CN109709337B - 人cd26的免疫组化检测试剂盒及其临床应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人CD26的免疫组化检测试剂盒及其临床应用，属于体外诊断领域。本发明公开的免疫组化检测试剂盒采用一种全新抗人CD26抗体，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3；以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：分别如SEQ ID NO：4、5、6所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。本发明采用的抗人CD26抗体特异性等相关检测性能可满足免疫组化试剂盒的性能要求，可以是鼠源抗体也可以是重组表达的嵌合人源抗体便于大量生产，其中重组表达的嵌合人源抗体减少人抗鼠抗体反应，减少非特异性吸附，也可满足大规模临床应用的需求。在应用CD26靶点药物时，伴随使用本发明的免疫组化试剂盒，可达到精准治疗的效果。

Description

人CD26的免疫组化检测试剂盒及其临床应用

技术领域

本发明属于体外诊断领域，尤其是一种抗人CD26抗体及其在免疫组织化学检测试剂盒中的应用。

背景技术

CD26是一种普遍存在的多功能II型跨膜蛋白，有多种生物学功能，也可以以溶解形式存在于血浆中。CD26常以同源二聚体形式存在，其单体含766个氨基酸，相对分子质量约110kDa。CD26氨基酸残基从内向外分为5个部分：胞内区(aa1～6)、跨膜区(aa7～28)、高度糖基化区(aa29-323)、富含半胱氨酸区(aa324～551)和C端催化结构域(552～766)。CD26的C端催化结构域发挥二肽基肽酶IV(Dipeptidylpeptidase4，DPPIV)活性，可以水解体内多种底物发挥生物学作用，富含半胱氨酸区可以和体内多种分子相互作用，从而参与体内免疫功能。CD26在免疫调节中的作用已被广泛研究，CD26是T细胞活化的分子标志，也在T细胞信号转导过程中作为共刺激分子，还涉及多种T细胞功能，包括T细胞发生成熟及迁移，细胞因子分泌，T细胞依赖的抗体产生，B细胞免疫球蛋白转型等。CD26在自身免疫性疾病的发生发展过程中发挥重要作用，已成为临床疾病的分子标志，并被认为是某些免疫性疾病的治疗或诊断靶点。

研究表明，部分癌症患者肿瘤组织无CD26表达，该类病人在使用以CD26为靶点的抗癌药物无疗效。因此，在使用CD26靶点药物前，对癌症病人肿瘤组织进行CD26蛋白表达情况检测，可达到精准治疗的效果。本发明所涉及的CD26抗原免疫组织化学检测试剂盒则可达到上述效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一个能有效的、特异性结合人CD26的抗体，并将其应用到免疫组织化学检测试剂盒中。更具体地说：

本发明的第一目的在于提供一种抗人CD26抗体，

其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；

以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

优选的是上述抗人CD26抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

本发明第二个目的是提供一种嵌合抗体，所述抗体重链氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，编码抗体重链的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，所述抗体轻链氨基酸序列如SEQID NO:11所示，编码抗体轻链的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示。

本发明第三个目的是提供一种含有上述嵌合抗体核苷酸序列的表达载体。

本发明第四个目的是提供一种含有上述嵌合抗体表达载体的重组细胞株。

本发明第五个目的是提供一种生产上述嵌合抗体的方法，包括：

(1)构建如上所述的表达抗人CD26抗体的哺乳动物宿主细胞株；

(2)将上述细胞株接种于培养基中悬浮培养；

(3)抗人CD26嵌合抗体的纯化制备。

上述所述载体优选为pCHO1.0。上述所述哺乳动物细胞CHO优选为CHO-S细胞。

本发明的第六个目的在于提供上述抗人CD26抗体在检测人体组织中CD26蛋白的应用。

本发明第七个目的是提供一种用于检测人肿瘤组织中的CD26蛋白表达的免疫组化试剂盒，包括抗人CD26抗体、同型对照阴性抗体、抗体稀释液和监控染色质量的质控片，所述抗人CD26抗体，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；

以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

优选的，上述抗人CD26抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

作为优选，所述抗人CD26抗体为嵌合抗体，其氨基酸序列由如SEQ ID NO:7所示的重链可变区与人单抗IgG1重链恒定区融合，如SEQ ID NO:8所示所述的轻链可变区与人单抗IgG1轻链恒定区融合构成。

作为优选，所述抗体稀释液优选含有1％BSA和10％山羊血清的0.05M TBS。

作为优选，所述抗体工作浓度为2.5-10ug/mL。

作为优选，与试剂盒配套使用的组织固定液为4％多聚甲醛或10％中性缓冲***。

作为优选，与试剂盒配套使用的抗原修复液为pH6.0的柠檬酸盐缓冲液。

在应用本发明的试剂盒时，抗体和目标抗原(CD26)结合后通过显色反应呈现组织切片中的目标抗原位点，通过光学显微镜可确定目标抗原的分布和含量，其结果可以为CD26靶点抗癌药物筛选临床适用人群并提供临床用药指导，以实现精准治疗的效果。

本发明提供的抗体特异性等相关检测性能可满足免疫组化试剂盒的性能要求，并且重组表达抗体便于大量生产，减少人抗鼠抗体反应，减少非特异性吸附，可满足大规模临床应用的需求。

附图说明

图1.抗人CD26鼠抗重链及轻链可变区基因电泳图。Lane 1为200DNA Ladder，Lane1为重链可变区PCR扩增基因，Lane 3为轻链可变区PCR扩增基因。

图2.抗人CD26嵌合抗体重链和轻链PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。泳道1为蛋白Marker，泳道2为重链基因PCR产物；泳道3为轻链基因PCR产物。

图3抗人CD26嵌合抗体经过两步层析SDS-PAGE电泳图。其中，泳道1为10-100KD非预染蛋白Marker，泳道2为抗人CD26嵌合抗体。

图4抗体特异性检测效果图(Western Blot)。泳道1为标准蛋白质(Marker)；泳道2为重组CD26蛋白

图5本发明试剂盒检测CD26高表达和不(或低)表达细胞结果(显微镜下400X观察)。

图5.1检测抗体在CD26高表达细胞中的染色图；5.2阴性对照抗体在CD26高表达细胞中的染色；图5.3检测抗体在CD26不(或低)表达细胞中的染色图；5.4阴性对照抗体在CD26不(或低)表达细胞中的染色。

图6检测抗体在正常人体组织中的染色图(显微镜下200X观察)。

图6.1检测抗体在正常人体大脑组织中的染色图；6.2阴性对照抗体在正常人体大脑组织中的染色；图6.3检测抗体在正常人体甲状腺组织中的染色；图6.4阴性对照抗体在正常人体甲状腺组织中的染色；图6.5检测抗体在正常人体肾上腺组织中的染色图；6.6阴性对照抗体在正常人体肾上腺组织中的染色；图6.7检测抗体在正常人体小肠组织中的染色；图6.8阴性对照抗体在正常人体小肠组织中的染色；图6.9检测抗体在正常人体肝脏组织中的染色；

图6.10阴性对照抗体在正常人体肝脏组织中的染色。

图7本发明试剂盒检测肿瘤病人组织结果(显微镜下400X观察)。

图7.1检测抗体在人肾癌组织中的染色图；7.2阴性对照抗体在人肾癌组织中的染色；图7.3检测抗体在人肾癌旁组织中的染色；图7.4阴性对照抗体在人肾癌旁组织中的染色。

具体实施方式

定义

“抗体”又称免疫球蛋白，是一类由B淋巴细胞分泌的大型Y形蛋白质，能够通过Y形的其中两个分叉顶端的互补位点(抗原结结合位)特异性结合靶抗原的免疫球蛋白分子，所述靶抗原如蛋白质、糖、多核苷酸、脂、多肽、小分子化合物等。

互补决定区(complementarity-determining region,CDR)，也叫做高变区。成型于抗体单体氨基酸的末端，是靶抗原与抗体结合的最关键区域，在免疫网络理论中，每个抗体的互补决定区又被称为独特型或者基因型。

“嵌合抗体”由鼠源抗体的可变区和人抗体的恒定区融合而成。

下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施例。

实施例1.抗人CD26杂交瘤细胞株的制备

1.动物免疫

以重组人CD26蛋白(本公司制备)按照一般免疫程序免疫BALB/c雌性小鼠(购自常州卡文斯实验动物有限公司)。具体免疫情况参见《抗体制备与使用实验指南》。采用间接ELISA法跟踪免疫小鼠血清滴度，选取血清效价最高的免疫小鼠，进行小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞进行融合实验。

2.细胞融合

(1).脾脏细胞的制备将免疫小鼠，摘眼球取血，经断颈椎处死后置于75％(v/v)的酒精中浸泡10分钟，于无菌操作台中取出其脾脏，置于细胞筛网中，充分研磨细胞，过筛网，用无菌1640培养基(购自Gibco公司)离心洗涤数次后，重悬细胞以制成单细胞悬液，并计数，备用。

(2).饲养细胞的制备取8～10周龄的雌性BALB/c小鼠一只，摘眼球获取阴性血清，经断颈椎处死后置75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌揭开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器将约10mL 1640HT培养基(购自SIGMA公司)注入小鼠腹腔，轻轻按摩腹部并吹打数次。吸取含有巨噬细胞的培养基注入20％1640HAT培养基中备用；

取2～3周龄的雌性BALB/c小鼠一只，经断颈椎处死后置于75％(v/v)酒精中浸泡10分钟；无菌取胸腺于细胞筛网中，研磨，过筛网，获得胸腺细胞置于上述含有巨噬细胞的20％1640HAT培养基中，备用。

(3).细胞融合

选择处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0，收集并计数。取约10⁸个上述脾细胞与2×10⁷个上述SP2/0细胞株加入融合管中混合，1000rpm离心10分钟后弃上清(尽量弃净)，将融合管置手掌上来回轻轻摩擦以使沉淀松散。60秒内先慢后快地加入1mL预热的PEG1450(聚乙二醇1450，购自SIGMA公司)，加入1640HT培养基30mL终止，1000rpm离心10分钟，去上清，轻轻摩擦使沉淀松散，加入步骤2所获得的20％的1640HAT培养基中。

将上述HAT培养基充分混匀后，以200μL/孔分装至96孔细胞培养板中，置37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养。一周后用10％1640HT培养基替换20％1640HAT培养基，3天后取上清进行检测。

3.抗人CD26蛋白特异性杂交瘤株筛选

(1).检测板的准备：用CB包被液稀释重组人CD26蛋白(本公司制备)至1μg/mL，包被96孔ELISA酶标板，100μL/孔，2～8℃包被过夜，洗涤一次拍干；含2％牛血清白蛋白的PBST缓冲液封闭(200ul/孔)，37℃封闭2小时；拍干，备用。

(2).阳性克隆的筛选：将待检细胞培养上清100μL/孔加入上述检测板中，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μL/孔的HRP标记的羊抗鼠IgG，于37℃作用30分钟后洗涤并拍干，加入100μL/孔的TMB显色液，于37℃避光显色15分钟，每孔加入50μL的2M H₂SO₄终止反应，并于OD450处读取数值。阳性孔确定原则：OD450值/阴性对照值≥2.1。选取阳性克隆株进行细胞克隆化筛选。经过三至四轮的克隆化筛选后，单克隆细胞株阳性率100％即确定为稳定细胞株，对细胞株进行定株。杂交瘤细胞株C29均具有较高的效价，遂后续进一步对上述杂交瘤细胞株进行抗体可变区序列测序分析。

实施例2.抗人CD26杂交瘤细胞株抗体可变区序列的测定

1.抗人CD26杂交瘤细胞总RNA的提取

将抗人CD26杂交瘤细胞株传代至75T培养瓶中培养，至细胞汇合至90％左右消化、离心收集细胞，使用High Pure RNA Isolation Kit(Roche)对抗人CD26单克隆杂交瘤细胞株进行Total RNA提取。然后以抗人CD26的Total RNA为模板，使用RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit(Thermo)逆转录扩增其cDNA第一链，反应产物存放于-20℃，长期储存，需要储存于-70℃。

2.PCR扩增重、轻链可变区基因

以抗人CD26杂交瘤细胞cDNA第一链为模板，在50μL反应体系中，分别加入cDNA 1μL，10×PCR缓冲液5μL，上游及下游引物各1μL(25pmo1)，dNTP1μL，25mmol/L MgCl₂ 1μL，H₂O39μL，95℃预变性10min，加Taq酶1μL，进入温度循环，进行PCR扩增。反应条件为94℃。变性1min，58℃。退火1min，72℃延伸1.5min，共30个循环，然后72℃保温10min。取5μL PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，见图1。

3.重链及轻链可变区基因的克隆和序列测定

按照pGM-T Fast连接试剂盒说明书(北京天跟生化科技有限公司，VT207-02)，将重、轻链可变区基因分别与pGM-T载体连接，转化大肠杆菌Top10感受态细胞中，蓝白斑筛选，37℃培养12-16h。

将得到的白色菌落接种含有终浓度为100μL的氨苄青霉素1-5mL LB培养基中，37℃摇床振荡3-4h后，PCR筛选***正确序列克隆。同时将PCR筛选阳性克隆送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，测定结果通过计算机网络基因库Kabat、Chothia及IMGT比较分析获得抗体的重链可变区基因(SEQ ID No:7)和轻链可变区基因(SEQ ID No:8)。经数据库分析上述序列，其重链可变区的各互补决定区的氨基酸序列分别是：如序列SEQ ID NO：1所示的CDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的CDR2和如序列SEQ ID NO：3所示的CDR3；其轻链可变区的各互补决定区的氨基酸序列是：如序列SEQ ID NO：4所示的CDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的CDR2和如序列SEQ ID NO：6所示的CDR3。

实施例4.抗人CD26嵌合抗体表达

1、抗人CD26嵌合抗体分子设计和密码子优化

将实施例3步骤3中抗人CD26杂交瘤细胞重链可变区序列直接与人单抗IgG1重链恒定区融合，获得抗人CD26嵌合抗体重链氨基酸序列(SEQ ID No:9)，将抗人CD26杂交瘤细胞轻链序列直接与人单抗IgG1轻链恒定区融合，获得抗人CD26嵌合抗体轻链氨基酸序列(SEQ ID No:11)，并分别将抗人CD26杂交瘤细胞重链和轻链基因分别用Optimum Gene^TM密码子优化软件进行密码子优化后得到本发明的抗人CD26杂交瘤细胞重链基因(SEQ ID No:10)和轻链基因(SEQ ID No:12)。

将优化后的抗人CD26杂交瘤细胞重链基因在5’端引入AvrII酶切位点序列，在3’端引入BstZ7I酶切位点序列，并进行全基因合成，将合成的基因片段，构建到pUC57质粒(由南京金斯瑞科技有限公司提供)中，得到一种长期保存质粒，记为pUC57-CD26-HC质粒。

将优化后的抗人CD26杂交瘤细胞轻链基因在5’端引入EcoRV酶切位点序列，在3’端引入PacI酶切位点序列，并进行全基因合成，将合成的基因片段，构建到pUC57质粒中，得到一种长期保存质粒，记为pUC57-CD26-LC质粒。

2、CD26嵌合抗体表达载体构建

分别以pUC57-CD26-HC和pUC57-CD26-LC质粒为模板，进行PCR扩增，所用引物序列如下：

上游引物M13F:CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC

下游引物M13R:AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA

反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶为Q5，2U/μL，加0.5μL。反应条件为98℃5秒、55℃45秒、72℃30秒，25个循环后，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示产物大小与预期大小一致(结果如图2所示)。

用AvrII(#R0174S，购自New England BioLabs公司)和BstZ17I(#R0594S，购自NewEngland BioLabs公司)双酶切后，1％琼脂糖电泳，得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒(DP214，购自北京天根生化科技有限公司)纯化。用T4连接酶(#M0202S，购自New EnglandBioLabs)连接到pCHO1.0质粒(购自Life公司)中，转化到Top10感受态细胞(CB104，购自北京天根生化科技有限公司)中，在含有卡那霉素(0408，购自Amresco公司)的LB固体培养基中37℃培养过夜。第二天挑取阳性克隆菌进行PCR鉴定，并将阳性结果进行测序比对，与预期序列完全一致，即得到重链表达质粒，记为pCHO1.0-HC。

用EcoRV(#R3195S，购自New England BioLabs公司)和PacI(#R0547S，购自NewEngland BioLabs公司)双酶切后，1％琼脂糖电泳，得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化。用T4连接酶连接到pCHO1.0-HC质粒中，转化到Top10感受态细胞中，在含有卡那霉素的LB固体培养基中37℃培养过夜。第二天挑取阳性克隆菌进行PCR鉴定，并将阳性结果进行测序比对，与预期序列完全一致，即得到嵌合单抗的表达质粒，记为pCHO1.0-D29。

3、稳定表达CD26嵌合抗体细胞株筛选

将测序正确的pCHO1.0-D29质粒用NruI限制内切酶线性化，电转染到CHO-S宿主细胞中后，分别加入一定浓度的Puromycin和MTX置于二氧化碳培养箱中37℃，8％CO₂进行加压筛选。10天后计算细胞活率，当细胞活率大于30％以上转移到摇床中，37℃，8％CO₂，130rpm悬浮培养，获得稳定表达抗人CD26嵌合抗体细胞株。

4、CD26嵌合抗体制备

将稳定表达抗人CD26嵌合抗体细胞株接种于Dynamis培养基中，37℃，8％CO₂，130rpm摇床中培养。当细胞密度达到5×10⁶cells/mL后，加入葡萄糖和补料培养基至摇瓶中。每天取样计算细胞密度，并每隔一天加入葡萄糖和补料培养基至摇瓶中，直至细胞活力低于85％收集上清培养液。将上述上清培养液，12000rpm，15min低温离心收集上清，0.22μm滤膜过滤即得处理后培养液上清，可进行层析纯化。

亲和层析选用的层析柱是HiTrapMabSelectSuRe(11-0034-94，购自GEhealthcare)，利用MabselectSuRe亲和层析柱从表达上清中捕获所有带Fc结构域的抗体，用平衡缓冲液(20mM NaH₂PO₄，150mM NaCl，pH7.2)平衡层析柱后，过亲和层析柱，用洗脱缓冲液(100mM柠檬酸，pH3.0)洗脱。通过HiTrapCapto S(17-5441-22，购自GE healthcare)阳离子交换层析，实现目标抗体精纯和换液，用平衡缓冲液A(50mM NaH₂PO₄，pH 5.0)平衡层析柱后，样品用双蒸水稀释电导至3.0-3.5ms之间，过HiTrapCapto S柱子结合后，用洗脱缓冲液B(50mMNaH₂PO₄，1M NaCl，pH 6.0)线性洗脱。纯化后的嵌合抗体进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，纯度在95％以上，见图3。

实施例4.抗体的性能评价

1.抗体的Western blot鉴定

a.聚丙烯酰胺凝胶电泳：配置12％分离胶、5％浓缩胶，分别上样标准蛋白质及人重组CD26蛋白(本公司制备)，恒压下电泳1小时；

b.转膜：恒流(35mA/膜)条件下转膜1小时，将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。考马斯亮蓝G250对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，观察蛋白的残留情况；

c.封闭：含5％脱脂奶的TBST缓冲液封闭(封闭液)，4℃过夜；封闭后洗涤液(TBST，详见TaKaRa公司TBST buffer)洗涤一次，10分钟；

d.抗原抗体反应：封闭液稀释(按1:1000体积比)辣根过氧化物酶标记抗体(1mg/mL，本公司采用经典过碘酸钠法标记，下同)，加入上述硝酸纤维素膜中，室温反应1小时；TBST洗涤5次，每次10分钟；

e.显色及拍照：吸干硝酸纤维素膜上残留液体，硝酸纤维素膜加入2mL稳定型过氧化物酶溶液(1mL)与鲁米诺/增强剂溶液(1mL)的混合液(购买于Thermo公司)，均匀润湿硝酸纤维素膜的表面，室温避光反应一分钟后于凝胶成像***(购买于GE公司)拍照(图4)，留取结果。

检测结果可见，本发明的抗体具有较好的特异性，可特异性检测人CD26蛋白。

实施例5免疫组化试剂盒的制备

本发明的免疫组化检测试剂盒包括特异性结合目的蛋白的HRP标记的检测抗体(上述CD26抗体)、同型对照阴性抗体(与检测抗体亚型一致的IgG1型其他抗体作为阴性对照抗体)、抗体稀释液和可以监控染色质量的阴阳性细胞质控片，

1、质控片及组织切片的制备

采用常规方法制备，以下举例仅用于说明而非限制本发明阴阳性细胞质控片可采用的方法，本领域技术人员知晓其他公知方法均可用。

(1)固定

①质控片中细胞的固定

收集体外培养细胞(抗原高表达细胞或低表达细胞)，离心(250g离心5min)后弃去细胞上清液，加入适量的0.01M PBS洗涤细胞，离心(250g离心5min)后弃去洗涤液，如上所述洗涤2次，使用移液枪将离心管底部的细胞团块吹打均匀后加入细胞团块体积约25倍体积的固定液(4％多聚甲醛或10％中性缓冲***均可)，100rpm摇晃固定24h；离心(250g离心5min)后弃去固定液，加入和固定液同等体积的纯化水，100rpm摇晃清洗2h，离心(250g离心5min)后弃去清洗液，使用移液枪将底部细胞团块吹打均匀后，吸取放置在滤纸内，包裹好放入包埋盒中待脱水。

②待检组织样本的固定

将新鲜采集的组织修取成厚度3-5毫米的小块，置于组织体积25倍体积的固定液中，100rpm摇晃固定24h，固定完毕后将组织块去除放入包埋盒中，使用流水冲洗2h后捞出沥干待脱水。

(2)脱水

将上述待脱水的样本(包埋盒内的细胞或组织)一起使用全自动脱水仪按照表1脱水程序进行脱水透明浸蜡。

表1

容器编号	内容试剂	脱水时间
			1	70％乙醇	45分钟至80分钟
2	80％乙醇	45分钟至80分钟
			3	95％乙醇	45分钟至80分钟
4	95％乙醇	45分钟至80分钟
			5	100％乙醇	45分钟至80分钟
6	100％乙醇	45分钟至80分钟
			7	二甲苯	45分钟至80分钟
8	二甲苯	45分钟至80分钟
			11	石蜡(60℃)	60分钟至105分钟
12	石蜡(60℃)	60分钟至105分钟

(3)包埋

将脱水透明浸蜡完毕的细胞或组织在石蜡包埋机(Leica HistoCore Arcadia包埋***)上进行石蜡块的制备。

(4)切片

使用组织切片机(Leica R2235轮转式切片机)将石蜡细胞块或组织块制备成薄切片(3-5微米)，用于免疫组化染色。

2、检测

使用上述制备的石蜡切片按照下述免疫组化染色流程进行免疫组化检测(同样地，以下举例仅用于说明而非限制本发明试剂盒的使用方法和所用试剂，本领域技术人员知晓其他同类试剂均可用)。

烘蜡：切片60℃烘蜡；

脱蜡：切片在一系列脱蜡(例如：二甲苯、梯度酒精和纯水)试剂中进行脱蜡水化；

抗原修复：使用水浴锅加热抗原修复液至临沸点后将切片放入加热15min后取出自然冷却。发明人考察了不同抗原修复液对检测结果的影响，见表3；

内源性过氧化酶去除：使用内源性过氧化酶去除剂(例如：含有3％的H₂O₂的0.05MTBS)去除组织切片中的内源性过氧化酶后使用洗涤液(例如：含有0.025％Triton X-100的0.05M TBS)进行洗涤；

封闭：使用封闭液(例如：含有1％BSA和10％山羊血清的0.05M TBS)对组织切片进行封闭；

检测抗体：甩掉封闭液，使用含有1％BSA和10％山羊血清的0.05M TBS稀释CD26检测抗体和阴性对照抗体，滴加覆盖在组织切片上进行2-8℃孵育16h-18h后使用洗涤液(例如：含有0.025％Triton X-100的0.05M TBS)进行洗涤，发明人考察了不同抗体浓度对检测结果的影响，见下表3；

显色：将DAB显色剂(例如：福州迈新生物技术有限公司，DAB试剂盒)滴加覆盖在组织切片上进行显色，肉眼观察，一般显色3-10分钟后使用洗涤液(例如：含有0.025％TritonX-100的0.05M TBS)进行洗涤；

复染：将切片在流水下冲洗后置于苏木素染色液(例如：珠海贝索生物技术有限公司，Mayer’s苏木素)中3-5分钟，取出放置在流水下冲洗至返蓝后自然风干；

封片：将切片置于二甲苯中，使用封片胶(例如：国药集团，中性树胶)进行封片；

阅片：正置光学显微镜进行阅片，蓝色为细胞核，棕黄色为阳性着色，阳性着色通过着色强度、着色密度和着色模式(部位)三部分进行评估。本检测着色模式应为胞膜或胞浆着色，评分标准见表2。

表2

3、考察不同条件下的检测特异性和敏感性，具体评价方法见实施例6，结果见下表3。

表3不同条件制备试剂盒对比结果

从对比结果可以看出：在固定液的选择上，4％多聚甲醛和10％中性缓冲***均可作为样本固定液；在抗原修复液的选择上，pH6.0柠檬酸盐缓冲液作为抗原修复液，阳性信号比较强，阴性信号最弱；从抗体浓度可以看出10ug/mL工作浓度下，阳性对照信号最强，且阴性对照不产生任何信号。

实施例6免疫组化检测试剂盒性能测试

1、特异性

使用和检测抗体亚型一致的IgG1嵌合抗体作为阴性对照抗体，在阴阳性质控细胞中进行染色(见图5)；图片可以看出，本发明试剂盒中的检测抗体在CD26高表达细胞(786-0)中存在较强的阳性着色(综合评分+++)，在CD26不(或低)表达细胞(A375)中不存在任何棕黄色着色(综合评分-)；试剂盒中的阴性对照抗体在CD26高表达细胞或不(或低)表达细胞中均不存在任何棕黄色着色(综合评分-)，上述结果表明本发明试剂盒具有良好的特异性。

2、免疫原性

使用一抗在正常人体组织(每种组织有3例，购买于西安艾丽娜生物科技有限公司)进行染色，确认一抗在正常人体组织中的交叉反应性。一共19种正常组织用于一抗的染色(见图6和表4)：

表4检测抗体在正常组织中的交叉反应

染色结果显示一抗在肾上腺、卵巢、脑垂体、扁桃体、心脏、胃、小肠、肝脏、舌、***、子宫、横纹肌和眼睛组织中存在交叉反应，上述染色结果可以为试剂盒用户使用带有正常组织的肿瘤标本在检测抗体的染色下正常组织中会存在的交叉反应提供参考。

3、批内批间重复性

使用了来源于5个人体肿瘤组织样本和阴阳性质控样本的3张切片进行CD26抗体和阴性对照抗体的染色(见图7和表5)，进行了连续3个批次的检测；结果显示在一个批次内各样本的3张切片在检测抗体和阴性抗体的染色下，着色深度、着色密度和着色模式无显著差异，批次间也不存在差异，上述结果表明本发明试剂盒具有良好的重复性。

表5批内批间重复性

上述结果显示，本发明检测试剂盒具有良好的检测性能，可用于组织或细胞中的CD26抗原的检测。

序列表

<110> 江苏众红生物工程创药研究院有限公司

<120> 人CD26的免疫组化检测试剂盒及其临床应用

<130> 人CD26的免疫组化检测试剂盒及其临床应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Gly Tyr Lys Phe Thr Ile Tyr Gly

1 5

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Tyr Thr

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Ala Arg Asp His Gly Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Arg Asn Ile Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Lys Val Phe

1

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 7

<211> 114

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Gly Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Asn Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ile Tyr

20 25 30

Gly Ile Lys Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Tyr Thr Val Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Phe

65 70 75 80

Leu Gln Ile Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ser Ile Phe Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Asp His Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 8

<211> 112

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Ser Ser Ser Arg Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Phe Lys Arg Leu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Thr Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 444

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Gly Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Asn Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ile Tyr

20 25 30

Gly Ile Lys Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Tyr Thr Val Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Phe

65 70 75 80

Leu Gln Ile Arg Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ser Ile Phe Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Asp His Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val

100 105 110

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

115 120 125

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

130 135 140

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

145 150 155 160

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

180 185 190

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

195 200 205

Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

275 280 285

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

290 295 300

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

305 310 315 320

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

340 345 350

Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

355 360 365

Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

385 390 395 400

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

405 410 415

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

420 425 430

Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 10

<211> 1335

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 10

gaggtgcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgggcagac ctggatccag cgtgaacctg 60

tcctgcaaga ccagcggcta caagttcaca atctatggca tcaagtgggt gaagcagagg 120

cctggacagg gactggagtg gatcggctac atctatccag gcaacggcta caccgtgtat 180

aatgagaagt tccagggcaa ggccaccctg acatctgaca cctcttccag cacagtgttt 240

ctgcagatca ggtctctgac atccgacgat tcttccatct tcttttgcgc tcgggaccac 300

ggcgattact ggggacaggg aaccacactg accgtgagct ctgcctctac aaagggcccc 360

tccgtgtttc cactggctcc atccagcaag tccaccagcg gaggaacagc cgctctgggc 420

tgtctggtga aggattattt ccccgagcct gtgaccgtga gctggaattc tggcgccctg 480

acctccggcg tgcatacatt tccagctgtg ctgcagtctt ccggcctgta cagcctgagc 540

tctgtggtga cagtgccctc cagctctctg ggcacccaga catatatctg taacgttaat 600

cacaagccat ctaataccaa ggtggacaag aaggtggagc ccaagtcctg tgataagaca 660

catacctgcc caccttgtcc tgctccagag ctgctgggcg gaccatccgt gttcctgttt 720

ccacccaagc ctaaggacac cctgatgatc tccagaacac cagaggtgac ctgcgtggtg 780

gtggacgtga gccacgagga tcccgaggtg aagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 840

gtgcataatg ctaagaccaa gccaagggag gagcagtaca atagcacata tcgggtggtg 900

tctgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtataa gtgcaaggtg 960

tctaataagg ccctgcccgc tcctatcgag aagacaatct ccaaggccaa gggccagcct 1020

agagagccac aggtgtacac cctgcctcca tcccgcgacg agctgacaaa gaaccaggtg 1080

agcctgacct gtctggtgaa gggcttctat ccctctgaca tcgctgtgga gtgggagtcc 1140

aatggccagc ctgagaacaa ttacaagacc acaccccctg tgctggacag cgatggctct 1200

ttctttctgt attccaagct gacagtggat aagagccgct ggcagcaggg caacgtgttt 1260

tcctgtagcg tgatgcatga ggctctgcac aatcattaca cccagaagtc tctgtccctg 1320

agccccggca agtga 1335

<210> 11

<211> 219

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 11

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Ser Ser Ser Arg Asn Ile Val His Ser

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Phe Lys Arg Leu Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Thr Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Thr Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 12

<211> 660

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 12

gacgtgctga tgacccagac accactgtcc ctgcccgtga gcctgggcga tcaggccagc 60

atctcttgct ccagctctag gaacatcgtg cactctgacg gcaatacata cctggattgg 120

tatctgcaga agcctggcca gtccccaaag ctgctgatct acaaggtgtt caagaggctg 180

agcggagtgc cagaccggtt ctccggaagc ggatctggaa ccgacttcac cctgaagatc 240

accagagtgg aggccgagga tctgggcgtg tacttctgct ttcagggctc ccatgtgccc 300

tatacattcg gcggaggaac cacactggag accaagcgca cagtggccgc tcctagcgtg 360

ttcatctttc ccccttctga cgagcagctg aagtctggca ccgcttccgt ggtgtgcctg 420

ctgaacaact tctacccaag ggaggccaag gtgcagtgga aggtggataa cgctctgcag 480

tccggcaata gccaggagtc tgtgaccgag caggactcca aggatagcac atattctctg 540

tccagcaccc tgacactgtc taaggccgac tacgagaagc acaaggtgta tgcttgcgag 600

gtgacccatc agggcctgtc ttcccccgtg acaaagtcct ttaacagagg cgagtgttga 660

Claims (8)

1.一种用于检测人肿瘤组织中的CD26蛋白表达的免疫组化试剂盒，包括抗人CD26抗体、同型对照阴性抗体、抗体稀释液和监控染色质量的质控片，其特征在于，所述抗人CD26抗体，其重链可变区含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：1所示的HCDR1、如序列SEQ ID NO：2所示的HCDR2和如序列SEQ ID NO：3所示的HCDR3；

以及其轻链可变区序列含有以下的互补决定区：氨基酸序列如序列SEQ ID NO：4所示的LCDR1、如序列SEQ ID NO：5所示的LCDR2和如序列SEQ ID NO：6所示的LCDR3。

2.如权利要求1所述的免疫组化试剂盒，其特征在于，抗人CD26抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

3.如权利要求2所述的免疫组化试剂盒，其特征在于，所述抗人CD26抗体为嵌合抗体，其氨基酸序列由如SEQ ID NO:7所示的重链可变区与人单抗IgG1重链恒定区融合，如SEQID NO:8所示所述的轻链可变区与人单抗IgG1轻链恒定区融合构成。

4.如权利要求3所述的免疫组化试剂盒，其特征在于，所述抗人CD26抗体由哺乳动物宿主细胞重组表达得到。

5.如权利要求1至4中任一项所述的免疫组化试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的抗体稀释液含有1% BSA和10%山羊血清的0.05M TBS。

6.如权利要求1至4中任一项所述的免疫组化试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的抗体工作浓度为2.5-10ug/mL。

7.如权利要求1至4中任一项所述的免疫组化试剂盒，其特征在于，与所述试剂盒配套使用的组织固定液为4%多聚甲醛或10%中性缓冲***。

8.如权利要求1至4中任一项所述的免疫组化试剂盒，其特征在于，与所述试剂盒配套使用的抗原修复液为pH6.0的柠檬酸盐缓冲液。

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