CN115990195A - 羊肚菌多糖及其合生元制剂在缓解肥胖产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了羊肚菌多糖及其合生元制剂在缓解肥胖产品中的应用，属于微生物技术领域。本发明主要针对羊肚菌多糖与益生菌复配的合生元通过增强肝脏抗氧化能力，降低肝脏炎症，促进短链脂肪酸合成，调节肠道菌群，达到缓解小鼠肥胖的作用。本发明证实了在益生菌的参与下，合生元能够相较于单纯的羊肚菌多糖发挥出明显的抗肥胖效果，羊肚菌多糖的功能物质被激活，产生了增强肝脏抗氧化能力、降低肝脏炎症并短链脂肪酸含量的作用。本发明可以对未来合生元制剂的开发提供新的方案及思路，可以为相关功能性食品或药品的开发提供研究基础，使肠道菌群结构的研究得到丰富与拓展。

Description

羊肚菌多糖及其合生元制剂在缓解肥胖产品中的应用

技术领域

本发明涉及羊肚菌多糖及其合生元制剂在缓解肥胖产品中的应用，属于微生物技术领域。

背景技术

肥胖被定义为一种与众多健康问题和寿命缩短相关的疾病。越来越多的证据表明，肥胖与慢性低度炎症密切相关，长期的肝脏炎症可能导致非酒精性脂肪肝、胰岛素抵抗、Ⅱ型糖尿病和心血管疾病的发生。不仅如此，肝脏也作为机体的解毒器官，长期的氧化应激也会对其造成严重损伤，同时也引发肝脏炎症的形成。肥胖症的高流行率目前是对公共健康的主要威胁，全球有5亿肥胖者和14亿超重者。因此，预防肥胖是现代社会面临的一项重大挑战。而益生菌作为一种微生态制剂的来源，可以进入到人体的肠道发挥维持机体肠道稳态，增强机体免疫力，缓解机体炎症等保健功能。有研究表明，益生菌可以通过肝肠轴调节肝脏的糖脂代谢，进而发挥抗肥胖，缓解Ⅱ型糖尿病，缓解非酒精性脂肪肝的功效。食用真菌作为一种营养食品在世界范围内越来越受欢迎，而且因其具有丰富的活性物质而具有抗糖尿病、抗氧化、抗炎和抗肿瘤等作用，因此从食源性的食用真菌中寻找缓解肥胖的膳食成分具有一定的意义与价值。

发明内容

本发明主要针对羊肚菌多糖与益生菌复配的合生元通过增强肝脏抗氧化能力，降低肝脏炎症，促进短链脂肪酸合成，调节肠道菌群，达到缓解小鼠肥胖的作用。本发明证实了在益生菌的参与下，合生元能够相较于单纯的羊肚菌多糖发挥出明显的抗肥胖效果。在益生菌的参与下，羊肚菌多糖的功能物质被激活，产生了增强肝脏抗氧化能力、降低肝脏炎症并短链脂肪酸含量的作用。

本发明提供了一种降低肝脏炎症且缓解肥胖的羊肚菌制剂，所述羊肚菌制剂为合生元制剂或者羊肚菌多糖；

所述合生元制剂是将长双歧杆菌长亚种、植物乳杆菌添加至羊肚菌多糖中得到的；所述羊肚菌多糖的制备方法为，将羊肚菌于沸水中提取0.5～1小时，重复提取后浓缩，将得到的浓缩液用乙醇进行醇提，醇提后离心取沉淀，干燥后即为羊肚菌多糖。

在本发明的一种实施方式中，所述羊肚菌制剂配制方法为：将冻存管中的益生菌(植物乳杆菌CCFM8661&长双歧杆菌CCFM1077)，离心去除甘油后，用0.9％的生理盐水重悬，再加入冻干后的羊肚菌多糖粉，震荡溶解。

在本发明的一种实施方式中，所述羊肚菌多糖的制备方法为：羊肚菌于沸水中提取0.5～1小时，重复提取5～6次，合并上清液，旋转蒸发浓缩，浓缩液加入三倍体积的无水乙醇，静置放置24小时，离心，收集沉淀，最终冷冻干燥。

在本发明的一种实施方式中，旋转蒸发浓缩的温度不要超过40℃。

在本发明的一种实施方式中，真空冷冻干燥的具体条件为-80℃，-0.06kPa，48h。

在本发明的一种实施方式中，所述制剂中，长双歧杆菌长亚种、植物乳杆菌是按照菌浓比为1:1的比例进行添加的。

在本发明的一种实施方式中，所述长双歧杆菌长亚种的添加量至少为1×10⁹CFU/g或1×10⁹CFU/mL，所述植物乳杆菌的添加量至少为1×10⁹CFU/g或1×10⁹CFU/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述长双歧杆菌长亚种为长双歧杆菌长亚种GDMCCNo：60769；所述乳杆菌为植物乳杆菌CGMCC No.5494。

所述长双歧杆菌长亚种GDMCC No：60769记载于公开号为CN111073828B的中国发明专利中，命名为长双歧杆菌长亚种CCFM1077。

所述植物乳杆菌CGMCC No.5494记载于公开号为CN102586148B的中国发明专利中，命名为植物乳杆菌CCFM8661。

本发明提供了一种缓解肥胖的产品，所述产品中含有羊肚菌制剂；所述羊肚菌制剂为合生元制剂或者羊肚菌多糖；

所述合生元制剂是将长双歧杆菌长亚种、植物乳杆菌添加至羊肚菌多糖中得到的；所述羊肚菌多糖的制备方法为，将羊肚菌于沸水中提取0.5～1小时，重复提取后浓缩，将得到的浓缩液用乙醇进行醇提，醇提后离心取沉淀，干燥后即为羊肚菌多糖。

在本发明的一种实施方式中，所述羊肚菌制剂配制方法为：将冻存管中的益生菌(植物乳杆菌CCFM8661&长双歧杆菌CCFM1077)，离心去除甘油后，用0.9％的生理盐水重悬，再加入冻干后的羊肚菌多糖粉，震荡溶解。

在本发明的一种实施方式中，所述羊肚菌多糖的制备方法为：羊肚菌于沸水中提取0.5～1小时，重复提取5～6次，合并上清液，旋转蒸发浓缩，浓缩液加入三倍体积的无水乙醇，静置放置24小时，离心，收集沉淀，最终冷冻干燥。

在本发明的一种实施方式中，旋转蒸发浓缩的温度不要超过40℃。

在本发明的一种实施方式中，真空冷冻干燥的具体条件为-80℃，-0.06kPa，48h。

在本发明的一种实施方式中，所述制剂中，长双歧杆菌长亚种、植物乳杆菌是按照菌浓比为1:1的比例进行添加的。

在本发明的一种实施方式中，所述长双歧杆菌长亚种的添加量至少为1×10⁹CFU/g或1×10⁹CFU/mL，所述植物乳杆菌的添加量至少为1×10⁹CFU/g或1×10⁹CFU/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述长双歧杆菌长亚种为长双歧杆菌长亚种GDMCCNo：60769；所述乳杆菌为植物乳杆菌CGMCC No.5494。

在本发明的一种实施方式中，所述产品中，总的益生菌的添加量至少为：2×10⁹CFU/g或2×10⁹CFU/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述产品中，所述羊肚菌多糖的添加量至少为：400mg/kg。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品、保健品、兽药或者饲料添加剂。

在本发明的一种实施方式中，所述药品还包括药学上可接受的赋型剂；所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。

在本发明的一种实施方式中，当产品为兽药或者饲料添加剂时，所述羊肚菌合生元制剂有效剂量不低于100mg/Kg。

在本发明的一种实施方式中，所述兽药或者饲料添加剂中还含有常规辅料。

在本发明的一种实施方式中，所述常规辅料包括填充剂、矫味剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、以及抗酸剂中的一种或多种。

本发明还提供了一种羊肚菌制剂在制备缓解肥胖的产品中的应用，所述羊肚菌制剂为合生元制剂或者羊肚菌多糖；所述合生元制剂是将长双歧杆菌长亚种、植物乳杆菌添加至羊肚菌多糖中得到的；所述羊肚菌多糖的制备方法为，将羊肚菌于沸水中提取0.5～1小时，重复提取后浓缩，将得到的浓缩液用乙醇进行醇提，醇提后离心取沉淀，干燥后即为羊肚菌多糖。

在本发明的一种实施方式中，所述合生元制剂配制方法为：将冻存管中的益生菌(植物乳杆菌CCFM8661&长双歧杆菌CCFM1077)，离心去除甘油后，用0.9％的生理盐水重悬，再加入冻干后的羊肚菌多糖粉，震荡溶解。

在本发明的一种实施方式中，所述羊肚菌多糖的制备方法为：羊肚菌于沸水中提取0.5～1小时，重复提取5～6次，合并上清液，旋转蒸发浓缩，浓缩液加入三倍体积的无水乙醇，静置放置24小时，离心，收集沉淀，最终冷冻干燥。

在本发明的一种实施方式中，旋转蒸发浓缩的温度不要超过40℃。

在本发明的一种实施方式中，真空冷冻干燥的具体条件为-80℃，-0.06kPa，48h。

在本发明的一种实施方式中，所述产品中，长双歧杆菌长亚种、植物乳杆菌是按照菌浓比为1:1的比例进行添加的。

在本发明的一种实施方式中，所述长双歧杆菌长亚种的添加量至少为1×10⁹CFU/g或1×10⁹CFU/mL，所述植物乳杆菌的添加量至少为1×10⁹CFU/g或1×10⁹CFU/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述产品中，所述羊肚菌多糖的添加量至少为：400mg/kg。

在本发明的一种实施方式中，所述长双歧杆菌长亚种为长双歧杆菌长亚种GDMCCNo：60769；所述乳杆菌为植物乳杆菌CGMCC No.5494。

所述长双歧杆菌长亚种GDMCC No：60769记载于公开号为CN111073828B的中国发明专利中，命名为长双歧杆菌长亚种CCFM1077。

所述植物乳杆菌CGMCC No.5494记载于公开号为CN102586148B的中国发明专利中，命名为植物乳杆菌CCFM8661。

在本发明的一种实施方式中，总的益生菌的添加量至少为：2×10⁹CFU/g或2×10⁹CFU/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述产品为药品、保健品、兽药或者饲料添加剂。

在本发明的一种实施方式中，所述药品还包括药学上可接受的赋型剂；所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。

在本发明的一种实施方式中，所述兽药或者饲料添加剂中还含有常规辅料；所述常规辅料包括填充剂、矫味剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、以及抗酸剂中的一种或多种。

本发明还提供了一种羊肚菌制剂在制备生物制剂中的应用，所述羊肚菌制剂为合生元制剂或者羊肚菌多糖；所述合生元制剂含有长双歧杆菌长亚种、植物乳杆菌和羊肚菌多糖；所述生物制剂具有以下(a)～(g)任一功能：

(a)缓解小鼠体重加重；

(b)降低体内脂肪积累；

(c)调节小鼠糖脂代谢异常；

(d)促进短链脂肪酸的合成；

(e)缓解小鼠肝脏氧化应激；

(f)降低肝脏炎症；

(g)调节肠道菌群。

在本发明的一种实施方式中，所述合生元制剂是将长双歧杆菌长亚种、植物乳杆菌添加至羊肚菌多糖中得到的；所述羊肚菌多糖的制备方法为，将羊肚菌于沸水中提取0.5～1小时，重复提取后浓缩，将得到的浓缩液用乙醇进行醇提，醇提后离心取沉淀，干燥后即为羊肚菌多糖。

在本发明的一种实施方式中，所述合生元制剂配制方法为：将冻存管中的益生菌(植物乳杆菌CCFM8661&长双歧杆菌CCFM1077)，离心去除甘油后，用0.9％的生理盐水重悬，再加入冻干后的羊肚菌多糖粉，震荡溶解。

在本发明的一种实施方式中，所述羊肚菌多糖的制备方法为：羊肚菌于沸水中提取0.5～1小时，重复提取5～6次，合并上清液，旋转蒸发浓缩，浓缩液加入三倍体积的无水乙醇，静置放置24小时，离心，收集沉淀，最终冷冻干燥。

在本发明的一种实施方式中，旋转蒸发浓缩的温度不要超过40℃。

在本发明的一种实施方式中，真空冷冻干燥的具体条件为-80℃，-0.06kPa，48h。

在本发明的一种实施方式中，所述制剂中，长双歧杆菌长亚种、植物乳杆菌是按照菌浓比为1:1的比例进行添加的，

在本发明的一种实施方式中，所述长双歧杆菌长亚种的添加量至少为1×10⁹CFU/g或1×10⁹CFU/mL，所述植物乳杆菌的添加量至少为1×10⁹CFU/g或1×10⁹CFU/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述长双歧杆菌长亚种为长双歧杆菌长亚种GDMCCNo：60769；所述乳杆菌为植物乳杆菌CGMCC No.5494。

在本发明的一种实施方式中，所述产品中，总的益生菌的添加量至少为：2×10⁹CFU/g或2×10⁹CFU/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述产品中，所述羊肚菌多糖的添加量至少为：400mg/kg。

本发明还提供了上述羊肚菌制剂通过增强肝脏抗氧化能力，降低肝脏炎症，促进短链脂肪酸合成，调节肠道菌群，达到缓解小鼠肥胖的作用。

在本发明的一种实施方式中，所述产品用于(a)～(g)至少一方面：

(a)缓解小鼠体重加重；

(b)降低体内脂肪积累；

(c)调节小鼠糖脂代谢异常；

(d)促进短链脂肪酸的合成；

(e)缓解小鼠肝脏氧化应激；

(f)降低肝脏炎症；

(g)调节肠道菌群。

有益效果

1、本发明首次证实羊肚菌多糖与益生菌复配后通过提高肝脏抗氧化能力和降低肝脏炎症来治疗小鼠的肥胖，其作用机制为合生元制剂改变了肥胖小鼠的菌群结构，进而改变了菌群代谢产物。具体地，羊肚菌多糖经过两种益生菌和肠道微生物的作用后，经肠道吸收通过肝肠轴调节肝脏，增加了肝脏中过氧化物酶和还原型谷胱甘肽含量，降低了丙二醛的含量，增强了肝脏的抗氧化能力；并且，降低了肝脏中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，来缓解肝脏损伤；促进了肠道短链脂肪酸的合成，其中乙酸和丁酸的含量显著增加，进而调节全身脂质代谢；羊肚菌多糖调节肠道菌群，其结构的变化与其他缓解肥胖的研究中所报道的一致，其中特异菌属Coprococcus的丰度与机体胆固醇含量呈负相关关系，Odoribacter的丰度的增加与缓解肝损伤及机体炎症相关；Odoribacter、Romboutsia的丰度与机体短链脂肪酸的含量呈正相关关系，从而达到抗肥胖的作用，具体如下：

(1)经过11周60％高脂饲料的喂养后，羊肚菌(高)组小鼠体重增长率为23.68％(P<0.001)，合生元组为21.74％(P<0.0001)。两组均显著缓解肥胖小鼠体重加重速度，合生元组能够发挥更显著的缓解效果。

(2)合生元组将肥胖小鼠附睾脂肪和皮下脂肪指数分别从5.98％下降至3.05％；1.87％下降至1.51％，但对褐色脂肪指数并未有显著提高。羊肚菌(高)组将附睾脂肪和皮下脂肪指数分别下降至3.74％和1.38％，褐色脂肪指数由0.3％提高至0.4％。

(3)合生元组将肥胖小鼠空腹血糖由6.8mmol/L降至5.33mmol/L，而羊肚菌(高)为6.08mmol/L，并未发挥调解血糖效果。

(4)合生元组将肥胖小鼠总甘油三酯和低密度脂蛋白分别由1.65mmol/L降至1.12mmol/L；0.95mmol/L降至0.5mmol/L。而羊肚菌(高)组总甘油三酯为1.4mmol/L，并未发挥降低效果，低密度脂蛋白降至0.65mmol/L，发挥了降低血液脂肪含量的作用。

(5)合生元组缓解肥胖小鼠肝脏氧化应激，过氧化氢酶含量由2.22U/mg提高至2.88U/mg；还原型谷胱甘肽含量由616.6μmol/mg提高至794.4μmol/mg，丙二醛含量由1.11nmol/mg降低至0.69nmol/mg。羊肚菌(高)组丙二醛含量降低至0.69nmol/mg，而过氧化氢酶和还原型谷胱甘肽含量并未有显著提高。

(6)合生元组降低肥胖小鼠肝脏炎症因子的含量，TNF-α含量由7178pg/mgprot降至3189pg/mgprot；IL-1β含量由525.6pg/mgprot降至236.5pg/mgprot；IL-6含量由782.6pg/mgprot降至594.8pg/mgprot；IL-10含量由2323pg/mgprot提高至3259pg/mgprot。羊肚菌(高)组显著分别将TNF-α和IL-1β降至3944pg/mgprot和242.9pg/mgprot，而IL-6和IL-10并未发挥显著效果。

(7)合生元组促进小鼠短链脂肪酸的合成分别将乙酸和丁酸由111.9μmol/g提高到151.3μmol/g；由18.37μmol/g提高到25.5μmol/g。羊肚菌(高)组分别为159μmol/g和22.66μμmol/g。

2、本发明可以对未来合生元制剂的开发提供新的方案及思路，可以为相关功能性食品或药品的开发提供研究基础，使肠道菌群结构的研究得到丰富与拓展。本发明提供了一种新型的针对制备肥胖、II型糖尿病、高血脂症、非酒精性脂肪肝等脂质代谢性疾病的产品。

附图说明

图1为高脂饮食的小鼠经历十一周的喂养后的体重变化；其中，A为经历十一周高脂饲料喂养，不同组别小鼠的体重变化；B为其曲线下面积；C为不同组别小鼠的体重增长率。

图2为解剖后不同组别小鼠的附睾脂肪直观图；其中，A为空白组，B为造模组，C为羊肚菌高剂量组，D为合生元组。

图3为不同组别小鼠不同脂肪组织系数；其中，A为附睾脂肪组织系数，B为皮下脂肪组织系数，C为褐脂脂肪组织系数。

图4为不同组别小鼠血生化指标；其中，A为空腹血糖，B为总甘油三酯，C为低密度脂蛋白。

图5为不同组别小鼠肝脏组织抗氧化能力的影响；其中，A为过氧化物酶CAT，B为还原型谷胱甘肽GSH，C为丙二醛MDA。

图6为不同组别小鼠对肝脏炎症因子的影响；其中，A为TNF-α，B为IL-1β，C为IL-6，D为IL-10。

图7为不同组别小鼠的短链脂肪酸含量的影响；其中，A为乙酸，B为丁酸。

图8为灌喂不同剂量羊肚菌多糖对菌群α多样性的影响；其中，每组6只小鼠(n＝6)，平均值±SD，P值使用非配对T检验计算，**P<0.01,***P<0.001，****P<0.0001；A为香浓指数，B为OTU水平。

图9为造模组、羊肚菌(低)组和羊肚菌(高)组菌群Lefse分析结果图；其中，A为进化分枝图，B为LDA得分图。

图10为灌喂造模组、羊肚菌低剂量组和羊肚菌高剂量组菌群Lefse分析后，特异菌属的丰度柱状图；其中，A为Coprococcus 3，B为Odoribacter，C为Harryflintia，D为Turicibacter，E为Romboutsia，F为Tyzzerella。

备注：空白组(低脂饮食)；造模组(高脂饮食)；羊肚菌低剂量组(灌喂羊肚菌多糖，100mg/kg，高脂饮食)；羊肚菌高剂量组(灌喂羊肚菌多糖，400mg/kg，高脂饮食)；复合菌剂组(灌喂植物乳杆菌CCFM8661和长双歧杆菌CCFM1077，1×10⁹CFU，高脂饮食)；合生元组(灌喂羊肚菌多糖和复合菌剂，400mg/kg，1×10⁹CFU，高脂饮食)，每组8只小鼠(n＝8)，平均值±SD，P值使用非配对T检验计算，*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001，****P<0.0001。

具体实施方式

下述实施例中所涉及的羊肚菌购自浙江省金华市磐安县华东宝药业有限公司。

下述实施例中所涉及的培养基如下：

双歧杆菌使用mMRS液体培养基：其配方为(1L)：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母提取物、20g葡萄糖、5g乙酸钠、1mL吐温80、2g磷酸氢二钾、2g柠檬酸二铵、0.1g七水硫酸镁、0.05g一水硫酸锰、1g半胱氨酸盐酸盐、蒸馏水：1000mL；pH：6.2-6.4；115℃灭菌20min。

植物乳杆菌使用MRS液体培养基：其配方为(1L)：10g蛋白胨、10g牛肉膏、5g酵母提取物、20g葡萄糖、5g乙酸钠、1mL吐温80、2g磷酸氢二钾、2g柠檬酸二铵、0.1g七水硫酸镁、0.05g一水硫酸锰、蒸馏水：1000mL；pH：6.2-6.4；115℃灭菌20min。

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

造模组小鼠体重率达到31.98％，已超过30％，认定已达到肥胖模型的成模调节。

附睾指数、皮下指数、褐脂指数的检测方法：

分别称取小鼠的附睾脂肪组织、皮下脂肪组织和褐色脂肪组织质量，再除以小鼠自身体量得到相应的附睾指数、皮下指数和褐脂指数。

血生化指标检测方法：

将-20℃冷冻血浆解冻后用0.9％生理盐水稀释3倍并保证每个样品不少于200μL。借助试剂盒在全自动生化分析仪上进行检测分析。

短链脂肪酸的检测方法：

小鼠盲肠内容物预先冷冻干燥，称取30-50mg冻干样本，利用无水***萃取短链脂肪酸，经离心分离及无水硫酸钠除水后，将得到的短链脂肪酸转移至气相瓶中采用气相色谱-质谱联用(gas chromatography–mass spectrometry，GC-MS)***进行上机检测。GC-MS***参数设置详见下表1。

表1：GC-MS参数设置

抗氧化能力的检测方法：

取-80℃冻存小鼠的肝脏组织50mg，使用南京建成的试剂盒，测定肝脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、还原性谷胱甘肽(GSH)含量。使用碧云天的BCA试剂盒测定肝脏中蛋白质的含量。具体操作步骤见试剂盒。

炎症因子的检测方法：

取-80℃冻存小鼠的肝脏组织50mg，使用R&D的试剂盒，测定肝脏组织中IL1β、IL-6和TNF-α含量。具体操作步骤见试剂盒。

α多样性、菌群信息的检测：

取小鼠结肠内容物，使用美国MP试剂盒进行粪便DNA的提取，然后再以其为模板对细菌的V3-V4片段进行PCR反应。将得到的PCR产物全部进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。使用胶回收试剂盒从含有目的条带的琼脂糖凝胶中回收并纯化目的基因。将提取好的菌群特异基因在Illumina Miseq PE300平台上机测试，下机数据通过QIIMEⅡ软件进行分析，并进行下机数据的质量控制。通过QIIMEⅡ将相似性>97％的高质量序列分类为操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)，最后根据OTU同源性进行比较并归类到属。

下述实施例中所涉及的高脂饲料、低脂饲料购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，配方如下表2：

表2动物实验的饲料配方表

实施例1：合生元制剂的制备

1、羊肚菌多糖的制备：

将羊肚菌于沸水中提取0.5～1小时，重复提取5～6次，合并上清液，旋转蒸发浓缩，浓缩液加入三倍体积的无水乙醇，静置放置24小时，离心，收集沉淀，用蒸馏水复溶后，使用sevag法去蛋白，最终冷冻干燥，得到羊肚菌多糖冻干粉。

其糖含量通过苯酚-硫酸法测定为76.13％，蛋白含量使用碧云天BCA试剂盒测定为8.16％。

取冻干后粉末用0.9％生理盐水溶解，得到羊肚菌多糖溶液，分别得到100mg/kg羊肚菌多糖溶液和400mg/kg羊肚菌多糖溶液。

2、复合菌剂的培养：

(1)将菌株植物乳杆菌CCFM8661及长双歧杆菌长亚种CCFM1077进行平板划线分离，在37℃恒温培养箱中培养48小时，分别制备得到植物乳杆菌CCFM8661单菌落、长双歧杆菌长亚种CCFM1077单菌落。

(2)益生菌的前处理

植物乳杆菌CCFM8661培养液的制备：

将分离好的植物乳杆菌CCFM8661单菌落接入到5mL MRS液体培养基中，在37℃恒温培养箱中培养12小时；制备得到种子液，将5mL液体培养基重悬后，再全部接入1L MRS和液体培养基中，在37℃恒温培养箱扩培18小时，制备得到植物乳杆菌CCFM8661培养液；

长双歧杆菌长亚种CCFM1077培养液的制备：

将分离好的长双歧杆菌长亚种CCFM1077单菌落接入mMRS的5mL液体培养基中，在37℃恒温培养箱中培养12小时；制备得到种子液，将5mL液体培养基重悬后，再全部接入1LmMRS液体培养基中，在37℃恒温培养箱扩培18小时，制备得长双歧杆菌长亚种CCFM1077培养液；

分别将上述培养液在常温、6000rpm条件下离心10min后得到菌泥，再加入1L的30％甘油，重悬后分装到2毫升的保菌管中，放入-20℃冰箱保存。

3、合生元的制备：

分别将步骤(2)的冻存管已冻存好的益生菌，在常温、6000rpm条件下离心10min后去除甘油后，用0.9％的生理盐水重悬后，分别得到植物乳杆菌CCFM8661重悬液和长双歧杆菌长亚种CCFM1077重悬液，此时，植物乳杆菌CCFM8661重悬液、长双歧杆菌长亚种CCFM1077重悬液中菌浓均为：1×10¹⁰CFU/mL；

分别将上述重悬液按照活菌数1:1的比例进行混合，总菌浓为：1×10¹⁰CFU/mL，得到混合菌液；

再向混合菌液中按照体积比为1:1的比例加入羊肚菌多糖溶液(400mg/kg)，震荡溶解，得到合生元制剂溶液。

实施例2：乳杆菌与双歧杆菌/羊肚菌多糖合生元制剂对缓解小鼠肥胖的影响

具体步骤如下：

实验分组及处理方法：

分别设置6组：

空白对照组、高脂饮食造模组、羊肚菌多糖低剂量组、羊肚菌多糖高剂量组、复合菌剂组、合生元组。

所述复合菌剂的制备方法为：按照实施例1的方法分别制备得到植物乳杆菌CCFM8661重悬液(菌浓为：1×10¹⁰CFU/mL)、长双歧杆菌长亚种CCFM1077重悬液(菌浓为：1×10¹⁰CFU/mL)，分别将上述菌悬液按照体积比为1：1的比例进行混合后，得到复合菌剂；

具体实验如下：

雄性C57BL6/J小鼠(n＝40)，7周龄，体重22至25克，在江南大学动物实验中心饲养(25±2℃，12/12小时光照/黑暗期)。在实验室条件下给予小鼠自由水和食物，观察一周时间。然后，将48只小鼠分成6组(每组n＝8)，空白组喂养低脂饲料；其他五组喂养高脂饲料。动物实验设计方案如表3所示。

表3动物实验的实验设计方案

空白组和造模组小鼠灌喂0.9％生理盐水；

羊肚菌低剂量组：灌喂100mg/kg的羊肚菌多糖溶液；

羊肚菌高剂量组：灌喂400mg/kg的羊肚菌多糖溶液；

合生元组：灌喂0.4mL合生元制剂；

复合菌剂组：灌喂0.2mL复合菌剂。

每周记录一次小鼠的体重，经历11周后，造模组小鼠平均体重增长率超过30％达到肥胖的成模标准。

在第12周，进行16h的禁食不禁水后将所有老鼠CO₂安乐死后，取血，取结肠及盲肠内容物，秤取其肝脏、附睾脂肪、皮下脂肪和褐色脂肪。

取70μL血浆，用0.9％生理盐水稀释3倍，借助试剂盒在全自动生化分析仪上检测血糖、甘油三酯和低密度脂蛋白含量。

结果显示：

(1)如图1A～C所示，经过11周60％高脂饲料的喂养后，造模组小鼠体重率达到31.98％，已超过30％，认定已达到肥胖模型的成模调节。

羊肚菌(高)组小鼠体重增长率为23.68％(P<0.001)，合生元组为21.74％(P<0.0001)。两组均显著缓解肥胖小鼠体重加重速度，合生元组能够发挥更显著的缓解效果。

(2)如图3所示，造模组小鼠的附睾脂肪、皮下脂肪和褐色脂肪的结果为：附睾指数、皮下指数、褐脂指数分别为：5.98％，1.87％，0.3％；

单纯灌喂羊肚菌多糖(高剂量)，附睾指数、皮下指数、褐脂指数分别为：3.74％、1.38％、0.40％；

灌喂合生元后，附睾指数、皮下指数、褐脂指数分别为：3.05％、1.51％、0.28％；

单纯灌喂益生菌后，附睾指数、皮下指数、褐脂指数分别为：3.26％、1.89％、0.36％。

单纯灌喂羊肚菌多糖(低剂量)，附睾指数、皮下指数、褐脂指数分别为：3.81％、2.07％、0.31％。

可见，图2～图3进一步表明了，对于全身性的脂肪组织，治疗组显著降低了脂肪在附睾组织和皮下组织中的累积。进一步验证了，合生元能够缓解高脂饮食下小鼠肥胖。

(3)如图4所示，造模组小鼠的空腹血糖、总甘油三酯和低密度脂蛋白含量分别为：6.80mmol/L，1.65mmol/L，0.95mmol/L；

单纯灌喂羊肚菌多糖(高剂量)，空腹血糖、总甘油三酯和低密度脂蛋白含量分别为：6.08mmol/L，1.40mmol/L，0.65mmol/L；

灌喂合生元后，空腹血糖、总甘油三酯和低密度脂蛋白含量分别为：5.33mmol/L，1.12mmol/L，0.50mmol/L；

单纯灌喂益生菌后，空腹血糖、总甘油三酯和低密度脂蛋白含量分别为：6.74mmol/L，1.40mmol/L，0.65mmol/L；

单纯灌喂羊肚菌多糖(低剂量)，空腹血糖、总甘油三酯和低密度脂蛋白含量分别为：5.69mmol/L，1.65mmol/L，0.97mmol/L。

图4表明了治疗组显著降低了空腹血糖和血液中脂质的含量，对小鼠糖脂代谢异常具有明显的治疗效果。

实施例3：乳杆菌与双歧杆菌/羊肚菌多糖合生元制剂对高脂饮食小鼠肝脏损伤的保护作用

具体实施方式同实施例2，实验结束后，取小鼠肝脏组织，使用ELISA试剂盒(南京建成生物技术有限公司，江苏南京，中国)评估其中CAT、GSH和MDA的含量；使用R&D ELISA试剂盒评估结肠和小肠组织样本的TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-10。取小鼠的盲肠内容物，检测肠道中短链脂肪酸的含量；

结果如下：

(1)如图5所示，造模组小鼠肝脏中的CAT、GSH、MDA的含量分别为：2.22U/mg、616.6μmol/mg、1.11nmol/mg；

单纯灌喂羊肚菌多糖(高剂量)，CAT、GSH、MDA的含量分别为：2.72U/mg、694.4μmol/mg、0.69nmol/mg；

灌喂合生元后，CAT、GSH、MDA的含量分别为：2.88U/mg、794.4μmol/mg、0.69nmol/mg；

单纯灌喂益生菌后，CAT、GSH、MDA的含量分别为：分别为：2.05U/mg、619.3μmol/mg、0.89nmol/mg；

单纯灌喂羊肚菌多糖(低剂量)，CAT、GSH、MDA的含量分别为：1.95U/mg、612.1μmol/mg、0.91nmol/mg。

结果显示，合生元组能明显提高肝脏中CAT和GSH的含量，并降低MDA含量。上述表明，在益生菌的激活作用下，合生元能够更有效地提高肝脏的抗氧化能力，减少肝脏损伤，进而缓解肝脏脂质代谢异常，降低肥胖。

(2)如图6所示，造模组小鼠肝脏中的TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的含量分别为：7178pg/mgprot、525.6pg/mgprot、782.6pg/mgprot、2323pg/mgprot；

单纯灌喂羊肚菌多糖(高剂量)，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的含量分别为：3944pg/mgprot、242.9pg/mgprot、692.8pg/mgprot、2420pg/mgprot；

灌喂合生元后，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的含量分别为：3189pg/mgprot、236.5pg/mgprot、594.8pg/mgprot、3259pg/mgprot；

单纯灌喂益生菌后，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的含量分别为：分别为：3411pg/mgprot、277.9pg/mgprot、1002pg/mgprot、2833pg/mgprot；

单纯灌喂羊肚菌多糖(低剂量)，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的含量分别为：4539pg/mgprot、320.3pg/mgprot、736.7pg/mgprot、1864pg/mgprot。

结果显示，合生元组能够更显著降低肝脏组织中TNF-α、IL-1β和IL-6三种促炎因子的含量，缓解肝脏炎症。而羊肚菌(高)组在IL-6炎症因子水平并未较造模组产生显著性差异。上述表明，羊肚菌多糖能够一定程度缓解肝脏炎症，但与益生菌复配后，能够更明显地降低肝脏的炎症水平。因此，合生元相较于单一的益生元能够发挥出更显著的缓解肝脏炎症的效果，进一步对机体发挥抗肥胖作用。

(3)如图7所示，造模组小鼠肝脏中的乙酸和丁酸的含量分别为：111.9μmol/g、18.37μmol/g；

单纯灌喂羊肚菌多糖(高剂量)，乙酸和丁酸的含量分别为：159.0μmol/g、22.66μmol/g；

灌喂合生元后，乙酸和丁酸的含量分别为：151.3μmol/g、25.50μmol/g；

单纯灌喂益生菌后，乙酸和丁酸的含量分别为：分别为：107.6μmol/g、19.34μmol/g；

单纯灌喂羊肚菌多糖(低剂量)，乙酸和丁酸的含量分别为：129.9μmol/g、21.17μmol/g。

结果显示，羊肚菌能够促进肠道中乙酸和丁酸含量的增加，单纯的益生菌并未增加短链脂肪酸含量。将两者复配后，合生元组能够促进更多的丁酸和乙酸的产生，进一步发挥缓解肥胖的效果。可能是由于两种益生菌并不适合在高脂模型的肠道菌群结构中生存，而羊肚菌多糖作为益生元可能有利用益生菌的存活并促进其代谢产生SCFAs。短链脂肪酸已有大量研究表明其对全身性炎症、抗肥胖、抗肿瘤等方面具有治疗作用，合生元能够更显著增加乙酸和丁酸的含量，进而缓解了肝脏损伤及机体的脂质代谢紊乱。

实施例4：益生元羊肚菌多糖对肥胖小鼠肠道菌群结构的调节

具体实施方式同实施例2，实验结束后，取小鼠结肠内容物，使用美国MP试剂盒进行粪便DNA的提取，然后再以其为模板对细菌的V3-V4片段进行PCR反应。将得到的PCR产物全部进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。使用胶回收试剂盒从含有目的条带的琼脂糖凝胶中回收并纯化目的基因。在Illumina Miseq PE300平台上机测试，下机数据通过QIIMEⅡ软件进行分析。通过QIIMEⅡ将相似性>97％的高质量序列分类为操作分类单元(operationaltaxonomic unit，OTU)，最后根据OTU同源性进行比较并归类到种，结果如图8～10所示。

结果显示：

(1)如图8所示，在α多样性上，肥胖小鼠的菌群丰度和数量显著降低，而灌喂羊肚菌多糖后小鼠的菌群丰度显著增加，有助于肠道菌群丰富度的提高。

(2)如图9～10所示，通过16S rRNA测序技术获取了小鼠菌群信息通过Lefse分析得到，造模组中LDA绝对值超过3的菌有Ruminococcaceae UCG-004、Tyzzerella，羊肚菌多糖组中超过的有Odoribacter、Coprococcus 3、Romboutsia、Harryflintia、Turicibacter和Ruminiclostridium 6。其中Romboutsia LDA值最大，Odoribacter和Coprococcus 3LDA值超过了3.5。图10将物种数具有显著性差异的6属菌进行了柱状图比较。

Ruminococcaceae常见于肥胖小鼠肠道之中，Odoribacter、Coprococcus 3、Romboutsia已有相关报道在抑制炎症因子、促进短链脂肪酸的合成方面呈正相关；其丰度的提高也与非酒精性脂肪肝、II型糖尿病以及结肠炎的恢复相关。羊肚菌组中丰度明显升高的菌属有Odoribacter、Coprococcus 3、Romboutsia、Harryflintia、Turicibacter，造模组中丰度显著升高的菌属有Tyzzerella。因此，可以推断羊肚菌能够提高Odoribacter、Coprococcus 3、Romboutsia、Harryflintia、Turicibacter的丰度，降低炎症因子，促进短链脂肪酸的生成，进而调节脂质代谢紊乱，降低肝脏炎症，缓解肥胖。

综上所述，益生元羊肚菌多糖与复合菌剂复配的合生元能够通过缓解肝脏损伤，增强其抗氧化能力，降低炎症，促进短链脂肪酸生成，调节肠道菌群，进而缓解机体的脂质代谢异常，降低了小鼠附睾脂肪组织和皮下脂肪组织的脂肪积累，降低小鼠的体重增长率，发挥出抗肥胖的作用。单一的复合菌剂在防止小鼠肥胖方面并未发挥出显著治疗效果。并且，相较于单一的益生元，羊肚菌多糖与复合菌剂复配后的合生元制剂可以发挥更显著的效果，起到更好的抗肥胖效果。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种降低肝脏炎症且缓解肥胖的羊肚菌制剂，其特征在于，所述羊肚菌制剂为合生元制剂或者羊肚菌多糖；所述合生元制剂是将长双歧杆菌长亚种、植物乳杆菌添加至羊肚菌多糖中得到的；所述羊肚菌多糖的制备方法为，将羊肚菌于沸水中提取0.5～1小时，重复提取后浓缩，将得到的浓缩液用乙醇进行醇提，醇提后离心取沉淀，干燥后即为羊肚菌多糖。

2.根据权利要求1所述的羊肚菌制剂，其特征在于，所述制剂中，长双歧杆菌长亚种、植物乳杆菌是按照菌浓比为1:1的比例进行添加的；优选的，所述长双歧杆菌长亚种的添加量至少为1×10⁹CFU/g或1×10⁹CFU/mL，所述植物乳杆菌的添加量至少为1×10⁹CFU/g或1×10⁹CFU/mL。

3.根据权利要求1或2所述的羊肚菌制剂，其特征在于，所述长双歧杆菌长亚种为长双歧杆菌长亚种GDMCC No：60769；所述乳杆菌为植物乳杆菌CGMCC No.5494。

4.一种缓解肥胖的产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1～3任一所述的羊肚菌制剂。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品中，长双歧杆菌长亚种、植物乳杆菌是按照菌浓比为1:1的比例进行添加的；所述羊肚菌多糖的添加量至少为：400mg/kg；优选的，所述长双歧杆菌长亚种的添加量至少为1×10⁹CFU/g或1×10⁹CFU/mL，所述植物乳杆菌的添加量至少为1×10⁹CFU/g或1×10⁹CFU/mL。

6.根据权利要求4或5所述的产品，其特征在于，所述产品为药品、保健品或者饲料添加剂。

7.权利要求1～3任一所述的羊肚菌制剂在制备缓解肥胖的产品中的应用，其特征在于，所述产品中，长双歧杆菌长亚种、植物乳杆菌是按照菌浓比为1:1的比例进行添加的；所述羊肚菌多糖的添加量至少为：400mg/kg；优选的，所述长双歧杆菌长亚种的添加量至少为1×10⁹CFU/g或1×10⁹CFU/mL，所述植物乳杆菌的添加量至少为1×10⁹CFU/g或1×10⁹CFU/mL。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品为药品、保健品、兽药或者饲料添加剂。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药品还包括药学上可接受的赋型剂；所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。

10.权利要求1～3任一所述的羊肚菌制剂在制备具有以下(a)～(g)任一种或多种功能的产品中的应用：

(a)缓解小鼠体重加重；

(b)降低体内脂肪积累；

(c)调节小鼠糖脂代谢异常；

(d)促进短链脂肪酸的合成；

(e)缓解小鼠肝脏氧化应激；

(f)降低肝脏炎症；

(g)调节肠道菌群。

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