CN115976107A - 一种重组杆状病毒载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组杆状病毒载体，重组杆状病毒载体包括p10启动子、EGFP核酸序列、pH启动子、Bmp53核酸序列；本发明还提供了该重组杆状病毒载体构建方法及应用。本发明构建的重组杆状病毒载体可以显著提高Bmp53基因在家蚕中的表达量，同时通过将Bmp53基因与绿色荧光基因EGFP基因共表达，使Bmp53基因的表达可视化，便于研究观察。

Description

一种重组杆状病毒载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于病毒载体技术领域，尤其涉及一种重组杆状病毒载体及其构建方法和应用。

背景技术

从哺乳动物到低等无脊椎动物，p53的作用机制在进化上是保守的。哺乳动物p53是细胞凋亡的关键调控因子，其通过调控细胞凋亡、DNA修复、遗传稳定性、细胞周期阻滞和衰老等多种途径参与一系列应激反应，可以有效避免机体发生炎症反应。p53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，是当前肿瘤分子生物学研究的热点。

构建Bmp53过表达转基因细胞系和个体，研究Bmp53信号通路对于***期组织凋亡与重塑等发育过程的调控作用，能够更好的认识家蚕***期组织凋亡的遗传调控，同时为***发育为主的害虫生物防治提供重要的基础信息。

目前昆虫杆状病毒表达***已广泛用于各种重组蛋白的生产。然而，还未有用于过表达家蚕Bmp53的重组杆状病毒载体。

发明内容

发明目的：本发明的第一目的是提供一种重组杆状病毒载体。

本发明的第二目的是提供所述重组杆状病毒载体的构建方法。

本发明的第三目的是提供含有所述重组杆状病毒载体的表达盒、重组病毒、重组细胞或重组菌。

本发明的第四目的是提供所述重组杆状病毒载体，以及含有所述重组杆状病毒载体的表达盒、重组病毒、重组细胞或重组菌在研究家蚕发育和***情况中的应用。

技术方案：本发明的重组杆状病毒载体，包括p10启动子、EGFP核酸序列、pH启动子和Bmp53核酸序列，所述p10启动子启动EGFP基因表达，所述pH启动子启动Bmp53基因表达。

一种所述重组杆状病毒载体的构建方法，包括以下步骤：

(1)分别设计用于家蚕Bmp53和EGFP基因片段扩增的引物；

(2)用引物扩增的方法获得Bmp53基因片段和EGFP基因片段；

(3)步骤(2)所述EGFP基因片段连接到带有启动子p10和pH的表达载体，获得重组质粒p10-EGFP-pH；

(4)步骤(2)所述Bmp53基因片段连接到步骤(3)所述重组质粒p10-EGFP-pH，获得重组质粒p10-EGFP-pH-Bmp53。

(5)将步骤(4)所述重组质粒p10-EGFP-pH-Bmp53转化DH10Bac感受态细胞，在复合抗生素平板上培养，挑取白色克隆鉴定，即得

优选的，步骤(1)所述用于家蚕Bmp53基因扩增的引物为：

Bmp53-F(BamHI)：AAGGATCCATGAAACACGAAATCATGAC；

Bmp53-R(XbaI)：CTAGTCTAGA TTCGCTGGCATGTTTCGTCG；

步骤(1)所述用于EGFP基因扩增的引物为：

EGFP-F(SmaI)：TCCCCCGGGATGGTGAGCAAGGGCGAG；

EGFP-R(KpnI)：CGGGGTACCTCACTTGTACAGCTCGTCC。

优选的，所述用于家蚕Bmp53基因片段扩增的上游引物设有BamHI酶切位点，下游引物设有XbaI酶切位点，用于EGFP基因片段扩增的上游引物设有SmaI酶切位点，下游引物设有KpnI酶切位点。

本发明内容还包括所述重组杆状病毒载体的表达盒、重组病毒、重组细胞或重组菌。

本发明内容还包括所述重组杆状病毒载体、表达盒、重组病毒、重组细胞或重组菌在研究家蚕发育和***情况中的应用。

本发明内容还包括所述的重组病毒在研究家蚕发育和***情况中的应用，包括如下步骤，将所述重组杆状病毒载体转染家蚕细胞，收集细胞中的病毒液感染家蚕，饲养并观察家蚕的生长发育情况。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)可以显著提高Bmp53基因的表达量；(2)通过将Bmp53基因与绿色荧光基因EGFP基因共表达，使Bmp53基因的表达可视化，便于研究观察；(3)有助于更好的认识家蚕***期组织凋亡的遗传调控，为通过抑制凋亡增加丝蛋白的合成提供理论基础，同时为防治***发育为主的害虫生物和凋亡引起的人类疾病提供重要的基础信息。

附图说明

图1为家蚕Bmp53 CDS序列及推导氨基酸序列；

图2为pfastbac-dual-p10-EGFP-pH-Bmp53载体示意图；

图3为Bacmid重组病毒质粒PCR扩增EGFP和Bmp53基因鉴定；

图4为Bacmid转染家蚕转基因细胞系及Bmp53表达量分析；

图5为Bacmid富集杆状病毒感染家蚕转基因个体及Bmp53表达量分析。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1克隆家蚕Bmp53基因

利用家蚕基因组数据库SilkDB 3.0(bioinfotoolkits.net)和NCBI gene(Home-Gene-NCBI(nih.gov))数据库设计家蚕Bmp53基因片段扩增引物，上游引物设有BamHI酶切位点，下游引物设有XbaI酶切位点。根据如下EGFP序列设计基因片段扩增引物，上游引物设有SmaI酶切位点，下游引物设有KpnI酶切位点。

EGFP序列来源于质粒pcDNA3.0-IE1-EGFP。pcDNA3.0-IE1-EGFP为可在家蚕细胞表达的质粒，由pcDNA3.0(Invitrogen)经农业农村部蚕桑遗传改良重点实验室改良而成。序列如下：

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA(SEQ ID NO.1)

引物设计如下：

Bmp53-F(BamHI):AAGGATCCATGAAACACGAAATCATGAC(SEQ ID NO.2)；

Bmp53-R(XbaI):CTAGTCTAGA TTCGCTGGCATGTTTCGTCG(SEQ ID NO.3)；

EGFP-F(SmaI):TCCCCCGGGATGGTGAGCAAGGGCGAG(SEQ ID NO.4)；

EGFP-R(KpnI):CGGGGTACCTCACTTGTACAGCTCGTCC(SEQ ID NO.5)。

以中国农业科学院蚕业研究所保存的纯种P50家蚕为材料，取100mg家蚕组织，提取总RNA，利用反转录试剂盒HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNAwiper)(R312，Vazyme)进行反转录，合成cDNA。以上述合成的cDNA为模板，扩增体系如下：

PCR扩增反应条件如下：

上述Bmp53基因PCR扩增片段进行胶回收保存。如图1所示，克隆所得CDS序列为1107bp的Bmp53基因，编码368个氨基酸，GenBank登录号为HM773025.1。Bmp53CDS序列如下：

ATGAAACACGAAATCATGACATCTCTTGAGGTTGCCACATGCGAAGATGACATAGTGAACATTGATTTGAACACTATACCGGATGAAGCATTGTTTCAAGGGGGGATACACGATCAAGTTGACATTGGAGTGCTAGATGACATTCCGTACATAATCAGTGATGTGTCTAACAATTCAAACAATTCCTTTCCTCTTGGACCCCGAGGACCGCCGCCTCGCAAAGACGATCCCGGGCAATACAACTTCAGCGTCGAAATCCACAGCAAGGATACACACAAGAAGAAGTTCTTGTTCTCGCACAAGCTGAACCGGATCTACGTGAACATGGAGACCGACTTCGCTGTCCAGTTCAACTGGGAGCTGGTGGACCTCGCCGTGACGCAGATGTACGTGCGCGCCACCGTCGTCTTCGAGGACGAGTCCCAGGCCGAGAAGAGAGTCGAGAGATGCATCCAGCACAAACTCTGCAGTTCCGATAAAGGCCAGGACCGCGTCGTGTCGGAGAACGTGCTGCGCTCGTCGCGGCCCCTGGGCACCAACGACGTGCAGTACTGCGGCCACCCGGACGACCCCGACTACTGGTACTCCGTGCTGGTGCAGCTGCCCAAGCCGGGCCGGGAGCCTTGCACGCACGCCTTCAAGTTCGTCTGCAAGAACTCCTGCAGCACCGGCATCAACCGCCGCTCCATAGCCGTCATCTTCACCCTGGAGAGCGCCTCCGGCTCGGTGCTGGGGCGGCAGACGGTGGGCGCGCGGGTGTGCTCGTGCACGGCGCGCGACATGTGCAAGGACGAGGAGGCGGAGGGCGCGCGCGCGGCCAGGAAGCGGCCCCGGCCCGCGCAGTCGCGCCTCCTCAAGAAGATCAAGCTGGAGACCGTCGGCGACCTGCCCGTCGACGCCGAGACCCTCACCCTGCCGCCGCTGGAAATTATCGGAGCCAAAACGGTGAAGACCGGCCTGGAAGTGATGCTGCGCATGATGGAGCAGGCGGCCCACTTCCACAAGCACGACCAGCTCGCCGCCGACGGCTACCAGCGCCGCGTCGCCAGCCTCCGACAGTACATCGACACGCTCGACGCCAAACCGACGAAACATGCCAGCGAATAG(SEQ ID NO.6)

以pcDNA3.0-IE1-EGFP质粒为模板，按上述扩增体系和反应条件扩增EGFP序列。

实施例2构建过表达重组载体pfastbac-dual-p10-EGFP-pH-Bmp53

取带有启动子p10和启动子pH的pfastbac-dual(Invitrogen)和EGFP回收产物分别用KpnI-HF(R3142，NEB)和SmaI(R0141，NEB)两种限制性内切酶进行双酶切反应，酶切体系如下：

DNA(质粒或基因)	2μg
		KpnI-HF	2μl
SmaI	2μl
		Cutsmart buffer	5μl
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	补充至50μl

将回收所得产物采用Solution I在16℃下连接2h，连接产物转化DH10B感受态细胞，培养单菌落，提取质粒并利用如下引物扩增：

pFastbac-F:TATTCCGGATTATTCATACC(SEQ ID NO.7)；

pFastBac-R:ACAAATGTGGTATGGCTGA(SEQ ID NO.8)。

获得符合预期大小的目的片段并测序鉴定，得到重组质粒pfastbac-dual-p10-EGFP。

取pfastbac-dual-p10-EGFP载体和Bmp53分别用BamHI(R0136，NEB)和XbaI(R0145，NEB)两种限制性内切酶进行双酶切反应，酶切体系如下：

DNA(质粒或基因)	2μg
		BamHI	2μl
XbaI	2μl
		Cutsmart buffer	5μl
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	up to 50μl

将回收所得产物采用Solution I在16℃下连接2h，连接产物转化DH10B感受态细胞，培养单菌落，提取质粒进行BamHI和XbaI双酶切鉴定，提取质粒并利用如下引物扩增鉴定：

pFastbac-F:TATTCCGGATTATTCATACC(SEQ ID NO.7)；

pFastbac-R:ACAAATGTGGTATGGCTGA(SEQ ID NO.8)。

得到重组质粒pfastbac-dual-p10-EGFP-pH-Bmp53。如图2所述，绿色荧光蛋白基因EGFP通过KpnI和SmaI位点***p10启动子下，家蚕基因Bmp53通过BamHI和XbaI位点***pH启动子下，最终质粒大小6960bp。

将上述1ng重组质粒pfastbac-dual-p10-EGFP和pfastbac-dual-p10-EGFP-pH-Bmp53分别转化DH10Bac感受态细胞，在50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、7μg/ml四环素、40μg/ml X-gal和40μg/ml IPTG复合抗生素平板上生长36h，挑取白色克隆用M13引物鉴定。本实施例分别构建了Bmp53过表达重组杆状病毒载体Bacmid-p10-EGFP-pH-Bmp53和作为对照的空载Bacmid-p10-EGFP，如图3所示鉴定结果，条带分别约2000bps和900bps左右。

实施例3建立Bmp53过表达转基因家蚕细胞系

转染步骤按照EntransterTM-D4000(Engreen)说明书进行。转染前24h接种BmN细胞(3X10⁵)于6孔板中，28℃条件下培养。待细胞培养密度达到60～80％，可做转染。取出4℃保存的转染试剂EntransterTM-D4000，震荡混匀。取2个灭菌的1.5ml离心管中各加入100μl不含TC-100的无血清培养基，分别标记为管1、2。取管1加入10μl转染试剂混匀，管2加入Bacmid-p10-EGFP-pH-Bmp53混匀。室温孵育5min。将管1、2混合，25℃室温下孵育混合物15min。将BmN细胞培养皿从恒温箱中取出，将上述混合物加入培养皿中，轻轻混匀后立即放入28℃恒温箱培养。孵育6h后将BmN细胞培养皿更换为含胎牛血清的TC-100培养基(胎牛血清与TC100培养基按照1:9的体积比混合)。Bacmid-p10-EGFP转染家蚕BmN细胞按如上步骤制作。转染72h后观察荧光蛋白的表达情况，结果为：上述两种转染重组病毒质粒家蚕BmN细胞，在FITC显微镜下均呈现绿色荧光，而普通家蚕BmN细胞(非转染)无绿色荧光，说明所构建的载体能用于下述转基因家蚕细胞系的建立。

在FITC显微镜下观察到绿色荧光蛋白且上述两种转染细胞少量死亡时，分别收集一代病毒液。病毒液以100μl/孔加入6孔板，约48h可建成稳定的Bmp53过表达转基因及EGFP对照家蚕细胞系。待细胞完全表达荧光后收集病毒液上清，收集细胞用于Bmp53信号通路分析，并检测蛋白表达情况。

如图4所示，荧光显微镜下，Bacmid转染家蚕细胞显示绿色荧光，表明EGFP在细胞中表达。通过定量PCR检测，发现转入Bacmid-p10-EGFP-pH-Bmp53重组杆状病毒载体细胞中Bmp53表达量是转入空载对照Bacmid-p10-EGFP的两倍以上。

实施例4构建Bmp53信号传导通路过表达的家蚕个体

上述步骤中收集的Bacmid-p10-EGFP-pH-Bmp53病毒液取5ml，加至放置有5ml20％糖垫的超速离心管中，配平后25000rpm在4℃下超速离心2h。超离完成后去上清，用500ul PBS悬浮，加PBS定容到10ml称重配平，35000rpm在4℃下超离1h，用300ul PBS 4℃过夜悬浮，制成富集病毒液，置于-20℃冰箱备用。为探究Bmp53对***发育的影响，等待家蚕生长至5龄第6天，在腹部第三与第四体节节膜处用10μl微量注射器注射5μl富集病毒液，待4～5天可在体视显微镜下见蚕体发绿色荧光，从而获得Bmp53信号传导通路过表达的家蚕个体。Bacmid-p10-EGFP病毒液转染家蚕个体按如上步骤操作。同时选取同批次(5龄第6天)未经任何处理的家蚕作为正常对照(normal)，待正常对照(normal)化蛹后在体视显微镜下观察所有处理，并定量检测Bmp53表达量。

如图5所示，Bacmid转染家蚕个体体视显微镜下家蚕现绿色荧光，表明杆状病毒成功感染个体且EGFP在个体中表达。通过定量PCR检测发现转入Bacmid-p10-EGFP-pH-Bmp53重组杆状病毒载体细胞中Bmp53表达量是转入空载对照Bacmid-p10-EGFP的两倍以上。

Claims (7)

1.一种重组杆状病毒载体，其特征在于，所述重组杆状病毒载体包括p10启动子、EGFP核酸序列、pH启动子和Bmp53核酸序列，所述p10启动子启动EGFP基因表达，所述pH启动子启动Bmp53基因表达。

2.一种权利要求1所述的重组杆状病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分别设计用于家蚕Bmp53和EGFP基因片段扩增的引物；

(2)通过引物扩增获得Bmp53基因片段和EGFP基因片段；

(3)步骤(2)所述EGFP基因片段连接到带有启动子p10和pH的表达载体，获得重组质粒p10-EGFP-pH；

(4)步骤(2)所述Bmp53基因片段连接到步骤(3)所述重组质粒p10-EGFP-pH，获得重组质粒p10-EGFP-pH-Bmp53；

(5)将步骤(4)所述重组质粒p10-EGFP-pH-Bmp53转化DH10Bac感受态细胞，在复合抗生素平板上培养，挑取白色克隆鉴定，即得。

3.根据权利要求2所述的重组杆状病毒载体的构建方法，其特征在于：

步骤(1)所述用于家蚕Bmp53基因扩增的引物为：

Bmp53-F：AAGGATCCATGAAACACGAAATCATGAC；

Bmp53-R：CTAGTCTAGATTCGCTGGCATGTTTCGTCG；

步骤(1)所述用于EGFP基因扩增的引物为：

EGFP-F：TCCCCCGGGATGGTGAGCAAGGGCGAG；

EGFP-R：CGGGGTACCTCACTTGTACAGCTCGTCC。

4.根据权利要求3所述的重组杆状病毒载体的构建方法，其特征在于，所述用于家蚕Bmp53基因片段扩增的上游引物设有BamHI酶切位点，下游引物设有XbaI酶切位点，用于EGFP基因片段扩增的上游引物设有SmaI酶切位点，下游引物设有KpnI酶切位点。

5.表达盒、重组病毒、重组细胞或重组菌，其特征在于，含有权利要求1所述的重组杆状病毒载体。

6.权利要求1所述的重组杆状病毒载体、权利要求5所述的表达盒、重组病毒、重组细胞或重组菌在研究家蚕发育和***情况中的应用。

7.权利要求5所述的重组病毒在研究家蚕发育和***情况中的应用，其特征在于，包括如下步骤，将权利要求1所述重组杆状病毒载体转染家蚕细胞，收集细胞中的病毒液感染家蚕，饲养并观察家蚕的生长发育情况。

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