CN114836418A

CN114836418A - 用于敲降猪流行性腹泻病毒的CRISPR-Cas13d***

Info

Publication number: CN114836418A
Application number: CN202110145282.4A
Authority: CN
Inventors: 胡晓湘; 赵成成; 兰欣悦; 李果; 连迪; 李宁
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-02-02
Filing date: 2021-02-02
Publication date: 2022-08-02
Anticipated expiration: 2041-02-02
Also published as: CN114836418B

Abstract

本发明提供一种用于敲降猪流行性腹泻病毒的CRISPR‑Cas13d***。本发明利用mCherry荧光报告基因，将PEDV病毒ORF3、E、M和N四个表达阅读框序列分别融合到mCherry基因的C端，构建筛选靶向PEDV表达阅读框的sgRNA高效作用靶点的荧光报告***，利用CRISPR‑Cas13d高效切割mRNA的特性，进行高效率sgRNAs的快速筛选。然后利用筛选出的高效靶向结合的sgRNAs进行CRISPR‑Cas13d***对靶病毒的高效降解。本发明提供的RNA病毒敲降方法具有高效率、高精准率及低脱靶率的优势。

Description

用于敲降猪流行性腹泻病毒的CRISPR-Cas13d***

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，具体地说，涉及一种用于敲降猪流行性腹泻病毒的CRISPR-Cas13d***。

背景技术

病毒是由一个核酸分子(DNA或RNA)与蛋白质构成的非细胞形态，为类生物，无法自行表现出生命现象。与一般的细胞生物的遗传物质为双链DNA不同的是，病毒的遗传物质可以为DNA或RNA，可以为单链或双链。从目前已发现的病毒来看，更多的是RNA病毒，RNA病毒是一类严重危害人类健康，农业安全生产的病毒，因其快速复制动力学、高突变率和复杂的进化动力学使其防控及相关疾病的治疗变得尤为艰难。每次RNA病毒的爆发都会造成严重的流行，并且其致死率很高，造成巨大的经济损失。目前对于RNA病毒的防治主要依靠疫苗、抗体和RNA干扰技术 (RNAi)，由于疫苗和抗体的研发时间长，针对病毒单一，RNAi技术脱靶效率高甚至会参与到机体转录过程，因此亟需开发新的抗RNA病毒方法。

为了对抗病毒，细菌和古细菌开发了一种独特的抗病毒***CRISPR/Cas***，这是一种适应性免疫***，通过创建特定位点的DNA双链断裂来抵抗外来质粒和病毒。因此，将CRISPR/Cas***应用于人类或哺乳动物的细胞内，对外来DNA和病毒进行细胞内防御，具有一定的启发意义(Catherine A.Freije et al.2019)。许多利用 CRISPR***破坏基因或在DNA水平引入编码序列变化的工具已经成功开发出来。然而，直到最近，用于破坏或编辑RNA分子的工具仍然有限。

最新研究表明，Ⅱ类Ⅵ型CRISPR效应蛋白Cas13d蛋白可高效切割ssRNA(SilvanaKonermann et al.，2018；Winston X.Yan et al.,2018)。Rfx-Cas13d含有2个HEPN蛋白域，可以将pre-crRNA处理为成熟的crRNA，也可以在20-30nt crRNA的指引下裂解靶向ssRNA分子。其长度仅约930aa，是目前最小的Ⅱ类CRISPR效应物，使其更易被腺相关病毒(AAV)包装，用于原代细胞和体内递送。Rfx-Cas13d对目标的侧翼序列没有要求，因此可以靶向任何RNA序列。CRISPR-Cas13d基因编辑工具的出现将为 RNA病毒的敲降提供新的策略。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于敲降猪流行性腹泻病毒(PEDV)的CRISPR-Cas13d***。

本发明的另一目的是提供一种基于CRISPR-Cas13d***高效干扰仔猪流行性腹泻病毒的方法。

为了实现本发明目的，发明人基于CRISPR-Cas13d同系物CasRx介导的高效、精准和特异的ssRNA切割活性，提供一种RNA病毒的敲降策略：通过CasRx***对 mCherry-PEDV-ORFs报告质粒mRNA的切割筛选高效sgRNA及高效sgRNA组合，利用筛选出的高效sgRNA进行PEDV的高效敲降，抑制RNA病毒的复制，从而实现对 RNA病毒防治。

第一方面，本发明提供一种基于CRISPR-Cas13d***的靶向猪流行性腹泻病毒基因组的sgRNA，选自

中的至少一条：

①靶向猪流行性腹泻病毒ORF3基因的sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ IDNO:11所示；

②靶向猪流行性腹泻病毒E基因的sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示；

③靶向猪流行性腹泻病毒M基因的sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示；

④靶向猪流行性腹泻病毒N基因的sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；

⑤靶向猪流行性腹泻病毒N基因的sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示；

⑥靶向猪流行性腹泻病毒ORF3基因的串联sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

⑦靶向猪流行性腹泻病毒E基因的串联sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示；

⑧靶向猪流行性腹泻病毒M基因的串联sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示；

⑨靶向猪流行性腹泻病毒N基因的串联sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示；

⑩靶向猪流行性腹泻病毒ORF3基因和E基因的串联sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

靶向猪流行性腹泻病毒E基因和M基因的串联sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

靶向猪流行性腹泻病毒M基因和N基因的串联sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

靶向猪流行性腹泻病毒N基因和ORF3基因的串联sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

靶向猪流行性腹泻病毒ORF3基因和M基因的串联sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

靶向猪流行性腹泻病毒E基因和N基因的串联sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

第二方面，本发明提供猪流行性腹泻病毒基因编辑载体，包括基于 CRISPR-Cas13d***的上述sgRNA表达载体和含有Cas13d蛋白的表达载体。

优选地，sgRNA表达载体的出发载体可以是pC0043-PspCas13b crRNA backbone。

基于CRISPR-Cas13d***的sgRNA表达载体的构建方法包括：将编码sgRNA的核酸序列构建到载体pC0043-PspCas13b crRNA backbone的两个BspQ1酶切位点之间，即得。

含有Cas13d蛋白的表达载体为在Cas13d蛋白的两端连有NLS序列或NES序列的载体。

优选地，所述含有Cas13d蛋白的表达载体的序列如SEQ ID NO:5所示。

第三方面，本发明提供用于敲降猪流行性腹泻病毒的CRISPR-Cas13d***，包含上述基因编辑载体。

优选地，所述***同时靶向猪流行性腹泻病毒ORF3、E、M和N单个或多个基因。

第四方面，本发明提供一种基于CRISPR-Cas13d***高效干扰仔猪流行性腹泻病毒的方法，包括：将所述基于CRISPR-Cas13d***的sgRNA表达载体和含有Cas13d 蛋白的表达载体共转染(如脂质体转染)至感染了PEDV的宿主细胞中。

进一步地，本发明提供一种基于CRISPR-Cas13d***的sgRNA高效作用靶点的筛选及其在PEDV敲降中的应用，包括以下步骤：

1)合成目标核酸序列，将目标核酸序列构建到含有报告基团的载体中，且目标核酸序列与报告基团位于同一表达盒内；

2)根据目标核酸序列，设计并合成一系列基于CRISPR-Cas13d***的sgRNA序列，并将其构建到sgRNA表达载体中；

3)将步骤1)的报告载体、含有Cas13d蛋白的表达载体与步骤2)所得sgRNA表达载体共同导入真核细胞中，得到一系列转染细胞；待转染细胞培养48h后，分别鉴定不同sgRNA对目标核酸序列的切割效率，根据切割效率筛选出高效sgRNA；

4)将高效sgRNA表达载体与含有Cas13d蛋白的表达载体共同转染到感染了 PEDV的真核宿主细胞中。

本发明还提供一种用于PEDV病毒敲降的试剂盒，所述试剂盒包括：根据上述方法获得的高效sgRNA，以及任选包括含有Cas13d蛋白的表达载体。

其中，步骤1)所述目标核酸序列5‘端具有帽子结构，且3’端具有多聚腺嘌呤核苷酸尾结构的核苷酸序列。

所述目标核酸序列包括但不限于mRNA或RNA病毒核酸序列。

优选地，RNA病毒为PEDV。

所述含有报告基团的载体为携带mCherry荧光蛋白的真核表达载体。

例如，mCherry荧光蛋白报告载体的构建如下：利用载体同源重组的方法将从PEDV病毒基因组扩增得到的ORF3、E、M和N四个表达阅读框序列分别连接到载体 pcDNA3.1-mCherry中mCherry基因的下游，构建得到mCherry-ORF3、mCherry-E、 mCherry-M、mCherry-N和mCherry-PEDV-ORFs荧光报告载体。

优选地，所述目标核酸序列位于mCherry荧光蛋白的C端。

前述的方法，步骤2)所述基于CRISPR-Cas13d***的sgRNA表达载体为 pC0043-PspCas13b crRNA backbone哺乳基因编辑质粒(参见Silvana Konermann et al.Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.(2018). Cell)，购自Addgene。

前述的方法，步骤3)所述含有Cas13d蛋白的表达载体为在Cas13d蛋白的两端连有NLS序列的载体。

更优选地，所述目标核酸序列为PEDV的ORF3、E、M和N基因；针对ORF3、E、 M和N基因筛选到的高效sgRNA，它们作用位点的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:11-13所示，针对N基因筛选到的高效sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:14、15所示。

可选地，步骤3)所述真核细胞为HEK293T、Vero。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)本发明提供一种CRISPR-Cas13d***高效降解PEDV的方法。利用荧光报告***筛选得到的高效的sgRNA，结合CRISPR-Cas13d***，进行PEDV的高效降解，充分显示了该方法对RNA病毒的高效抑制性，同时适用于其他RNA病毒的抑制。

(二)本发明具有高精准性及低脱靶率的优势。CRISPR-Cas13d***转染细胞活性状态未受影响，且无脱靶现象存在，可应用于农业动物抗病育种及人类RNA病毒性疾病的研究与新型药物的研发等领域。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中利用CRISPR-Cas13d***切割mCherry-ORF3(A)、mCherry-E(B)、mCherry-M(C)、mCherry-N(D)和mCherry-PEDV-ORFs(E)实现高效sgRNA筛选的示意图。

图2为本发明较佳实施例中利用工程化NLS-Cas13d、NES-Cas13d切割PEDV，实现高效率敲降RNA病毒的示意图。

图3为本发明较佳实施例中mCherry-ORF3、mCherry-N、mCherry-M和mCherry-E 报告***在HEK293T上的mRNA敲降效果图。

图4为本发明较佳实施例中串联sgRNA对mCherry-PEDV-ORFs报告***在HEK293T上的mRNA敲降效果图。

图5为本发明较佳实施例中筛选出的高效sgRNA对PEDV病毒在vero细胞中高效敲降的Western Blot效果图。

具体实施方式

本发明提供一种PEDV敲降方法，包括：

构建mCherry-PEDV-ORFs荧光蛋白报告载体，比对选定PEDV相对保守的区域ORF3、E、M和N的20-30nt模板序列(无PAM和PFS限制)。

利用sgRNA序列将Cas13d定位到目标序列以使PEDV的RNA被切割，从而实现 PEDV的敲降。

在细胞系HEK293T进行mCherry-PEDV-ORFs报告***筛选CRISPR-Cas13d高效切割mRNA的sgRNAs筛选。

本发明还提供一种用于PEDV病毒敲降的试剂盒，包括筛选到的高效sgRNA、工程化的Cas13d载体以及扩增试剂。

所述sgRNA序列为与目标序列正向一致的20-30nt序列。

本发明中，Cas13d蛋白载体可选自RfxCas13d-NLS-HA(CasRx)。参见SilvanaKonermann et al.Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPREffectors.(2018).Cell。载体RfxCas13d-NLS-HA(CasRx)购自Addgene公司。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning:a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1基于CRISPR-Cas13d***高效干扰仔猪流行性腹泻病毒的方法

1、构建mCherry-PEDV-ORFs荧光报告***

如图1所示，将ORF3、E、M和N序列扩增后，融合至mCherry基因的C端，形成荧光报告***：

(1)mCherry-ORF3，图1(A)，SEQ ID NO:1；

(2)mCherry-E，图1(B)，SEQ ID NO:2；

(3)mCherry-M，图1(C)，SEQ ID NO:3；

(4)mCherry-N，图1(D)，SEQ ID NO:4。

同时构建入核信号NLS介导的Cas13d表达载体，将合成的NLS序列***至Cas13d蛋白的首尾两端，得到工程化Cas13d表达载体NLS-Cas13d-NLS(图2，SEQ ID NO:16)。

然后进行sgRNA的设计。Cas13d蛋白酶对靶标的侧翼序列没有要求，可以靶向任何RNA序列。

通过比对50种PEDV的不同毒株序列，选择ORF3、E、M与N两个开放阅读框中相对保守的区域进行sgRNA的设计，sgRNA的长度为20-30nt。

制备与目标序列正向一致的sgRNA序列。

本发明选定下述目标序列来设计相应的sgRNA：

PEDV-ORF3：

ORF3-sgRNA1:GACAGCAAAACGCGCTGCCAACATAATATA

ORF3-sgRNA2:TCATTCACTAATTGTAGCATACTCGTCTAG

ORF3-sgRNA3:TTCACTAATTGTAGCATACTCGTCTAGTTG

ORF3-sgRNA4:CACTAATTGTAGCATACTCGTCTAGTTGAA

ORF3-sgRNA5:AATCACAATGGATTTGCCGTCATA

PEDV-E：

E-sgRNA1：TAGACCATTATCATTCACTAATTGTAGCAT

E-sgRNA2：CTAGACCATTATCATTCACTAATTGTAGCA

E-sgRNA3：ACAACCGGTGACAAGTGAAGCACAGATTAA

E-sgRNA4：CACAACCGGTGACAAGTGAAGCACAGATTA

PEDV-M：

M-sgRNA1：TACTTGTAATGGCCATACTGAAGCACTAC

M-sgRNA2：CCAAAGTATCCATAGAATAGCCATCTTGAC

M-sgRNA3：AGAGGCCAAAGTATCCATAGAATAGCCATC

M-sgRNA4：CAAGAGGCCAAAGTATCCATAGAATAGCCA

M-sgRNA5：AGGCCAAAGTATCCATAGAATAGCCATCT

M-sgRNA6：GCCAAAGTATCCATAGAATAGCCATCTTG

M-sgRNA7：AGTGATGCAAGCCATAAGGATGCTGAAAG

M-sgRNA8：TACATTATCCACAGCATAAGAGTGATGCAA

M-sgRNA9：ACCACCAAGAATGTGTCCTGCGCCACAAC

M-sgRNA10：AGACCACCAAGAATGTGTCCTGCGCCACAA

M-sgRNA11：TCACAGAAGTAGTGAGAAGCGCGTC

M-sgRNA12：TACACCAGTTGGTGCTCCAAGCACTGGAAT

M-sgRNA13：CAATGTACCACTAAGGAGTGTTAGCGTTACACC

M-sgRNA14：TTACCTGTACGCCAGTAGCAACCTTATAGC

M-sgRNA15：TGACTTACCTGTACGCCAGTAGCAACCTT

M-sgRNA16：GTTGTAGTGGCCTTGGCGACTGTGACGAAA

M-sgRNA17：TAGACAATTGTTGTAGTGGCCTTGGCGACT

PEDV-N：

N-sgRNA1：GCACCCGTTTGCGGCCACGATCCTG

N-sgRNA2：ATTAGTAACCCTAAGAGGGGCAT

N-sgRNA3：CGCTCACCACGGCGCATGCGCCAG

N-sgRNA4：TAGAAATGCCAATTGGAAGGTTGTTCAAT

N-sgRNA5：CCAGAAAACACCCTCAGTACGAGTCCTATA

N-sgRNA6：CAACCCAGAAAACACCCTCAGTACGAGTCCTATA

N-sgRNA7：CTGGTTATTTCCACGATTCTGTGAATTACC

N-sgRNA8：TTATTGTTATTATTATTGCCTCCTCT

N-sgRNA9：ACAGCAGCCACCAGATCATCGCGTGATGT

N-sgRNA10：ACGCTATTTTCGCCCTTGGGAATTCTCCTCCACTC

N-sgRNA11：CTACGCTATTTTCGCCCTTGGGAATTCTC

N-sgRNA12：AACAGCCACATTACCACCAAAGAGCAATG

N-sgRNA13：TATGTAATCTCGTAAGAGTCCGCTAGCTC

N-sgRNA14：TTTTAAATGCATCCACCTGTGAAACAAGAAGCTC

N-sgRNA15：ATCTCGTTGATAATTTCAACGGCCGT

针对上述选定的目标基因序列，构建相应的sgRNA表达载体。

2、在细胞株上进行CRISPR-Cas13d***介导的mCherry-ORF3、mCherry-E、mCherry-M和mCherry-N报告质粒的mRNA切割，实现高效靶向结合sgRNA的筛选按常规操作步骤进行细胞株的mRNA敲降。

(1)以HEK293T细胞为例，本发明进行真核生物细胞的培养与转染：将HEK293T 细胞接种培养于添加10％FBS的DMEM高糖培养基中(GIBCO，11965-092)，其中含青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)。

(2)在转染前分至24孔板中，待密度达到70％-80％时进行转染。

(3)以脂质体转染为例，按照Lipofectamine^TM LTX和PIUS Transfection Reagent(Invitrogen，15338-100)操作手册，以mCherry-ORF3报告质粒为例，将100ng mCherry-ORF3质粒与300ng NLS-Cas13d-NLS及600ng gRNA表达质粒混匀，共转染至每孔细胞中，6-8h后换液，48h后进行切割效率的鉴定及检测。

(4)mRNA切割效率分析

a、转染细胞48h后，使用PBS清洗细胞两次，补充500ul浓度10％FBS的培养基，进行细胞荧光成像拍照；

b、收取细胞使用Trizol法进行总RNA提取，提取的RNA进行浓度测定，使用反转试剂进行反转录获取cDNA。

去除gDNA的反应体系为：1μg mRNA，2μl 5×gDNA Eraser Buffer，1μl gDNAEraser，用不含RNase的ddH₂O补齐至10μl。

去除gDNA程序：42℃，2min；4℃保持。

反转录体系(以1μg mRNA为例)：10μl上述反应液，1μl PrimeScript RT EnzymeMix I，1μl RT Primer Mix，4μl 5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)，4μl不含RNase 的ddH₂O。

反转录程序：37℃，15min；85℃ 5s；4℃保持。

c、实时荧光定量PCR：针对PEDV基因ORF3、E、M和N，分别设计Q-PCR检测引物，利用反转录产物(稀释10倍)进行Q-PCR检测转染48h后mCherry-ORF3、 mCherry-E、mCherry-M和mCherry-N mRNA的相对表达量。

Q-PCR反应体系：2μl cDNA，10μl 2×Q-PCR Mix，0.8μl正向引物，0.8μl反向引物，用不含RNase的ddH₂O补齐至20μl。

Q-PCR反应程序：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火34s，40个循环；按照仪器操作说明选择熔解曲线分析：95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，利用2^-△△CT法分析定量数据。Q-PCR引物如下：

PEDV-ORF3：

qPCR-ORF3-F(1):AGTGTTTTTATCTACTTCTT

qPCR-ORF3-R(1)：TTATAGCGCCAGGAGTAAAA

qPCR-ORF3-F(2)：ACTCTTTTGTTGCTTTCGTT

qPCR-ORF3-R(2)：TTCACTAATTGTAGCATACT

qPCR-ORF3-R(3)：TTCTTGCCATCAAGAAGCTC

qPCR-ORF3-F(3)：ACACTTTCTTTCCTCAATGG

PEDV-E：

qPCR-E-F：ATGCTACAATTAGTGAATGA

qPCR-E-R：TTATACGTCAATAACAGTAC

PEDV-M：

qPCR-M-F(1)：ATGTCTAACGGTTCTATTCC

qPCR-M-R(1)：TGAAAGCTAGCCCATGCATC

qPCR-M-F(2)：GGTCAATTGGGTCTTTTTTG

qPCR-M-R(2)：CTTATAGCCCTCTACAAGCA

qPCR-M-F(3)：ACTGGCGTACAGGTAAGTCA

qPCR-M-R(3)：TGAAGCACTTTCTCACTATC

PEDV-N：

qPCR-N-F(1)：GCGGCATGGACGAGCTGTAC

qPCR-N-R(1)：GCATTATTTGCAAGTACCTT

qPCR-N-F(2):ATTGGATACTGGAATGAGCA

qPCR-N-R(2)：ACCCAGGTTAGTGGGTTCAG

qPCR-N-F(3)：GTAACAACAGAGGCAATAACC

qPCR-N-R(3)：CCAAAGATTTAAGGGCATCC

qPCR-N-F(4)：CCAGAGCCACTTCGAAAGAA

qPCR-N-R(4)：CATTTGGTGCTAAACTGGCG

qPCR-N-F(5)：GCCAGTTTAGCACCAAATGT

qPCR-N-R(5)：TTCTTTCTCTGGGGTTTTGC

GAPDH(内参基因)：

GAPDH-F：AGAAGGCTGGGGCTCATTTG

GAPDH-R：AGGGGCCATCCACAGTCTTC

结果表明，mCherry-ORF3、mCherry-E、mCherry-M和mCherry-N报告质粒mRNA 发生了高效的敲降，其中ORF3-sgRNA3(SEQ ID NO:11)、E-sgRNA2(SEQ ID NO:12)、M-sgRNA5(SEQ ID NO:13)和N-sgRNA2(SEQ ID NO:14)效果最佳(图 3)。后续实验中采用N-sgRNA10(SEQ ID NO:15)。

本发明利用CRISPR-Cas13d***精准的对PEDV特定ORF的切割，从而提供比传统RNA敲降方法更高效、更精确以及更少脱靶效应的RNA病毒敲降策略，为RNA病毒介导疾病的治疗提供了新的思路及方向。

实施例2基于CRISPR-Cas13d***高效干扰仔猪流行性腹泻病毒的方法

1、构建mCherry-PEDV-ORFs荧光报告***

(1)mCherry-PEDV-ORFs，图1(A)，SEQ ID NO:10；

同时构建入核信号NLS和出核信号NES介导的Cas13d表达载体，将合成的NLS序列或NES序列***至Cas13d蛋白的首尾两端，得到工程化Cas13d表达载体NLS-Cas13d-NLS、NES-Cas13d-NES(图2，SEQ ID NO:16和17)。

然后进行串联sgRNA的设计。Cas13d蛋白酶对靶标的侧翼序列没有要求，可以靶向任何RNA序列。

通过将筛选出的高效gRNA进行不同组合的串联，制备靶向同一基因或不同基因的串联sgRNA。

制备与目标序列正向一致的sgRNA序列。

本发明选定下述目标序列来设计相应的sgRNA：

①靶向猪流行性腹泻病毒ORF3基因和E基因的串联sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

②靶向猪流行性腹泻病毒E基因和M基因的串联sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

③靶向猪流行性腹泻病毒M基因和N基因的串联sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

④靶向猪流行性腹泻病毒N基因和ORF3基因的串联sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

⑤靶向猪流行性腹泻病毒ORF3基因和M基因的串联sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；

⑥靶向猪流行性腹泻病毒E基因和N基因的串联sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

针对上述选定的目标基因序列，构建相应的sgRNA表达载体，sgRNA序列如下：

M5/E2:

5′-GAGGCCAAAGTATCCATAGAATAGCCATCTCAAGTAAACCCCTACCAACTGG TCGGGGTTTGAAACCTAGACCATTATCATTCACTAATTGTAGCA-3′

M5/ORF3-3:

5′-GAGGCCAAAGTATCCATAGAATAGCCATCTCAAGTAAACCCCTACCAACTGG TCGGGGTTTGAAACTTCACTAATTGTAGCATACTCGTCTAGTTG-3′

M5/N10:

5′-GAGGCCAAAGTATCCATAGAATAGCCATCTCAAGTAAACCCCTACCAACTGG TCGGGGTTTGAAACACGCTATTTTCGCCCTTGGGAATTCTCCTCCACTC-3′

ORF3-3/E2:

5′-GTTCACTAATTGTAGCATACTCGTCTAGTTGCAAGTAAACCCCTACCAACTGG TCGGGGTTTGAAACTAGACCATTATCATTCACTAATTGTAGCA-3′

N10/E2:

5′-GCGCTATTTTCGCCCTTGGGAATTCTCCTCCACTCCAAGTAAACCCCTACCAA CTGGTCGGGGTTTGAAACTAGACCATTATCATTCACTAATTGTAGCA-3′

ORF3-3/N10:

5′-GTTCACTAATTGTAGCATACTCGTCTAGTTGCAAGTAAACCCCTACCAACTGG TCGGGGTTTGAAACCGCTATTTTCGCCCTTGGGAATTCTCCTCCACTC-3′

M5/M14:

5′-GAGGCCAAAGTATCCATAGAATAGCCATCTCAAGTAAACCCCTACCAACTGG TCGGGGTTTGAAACCTTACCTGTACGCCAGTAGCAACCTTATAGC-3′

N7/N10:

5′-GCTGGTTATTTCCACGATTCTGTGAATTACCCAAGTAAACCCCTACCAACTGG TCGGGGTTTGAAACACGCTATTTTCGCCCTTGGGAATTCTCCTCCACTC-3′

E2/E3:

5′-GACAACCGGTGACAAGTGAAGCACAGATTAACAAGTAAACCCCTACCAACT GGTCGGGGTTTGAAACCTAGACCATTATCATTCACTAATTGTAGCA-3′

ORF3-1/ORF3-3:

5′-GTTCACTAATTGTAGCATACTCGTCTAGTTGCAAGTAAACCCCTACCAACTGG TCGGGGTTTGAAACGACAGCAAAACGCGCTGCCAACATAATATA-3′

2、在细胞株上进行CRISPR-Cas13d***介导的mCherry-PEDV-ORFs、报告质粒的mRNA切割，实现高效靶向结合sgRNA的筛选。

按常规操作步骤进行细胞株的mRNA敲降。

(1)以HEK293T细胞为例，本发明进行真核生物细胞的培养与转染：HEK293T 细胞接种培养于添加10％FBS的DMEM高糖培养基中(GIBCO，11965-092)，其中含青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)。

(2)在转染前分至24孔板中，待密度达到70％-80％时进行转染。

(4)mRNA切割效率分析

去除gDNA的反应体系为：1μg mRNA，2μl 5×gDNA Eraser Buffer，1μl gDNAEraser，不含RNase的ddH₂O，补齐至10μl。

去除gDNA程序：42℃，2min；4℃保持。

反转录体系(以1μg为例)：10μl上述反应液，1μl PrimeScript RT Enzyme Mix I，1μl RT Primer Mix，4μl 5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)，4μl不含RNase的ddH₂O。

反转录程序：37℃，15min；85℃ 5s；4℃保持。

Q-PCR反应体系：2μl cDNA，10μl 2×Q-PCR Mix，0.8μl正向引物，0.8μl反向引物，不含RNase的ddH₂O，补齐至20μl。

PEDV-ORF3：

qPCR-ORF3-F(1):AGTGTTTTTATCTACTTCTT

qPCR-ORF3-R(1)：TTATAGCGCCAGGAGTAAAA

qPCR-ORF3-R(3)：TTCTTGCCATCAAGAAGCTC

qPCR-ORF3-F(3)：ACACTTTCTTTCCTCAATGG

PEDV-E：

qPCR-E-F：ATGCTACAATTAGTGAATGA

qPCR-E-R：TTATACGTCAATAACAGTAC

PEDV-M：

qPCR-M-F(2)：GGTCAATTGGGTCTTTTTTG

qPCR-M-R(2)：CTTATAGCCCTCTACAAGCA

qPCR-M-F(3)：ACTGGCGTACAGGTAAGTCA

qPCR-M-R(3)：TGAAGCACTTTCTCACTATC

PEDV-N：

qPCR-N-F(2):ATTGGATACTGGAATGAGCA

qPCR-N-R(2)：ACCCAGGTTAGTGGGTTCAG

qPCR-N-F(3)：GTAACAACAGAGGCAATAACC

qPCR-N-R(3)：CCAAAGATTTAAGGGCATCC

GAPDH(内参基因)：

GAPDH-F：AGAAGGCTGGGGCTCATTTG

GAPDH-R：AGGGGCCATCCACAGTCTTC

结果表明，mCherry-PEDV-ORFs报告质粒mRNA发生了高效的敲降，其中靶向同一基因的串联sgRNA和靶向不同基因的串联sgRNA的敲降效率要高于单个sgRNA 的敲降效率，并且靶向不同基因的串联sgRNA的敲降效率要更高(图4)。

实施例3 PEDV病毒的敲降

设计工程化NLS-/NES-Cas13d，在vero细胞上进行PEDV病毒的敲降。

(1)将vero细胞接种培养于添加10％FBS的DMEM高糖培养液中(Gbico)，其中含青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)。

(2)在转染前分至24孔板中，待密度达到70％-80％时进行转染。

(3)转染以脂质体转染为例。按照Lipofectamine^TM 3000Transfection Reagent(Invitrogen)的操作手册，将400ng NES-/NLS-Cas13d及600ng pC0043-PspCas13b crRNAbackbone质粒混匀，共转染至每孔细胞中，6-8h后换液(设置不同转染组别，分别用于不同时间段细胞上清液中病毒滴度的测定，特定时间点细胞内部病毒蛋白表达情况的检测)。

(4)RNA病毒感染细胞：细胞转染12h后进行PEDV病毒的感染实验(控制滴度 MOI＝0.01)。弃掉细胞培养液，将病毒与无血清培养基DMEM、胰酶混匀后添加至各孔细胞，37℃培养2h后补充10％FBS完全培养基，继续培养，收集病毒感染0h，12h， 24h，36h，48h等不同时间段的培养基上清，进行病毒滴度测定，同时在第14h时进行细胞的western blot检测细胞内部病毒蛋白的表达水平。

(5)病毒滴度测定(TCID50法)

转染细胞感染PEDV病毒0-48h时间范围内，分别收集0h，12h，24h，36h，48h，等时间点的细胞培养液，使用TCID50法进行病毒滴度的测定。

TCID50法测定病毒滴度：

A、细胞准备：将vero细胞经过24-48h培养后，传代至96孔板中，通过细胞计数法使每个96孔板中的细胞为2×10⁴，每孔100μl，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养12-24h，接种病毒前使细胞长至80-90％汇合度。

B、病毒准备：每个病毒样品取100μl，加入900μl 2％FBS和1％PS的DMEM维持培养基，再取100μl原液稀释10倍，设置9-10个梯度进行稀释。

C、细胞接毒：将细胞用PBS清洗一遍，弃掉上清液，按照稀释倍数由高到低的顺序加入病毒液100μl，每个梯度接种8个孔，注意过程中不要使细胞变干。同时设置至少5孔对照组不加病毒，只添加维持培养基。

D、病毒培养：接种后的培养皿于37℃，5％CO₂培养箱中培养，每天观察细胞病变装并作记录。

E、滴度计算：细胞培养4-5天后，统计每个梯度的病变孔数，使用Reed-Muench 的方法进行计算TCID50值。

(7)Western Blot检测细胞内RNA病毒的蛋白表达量

A、提取细胞蛋白

B、BCA检测蛋白浓度，样品上样量为20-30μg，上样体积为30ul，加入5×蛋白上样缓冲液6μL，混匀，在沸水中水浴10min。

C、制作分离胶和浓缩胶

D、将蛋白样品上样，进行电泳，电压先用60V 30min，90V继续电泳，直至蓝色的前沿条带将将跑出分离胶底部，停止电泳。

E、取出SDS-PAGE，切掉浓缩胶部分，将PVDF膜按尺寸(6cm×8cm)裁剪好，先泡入无水甲醛中处理10s，然后在转膜缓冲液中平衡。

F、将准备好的滤纸、海绵垫和PVDF膜按顺序组装转膜装置，赶走气泡。

G、转膜完毕后，转移到封闭液中，室温震荡1h，弃去封闭液，加入一抗，孵育过夜。

H、PBST洗膜3次，加入二抗，室温1h，PBST洗膜3次，显影。

PEDV病毒在转染Cas13d的vero细胞中的敲降效果见图4。

(8)转染细胞的活性检测

转染细胞48h后，利用cck8 assay试剂盒进行细胞活性的检测。

PEDV病毒在vero细胞上的敲降效果见图5。

结果表明，NLS-Cas13d***介导PEDV病毒发生了高效的敲降，细胞活性未出现明显变化，且无脱靶情况发生。

实施例1～3中，对照组(Mock)中的NC-sgRNA为不靶向任何基因的一段随机序列形成的sgRNA(TCACCAGAAGCGTACCATACTCACGAACAG)，连接 pC0043-PspCas13b crRNAbackbone质粒。

本发明利用CRISPR-Cas13d***建立了ssRNA切割技术，通过精准的RNA病毒特定ORF的切割，从而提供比传统RNA敲降方法更高效、更精确以及更少脱靶效应的 RNA病毒敲降策略，为RNA病毒介导疾病的治疗提供了新的思路及方向。

本发明中涉及的序列如下：

mCherry-ORF3，SEQ ID NO:1；mCherry-E，SEQ ID NO:2；mCherry-M，SEQ ID NO:3；mCherry-N，SEQ ID NO:4；Cas13d表达载体，SEQ ID NO:5；PEDV-ORF3， SEQ ID NO:6；PEDV-E，SEQ ID NO:7；PEDV-M，SEQ ID NO:8；PEDV-N，SEQ ID NO:9；PEDV-ORFs，SEQ ID NO:10；ORF3-sgRNA3，SEQ ID NO:11；E-sgRNA2， SEQ ID NO:12；M-sgRNA5，SEQ ID NO:13；N-sgRNA2，SEQ ID NO:14；N-sgRNA10， SEQ ID NO:15；NLS-Cas13d-NLS，SEQ ID NO:16；NES-Cas13d-NES，SEQ ID NO:17。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献:

[1]Catherine A.Freije，Cameron Myhrvold,Chloe K.Boehm，etal.Programmable Inhibition and Detection of RNA Viruses Using Cas13.MolecularCell 76，Pages 1-12(2019).

[2]Silvana Konermann，PeterLotfy，Nicholas J.Brideau.TranscriptomeEngineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.Cell 173(3)，665-676(2018).

[3]Winston X.Yan，Shaorong Chong，Huaibin Zhang，et al.Cas13d Is aCompact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein.Molecular Cell 70，Pages 327-339(2018).

[4]Li G，Wang X，Liu Y，et al.Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus(PRRSV)inhibition with engineered Cas13d.J Genet Genomics.2020；S1673-8527(20)30048-5。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 用于敲降猪流行性腹泻病毒的CRISPR-Cas13d***

<130> KHP201114917.6

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagat gtttcttgga 720

ctttttcaat acacgattga cacagttgtc aaagatgtct caaagtctgc taacttgtct 780

ttggatgctg tccaagagtt ggagctcaat gtagttccaa ttagacaagc ttcaaatgtg 840

acgggttttc ttttcaccag tgtttttatc tacttctttg cactgtttaa agcgtcttct 900

ttgaggcgca attatattat gttggcagcg cgttttgctg tcattgttct ttattgccca 960

cttttatatt attgtggtgc atttttagat gcaactatta tttgttgcac acttattggc 1020

aggctttgtt tagtctgctt ttactcctgg cgctataaaa atgcgctctt tattattttt 1080

aatactacga cactttcttt cctcaatggt aaagcagctt attatgacgg caaatccatt 1140

gtgattttag aaggtggtga ccattacatc acttttggca actcttttgt tgctttcgtt 1200

agtagcatcg acttgtatct agctatacgt gggcggcaag aagctgacct acagctgttg 1260

cgaactgttg agcttcttga tggcaagaag ctttatgtct tttcgcaaca tcaaattgtt 1320

ggcattacta atgctgcatt tgactcaatt caactagacg agtatgctac aattagtgaa 1380

tga 1383

<210> 2

<211> 942

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagta aatgctacaa 720

ttagtgaatg ataatggtct agtagttaat gttatacttt ggcttttcgt actctttttc 780

ctgcttatta taagcattac tttcgtccaa ttggttaatc tgtgcttcac ttgtcaccgg 840

ttgtgtaata gcgcagttta cacacctata gggcgtttgt atagagttta taagtcttac 900

atgcaaatag accccttccc cagtactgtt attgacgtat aa 942

<210> 3

<211> 1389

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagat gtctaacggt 720

tctattcccg ttgatgaggt gattcaacac cttagaaact ggaatttcac atggaatatc 780

atactgacga tactacttgt agtgcttcag tatggccatt acaagtactc tgcgttcttg 840

tatggtgtca agatggctat tctatggata ctttggcctc ttgtgttagc actgtcactt 900

tttgatgcat gggctagctt tcaggtcaat tgggtctttt ttgctttcag catccttatg 960

gcttgcatca ctcttatgct gtggataatg tactttgtca atagcattcg gttgtggcgc 1020

aggacacatt cttggtggtc tttcaatcct gaaacagacg cgcttctcac tacttctgtg 1080

atgggccgac aggtctgcat tccagtgctt ggagcaccaa ctggtgtaac gctaacactc 1140

cttagtggta cattgcttgt agagggctat aaggttgcta ctggcgtaca ggtaagtcaa 1200

ttacctaatt tcgtcacagt cgccaaggcc actacaacaa ttgtctacgg acgtgttggt 1260

cgttcagtca atgcttcatc tggcactggt tgggctttct atgtccggtc caaacacggc 1320

gactactcag ctgtgagtaa tccgagttcg gttctcacag atagtgagaa agtgcttcat 1380

ttagtctaa 1389

<210> 4

<211> 2034

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagat ggcttctgtc 720

agttttcagg atcgtggccg caaacgggtg ccattatccc tctatgcccc tcttagggtt 780

actaatgaca aacccctttc taaggtactt gcaaataatg ctgtacccac taataaagga 840

aataaggacc agcaaattgg atactggaat gagcaaattc gctggcgcat gcgccgtggt 900

gagcgaattg aacaaccttc caattggcat ttctactacc tcggaacagg acctcacgcc 960

gacctccgct ataggactcg tactgagggt gttttctggg ttgctaaaga aggcgcaaag 1020

actgaaccca ctaacctggg tgtcagaaag gcgtctgaaa agccaatcat tccaaatttc 1080

tctcaacagc ttcccagcgt agttgagatt gttgaaccta acacacctcc tacttcacgt 1140

gcaaattcac gtagcaggag tcgtggtaat ggcaacaaca ggtccagatc tccaagtaac 1200

aacagaggca ataaccagtc ccgcggtaat tcacagaatc gtggaaataa ccagggtcgt 1260

ggagcttctc agaacagagg aggcaataat aataacaata acaagtctcg taaccagtcc 1320

aagaacagaa accagtcaaa tgaccgtggt ggtgtaacat cacgcgatga tctggtggct 1380

gctgtcaagg atgcccttaa atctttgggt attggcgaaa accctgacaa gcttaagcaa 1440

cagcagaagc ccaaacagga aaggtctgac agcagcggca aaaatacacc taagaagaac 1500

aaatccagag ccacttcgaa agaacgtgac ctcaaagaca tcccagagtg gaggagaatt 1560

cccaagggcg aaaatagcgt agcagcttgc ttcggaccca ggggaggctt caaaaatttt 1620

ggagatgcgg aatttgtcga aaaaggtgtt gatgcctcag gctatgctca gatcgccagt 1680

ttagcaccaa atgttgcagc attgctcttt ggtggtaatg tggctgttcg tgagctagcg 1740

gactcttacg agattacata taattataaa atgactgtgc caaagtctga tccaaatgta 1800

gagcttcttg tttcacaggt ggatgcattt aaaactggga atgcaaaacc ccagagaaag 1860

aaggaaaaga agaacaagcg tgaaaccacg cagcagctga atgaagaggc catctacgat 1920

gatgtgggtg tgccatctga ttcgactcat gccaatttgg aatgggacac agctgtagac 1980

ggtggtgaca cggccgttga aattatcaac gagatcttcg acacaggaaa ttaa 2034

<210> 5

<211> 2898

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atcgagaaga agaagagctt cgccaagggc atgggagtga agagcaccct ggtgtccggc 60

tctaaggtgt acatgaccac atttgctgag ggaagcgacg ccaggctgga gaagatcgtg 120

gagggcgata gcatcagatc cgtgaacgag ggagaggctt tcagcgccga gatggctgac 180

aagaacgctg gctacaagat cggaaacgcc aagttttccc acccaaaggg ctacgccgtg 240

gtggctaaca acccactgta caccggacca gtgcagcagg acatgctggg actgaaggag 300

acactggaga agaggtactt cggcgagtcc gccgacggaa acgataacat ctgcatccag 360

gtcatccaca acatcctgga tatcgagaag atcctggctg agtacatcac aaacgccgct 420

tacgccgtga acaacatctc cggcctggac aaggatatca tcggcttcgg aaagttttct 480

accgtgtaca catacgacga gttcaaggat ccagagcacc accgggccgc ttttaacaac 540

aacgacaagc tgatcaacgc catcaaggct cagtacgacg agttcgataa ctttctggat 600

aaccccaggc tgggctactt cggacaggct ttcttttcta aggagggcag aaactacatc 660

atcaactacg gaaacgagtg ttacgacatc ctggccctgc tgagcggact gaggcactgg 720

gtggtgcaca acaacgagga ggagtctcgg atcagccgca cctggctgta caacctggac 780

aagaacctgg ataacgagta catctccaca ctgaactacc tgtacgacag gatcaccaac 840

gagctgacaa acagcttctc caagaactct gccgctaacg tgaactacat cgctgagacc 900

ctgggcatca acccagctga gttcgctgag cagtacttca gattttccat catgaaggag 960

cagaagaacc tgggcttcaa catcacaaag ctgagagaag tgatgctgga cagaaaggat 1020

atgtccgaga tcaggaagaa ccacaaggtg ttcgattcta tcagaaccaa ggtgtacaca 1080

atgatggact ttgtgatcta caggtactac atcgaggagg atgccaaggt ggccgctgcc 1140

aacaagagcc tgcccgacaa cgagaagtct ctgagcgaga aggatatctt cgtgatcaac 1200

ctgagaggct cctttaacga cgatcagaag gacgctctgt actacgatga ggccaacagg 1260

atctggagaa agctggagaa catcatgcac aacatcaagg agttccgggg aaacaagacc 1320

cgcgagtaca agaagaagga cgctccaagg ctgcctagga tcctgcctgc tggaagggac 1380

gtgagcgcct tcagcaagct gatgtacgcc ctgacaatgt ttctggacgg aaaggagatc 1440

aacgatctgc tgaccacact gatcaacaag ttcgacaaca tccagtcttt tctgaaagtg 1500

atgcctctga tcggcgtgaa cgctaagttc gtggaggagt acgccttctt taaggacagc 1560

gccaagatcg ctgatgagct gcggctgatc aagtcctttg ccaggatggg agagccaatc 1620

gctgacgcta ggagagctat gtacatcgat gccatccgga tcctgggaac caacctgtct 1680

tacgacgagc tgaaggctct ggccgacacc ttcagcctgg atgagaacgg caacaagctg 1740

aagaagggca agcacggaat gcgcaacttc atcatcaaca acgtgatcag caacaagcgg 1800

tttcactacc tgatcagata cggcgaccca gctcacctgc acgagatcgc taagaacgag 1860

gccgtggtga agttcgtgct gggacggatc gccgatatcc agaagaagca gggccagaac 1920

ggaaagaacc agatcgaccg ctactacgag acctgcatcg gcaaggataa gggaaagtcc 1980

gtgtctgaga aggtggacgc tctgaccaag atcatcacag gcatgaacta cgaccagttc 2040

gataagaaga gatctgtgat cgaggacacc ggaagggaga acgccgagag agagaagttt 2100

aagaagatca tcagcctgta cctgacagtg atctaccaca tcctgaagaa catcgtgaac 2160

atcaacgcta gatacgtgat cggcttccac tgcgtggagc gcgatgccca gctgtacaag 2220

gagaagggat acgacatcaa cctgaagaag ctggaggaga agggctttag ctccgtgacc 2280

aagctgtgcg ctggaatcga cgagacagcc cccgacaaga ggaaggatgt ggagaaggag 2340

atggccgaga gagctaagga gagcatcgac tccctggagt ctgctaaccc taagctgtac 2400

gccaactaca tcaagtactc cgatgagaag aaggccgagg agttcaccag gcagatcaac 2460

agagagaagg ccaagaccgc tctgaacgcc tacctgagga acacaaagtg gaacgtgatc 2520

atccgggagg acctgctgcg catcgataac aagacctgta cactgttccg gaacaaggct 2580

gtgcacctgg aggtggctcg ctacgtgcac gcctacatca acgacatcgc cgaggtgaac 2640

tcctactttc agctgtacca ctacatcatg cagaggatca tcatgaacga gagatacgag 2700

aagtctagcg gcaaggtgtc tgagtacttc gacgccgtga acgatgagaa gaagtacaac 2760

gatagactgc tgaagctgct gtgcgtgcct ttcggatact gtatcccacg gtttaagaac 2820

ctgagcatcg aggccctgtt cgaccgcaac gaggctgcca agtttgataa ggagaagaag 2880

aaggtgagcg gcaactcc 2898

<210> 6

<211> 675

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgtttcttg gactttttca atacacgatt gacacagttg tcaaagatgt ctcaaagtct 60

gctaacttgt ctttggatgc tgtccaagag ttggagctca atgtagttcc aattagacaa 120

gcttcaaatg tgacgggttt tcttttcacc agtgttttta tctacttctt tgcactgttt 180

aaagcgtctt ctttgaggcg caattatatt atgttggcag cgcgttttgc tgtcattgtt 240

ctttattgcc cacttttata ttattgtggt gcatttttag atgcaactat tatttgttgc 300

acacttattg gcaggctttg tttagtctgc ttttactcct ggcgctataa aaatgcgctc 360

tttattattt ttaatactac gacactttct ttcctcaatg gtaaagcagc ttattatgac 420

ggcaaatcca ttgtgatttt agaaggtggt gaccattaca tcacttttgg caactctttt 480

gttgctttcg ttagtagcat cgacttgtat ctagctatac gtgggcggca agaagctgac 540

ctacagctgt tgcgaactgt tgagcttctt gatggcaaga agctttatgt cttttcgcaa 600

catcaaattg ttggcattac taatgctgca tttgactcaa ttcaactaga cgagtatgct 660

acaattagtg aatga 675

<210> 7

<211> 231

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgctacaat tagtgaatga taatggtcta gtagttaatg ttatactttg gcttttcgta 60

ctctttttcc tgcttattat aagcattact ttcgtccaat tggttaatct gtgcttcact 120

tgtcaccggt tgtgtaatag cgcagtttac acacctatag ggcgtttgta tagagtttat 180

aagtcttaca tgcaaataga ccccttcccc agtactgtta ttgacgtata a 231

<210> 8

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgtctaacg gttctattcc cgttgatgag gtgattcaac accttagaaa ctggaatttc 60

acatggaata tcatactgac gatactactt gtagtgcttc agtatggcca ttacaagtac 120

tctgcgttct tgtatggtgt caagatggct attctatgga tactttggcc tcttgtgtta 180

gcactgtcac tttttgatgc atgggctagc tttcaggtca attgggtctt ttttgctttc 240

agcatcctta tggcttgcat cactcttatg ctgtggataa tgtactttgt caatagcatt 300

cggttgtggc gcaggacaca ttcttggtgg tctttcaatc ctgaaacaga cgcgcttctc 360

actacttctg tgatgggccg acaggtctgc attccagtgc ttggagcacc aactggtgta 420

acgctaacac tccttagtgg tacattgctt gtagagggct ataaggttgc tactggcgta 480

caggtaagtc aattacctaa tttcgtcaca gtcgccaagg ccactacaac aattgtctac 540

ggacgtgttg gtcgttcagt caatgcttca tctggcactg gttgggcttt ctatgtccgg 600

tccaaacacg gcgactactc agctgtgagt aatccgagtt cggttctcac agatagtgag 660

aaagtgcttc atttagtcta a 681

<210> 9

<211> 1326

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggcttctg tcagttttca ggatcgtggc cgcaaacggg tgccattatc cctctatgcc 60

cctcttaggg ttactaatga caaacccctt tctaaggtac ttgcaaataa tgctgtaccc 120

actaataaag gaaataagga ccagcaaatt ggatactgga atgagcaaat tcgctggcgc 180

atgcgccgtg gtgagcgaat tgaacaacct tccaattggc atttctacta cctcggaaca 240

ggacctcacg ccgacctccg ctataggact cgtactgagg gtgttttctg ggttgctaaa 300

gaaggcgcaa agactgaacc cactaacctg ggtgtcagaa aggcgtctga aaagccaatc 360

attccaaatt tctctcaaca gcttcccagc gtagttgaga ttgttgaacc taacacacct 420

cctacttcac gtgcaaattc acgtagcagg agtcgtggta atggcaacaa caggtccaga 480

tctccaagta acaacagagg caataaccag tcccgcggta attcacagaa tcgtggaaat 540

aaccagggtc gtggagcttc tcagaacaga ggaggcaata ataataacaa taacaagtct 600

cgtaaccagt ccaagaacag aaaccagtca aatgaccgtg gtggtgtaac atcacgcgat 660

gatctggtgg ctgctgtcaa ggatgccctt aaatctttgg gtattggcga aaaccctgac 720

aagcttaagc aacagcagaa gcccaaacag gaaaggtctg acagcagcgg caaaaataca 780

cctaagaaga acaaatccag agccacttcg aaagaacgtg acctcaaaga catcccagag 840

tggaggagaa ttcccaaggg cgaaaatagc gtagcagctt gcttcggacc caggggaggc 900

ttcaaaaatt ttggagatgc ggaatttgtc gaaaaaggtg ttgatgcctc aggctatgct 960

cagatcgcca gtttagcacc aaatgttgca gcattgctct ttggtggtaa tgtggctgtt 1020

cgtgagctag cggactctta cgagattaca tataattata aaatgactgt gccaaagtct 1080

gatccaaatg tagagcttct tgtttcacag gtggatgcat ttaaaactgg gaatgcaaaa 1140

ccccagagaa agaaggaaaa gaagaacaag cgtgaaacca cgcagcagct gaatgaagag 1200

gccatctacg atgatgtggg tgtgccatct gattcgactc atgccaattt ggaatgggac 1260

acagctgtag acggtggtga cacggccgtt gaaattatca acgagatctt cgacacagga 1320

aattaa 1326

<210> 10

<211> 2911

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgtttcttg gactttttca atacacgatt gacacagttg tcaaagatgt ctcaaagtct 60

gctaacttgt ctttggatgc tgtccaagag ttggagctca atgtagttcc aattagacaa 120

gcttcaaatg tgacgggttt tcttttcacc agtgttttta tctacttctt tgcactgttt 180

aaagcgtctt ctttgaggcg caattatatt atgttggcag cgcgttttgc tgtcattgtt 240

ctttattgcc cacttttata ttattgtggt gcatttttag atgcaactat tatttgttgc 300

acacttattg gcaggctttg tttagtctgc ttttactcct ggcgctataa aaatgcgctc 360

tttattattt ttaatactac gacactttct ttcctcaatg gtaaagcagc ttattatgac 420

ggcaaatcca ttgtgatttt agaaggtggt gaccattaca tcacttttgg caactctttt 480

gttgctttcg ttagtagcat cgacttgtat ctagctatac gtgggcggca agaagctgac 540

ctacagctgt tgcgaactgt tgagcttctt gatggcaaga agctttatgt cttttcgcaa 600

catcaaattg ttggcattac taatgctgca tttgactcaa ttcaactaga cgagtatgct 660

acaattagtg aatgataatg gtctagtagt taatgttata ctttggcttt tcgtactctt 720

tttcctgctt attataagca ttactttcgt ccaattggtt aatctgtgct tcacttgtca 780

ccggttgtgt aatagcgcag tttacacacc tatagggcgt ttgtatagag tttataagtc 840

ttacatgcaa atagacccct tccccagtac tgttattgac gtataaacga aatatgtcta 900

acggttctat tcccgttgat gaggtgattc aacaccttag aaactggaat ttcacatgga 960

atatcatact gacgatacta cttgtagtgc ttcagtatgg ccattacaag tactctgcgt 1020

tcttgtatgg tgtcaagatg gctattctat ggatactttg gcctcttgtg ttagcactgt 1080

cactttttga tgcatgggct agctttcagg tcaattgggt cttttttgct ttcagcatcc 1140

ttatggcttg catcactctt atgctgtgga taatgtactt tgtcaatagc attcggttgt 1200

ggcgcaggac acattcttgg tggtctttca atcctgaaac agacgcgctt ctcactactt 1260

ctgtgatggg ccgacaggtc tgcattccag tgcttggagc accaactggt gtaacgctaa 1320

cactccttag tggtacattg cttgtagagg gctataaggt tgctactggc gtacaggtaa 1380

gtcaattacc taatttcgtc acagtcgcca aggccactac aacaattgtc tacggacgtg 1440

ttggtcgttc agtcaatgct tcatctggca ctggttgggc tttctatgtc cggtccaaac 1500

acggcgacta ctcagctgtg agtaatccga gttcggttct cacagatagt gagaaagtgc 1560

ttcatttagt ctaaacagaa actttatggc ttctgtcagt tttcaggatc gtggccgcaa 1620

acgggtgcca ttatccctct atgcccctct tagggttact aatgacaaac ccctttctaa 1680

ggtacttgca aataatgctg tacccactaa taaaggaaat aaggaccagc aaattggata 1740

ctggaatgag caaattcgct ggcgcatgcg ccgtggtgag cgaattgaac aaccttccaa 1800

ttggcatttc tactacctcg gaacaggacc tcacgccgac ctccgctata ggactcgtac 1860

tgagggtgtt ttctgggttg ctaaagaagg cgcaaagact gaacccacta acctgggtgt 1920

cagaaaggcg tctgaaaagc caatcattcc aaatttctct caacagcttc ccagcgtagt 1980

tgagattgtt gaacctaaca cacctcctac ttcacgtgca aattcacgta gcaggagtcg 2040

tggtaatggc aacaacaggt ccagatctcc aagtaacaac agaggcaata accagtcccg 2100

cggtaattca cagaatcgtg gaaataacca gggtcgtgga gcttctcaga acagaggagg 2160

caataataat aacaataaca agtctcgtaa ccagtccaag aacagaaacc agtcaaatga 2220

ccgtggtggt gtaacatcac gcgatgatct ggtggctgct gtcaaggatg cccttaaatc 2280

tttgggtatt ggcgaaaacc ctgacaagct taagcaacag cagaagccca aacaggaaag 2340

gtctgacagc agcggcaaaa atacacctaa gaagaacaaa tccagagcca cttcgaaaga 2400

acgtgacctc aaagacatcc cagagtggag gagaattccc aagggcgaaa atagcgtagc 2460

agcttgcttc ggacccaggg gaggcttcaa aaattttgga gatgcggaat ttgtcgaaaa 2520

aggtgttgat gcctcaggct atgctcagat cgccagttta gcaccaaatg ttgcagcatt 2580

gctctttggt ggtaatgtgg ctgttcgtga gctagcggac tcttacgaga ttacatataa 2640

ttataaaatg actgtgccaa agtctgatcc aaatgtagag cttcttgttt cacaggtgga 2700

tgcatttaaa actgggaatg caaaacccca gagaaagaag gaaaagaaga acaagcgtga 2760

aaccacgcag cagctgaatg aagaggccat ctacgatgat gtgggtgtgc catctgattc 2820

gactcatgcc aatttggaat gggacacagc tgtagacggt ggtgacacgg ccgttgaaat 2880

tatcaacgag atcttcgaca caggaaatta a 2911

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttcactaatt gtagcatact cgtctagttg 30

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctagaccatt atcattcact aattgtagca 30

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aggccaaagt atccatagaa tagccatct 29

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

attagtaacc ctaagagggg cat 23

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

acgctatttt cgcccttggg aattctcctc cactc 35

<210> 16

<211> 2964

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cctaaaaaga aaagaaaggt gggttctggt atcgagaaga agaagagctt cgccaagggc 60

atgggagtga agagcaccct ggtgtccggc tctaaggtgt acatgaccac atttgctgag 120

ggaagcgacg ccaggctgga gaagatcgtg gagggcgata gcatcagatc cgtgaacgag 180

ggagaggctt tcagcgccga gatggctgac aagaacgctg gctacaagat cggaaacgcc 240

aagttttccc acccaaaggg ctacgccgtg gtggctaaca acccactgta caccggacca 300

gtgcagcagg acatgctggg actgaaggag acactggaga agaggtactt cggcgagtcc 360

gccgacggaa acgataacat ctgcatccag gtcatccaca acatcctgga tatcgagaag 420

atcctggctg agtacatcac aaacgccgct tacgccgtga acaacatctc cggcctggac 480

aaggatatca tcggcttcgg aaagttttct accgtgtaca catacgacga gttcaaggat 540

ccagagcacc accgggccgc ttttaacaac aacgacaagc tgatcaacgc catcaaggct 600

cagtacgacg agttcgataa ctttctggat aaccccaggc tgggctactt cggacaggct 660

ttcttttcta aggagggcag aaactacatc atcaactacg gaaacgagtg ttacgacatc 720

ctggccctgc tgagcggact gaggcactgg gtggtgcaca acaacgagga ggagtctcgg 780

atcagccgca cctggctgta caacctggac aagaacctgg ataacgagta catctccaca 840

ctgaactacc tgtacgacag gatcaccaac gagctgacaa acagcttctc caagaactct 900

gccgctaacg tgaactacat cgctgagacc ctgggcatca acccagctga gttcgctgag 960

cagtacttca gattttccat catgaaggag cagaagaacc tgggcttcaa catcacaaag 1020

ctgagagaag tgatgctgga cagaaaggat atgtccgaga tcaggaagaa ccacaaggtg 1080

ttcgattcta tcagaaccaa ggtgtacaca atgatggact ttgtgatcta caggtactac 1140

atcgaggagg atgccaaggt ggccgctgcc aacaagagcc tgcccgacaa cgagaagtct 1200

ctgagcgaga aggatatctt cgtgatcaac ctgagaggct cctttaacga cgatcagaag 1260

gacgctctgt actacgatga ggccaacagg atctggagaa agctggagaa catcatgcac 1320

aacatcaagg agttccgggg aaacaagacc cgcgagtaca agaagaagga cgctccaagg 1380

ctgcctagga tcctgcctgc tggaagggac gtgagcgcct tcagcaagct gatgtacgcc 1440

ctgacaatgt ttctggacgg aaaggagatc aacgatctgc tgaccacact gatcaacaag 1500

ttcgacaaca tccagtcttt tctgaaagtg atgcctctga tcggcgtgaa cgctaagttc 1560

gtggaggagt acgccttctt taaggacagc gccaagatcg ctgatgagct gcggctgatc 1620

aagtcctttg ccaggatggg agagccaatc gctgacgcta ggagagctat gtacatcgat 1680

gccatccgga tcctgggaac caacctgtct tacgacgagc tgaaggctct ggccgacacc 1740

ttcagcctgg atgagaacgg caacaagctg aagaagggca agcacggaat gcgcaacttc 1800

atcatcaaca acgtgatcag caacaagcgg tttcactacc tgatcagata cggcgaccca 1860

gctcacctgc acgagatcgc taagaacgag gccgtggtga agttcgtgct gggacggatc 1920

gccgatatcc agaagaagca gggccagaac ggaaagaacc agatcgaccg ctactacgag 1980

acctgcatcg gcaaggataa gggaaagtcc gtgtctgaga aggtggacgc tctgaccaag 2040

atcatcacag gcatgaacta cgaccagttc gataagaaga gatctgtgat cgaggacacc 2100

ggaagggaga acgccgagag agagaagttt aagaagatca tcagcctgta cctgacagtg 2160

atctaccaca tcctgaagaa catcgtgaac atcaacgcta gatacgtgat cggcttccac 2220

tgcgtggagc gcgatgccca gctgtacaag gagaagggat acgacatcaa cctgaagaag 2280

ctggaggaga agggctttag ctccgtgacc aagctgtgcg ctggaatcga cgagacagcc 2340

cccgacaaga ggaaggatgt ggagaaggag atggccgaga gagctaagga gagcatcgac 2400

tccctggagt ctgctaaccc taagctgtac gccaactaca tcaagtactc cgatgagaag 2460

aaggccgagg agttcaccag gcagatcaac agagagaagg ccaagaccgc tctgaacgcc 2520

tacctgagga acacaaagtg gaacgtgatc atccgggagg acctgctgcg catcgataac 2580

aagacctgta cactgttccg gaacaaggct gtgcacctgg aggtggctcg ctacgtgcac 2640

gcctacatca acgacatcgc cgaggtgaac tcctactttc agctgtacca ctacatcatg 2700

cagaggatca tcatgaacga gagatacgag aagtctagcg gcaaggtgtc tgagtacttc 2760

gacgccgtga acgatgagaa gaagtacaac gatagactgc tgaagctgct gtgcgtgcct 2820

ttcggatact gtatcccacg gtttaagaac ctgagcatcg aggccctgtt cgaccgcaac 2880

gaggctgcca agtttgataa ggagaagaag aaggtgagcg gcaactccgg ttctggtctc 2940

gagcccaaga agaagaggaa agtc 2964

<210> 17

<211> 2976

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctgcctccac ttgaaagact gacactgggt tctggtatcg agaagaagaa gagcttcgcc 60

aagggcatgg gagtgaagag caccctggtg tccggctcta aggtgtacat gaccacattt 120

gctgagggaa gcgacgccag gctggagaag atcgtggagg gcgatagcat cagatccgtg 180

aacgagggag aggctttcag cgccgagatg gctgacaaga acgctggcta caagatcgga 240

aacgccaagt tttcccaccc aaagggctac gccgtggtgg ctaacaaccc actgtacacc 300

ggaccagtgc agcaggacat gctgggactg aaggagacac tggagaagag gtacttcggc 360

gagtccgccg acggaaacga taacatctgc atccaggtca tccacaacat cctggatatc 420

gagaagatcc tggctgagta catcacaaac gccgcttacg ccgtgaacaa catctccggc 480

ctggacaagg atatcatcgg cttcggaaag ttttctaccg tgtacacata cgacgagttc 540

aaggatccag agcaccaccg ggccgctttt aacaacaacg acaagctgat caacgccatc 600

aaggctcagt acgacgagtt cgataacttt ctggataacc ccaggctggg ctacttcgga 660

caggctttct tttctaagga gggcagaaac tacatcatca actacggaaa cgagtgttac 720

gacatcctgg ccctgctgag cggactgagg cactgggtgg tgcacaacaa cgaggaggag 780

tctcggatca gccgcacctg gctgtacaac ctggacaaga acctggataa cgagtacatc 840

tccacactga actacctgta cgacaggatc accaacgagc tgacaaacag cttctccaag 900

aactctgccg ctaacgtgaa ctacatcgct gagaccctgg gcatcaaccc agctgagttc 960

gctgagcagt acttcagatt ttccatcatg aaggagcaga agaacctggg cttcaacatc 1020

acaaagctga gagaagtgat gctggacaga aaggatatgt ccgagatcag gaagaaccac 1080

aaggtgttcg attctatcag aaccaaggtg tacacaatga tggactttgt gatctacagg 1140

tactacatcg aggaggatgc caaggtggcc gctgccaaca agagcctgcc cgacaacgag 1200

aagtctctga gcgagaagga tatcttcgtg atcaacctga gaggctcctt taacgacgat 1260

cagaaggacg ctctgtacta cgatgaggcc aacaggatct ggagaaagct ggagaacatc 1320

atgcacaaca tcaaggagtt ccggggaaac aagacccgcg agtacaagaa gaaggacgct 1380

ccaaggctgc ctaggatcct gcctgctgga agggacgtga gcgccttcag caagctgatg 1440

tacgccctga caatgtttct ggacggaaag gagatcaacg atctgctgac cacactgatc 1500

aacaagttcg acaacatcca gtcttttctg aaagtgatgc ctctgatcgg cgtgaacgct 1560

aagttcgtgg aggagtacgc cttctttaag gacagcgcca agatcgctga tgagctgcgg 1620

ctgatcaagt cctttgccag gatgggagag ccaatcgctg acgctaggag agctatgtac 1680

atcgatgcca tccggatcct gggaaccaac ctgtcttacg acgagctgaa ggctctggcc 1740

gacaccttca gcctggatga gaacggcaac aagctgaaga agggcaagca cggaatgcgc 1800

aacttcatca tcaacaacgt gatcagcaac aagcggtttc actacctgat cagatacggc 1860

gacccagctc acctgcacga gatcgctaag aacgaggccg tggtgaagtt cgtgctggga 1920

cggatcgccg atatccagaa gaagcagggc cagaacggaa agaaccagat cgaccgctac 1980

tacgagacct gcatcggcaa ggataaggga aagtccgtgt ctgagaaggt ggacgctctg 2040

accaagatca tcacaggcat gaactacgac cagttcgata agaagagatc tgtgatcgag 2100

gacaccggaa gggagaacgc cgagagagag aagtttaaga agatcatcag cctgtacctg 2160

acagtgatct accacatcct gaagaacatc gtgaacatca acgctagata cgtgatcggc 2220

ttccactgcg tggagcgcga tgcccagctg tacaaggaga agggatacga catcaacctg 2280

aagaagctgg aggagaaggg ctttagctcc gtgaccaagc tgtgcgctgg aatcgacgag 2340

acagcccccg acaagaggaa ggatgtggag aaggagatgg ccgagagagc taaggagagc 2400

atcgactccc tggagtctgc taaccctaag ctgtacgcca actacatcaa gtactccgat 2460

gagaagaagg ccgaggagtt caccaggcag atcaacagag agaaggccaa gaccgctctg 2520

aacgcctacc tgaggaacac aaagtggaac gtgatcatcc gggaggacct gctgcgcatc 2580

gataacaaga cctgtacact gttccggaac aaggctgtgc acctggaggt ggctcgctac 2640

gtgcacgcct acatcaacga catcgccgag gtgaactcct actttcagct gtaccactac 2700

atcatgcaga ggatcatcat gaacgagaga tacgagaagt ctagcggcaa ggtgtctgag 2760

tacttcgacg ccgtgaacga tgagaagaag tacaacgata gactgctgaa gctgctgtgc 2820

gtgcctttcg gatactgtat cccacggttt aagaacctga gcatcgaggc cctgttcgac 2880

cgcaacgagg ctgccaagtt tgataaggag aagaagaagg tgagcggcaa ctccggttct 2940

ggtctcgagc tgcctccact tgaaagactg acactg 2976

Claims

1.基于CRISPR-Cas13d***的靶向猪流行性腹泻病毒基因组的sgRNA，其特征在于，选自①～⑤中的至少一条：

①靶向猪流行性腹泻病毒ORF3基因的sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；

⑤靶向猪流行性腹泻病毒N基因的sgRNA，其作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。

2.猪流行性腹泻病毒基因编辑载体，其特征在于，包括基于CRISPR-Cas13d***的sgRNA表达载体和含有Cas13d蛋白的表达载体；

其中，sgRNA同权利要求1中所述。

3.根据权利要求2所述的基因编辑载体，其特征在于，sgRNA表达载体的出发载体为pC0043-PspCas13b crRNA backbone。

4.根据权利要求2所述的基因编辑载体，其特征在于，含有Cas13d蛋白的表达载体为在Cas13d蛋白的两端连有NLS序列或NES序列的载体；

5.用于敲降猪流行性腹泻病毒的CRISPR-Cas13d***，其特征在于，包含权利要求2-4任一项所述的基因编辑载体。

6.根据权利要求5所述的***，其特征在于，所述***靶向猪流行性腹泻病毒ORF3、E、M和N基因。