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使分离的淋巴细胞与包括适于敲除HPRT的组分的递送媒介物接触，以提供HPRT缺陷型淋巴细胞群；(c)使HPRT缺陷型淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂；(d)在造血干细胞移植后，向患者施用治疗有效量的经修饰淋巴细胞的制剂；以及(e)任选地，在患者发展移植物抗宿主病(GvHD)后，施用二氢叶酸还原酶抑制剂。
在一些实施方案中，二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。在一些实施方案中，正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂包含嘌呤类似物。在一些实施方案中，嘌呤类似物是6-TG。在一些实施方案中，6-TG的量在约1至约15μg/mL的范围内。
在一些实施方案中，适于敲除HPRT的组分包含与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，适于敲除HPRT的组分包含与SEQ IDNO:25-39中的任一者具有至少95％序列同一性的指导RNA。在一些实施方案中，适于敲除HPRT的组分包含靶向选自SEQ ID NO:25-39的核酸序列的指导RNA。在一些实施方案中，适于敲除HPRT的组分还包含Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Cas12蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12a蛋白。在一些实施方案中，Cas12蛋白是Cas12b蛋白。在一些实施方案中，递送媒介物是纳米胶囊。在一些实施方案中，递送媒介物是包含一个或多个靶向部分的纳米胶囊。
在本公开的第二十九额外的实施方案中是经修饰淋巴细胞的制剂用于在造血干细胞移植后向对其有治疗需要的受试者提供淋巴细胞输注益处的用途，其中经修饰淋巴细胞的制剂通过如下方式生成：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)用表达载体转导分离的淋巴细胞；以及(c)使转导的分离的淋巴细胞暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2和5-11中的任一者的序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2和5-11中的任一者的序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2和5-11中的任一者的序列具有至少97％同一性。在一些实施方案中，shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列。
在本公开的第三十额外的实施方案中是经修饰淋巴细胞的制剂用于在造血干细胞移植后向对其有治疗需要的受试者提供淋巴细胞输注益处的用途，其中经修饰淋巴细胞的制剂通过如下方式生成：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使分离的淋巴细胞与包括适于敲除HPRT的组分的递送媒介物接触，以提供HPRT缺陷型淋巴细胞群；以及(c)使HPRT缺陷型淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂。在一些实施方案中，递送媒介物是纳米胶囊。在一些实施方案中，纳米胶囊包含与SEQID NO:25-39中的任一者具有至少90％序列同一性的gRNA以及Cas蛋白(例如，Cas9蛋白、Cas12a蛋白、或Cas12b蛋白)。在一些实施方案中，纳米胶囊包含与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少95％序列同一性的gRNA以及Cas蛋白(例如，Cas9蛋白、Cas12a蛋白、或Cas12b蛋白)。
在本公开的第三十一额外的实施方案中是一种药物组合物，该药物组合物包含(i)慢病毒表达载体，其中慢病毒表达载体包括与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者具有至少90％同一性；以及(ii)药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列具有至少97％同一性。在一些实施方案中，shRNA包含SEQ IDNO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列。
在本公开的第三十二额外的实施方案中是一种试剂盒，该试剂盒包含(i)与SEQID NO:25-39中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA；以及(ii)Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA包含SEQ ID NO:25-39中的任一者的序列。在一些实施方案中，Cas蛋白是Cas9。在一些实施方案中，Cas蛋白是Cas12a。在一些实施方案中，Cas蛋白是Cas12b。
在本公开的第三十三额外的实施方案中是一种纳米胶囊，该纳米胶囊包含(i)与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少90％序列同一性的gRNA；以及(ii)Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ IDNO:25-39中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA包含SEQ ID NO:25-39中的任一者的序列。在一些实施方案中，纳米胶囊包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，至少一个靶向部分靶向T细胞标记。在一些实施方案中，T细胞标记选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127或FoxP3和CD44。在一些实施方案中，T细胞标记是CD3。在一些实施方案中，T细胞标记是CD28。在一些实施方案中，纳米胶囊包含聚合物壳。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊由两种不同的带正电荷的单体、至少一种中性单体，以及交联剂构成。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊不含具有咪唑基团的单体。
在本公开的第三十四额外的实施方案中是一种用纳米胶囊转染的宿主细胞，其中纳米胶囊包含(i)与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少90％序列同一性的gRNA；以及(ii)Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少95％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少97％序列同一性。在一些实施方案中，指导RNA包含SEQ ID NO:25-39中的任一者的序列。在一些实施方案中，纳米胶囊包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，至少一个靶向部分靶向T细胞标记。在一些实施方案中，T细胞标记选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127或FoxP3和CD44。在一些实施方案中，T细胞标记是CD3。在一些实施方案中，T细胞标记是CD28。在一些实施方案中，纳米胶囊包含聚合物壳。在一些实施方案中，纳米胶囊由两种不同的带正电荷的单体、至少一种中性单体，以及交联剂构成。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊不含具有咪唑基团的单体。
在本公开的第三十五额外的实施方案中是经修饰淋巴细胞的制剂用于在造血干细胞移植后向对其有治疗需要的受试者提供淋巴细胞输注益处的用途，其中经修饰淋巴细胞的制剂通过如下方式生成：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使分离的淋巴细胞与纳米胶囊接触，该纳米胶囊包含(i)与SEQ ID NO:25-39中的任一者具有至少90％序列同一性的gRNA；以及(ii)Cas蛋白；以及(c)使HPRT缺陷型淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂。在一些实施方案中，gRNA包含SEQ ID NO:25-39中的任一者的序列。
在本公开的第三十六额外的实施方案中是一种包含表达载体的纳米胶囊，该表达载体包含与第一核酸序列可操作地连接的第一表达控制序列，第一核酸序列编码敲低HPRT的shRNA，其中shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列具有至少90％同一性。在一些实施方案中，shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列具有至少95％同一性。在一些实施方案中，shRNA与SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列具有至少97％同一性。在一些实施方案中，shRNA包含SEQ ID NO:2、5、6、7、8、9、10和11中的任一者的序列。在一些实施方案中，纳米胶囊包含至少一个靶向部分。在一些实施方案中，纳米胶囊包含聚合物壳。在一些实施方案中，聚合物纳米胶囊由两种不同的带正电荷的单体、至少一种中性单体，以及交联剂构成。在一些实施方案中，至少一个靶向部分靶向T细胞标记。在一些实施方案中，T细胞标记选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127或FoxP3和CD44。在一些实施方案中，T细胞标记是CD3。在一些实施方案中，T细胞标记是CD28。
进一步实施方案
进一步实施方案1一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，其包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；以及(c)向所述患者施用治疗有效量的所述经修饰淋巴细胞群。
进一步实施方案2根据进一步实施方案1所述的方法，其还包括向所述患者施用HSC移植物。
进一步实施方案3根据进一步实施方案2所述的方法，其中所述HSC移植物在施用所述经修饰淋巴细胞群之前、同时、或之后施用。
进一步实施方案4根据进一步实施方案1所述的方法，其中所述指导RNA分子靶向HPRT 1基因的外显子3内的序列。
进一步实施方案5根据进一步实施方案1所述的方法，其中所述指导RNA分子靶向HPRT 1基因的外显子8内的序列。
进一步实施方案6根据进一步实施方案1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少90％序列同一性。
进一步实施方案7根据进一步实施方案1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少95％序列同一性。
进一步实施方案8根据进一步实施方案1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少97％序列同一性。
进一步实施方案9根据进一步实施方案1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者。
进一步实施方案10根据前述进一步实施方案中任一项所述的方法，其中所述内切核酸酶包含Cas蛋白。
进一步实施方案11根据进一步实施方案10所述的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas9蛋白。
进一步实施方案12根据进一步实施方案10所述的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas12蛋白。
进一步实施方案13根据进一步实施方案12所述的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12a蛋白。
进一步实施方案14根据进一步实施方案12所述的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
进一步实施方案15根据前述进一步实施方案中任一项所述的方法，其中用病毒递送媒介物、非病毒递送媒介物，或者通过物理方法来转染或转导从所述供体样本获得的淋巴细胞。
进一步实施方案16根据进一步实施方案15所述的方法，其中所述物理方法选自显微注射和电穿孔。
进一步实施方案17根据进一步实施方案15所述的方法，其中所述非病毒递送媒介物是纳米胶囊。
进一步实施方案18根据进一步实施方案17所述的方法，其中所述纳米胶囊包含至少一个靶向部分。
进一步实施方案19根据进一步实施方案18所述的方法，其中所述至少一个靶向部分靶向选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127、FoxP3和CD44的分化标记簇。
进一步实施方案20根据前述进一步实施方案中任一项所述的方法，其还包括活化一种或多种选自CD28、ICOS、CTLA4、PD1、PD1H和BTLA的细胞表面标记。
进一步实施方案21根据进一步实施方案15所述的方法，其中所述病毒递送媒介物是表达载体，并且其中所述表达载体包括编码所述内切核酸酶的第一核酸序列以及编码所述指导RNA分子的第二核酸。
进一步实施方案22根据进一步实施方案21所述的方法，其中所述表达载体是慢病毒表达载体。
进一步实施方案23根据前述进一步实施方案中任一项所述的方法，其中与未转染的供体淋巴细胞相比，所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约70％。
进一步实施方案24根据前述进一步实施方案中任一项所述的方法，其中与未转染的供体淋巴细胞相比，所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约80％。
进一步实施方案25根据前述进一步实施方案中任一项所述的方法，其中与未转染的供体淋巴细胞相比，所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约90％。
进一步实施方案26根据前述进一步实施方案中任一项所述的方法，其中所述正选择包括使所述生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞群与嘌呤类似物接触。
进一步实施方案27根据进一步实施方案26所述的方法，其中所述嘌呤类似物选自6-TG和6-MP。
进一步实施方案28根据进一步实施方案26至27中任一项所述的进一步实施方案的方法，其中所述嘌呤类似物的量在约1至约15μg/mL的范围内。
进一步实施方案29根据前述进一步实施方案中任一项所述的方法，其中所述正选择包括使所述生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞群与嘌呤类似物和别嘌呤醇两者接触。
进一步实施方案30根据进一步实施方案中任一项所述的方法，其中至少约70％的所述经修饰淋巴细胞群对二氢叶酸还原酶抑制剂敏感。
进一步实施方案31根据前述进一步实施方案中任一项所述的方法，其还包括向所述患者施用一个或多个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂。
进一步实施方案32根据进一步实施方案31所述的方法，其中所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。
进一步实施方案33根据前述进一步实施方案中任一项所述的方法，其中所述群体修饰的淋巴细胞以单次推注施用。
进一步实施方案34根据前述进一步实施方案中任一项所述的方法，其中将多剂量的所述经修饰淋巴细胞群施用于所述患者。
进一步实施方案35根据进一步实施方案34所述的方法，其中所述多剂量的每个剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约240×106个细胞/kg。
进一步实施方案36根据进一步实施方案35所述的方法，其中总剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约730×106个细胞/kg。
进一步实施方案37一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，其包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列的指导RNA分子来转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；(c)向所述患者施用治疗有效量的所述经修饰淋巴细胞群。
进一步实施方案38根据进一步实施方案37所述的方法，其还包括向所述患者施用HSC移植物。
进一步实施方案39根据进一步实施方案38所述的方法，其中所述HSC移植物在施用所述经修饰淋巴细胞群之前、同时、或之后施用。
进一步实施方案40根据进一步实施方案37至39中任一项所述的方法，其中所述指导RNA分子与位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。
进一步实施方案41根据进一步实施方案37至39中任一项所述的方法，其中所述指导RNA分子靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。
进一步实施方案42根据进一步实施方案41所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约14个核苷酸至约30个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案43根据进一步实施方案41所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案44根据进一步实施方案41所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案45根据进一步实施方案37至39中任一项所述的方法，其中所述指导RNA分子与位于约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。
进一步实施方案46根据进一步实施方案37至39中任一项所述的方法，其中所述指导RNA分子靶向位于约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。
进一步实施方案47根据进一步实施方案46所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约14个核苷酸至约30个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案48根据进一步实施方案46所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案49根据进一步实施方案46所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案50根据进一步实施方案37至39中任一项所述的方法，其中所述指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少90％序列同一性。
进一步实施方案51根据进一步实施方案37至39中任一项所述的方法，其中所述指导RNA分子基因与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少95％序列同一性。
进一步实施方案52根据进一步实施方案37至39中任一项所述的方法，其中所述指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少97％序列同一性。
进一步实施方案53根据进一步实施方案37至39中任一项所述的方法，其中所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者。
进一步实施方案54根据进一步实施方案37至53中任一项所述的方法，其中所述内切核酸酶包含Cas蛋白。
进一步实施方案55根据进一步实施方案54所述的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas9蛋白。
进一步实施方案56根据进一步实施方案54所述的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas12蛋白。
进一步实施方案57根据进一步实施方案56所述的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12a蛋白。
进一步实施方案58根据进一步实施方案56所述的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
进一步实施方案59根据进一步实施方案37至58中任一项所述的方法，其中用病毒递送媒介物、非病毒递送媒介物，或者通过物理方法来转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞。
进一步实施方案60根据进一步实施方案59所述的方法，其中所述物理方法选自显微注射和电穿孔。
进一步实施方案61根据进一步实施方案59所述的方法，其中所述非病毒递送媒介物是纳米胶囊。
进一步实施方案62根据进一步实施方案61所述的方法，其中所述纳米胶囊包含至少一个靶向部分。
进一步实施方案63根据进一步实施方案62所述的方法，其中所述至少一个靶向部分靶向选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127、FoxP3和CD44的分化标记簇。
进一步实施方案64根据进一步实施方案37至63中任一项所述的方法，其还包括活化一种或多种选自CD28、ICOS、CTLA4、PD1、PD1H和BTLA的细胞表面标记。
进一步实施方案65根据进一步实施方案37至58中任一项所述的方法，其中所述病毒递送媒介物是表达载体，并且其中所述表达载体包括编码所述内切核酸酶的第一核酸序列以及编码所述指导RNA分子的第二核酸。
进一步实施方案66根据进一步实施方案65所述的方法，其中所述表达载体是慢病毒表达载体。
进一步实施方案67根据进一步实施方案37至66中任一项所述的方法，其中与未转染的供体淋巴细胞相比，所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约70％。
进一步实施方案68根据进一步实施方案37至66中任一项所述的方法，其中与未转染的供体淋巴细胞相比，所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约80％。
进一步实施方案69根据进一步实施方案37至66中任一项所述的方法，其中与未转染的供体淋巴细胞相比，所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约90％。
进一步实施方案70根据进一步实施方案37至66中任一项所述的方法，其中所述正选择包括使所述生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞群与嘌呤类似物接触。
进一步实施方案71根据进一步实施方案70所述的方法，其中所述嘌呤类似物选自6-TG和6-MP。
进一步实施方案72根据进一步实施方案70至71中任一项所述的方法，其中所述嘌呤类似物的量在约1至约15μg/mL的范围内。
进一步实施方案73根据进一步实施方案37至69中任一项所述的方法，其中所述正选择包括使所述生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞群与嘌呤类似物和别嘌呤醇两者接触。
进一步实施方案74根据进一步实施方案37至73中任一项所述的方法，其中至少约70％的所述经修饰淋巴细胞对二氢叶酸还原酶抑制剂敏感。
进一步实施方案75根据进一步实施方案37至74中任一项所述的方法，其还包括向所述患者施用一个或多个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂。
进一步实施方案76根据进一步实施方案75所述的方法，其中所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。
进一步实施方案77根据进一步实施方案37至76中任一项所述的方法，其中所述经修饰淋巴细胞以单次推注施用。
进一步实施方案78根据进一步实施方案37至76中任一项所述的方法，其中将多剂量的所述经修饰淋巴细胞施用于所述患者。
进一步实施方案79根据进一步实施方案37至78中任一项所述的方法，其中所述多剂量的每个剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约240×106个细胞/kg。
进一步实施方案80根据进一步实施方案79所述的方法，其中总剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约730×106个细胞/kg。
进一步实施方案81一种在对其有治疗需要的患者中治疗血液学癌症的方法，其包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；(c)通过向所述患者施用HSC移植物来诱导至少部分移植物抗恶性肿瘤效应；以及(d)在检测到残留疾病或疾病复发后，向所述患者施用治疗有效量的所述经修饰淋巴细胞群。
进一步实施方案82根据进一步实施方案81所述的方法，其中所述指导RNA分子靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。
进一步实施方案83根据进一步实施方案82所述的方法，其中所述指导RNA分子与位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。
进一步实施方案84根据进一步实施方案82所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约14个核苷酸至约30个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案85根据进一步实施方案82所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案86根据进一步实施方案82所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案87根据进一步实施方案81所述的方法，其中所述指导RNA分子靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。
进一步实施方案88根据进一步实施方案87所述的方法，其中所述指导RNA分子与位于基于基因组构建物GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。
进一步实施方案89根据进一步实施方案87所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约14个核苷酸至约30个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案90根据进一步实施方案87所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案91根据进一步实施方案87所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案92根据进一步实施方案81所述的方法，其中所述指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少90％序列同一性。
进一步实施方案93根据进一步实施方案81所述的方法，其中所述指导RNA分子基因与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少95％序列同一性。
进一步实施方案94根据进一步实施方案81所述的方法，其中所述指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少97％序列同一性。
进一步实施方案95根据进一步实施方案81所述的方法，其中所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者。
进一步实施方案96根据进一步实施方案81所述的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas9蛋白。
进一步实施方案97根据进一步实施方案81所述的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas12蛋白。
进一步实施方案98根据进一步实施方案81所述的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12a蛋白。
进一步实施方案99根据进一步实施方案81所述的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
进一步实施方案100根据进一步实施方案81至99中任一项所述的方法，其中用病毒递送媒介物、非病毒递送媒介物，或者通过物理方法来转染或转导从所述供体样本获得的淋巴细胞。
进一步实施方案101根据进一步实施方案100所述的方法，其中所述物理方法选自显微注射和电穿孔。
进一步实施方案102根据进一步实施方案100所述的方法，其中所述非病毒递送媒介物是纳米胶囊。
进一步实施方案103根据进一步实施方案102所述的方法，其中所述纳米胶囊包含至少一个靶向部分。
进一步实施方案104根据进一步实施方案103所述的方法，其中所述至少一个靶向部分靶向选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127、FoxP3和CD44的分化标记簇。
进一步实施方案105根据进一步实施方案100中任一项所述的方法，其中所述病毒递送媒介物是表达载体，并且其中所述表达载体包括编码所述内切核酸酶的第一核酸序列以及编码所述指导RNA分子的第二核酸。
进一步实施方案106根据进一步实施方案105所述的方法，其中所述表达载体是慢病毒表达载体。
进一步实施方案107根据进一步实施方案81至106中任一项所述的方法，其中与未转染的供体淋巴细胞相比，所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约70％。
进一步实施方案108根据进一步实施方案81至106中任一项所述的方法，其中与未转染的供体淋巴细胞相比，所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约80％。
进一步实施方案109根据进一步实施方案81至106中任一项所述的方法，其中与未转染的供体淋巴细胞相比，所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约90％。
进一步实施方案110根据进一步实施方案81至109中任一项所述的方法，其中所述正选择包括使所述生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞群与嘌呤类似物接触。
进一步实施方案111根据进一步实施方案110所述的方法，其中所述嘌呤类似物选自6-TG和6-MP。
进一步实施方案112根据进一步实施方案110中任一项所述的方法，其中所述嘌呤类似物的量在约1至约15μg/mL的范围内。
进一步实施方案113根据进一步实施方案81至109中任一项所述的方法，其中所述正选择包括使所述生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞群与嘌呤类似物和别嘌呤醇两者接触。
进一步实施方案114根据进一步实施方案81至113中任一项所述的方法，其中至少约70％的所述经修饰淋巴细胞对二氢叶酸还原酶抑制剂敏感。
进一步实施方案115根据进一步实施方案81至113中任一项所述的方法，其还包括向所述患者施用一个或多个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂。
进一步实施方案116根据进一步实施方案115所述的方法，其中所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。
进一步实施方案117根据进一步实施方案81至116中任一项所述的方法，其中所述经修饰淋巴细胞以单次推注施用。
进一步实施方案118根据进一步实施方案81至116中任一项所述的方法，其中将多剂量的所述经修饰淋巴细胞施用于所述患者。
进一步实施方案119根据进一步实施方案118所述的方法，其中所述多剂量的每个剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约240×106个细胞/kg。
进一步实施方案120根据进一步实施方案118所述的方法，其中总剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约730×106个细胞/kg。
进一步实施方案121一种用HPRT缺陷型淋巴细胞治疗患者的方法，其包括以下步骤：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使所述分离的淋巴细胞与(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子接触；(c)使所述HPRT缺陷型淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂；(d)在造血干细胞移植后，向所述患者施用治疗有效量的所述经修饰淋巴细胞的制剂；以及(e)任选地，在所述患者发展移植物抗宿主病(GvHD)后，施用二氢叶酸还原酶抑制剂。
进一步实施方案122根据进一步实施方案121所述的方法，其中所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。
进一步实施方案123根据进一步实施方案121至122中任一项所述的方法，其中正选择所述HPRT缺陷型淋巴细胞的所述试剂包含嘌呤类似物。
进一步实施方案124根据进一步实施方案123所述的方法，其中所述嘌呤类似物选自6-TG和6-MP。
进一步实施方案125根据进一步实施方案123所述的方法，其中嘌呤类似物的量在约1至约15μg/mL的范围内。
进一步实施方案126根据进一步实施方案121所述的方法，其中所述指导RNA分子靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。
进一步实施方案127根据进一步实施方案126所述的方法，其中所述指导RNA分子与位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。
进一步实施方案128根据进一步实施方案126所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约14个核苷酸至约30个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案129根据进一步实施方案126所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案130根据进一步实施方案126所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案131根据进一步实施方案121所述的方法，其中所述指导RNA分子靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。
进一步实施方案132根据进一步实施方案131所述的方法，其中所述指导RNA分子与位于基于基因组构建物GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。
进一步实施方案133根据进一步实施方案131所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约14个核苷酸至约30个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案134根据进一步实施方案131所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案135根据进一步实施方案131所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案136根据进一步实施方案121所述的方法，其中所述指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少90％序列同一性。
进一步实施方案137根据进一步实施方案121所述的方法，其中所述指导RNA分子基因与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少95％序列同一性。
进一步实施方案138根据进一步实施方案121所述的方法，其中所述指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少97％序列同一性。
进一步实施方案139根据进一步实施方案121所述的方法，其中所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者。
进一步实施方案140根据进一步实施方案121所述的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas9蛋白。
进一步实施方案141根据进一步实施方案121所述的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas12蛋白。
进一步实施方案142根据进一步实施方案141所述的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12a蛋白。
进一步实施方案143根据进一步实施方案141所述的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
进一步实施方案144根据进一步实施方案121至143中任一项所述的方法，其中从所述供体样本获得的所述淋巴细胞与病毒递送媒介物(包括非病毒递送媒介物)接触，或者通过物理方法接触。
进一步实施方案145根据进一步实施方案144所述的方法，其中所述物理方法选自显微注射和电穿孔。
进一步实施方案146根据进一步实施方案144所述的方法，其中所述非病毒递送媒介物是纳米胶囊。
进一步实施方案147根据进一步实施方案146所述的方法，其中所述纳米胶囊包含至少一个靶向部分。
进一步实施方案148根据进一步实施方案147所述的方法，其中所述至少一个靶向部分靶向选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127、FoxP3和CD44的分化标记簇。
进一步实施方案149根据进一步实施方案121至148中任一项所述的方法，其中所述递送媒介物是表达载体，并且其中所述表达载体包括编码所述内切核酸酶的第一核酸序列以及编码所述指导RNA分子的第二核酸。
进一步实施方案150根据进一步实施方案121至149所述的方法，其中所述表达载体是慢病毒表达载体。
进一步实施方案151根据进一步实施方案121至150中任一项所述的方法，其中所述制剂以单次推注施用。
进一步实施方案152根据进一步实施方案121至150中任一项所述的方法，其中将多剂量的所述制剂施用于所述患者。
进一步实施方案153根据进一步实施方案152所述的方法，其中所述制剂的每个剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约240×106个细胞/kg。
进一步实施方案154根据进一步实施方案152所述的方法，其中制剂的总剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约730×106个细胞/kg。
进一步实施方案155经修饰淋巴细胞的制剂用于向对其有治疗需要的受试者提供淋巴细胞输注益处的用途，其中所述经修饰淋巴细胞制剂通过如下方式生成：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使所述分离的淋巴细胞与包含(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子接触，以提供基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；以及(c)使所述HPRT缺陷型淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂。
进一步实施方案156根据进一步实施方案155所述的用途，其中所述受试者在造血干细胞移植后需要治疗。
进一步实施方案157根据进一步实施方案155或156所述的制剂的用途，其中所述指导RNA分子靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。
进一步实施方案158根据进一步实施方案157所述的制剂的用途，其中所述指导RNA分子与位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。
进一步实施方案159根据进一步实施方案157所述的制剂的用途，其中所靶向的所述序列具有约14个核苷酸至约30个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案160根据进一步实施方案157所述的制剂的用途，其中所靶向的所述序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案161根据进一步实施方案157所述的制剂的用途，其中所靶向的所述序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案162根据进一步实施方案155和156中任一项所述的制剂的用途，其中所述指导RNA分子靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。
进一步实施方案163根据进一步实施方案162所述的制剂的用途，其中所述指导RNA分子与位于基于基因组构建物GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。
进一步实施方案164根据进一步实施方案162所述的制剂的用途，其中所靶向的所述序列具有约14个核苷酸至约30个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案165根据进一步实施方案162所述的制剂的用途，其中所靶向的所述序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案166根据进一步实施方案162所述的制剂的用途，其中所靶向的所述序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案167根据进一步实施方案155所述的制剂的用途，其中所述指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少90％序列同一性。
进一步实施方案168根据进一步实施方案155所述的制剂的用途，其中所述指导RNA分子基因与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少95％序列同一性。
进一步实施方案169根据进一步实施方案155所述的制剂的用途，其中所述指导RNA分子与SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者具有至少97％序列同一性。
进一步实施方案170根据进一步实施方案155所述的制剂的用途，其中所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:40-44和46-56中的任一者。
进一步实施方案171 一种试剂盒，其包含：(i)与SEQ ID NO:40-49中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA分子；以及(ii)Cas蛋白。
进一步实施方案172根据进一步实施方案171所述的试剂盒，其中所述Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。
进一步实施方案173根据进一步实施方案171至172中任一项所述的试剂盒，其中所述指导RNA分子与SEQ ID NO:40-56中的任一者具有至少95％序列同一性。
进一步实施方案174根据进一步实施方案171至172中任一项所述的试剂盒，其中所述指导RNA分子与SEQ ID NO:40-56中的任一者具有至少97％序列同一性。
进一步实施方案175根据进一步实施方案171至172中任一项所述的试剂盒，其中所述指导RNA分子与SEQ ID NO:40-56中的任一者具有至少99％序列同一性。
进一步实施方案176根据进一步实施方案171至172中任一项所述的试剂盒，其中所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:40-56中的任一者。
进一步实施方案177一种试剂盒，其包含：(i)指导RNA分子，所述指导RNA分子靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列，以及(ii)Cas蛋白。
进一步实施方案178根据进一步实施方案177所述的试剂盒，其中所述Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。
进一步实施方案179根据进一步实施方案177所述的试剂盒，其中所述指导RNA分子与位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。
进一步实施方案180根据进一步实施方案177所述的试剂盒，其中所靶向的所述序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案181根据进一步实施方案177所述的试剂盒，其中所靶向的所述序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案182一种试剂盒，其包含：(i)指导RNA分子，所述指导RNA分子靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列，以及(ii)Cas蛋白。
进一步实施方案183根据进一步实施方案182所述的试剂盒，其中所述Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。
进一步实施方案184根据进一步实施方案182所述的试剂盒，其中所述指导RNA分子与位于基于基因组构建物GRCh38的约134498608至约134498684之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。
进一步实施方案185根据进一步实施方案182所述的试剂盒，其中所靶向的所述序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案186根据进一步实施方案182所述的试剂盒，其中所靶向的所述序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案187一种纳米胶囊，其包含(i)与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA分子；以及(ii)Cas蛋白。
进一步实施方案188根据进一步实施方案187所述的纳米胶囊，其中所述Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。
进一步实施方案189根据进一步实施方案187至188中任一项所述的纳米胶囊，其中所述指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少95％序列同一性。
进一步实施方案190根据进一步实施方案187至188中任一项所述的纳米胶囊，其中所述指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少98％序列同一性。
进一步实施方案191根据进一步实施方案187至188中任一项所述的纳米胶囊，其中所述纳米胶囊包含至少一个靶向部分。
进一步实施方案192根据进一步实施方案191所述的纳米胶囊，其中所述至少一个靶向部分靶向选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127或FoxP3和CD44的分化标记簇。
进一步实施方案193根据进一步实施方案187至192中任一项所述的纳米胶囊，其中所述纳米胶囊包含聚合物壳。
进一步实施方案194根据进一步实施方案187至193中任一项所述的纳米胶囊，其中聚合物纳米胶囊由两种不同的带正电荷的单体、至少一种中性单体，以及交联剂构成。
进一步实施方案195一种宿主细胞，其用根据进一步实施方案187-194中任一项所述的纳米胶囊转染。
进一步实施方案196根据进一步实施方案195所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原代T淋巴细胞。
进一步实施方案197根据进一步实施方案195所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CEM细胞。
进一步实施方案198经修饰淋巴细胞的制剂用于在造血干细胞移植后向对其有治疗需要的受试者提供淋巴细胞输注益处的用途，其中所述经修饰淋巴细胞的制剂通过如下方式生成：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使所述分离的淋巴细胞与根据进一步实施方案187至194中任一项所述的纳米胶囊接触，以及(c)使所述HPRT缺陷型淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂。
进一步实施方案199一种试剂盒，其包含根据进一步实施方案187至194中任一项所述的纳米胶囊，以及二氢叶酸还原酶抑制剂。
进一步实施方案200根据进一步实施方案199所述的试剂盒，其中所述二氢叶酸还原酶抑制剂是MTX或MPA。
进一步实施方案201一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，其包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子2、外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；以及(c)在施用HSC移植物后，向所述患者施用治疗有效量的所述经修饰淋巴细胞群。
进一步实施方案202根据进一步实施方案201所述的方法，其还包括向所述患者施用HSC移植物。
进一步实施方案203根据进一步实施方案202所述的方法，其中所述HSC移植物在施用所述经修饰淋巴细胞群之前、同时、或之后施用。
进一步实施方案204根据进一步实施方案201所述的方法，其中所述指导RNA分子靶向HPRT 1基因的外显子2内的序列。
进一步实施方案205根据进一步实施方案201所述的方法，其中所述指导RNA分子靶向HPRT 1基因的外显子3内的序列。
进一步实施方案206根据进一步实施方案201所述的方法，其中所述指导RNA分子靶向HPRT 1基因的外显子8内的序列。
进一步实施方案207根据进一步实施方案201所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2、外显子3或外显子8之一内的序列的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少90％序列同一性。
进一步实施方案208根据进一步实施方案201所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2、外显子3或外显子8之一内的序列的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少95％序列同一性。
进一步实施方案209根据进一步实施方案201所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2、外显子3或外显子8之一内的序列的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少97％序列同一性。
进一步实施方案210根据进一步实施方案201所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2、外显子3或外显子8之一内的序列的所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:40-61中的任一者。
进一步实施方案211根据进一步实施方案-201至210中任一项所述的方法，其中所述内切核酸酶包含Cas蛋白。
进一步实施方案212根据进一步实施方案211所述的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas9蛋白。
进一步实施方案213根据进一步实施方案211所述的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas12蛋白。
进一步实施方案214根据进一步实施方案213所述的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12a蛋白。
进一步实施方案215根据进一步实施方案213所述的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
进一步实施方案216根据进一步实施方案201至215中任一项所述的方法，其中用病毒递送媒介物、非病毒递送媒介物，或者通过物理方法来转染或转导从所述供体样本获得的淋巴细胞。
进一步实施方案217根据进一步实施方案216所述的方法，其中所述物理方法选自显微注射和电穿孔。
进一步实施方案218根据进一步实施方案216所述的方法，其中所述非病毒递送媒介物是纳米胶囊。
进一步实施方案219根据进一步实施方案218所述的方法，其中所述纳米胶囊包含至少一个靶向部分。
进一步实施方案220根据进一步实施方案219所述的方法，其中所述至少一个靶向部分靶向选自CD3、CD4、CD7、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、RO、CD56、CD62L、CD127、FoxP3和CD44的分化标记簇。
进一步实施方案221一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，其包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；以及(c)向所述患者施用治疗有效量的所述经修饰淋巴细胞群。
进一步实施方案222根据进一步实施方案221所述的方法，其还包括向所述患者施用HSC移植物。
进一步实施方案223根据进一步实施方案222所述的方法，其中所述HSC移植物在施用所述经修饰淋巴细胞群之前、同时、或之后施用。
进一步实施方案224根据进一步实施方案221所述的方法，其中所述指导RNA与SEQID NO:40-61中的任一者具有至少95％序列同一性。
进一步实施方案225根据进一步实施方案221所述的方法，其中所述指导RNA与SEQID NO:40-61中的任一者具有至少97％序列同一性。
进一步实施方案226根据进一步实施方案221所述的方法，其中所述指导RNA与SEQID NO:40-4961中的任一者具有至少99％序列同一性。
进一步实施方案227根据进一步实施方案221所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:40-61中的任一者。
进一步实施方案228一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，其包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子2内的序列的指导RNA分子转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；(c)向所述患者施用HSC移植物；以及(d)在施用HSC移植物后，向所述患者施用治疗有效量的所述经修饰淋巴细胞群。
进一步实施方案229根据进一步实施方案228所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少90％序列同一性。
进一步实施方案230根据进一步实施方案228所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少95％序列同一性。
进一步实施方案231根据进一步实施方案228所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少97％序列同一性。
进一步实施方案232根据进一步实施方案228所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少99％序列同一性。
进一步实施方案233根据进一步实施方案228所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:45和57-61中的任一者。
进一步实施方案234一种在对其有治疗需要的患者中治疗血液学癌症的方法，其包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子2内的序列的指导RNA分子转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；(c)通过向所述患者施用HSC移植物来诱导至少部分移植物抗恶性肿瘤效应；以及(d)在检测到残留疾病或疾病复发后，向所述患者施用治疗有效量的所述经修饰淋巴细胞群。
进一步实施方案235根据进一步实施方案234所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少90％序列同一性。
进一步实施方案236根据进一步实施方案234所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少95％序列同一性。
进一步实施方案237根据进一步实施方案234所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少97％序列同一性。
进一步实施方案238根据进一步实施方案234所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少99％序列同一性。
进一步实施方案239根据进一步实施方案234所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:45和57-61中的任一者。
进一步实施方案240一种用HPRT缺陷型淋巴细胞治疗患者的方法，其包括以下步骤：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使所述分离的淋巴细胞与(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子2内的序列的指导RNA分子接触；(c)使所述HPRT缺陷型淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂；(d)在造血干细胞移植后，向所述患者施用治疗有效量的所述经修饰淋巴细胞的制剂；以及(e)任选地，在所述患者发展移植物抗宿主病(GvHD)后，施用二氢叶酸还原酶抑制剂。
进一步实施方案241根据进一步实施方案240所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少90％序列同一性。
进一步实施方案242根据进一步实施方案240所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少95％序列同一性。
进一步实施方案243根据进一步实施方案240所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少97％序列同一性。
进一步实施方案244根据进一步实施方案240所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少99％序列同一性。
进一步实施方案245根据进一步实施方案240所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:45和57-61中的任一者。
进一步实施方案246经修饰淋巴细胞的制剂用于在造血干细胞移植后向对其有治疗需要的受试者提供淋巴细胞输注益处的用途，其中所述经修饰淋巴细胞的制剂通过如下方式生成：(a)从供体受试者分离淋巴细胞；(b)使所述分离的淋巴细胞与(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子2内的序列的指导RNA分子接触，以提供基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；以及(c)使所述HPRT缺陷型淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂。
进一步实施方案247根据进一步实施方案246所述的用途，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少90％序列同一性。
进一步实施方案248根据进一步实施方案246所述的用途，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少95％序列同一性。
进一步实施方案249根据进一步实施方案246所述的用途，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少97％序列同一性。
进一步实施方案250根据进一步实施方案246所述的用途，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少99％序列同一性。
进一步实施方案251根据进一步实施方案246所述的用途，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:45和57-61中的任一者。
进一步实施方案252一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，其包括：(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134473409至约134473460之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列的指导RNA分子来转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；(b)离体正选择所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；(c)向所述患者施用治疗有效量的所述经修饰淋巴细胞群。
进一步实施方案253根据进一步实施方案252所述的方法，其还包括向所述患者施用HSC移植物。
进一步实施方案254根据进一步实施方案252所述的方法，其中所述HSC移植物在施用所述经修饰淋巴细胞群之前、同时、或之后施用。
进一步实施方案255根据进一步实施方案252至254中任一项所述的方法，其中所述指导RNA分子与位于基于基因组构建物GRCh38的约134473409至约134473460之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。
进一步实施方案256根据进一步实施方案255所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约14个核苷酸至约30个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案257根据进一步实施方案255所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约18个核苷酸至约26个核苷酸范围内的长度。
进一步实施方案258根据进一步实施方案255所述的方法，其中所靶向的所述序列具有约21个核苷酸至约25个核苷酸范围内的长度。
在本说明书中提及的和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开均全文以引用方式并入本文。实施方案的一些方面可根据需要修改，以采用各种专利、申请和公开的概念来提供其它实施方案。
尽管已经参考多个例示性实施方案描述了本公开，但是应当理解，本领域的技术人员可设计出落入本公开的原理的精神和范围内的许多其它修改和实施方案。更具体地，在不脱离本公开的精神的情况下，在前述公开、附图和所附权利要求的范围内，合理的变型和修改在主题组合布置的构成部分和/或布置中是可能的。除了构成部分和/或布置的变型和修改之外，替代用途对于本领域的技术人员也是显而易见的。
序列表
<110> 美国杰特贝林生物制品有限公司
C-G·陈
W·J·阿扎
A·L-C·胡
C·W·阿尔玛
<120> 具有杀伤开关的供体T细胞
<130> Calimmune-097WO
<150> US 63/044,697
<151> 2020-06-26
<160> 61
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: shHPRT 734
<400> 1
aggatatgcc cttgactatt tgtccgacat agtcaagggc atatcctttt tt 52
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Modified sh734
<400> 2
aggatatgcc cttgactatg ccctgaccca gcatagtcaa gggcatatcc t 51
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: shRNA targeting an HPRT gene
<400> 3
aggatatgcc cttgactatt tgtccgacat agtcaagggc atatcc 46
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: shRNA targeting an HPRT gene
<400> 4
tcctatacgg gaactgataa acaggctgta tcagttcccg tatagg 46
<210> 5
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: shHPRT 616
<400> 5
gcaggcagta taatccaaat acctgaccca tatttggatt atactgcctg cttttt 56
<210> 6
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: shHPRT 211
<400> 6
ggttatgacc ttgatttata cctgacccat attaaatcaa ggtcataacc ttttt 55
<210> 7
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: shHPRT 734.1
<400> 7
gggatatgcc cttgactaat acctgaccca tattagtcaa gggcatatcc cttttt 56
<210> 8
<211> 111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: miRNA734 de novo (DNA form)
<400> 8
acccgtacat atttttgtgt agctctagtt tatagtcaag ggcatatcct tgtgtttttt 60
ttgaaggata tgcccttgac tataaactag cgctacactt tttcgtcttg t 111
<210> 9
<211> 111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: miRNA211 de novo (DNA form)
<400> 9
acccgtacat atttttgtgt agctctagtt ataaatcaag gtcataacct tgtgtttttt 60
ttgaaggtta tgaccttgat ttataactag cgctacactt tttcgtcttg t 111
<210> 10
<211> 166
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: miRNA211-3G
<400> 10
ccggatcaac gccctaggtt tatgtttgga tgaactgaca tacgcgtatc cgtcttttaa 60
atcaaggtca taaccgtagt gaaatatata ttaaacaggt tatgaccttg atttaaaata 120
cggtaacgcg gaattcgcaa ctattttatc aattttttgc gtcgac 166
<210> 11
<211> 166
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: miRNA734-3G
<400> 11
ccggatcaac gccctaggtt tatgtttgga tgaactgaca tacgcgtatc cgtcttatag 60
tcaagggcat atcctgtagt gaaatatata ttaaacaagg atatgccctt gactataata 120
cggtaacgcg gaattcgcaa ctattttatc aattttttgc gtcgac 166
<210> 12
<211> 1435
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<223> Homo sapiens hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1),
mRNA
<400> 12
ggcggggcct gcttctcctc agcttcaggc ggctgcgacg agccctcagg cgaacctctc 60
ggctttcccg cgcggcgccg cctcttgctg cgcctccgcc tcctcctctg ctccgccacc 120
ggcttcctcc tcctgagcag tcagcccgcg cgccggccgg ctccgttatg gcgacccgca 180
gccctggcgt cgtgattagt gatgatgaac caggttatga ccttgattta ttttgcatac 240
ctaatcatta tgctgaggat ttggaaaggg tgtttattcc tcatggacta attatggaca 300
ggactgaacg tcttgctcga gatgtgatga aggagatggg aggccatcac attgtagccc 360
tctgtgtgct caaggggggc tataaattct ttgctgacct gctggattac atcaaagcac 420
tgaatagaaa tagtgataga tccattccta tgactgtaga ttttatcaga ctgaagagct 480
attgtaatga ccagtcaaca ggggacataa aagtaattgg tggagatgat ctctcaactt 540
taactggaaa gaatgtcttg attgtggaag atataattga cactggcaaa acaatgcaga 600
ctttgctttc cttggtcagg cagtataatc caaagatggt caaggtcgca agcttgctgg 660
tgaaaaggac cccacgaagt gttggatata agccagactt tgttggattt gaaattccag 720
acaagtttgt tgtaggatat gcccttgact ataatgaata cttcagggat ttgaatcatg 780
tttgtgtcat tagtgaaact ggaaaagcaa aatacaaagc ctaagatgag agttcaagtt 840
gagtttggaa acatctggag tcctattgac atcgccagta aaattatcaa tgttctagtt 900
ctgtggccat ctgcttagta gagctttttg catgtatctt ctaagaattt tatctgtttt 960
gtactttaga aatgtcagtt gctgcattcc taaactgttt atttgcacta tgagcctata 1020
gactatcagt tccctttggg cggattgttg tttaacttgt aaatgaaaaa attctcttaa 1080
accacagcac tattgagtga aacattgaac tcatatctgt aagaaataaa gagaagatat 1140
attagttttt taattggtat tttaattttt atatatgcag gaaagaatag aagtgattga 1200
atattgttaa ttataccacc gtgtgttaga aaagtaagaa gcagtcaatt ttcacatcaa 1260
agacagcatc taagaagttt tgttctgtcc tggaattatt ttagtagtgt ttcagtaatg 1320
ttgactgtat tttccaactt gttcaaatta ttaccagtga atctttgtca gcagttccct 1380
tttaaatgca aatcaataaa ttcccaaaaa tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1435
<210> 13
<211> 299
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: 7sk/sh734 expression cassette sequence
<400> 13
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gcagaacaat ttgctgaggg ctattgaggc gcaacagcat ctgttgcaac tcacagtctg 300
gggcatcaag cagctccagg caagaatcct ggctgtggaa agatacctaa aggatcaaca 360
gctcctgggg atttggggtt gctctggaaa actcatttgc accactgctg tgccttggaa 420
tgctagttgg agtaataaat ctctggaaca gatttggaat cacacgacct ggatggagtg 480
ggacagagaa attaacaatt acacaagctt aatacactcc ttaattgaag aatcgcaaaa 540
ccagcaagaa aagaatgaac aagaattatt ggaattagat aaatgggcaa gtttgtggaa 600
ttggtttaac ataacaaatt ggctgtggta tataaaatta ttcataatga tagtaggagg 660
cttggtaggt ttaagaatag tttttgctgt actttctata gtgaatagag ttaggcaggg 720
atattcacca ttatcgtttc agacccacct cccaaccccg aggggaccg 769
<210> 20
<211> 9
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Hairpin loop sequence of sh734
<400> 20
ttgtccgac 9
<210> 21
<211> 9
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: hsa-miR-22 loop sequence
<400> 21
ccugaccca 9
<210> 22
<211> 111
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: miRNA734 de novo (RNA form)
<400> 22
acccguacau auuuuugugu agcucuaguu uauagucaag ggcauauccu uguguuuuuu 60
uugaaggaua ugcccuugac uauaaacuag cgcuacacuu uuucgucuug u 111
<210> 23
<211> 111
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: miRNA211 de novo (RNA form)
<400> 23
acccguacau auuuuugugu agcucuaguu auaaaucaag gucauaaccu uguguuuuuu 60
uugaagguua ugaccuugau uuauaacuag cgcuacacuu uuucgucuug u 111
<210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: miRNA 451 hairpin sequence
<400> 24
aaaccgttac cattactgag tttagtaatg gtaatggttc tc 42
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA
<400> 25
gttatggcga cccgcagccc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA
<400> 26
gcgggtcgcc ataacggagc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA
<400> 27
cgtgacgtaa agccgaaccc 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA
<400> 28
ggcacggaaa gcgaccacct 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA
<400> 29
catgcgtatt tgacacacga 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA
<400> 30
gctaagtgct agagttacgg 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA
<400> 31
gaggcgcggg atccgcagtg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Sequence with Chromosome X targeted by a gRNA
<400> 32
ttattactgt tccccgccag 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IN-1
<400> 33
attatgctga ggatttggaa 20
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IDT-1
<400> 34
gatgatctct ctcaacttta ac 22
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IDT-6
<400> 35
catacctaat cattatgctg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IDT-4
<400> 36
ggttatgacc ttgatttatt 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IDT-2
<400> 37
catggactaa ttatggacag 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: IDT-3
<400> 38
tagccctctg tgtgctcaag 20
<210> 39
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: Nat Paper
<400> 39
gccctggccg gttcaggccc acg 23
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: gRNA 12
<400> 40
gccccccttg agcacacaga ggg 23
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: gRNA 13
<400> 41
agcccccctt gagcacacag agg 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: gRNA 15
<400> 42
gatgtgatga aggagatggg agg 23
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: gRNA 16
<400> 43
ctgataaaat ctacagtcat agg 23
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: gRNA 17
<400> 44
gtagccctct gtgtgctcaa ggg 23
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: gRNA 18
<400> 45
ttatgctgag gatttggaaa ggg 23
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: gRNA 19
<400> 46
gtgctttgat gtaatccagc agg 23
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: gRNA 20
<400> 47
tgaagtattc attatagtca agg 23
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: gRNA 21
<400> 48
tatcctacaa caaacttgtc tgg 23
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic: gRNA 22
<400> 49
gaagtattca ttatagtcaa ggg 23
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 50
tagcccccct tgagcacaca 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 51
atgtaatcca gcaggtcagc 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 52
tattcagtgc tttgatgtaa 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 53
ctgacctgct ggattacatc 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 54
tcagactgaa gagctattgt 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 55
aaattccaga caagtttgtt 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 56
ttgtaggata tgcccttgac 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 57
caaatcctca gcataatgat 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 58
ttttgcatac ctaatcatta 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 59
catacctaat cattatgctg 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 60
gaaagggtgt ttattcctca 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 61
ttcctcatgg actaattatg 20

Claims (54)

1.一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，其包括：
(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子2、外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；
(b)离体正选择所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；以及
(c)向所述患者施用治疗有效量的所述经修饰淋巴细胞群。
2.根据权利要求1所述的方法，其还包括向所述患者施用HSC移植物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述HSC移植物在施用所述经修饰淋巴细胞群之前、同时、或之后施用。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述指导RNA分子靶向HPRT 1基因的外显子2内的序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述指导RNA分子靶向HPRT 1基因的外显子3内的序列。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述指导RNA分子靶向HPRT 1基因的外显子8内的序列。
7.根据权利要求1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少95％序列同一性。
8.根据权利要求1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少99％序列同一性。
9.根据权利要求1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:45和57-61中的任一者。
10.根据权利要求1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子3之一内的序列的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:41-44、46和50-51中的任一者具有至少95％序列同一性。
11.根据权利要求1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子3之一内的序列的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:41-44、46和50-51中的任一者具有至少99％序列同一性。
12.根据权利要求1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子3之一内的序列的所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:41-44、46和50-51中的任一者。
13.根据权利要求1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子8之一内的序列的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:47-49、46、55和56中的任一者具有至少95％序列同一性。
14.根据权利要求1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子8之一内的序列的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:47-49、46、55和56中的任一者具有至少99％序列同一性。
15.根据权利要求1所述的方法，其中靶向HPRT 1基因的外显子8之一内的序列的所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:47-49、46、55和56中的任一者。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述指导RNA分子与位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列至少约85％互补。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述指导RNA分子靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述内切核酸酶包含Cas蛋白。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas9蛋白。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述Cas蛋白包含Cas12蛋白。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12a蛋白。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述Cas12蛋白是Cas12b蛋白。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中用病毒递送媒介物、非病毒递送媒介物或者通过物理方法来转染或转导从所述供体样本获得的淋巴细胞。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述物理方法选自显微注射和电穿孔。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述非病毒递送媒介物是纳米胶囊，任选地其中所述纳米胶囊包含至少一个靶向部分。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述病毒递送媒介物是表达载体，并且其中所述表达载体包括编码所述内切核酸酶的第一核酸序列以及编码所述指导RNA分子的第二核酸。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述表达载体是慢病毒表达载体。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与未转染的供体淋巴细胞相比，所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群内的HPRT1基因表达水平降低至少约70％，优选地降低至少约80％，更优选地降低至少约90％。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述正选择包括使所述生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞群与嘌呤类似物接触，优选地其中所述嘌呤类似物选自6-TG和6-MP。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述嘌呤类似物的量在约1至约15μg/mL的范围内。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述正选择包括使所述生成的基本HPRT缺陷型淋巴细胞群与嘌呤类似物和别嘌呤醇两者接触。
32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括向所述患者施用一个或多个剂量的二氢叶酸还原酶抑制剂，优选地其中所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述群体修饰的淋巴细胞以单次推注或以多剂量施用。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述多剂量的每个剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约240×106个细胞/kg。
35.根据权利要求33所述的方法，其中总剂量包含约0.1×106个细胞/kg至约730×106个细胞/kg。
36.一种用HPRT缺陷型淋巴细胞治疗患者的方法，其包括以下步骤：
(a)从供体受试者分离淋巴细胞；
(b)使所述分离的淋巴细胞与(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子2、外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子接触；
(c)使所述HPRT缺陷型淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂；
(d)在造血干细胞移植后，向所述患者施用治疗有效量的所述经修饰淋巴细胞的制剂；以及
(e)任选地，在所述患者发生移植物抗宿主病(GvHD)后，施用二氢叶酸还原酶抑制剂。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述二氢叶酸还原酶抑制剂选自MTX或MPA。
38.经修饰淋巴细胞的制剂用于向对其有治疗需要的受试者提供淋巴细胞输注益处的用途，其中所述经修饰淋巴细胞的制剂通过如下方式生成：
(a)从供体受试者分离淋巴细胞；
(b)使所述分离的淋巴细胞与包含(i)内切核酸酶和(ii)靶向HPRT 1基因的外显子2、外显子3或外显子8之一内的序列的指导RNA分子接触，以提供基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；以及
(c)使所述HPRT缺陷型淋巴细胞群暴露于正选择HPRT缺陷型淋巴细胞的试剂，以提供经修饰淋巴细胞的制剂。
39.根据权利要求38所述的用途，其中所述受试者在造血干细胞移植后需要治疗。
40.根据权利要求38或39中任一项所述的制剂的用途，其中所述指导RNA分子靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列。
41.根据权利要求38所述的用途，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:45和57-61中的任一者具有至少95％序列同一性。
42.根据权利要求38所述的用途，其中靶向HPRT 1基因的外显子2的所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:45和57-61中的任一者。
43.根据权利要求38所述的制剂的用途，其中靶向HPRT 1基因的外显子3的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:41-44、46和50-51中的任一者具有至少95％序列同一性。
44.根据权利要求38所述的制剂的用途，其中靶向HPRT 1基因的外显子3的所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:41-44、46和50-51中的任一者。
45.根据权利要求38所述的制剂的用途，其中靶向HPRT 1基因的外显子8的所述指导RNA分子与SEQ ID NO:47-49、55和56中的任一者具有至少95％序列同一性。
46.根据权利要求38所述的制剂的用途，其中靶向HPRT 1基因的外显子8的所述指导RNA分子包含SEQ ID NO:47-49、55和56中的任一者。
47.一种在向对其有治疗需要的患者提供淋巴细胞输注益处的同时减轻副作用的方法，其包括：
(a)通过用(i)内切核酸酶和(ii)与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少90％序列同一性的指导RNA转染或转导从供体样本获得的淋巴细胞，生成基本HPRT缺陷型淋巴细胞群；
(b)离体正选择所述基本HPRT缺陷型淋巴细胞群，以提供经修饰淋巴细胞群；以及
(c)向所述患者施用治疗有效量的所述经修饰淋巴细胞群。
48.根据权利要求47所述的方法，其还包括向所述患者施用HSC移植物。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述指导RNA与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少95％序列同一性。
50.根据权利要求47所述的方法，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:40-61中的任一者。
51.一种试剂盒，其包含：(i)与SEQ ID NO:40-61中的任一者具有至少95％序列同一性的指导RNA分子；以及(ii)Cas蛋白。
52.根据权利要求51所述的试剂盒，其中所述Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。
53.一种试剂盒，其包含：(i)指导RNA分子，所述指导RNA分子靶向位于基于基因组构建物GRCh38的约134475181至约134475364之间或除GRCh38以外的基因组构建物中的等同位置的染色体X内的序列，以及(ii)Cas蛋白。
54.根据权利要求53所述的试剂盒，其中所述Cas蛋白选自Cas9蛋白和Cas12蛋白。
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