CN115992262A - 一种与乌苏里貉体重相关的snp分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子遗传学技术领域，具体涉及与乌苏里貉体重大小相关的SNP分子标记及其应用。所述SNP分子标记位于貉参考基因组NYPRO_anot_genome的Nypro681序列上第128151处的C/T碱基突变，不同基因型的乌苏里貉个体体重表现出显著差异，为乌苏里貉体重性状的标记辅助选择育种提供新的标记资源。本发明利用PCR技术和Sanger测序法检测上述SNP分子标记，并将其应用于乌苏里貉体重性状早期选择上，建立一种乌苏里貉体重性状分子标记辅助选择技术，以指导其选种选配，从而缩短育种周期，加快育种进程，降低育种成本。

Description

一种与乌苏里貉体重相关的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及SNP分子标记技术领域，尤其涉及一种与乌苏里貉体重相关的SNP分子标记及其应用。

背景技术

貉是人工饲养的重要经济动物之一，其经济价值主要来源于毛皮。貉皮属大毛细皮，有轻便、保暖、美观等优点，多数被用来加工成服装的帽条、袖口等，在国际裘皮市场占据重要地位。因此，皮张质量的优劣直接影响养殖者的经济效益。在貉养殖中，体型性状如体重等是最重要的经济性状之一，直接决定皮张尺码的大小和毛皮等级的划分。在貉育种工作中，将体重等作为主要指标选育出大体型的貉，是当前貉育种的主要目标。

随着分子生物学技术在畜禽育种工作中的广泛应用，在许多畜禽上都发现了与其经济性状紧密连锁的SNP分子标记，并使用这些分子标记进行辅助选择育种，极大地加快了育种进程。单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)主要是指由于单个核苷酸的变异而引起基因组水平上DNA序列多态性，形式包括单个碱基的缺失、***、转换及颠换。SNP作为第三代遗传标记，广泛应用于动植物育种中。因此，在貉育种中，开发和运用遗传标记是当前育种工作的主要研究方向，同时采用分子标记指导育种，对貉经济性状的遗传改良具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种与乌苏里貉体重相关的SNP分子标记及其应用。

本发明的目的之一在于：提供一种与乌苏里貉体重相关的SNP分子标记，位于貉参考基因组的Nypro681序列上第128151处点的碱基处，该SNP分子标记位点具有C/T多态性。

Nypro681的GenBank登录号：CAJHUB010000647.1；貉参考基因组的信息版本号为NYPRO_anot_genome，2021年2月。

优选地，所述含有SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的SNP分子标记位于第171位。

优选地，所述SNP分子标记多态性位点的CC基因型的体重显著高于CT基因型和TT基因型，而CT基因型的体重又显著高于TT基因型。

本发明的目的之二在于：提供上述SNP分子标记在乌苏里貉体重性状检测或乌苏里貉育种中的应用。

本发明的目的之三在于：提供上述SNP标记的引物对，上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示。

本发明的目的之四在于：提供上述引物对在乌苏里貉体重性状检测或乌苏里貉育种中的应用。

本发明的目的之五在于：提供一种试剂盒，含有上述引物对。

本发明的目的之六在于：提供一种预测乌苏里貉体重性状的方法，检测如上述SNP分子标记的多态性位点基因型。

优选地，采用上述引物对或上述试剂盒进行检测。

具体包括以下步骤：

(1)提取乌苏里貉血液基因组DNA，作为模板DNA；

(2)利用上述引物对，将步骤(1)获得的基因组DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(3)对步骤(2)获得的PCR扩增产物纯化、测序，并获得测序结果；

(4)基于测序结果进行基因分型，当所述SNP分子标记碱基为T时，基因型为TT；所述SNP分子标记碱基为C时，基因型为CC或CT；CC基因型的乌苏里貉体重极显著高于CT基因型和TT基因型(P<0.01)，CT基因型乌苏里貉体重显著高于TT基因型体(P<0.05)。

本发明的目的之七在于：提供一种乌苏里貉育种改良方法，确定乌苏里貉的上述SNP分子标记，并根据乌苏里貉SNP分子标记做出相应的选择：乌苏里貉的继代选育参照上述SNP分子标记的多态性位点标记为C的个体，淘汰所述SNP分子标记多态性位点标记为T的个体。

即，检测乌苏里貉参考基因组NYPRO_anot_genome的Nypro681(GenBank登录号：CAJHUB010000647.1)序列上第128151处碱基突变类型，选择该处碱基为C的乌苏里貉作为种貉，碱基为T的个体不宜留作种用。

本发明公开了一种与乌苏里貉体重大小相关的SNP分子标记，位于貉参考基因组NYPRO_anot_genome的Nypro681序列上第128151处的C/T碱基突变；所述SNP分子标记碱基为T时，基因型为TT；所述SNP分子标记碱基为C时，基因型为CC或CT；CC基因型的乌苏里貉体重极显著高于TC基因型和TT基因型体(P<0.01)；CT基因型乌苏里貉体重显著高于TT基因型(P<0.05)。

本发明基于所述SNP分子标记，开发了用于检测该分子标记的特异性引物对，应用PCR技术和Sanger测序法检测碱基类型，以此建立了一种高效准确的分子标记辅助育种技术，能够快速筛选出具有优势等位基因的乌苏里貉个体。

本发明将上述分子标记检测技术应用于乌苏里貉种貉体重性状的遗传改良中，以指导其选种选配，能够加强乌苏里貉早期选择，提高选种的准确性，从而缩短世代间隔，缩短育种周期，加快育种进程，降低育种成本，对选育出大体重的乌苏里貉种群具有积极的促进作用。

附图说明

图1为实施例4中SNP分子标记所在DNA片段的PCR扩增结果。

图2为实施例5中PCR扩增产物纯化并测序后的基因分型结果；其中CC、CT、TT依次代表CC基因型、CT基因型以及TT基因型。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

实施例1样品采集和表型测定

本申请人以96只乌苏里貉公貉为研究对象，试验貉群均在同一养殖环境、饲养条件、饲喂方式下进行饲养。打皮前，采集所有试验乌苏里貉的血液样本5mL于EDTA抗凝采血管中，-20℃保存备用；称量乌苏里貉体重并记录数据。

实施例2基因组DNA提取和质量检测

采用北京天根生化技术有限公司生产的血液基因组DNA提取试剂盒(TIANampGenomic DNA Kit)，从乌苏里貉血液样本中提取基因组DNA。

取5μL DNA溶液，于1％琼脂糖凝胶电泳检测，单一条带说明DNA完整无降解，有明显的条带说明浓度可以满足PCR要求；分光光度计检测浓度和纯度，取1μL检测OD值，OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.7～2.0，说明DNA质量较好，满足实验要求。

实施例3设计引物

以乌苏里貉基因组NYPRO_anot_genome版本的Nypro681(GenBank登录号：CAJHUB010000647.1)序列为参考，利用Primer Premier 5.0软件设计一对特异性引物，具体如下：

Primer	Sequence(5'-3')
		F	tatttgttga atcccatagc cttac
R	taattatcta agccatggaa aactg

扩增产物为447bp，序列信息如下所示：

tatttgttga atcccatagc cttacagctg aagaatacat ttggatgatt ttcgcctgcc

tgctgatttg gaagtggaat ggctttctct gtacttcatc tttattgggt aatgatcacg

gtgtctgcat atttcaagtt cgggaaaata tattccagct ttgttgctgg tactctgagg

atgatgtttg gtttgtattg tttatcttga gccagtgacc agtgttacac aatatggata

taattggtag aagtaacaaa gtctgatatg ataagaagaa agactaaaat atcagattta

ctgaaataat ctctgagtgc tgtgggagag aatcagatac ttggcagtgc acacagtcct

aagggtggca gttgattcac tcttaattgt ctagagactc aatgaatgac acacatattt

cacagttttc catggcttag ataatta

上述扩增片段中包含位于第171位的SNP分子标记位点，也就是Nypro681序列上第128151处的C/T。

实施例4目的片段扩增及检测

以血液基因组DNA为模板，利用步骤3中设计的特异性引物进行目的片段扩增，

PCR扩增体系：

试剂	剂量
		模板DNA	1μL
浓度为10μM的上游引物	1μL
		浓度为10μM的下游引物	1μL
浓度为10μM的Dntp(mix)	1μL
		<![CDATA[10×Taq Buffer(with MgCl<sub>2</sub>)]]>	2.5μL
浓度5U/μL的Taq酶	0.2μL
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	加至总体积为25μL

PCR反应程序：

所得反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，电泳参数：150V，100mA，10～20min；电泳结果如图1所示。

实施例5测序及基因分型

目的PCR条带切胶回收，采用Sanger测序法获得序列信息，测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。测序结果利用Sequence analysis软件进行分析，根据测序峰图将步骤3中所述SNP标记进行基因分型，96个样本共包含CC、CT和TT三种基因型，如图2所示。

实施例6统计分析

采用IBM SPSS Statistics 22软件对乌苏里貉不同基因型体重数据进行描述性统计，结果如下表所示。

乌苏里貉不同基因型个体数量和体重大小(平均数±标准误)分别为：

CC型个体数为31只，体重为9.27±0.13kg；

TT型个体数为23只，体重为8.02±0.14kg；

CT型个体数为40只，体重为8.55±0.14kg。

采用单因素方差分析比较乌苏里貉不同基因型间的体重差异，结果如下表所示：

基因型	体重(kg)
		CC型	<![CDATA[9.27±0.13<sup>aA</sup>]]>
TT型	<![CDATA[8.02±0.14<sup>bB</sup>]]>
		CT型	<![CDATA[8.55±0.14<sup>cB</sup>]]>

CC基因型乌苏里貉体重极显著高于TT基因型和CT基因型(P<0.01)，CT基因型乌苏里貉体重显著高于TT型(P<0.05)。

结果表明，通过对乌苏里貉Nypro681序列上第128151处的碱基进行基因型检测，可作为判断乌苏里貉体重大小的重要指标，为乌苏里貉分子标记辅助育种提供依据。通过采集乌苏里貉血液样本，提取基因组DNA，并应用本发明所提供的特异性引物及基因分型方法即可预估其未来体重大小，通过不断淘汰乌苏里貉Nypro681序列上第128151处分子标记为T的个体，从而逐步提高乌苏里貉群体的体重。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种与乌苏里貉体重相关的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记位于貉基因组的Nypro681序列上第128151处点的碱基处，该SNP分子标记位点具有C/T多态性。

2.根据权利要求1所述SNP分子标记，其特征在于，所述含有SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的SNP分子标记位于第171位。

3.根据权利要求1所述SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记多态性位点的CC基因型和CT基因型的体重显著高于TT基因型。

4.如权利要求1-3任一项所述SNP分子标记在乌苏里貉体重性状检测或乌苏里貉育种中的应用。

5.一种用于检测权利要求1-3任一项所述SNP标记的引物对，其特征在于，上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示。

6.如权利要求5所述引物对在乌苏里貉体重性状检测或乌苏里貉育种中的应用。

7.一种试剂盒，其特征在于，含有权利要求5所述引物对。

8.一种预测乌苏里貉体重性状的方法，其特征在于，检测如权利要求1-3任一项所述SNP分子标记的多态性位点基因型。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，采用权利要求5所述引物对或权利要求7所述试剂盒进行检测。

10.一种乌苏里貉育种改良方法，其特征在于，确定乌苏里貉的如权利要求1中所述SNP分子标记，并根据乌苏里貉SNP分子标记做出相应的选择：乌苏里貉的继代选育参照权利要求1-3任一项所述SNP分子标记的多态性位点标记为C的个体，淘汰所述SNP分子标记多态性位点标记为T的个体。

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