CN117701486B - 一种生产pha的重组菌及其构建方法与应用 - Google Patents
一种生产pha的重组菌及其构建方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种生产PHA的重组菌及其构建方法与应用。本发明发现Pel多糖合成基因或其编码蛋白的表达量降低和/或活性降低能够显著提高PHA生产菌的PHA生产性能，通过降低或丧失Pel多糖合成基因或其编码蛋白的表达量和/或活性构建的重组菌的生长速率和生物量显著提高，且PHA的产量和生产强度也显著提高。上述Pel多糖合成基因的新功能的发现为PHA生产菌的构建提供了新的改造靶点和策略，有利于降低PHA工业生产的成本，进而提升PHA在传统塑料和生物基可降解塑料市场中的竞争力及其商业化应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种生产PHA的重组菌及其构建方法与应用。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯（PHA）是一类由微生物合成的高分子聚酯，具有良好的生物可降解性，可以在多种应用场景中替代传统塑料。然而，目前PHA的生产成本相比传统塑料和其他生物基可降解塑料仍然较高，在一定程度上限制了其商业化应用。PHA生产菌的PHA生产性能是影响PHA生产成本的关键因素，因此，为了降低PHA的生产成本，需要提高PHA生产菌的PHA产量、生产强度等生产性能。
发明内容
本发明提供一种生产PHA的重组菌及其构建方法与应用
现有技术对PHA生产菌的遗传改造和优化多集中在PHA合成通路，较少涉及对底盘菌背景基因组的改造。本发明在研发过程中发现细菌Pel多糖合成基因及其编码蛋白的表达量和/或活性对细菌的PHA生产性能存在明显影响，降低Pel多糖合成基因及其编码蛋白的表达量和/或活性不仅能够显著促进细菌生长，提高其生物量，而且能够显著提高细菌的PHA产量和生产强度。
Pel多糖是一种富含N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）的细菌多糖，研究表明，其与铜绿假单胞菌生物膜的结构和功能相关。Pel多糖合成基因包括pelA、pelB、pelC、pelD、pelE、pelF、pelG，在细菌基因组中以pelABCDEFG操纵子形式存在，该操纵子在生物膜发育早期和晚期参与生物膜发育相关的胞外多糖的合成，产生富含葡萄糖的生物膜基质。pelABCDEFG操纵子在贪铜菌属（Cupriavidus）、假单胞菌属（Pseudomonas）等细菌中均有报道，且PelABCDEFG操纵子在不同细菌物种中高度保守，因此Pel多糖可能是一个在细菌中广泛存在的生物膜决定因素。专利申请CN108060111A公开了pelABCDEFG的表达量变化与假单胞菌中的鼠李糖脂产量有关，具体如下：该专利申请公开了一种提高鼠李糖脂产量的铜绿假单胞菌及其构建方法，该菌株的A组中的基因表达量降低或丧失同时B组中的基因表达量升高；A组中的基因选自pslABCDEFGHIJKLMNO胞外多糖合成基因簇、pelABCDEFG多糖合成基因簇、藻酸盐合成基因簇algD-alg8-alg44-algKEGXLIJF以及聚羟基脂肪酸PHA合成关键基因簇phaC1-D-C2中的一个或任意几个基因的组合；B组中的基因选自rmlACBD、rmlBDAC、rhlYZ、algC、fadD4、lipC以及estA中的一个基因或任意几个基因的组合。该菌株具有显著提高鼠李糖脂的产量、稳定遗传以及有利于下游产品的分离纯化等优点。然而目前尚未有Pel多糖合成基因与细菌生长速率以及PHA生产相关的报道。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供生产PHA的重组菌，所述重组菌的Pel多糖合成基因或其编码蛋白的表达量和/或活性降低或丧失，PHA生产性能因此而获得提升。
上述生产PHA的重组菌是指能够合成并积累PHA的工程化细菌。
在本发明的一些实施方式中，以能够合成并积累PHA的细菌为出发菌，对所述出发菌进行修饰以使得其中Pel多糖合成基因或其编码蛋白的表达量和/或活性降低或丧失。
对于出发菌，本发明没有特殊限制，只要其能够合成并积累PHA，且其中含有Pel多糖合成基因，降低或丧失其Pel多糖合成基因或其编码蛋白的表达量和/或活性原则上均可以提高其PHA生产性能。
以上所述的Pel多糖合成基因为选自pelA、pelB、pelC、pelD、pelE、pelF、pelG中的一种或多种。
具体地，所述Pel多糖合成基因为pelA、pelB、pelC、pelD、pelE、pelF、pelG中的任意一个或任意2~7个的组合。
在本发明的一些实施方式中，所述Pel多糖合成基因为pelA、pelB、pelC、pelD、pelE、pelF和pelG。
优选地，所述Pel多糖合成基因为pelABCDEFG多糖合成基因簇中的部分基因或全部基因，即对Pel多糖合成通路上的一个或多个必需基因进行表达干预，从而调节Pel多糖的合成通路。
作为一种效果最优的方案，在本发明的一些实施方式中，所述Pel多糖合成基因为pelABCDEFG多糖合成基因簇，即对Pel多糖合成通路上的7个必需基因同时进行表达干预。
上述表达量和/或活性降低或丧失包括减弱所述基因或蛋白的表达量和/或活性，或者使得所述基因或蛋白不表达或失活。
对于实现表达量和/或活性降低或丧失的方式和技术手段，本发明没有特殊限制，例如，可采用常用的基因工程手段和基因编辑方法对所述蛋白、其编码基因、其调控元件和/或其调节基因或蛋白进行修饰，以使得所述基因或蛋白的表达量和/或活性降低或丧失。
在本发明的一些实施方式中，所述基因或蛋白的表达量和/或活性降低或丧失通过以下（1）~（3）中的任意一种或多种方式的组合实现：
（1）对蛋白的氨基酸序列进行突变以使得基因或蛋白的表达量和/或活性降低或丧失；
（2）对基因的核苷酸序列进行突变以使得基因或蛋白的表达量和/或活性降低或丧失；
（3）将基因的转录和/或翻译调控元件替换为活性更弱的元件以使得基因或蛋白的表达量降低。
以上所述的氨基酸序列的突变包括缺失、***或替换一个或多个氨基酸。
以上所述的核苷酸序列的突变包括缺失、***或替换一个或多个核苷酸。
以上所述的转录、翻译调控元件包括启动子、核糖体结合位点等。
在本发明的一些实施方式中，所述基因或蛋白的表达量和/或活性降低或丧失通过失活所述基因或蛋白实现。所述失活可通过将所述基因全部敲除或敲除其部分序列实现。
在本发明的一些实施方式中，所述重组菌的pelA、pelB、pelC、pelD、pelE、pelF和pelG基因或其编码蛋白失活。
在本发明的一些实施方式中，所述重组菌的pelABCDEFG多糖合成基因簇被敲除。
应当理解的是，本发明在具体实施方式中通过失活pelA、pelB、pelC、pelD、pelE、pelF和pelG基因构建产PHA重组菌仅作示例性说明，在本领域技术人员已知本发明降低Pel多糖合成基因或其编码蛋白的表达量和/或活性的目的的基础上，采用其他同样能够实现上述目的的技术手段，均属于本发明技术手段的等同变形，故均在本发明的保护范围之中。
对于重组菌所属细菌种属原则上没有特殊限制，只要其能够合成并积累PHA，且其中含有Pel多糖合成基因即可，包括但不限于罗尔斯通氏菌属细菌（例如罗氏真养菌）、假单胞菌属细菌（例如恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌）、产碱杆菌属细菌（例如真养产碱杆菌）、气单胞菌属细菌（例如嗜水气单胞菌）、埃希氏菌属细菌（例如大肠杆菌）、芽孢杆菌属细菌（例如枯草芽孢杆菌）、棒杆菌属细菌（例如谷氨酸棒杆菌）、嗜盐菌和酵母菌等。
在本发明的一些实施方式中，上述重组菌为罗尔斯通氏菌属细菌或假单胞菌属细菌。优选地，所述重组菌为罗氏真养菌、恶臭假单胞菌或铜绿假单胞菌。
本发明通过实验验证，通过修饰降低或丧失PHA生产菌的Pel多糖合成基因或其编码蛋白的表达量和/或活性得到的产PHA重组菌的生产性能显著提高，具体表现在菌株的生长速率提高、生物量提高以及PHA产量和生产强度提高。
第二方面，本发明提供以上所述的重组菌的制备方法，所述方法包括：对生产PHA的细菌进行修饰，以使得其Pel多糖合成基因或其编码蛋白的表达量和/或活性降低或丧失。
优选地，所述Pel多糖合成基因或其编码蛋白的表达量和/或活性降低或丧失通过敲除pelABCDEFG多糖合成基因簇实现。
第三方面，本发明提供以上所述的重组菌在PHA发酵生产中的应用。
优选地，所述应用包括：培养所述重组菌，收集包含PHA的培养物的步骤。
上述培养可采用PHA生产的常用底物（包括碳源、氮源等）进行，其中碳源包括但不限于植物油、餐厨废油、糖类物质等生物质，氮源包括但不限于铵盐等无机氮源或酵母粉、蛋白胨等有机氮源。培养基中还可添加无机盐（包括但不限于磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等），微量元素（包括但不限于镁、钙、锌、锰、钴、硼、铜、镍、钼等）。
在本发明的一些实施方式中，所述培养为以植物油（包括但不限于棕榈油、棕榈仁油、花生油、大豆油、亚麻油、菜籽油、棉籽油、蓖麻油、玉米油中的一种或多种的混合物）为碳源进行。
第四方面，本发明提供一种提高PHA生产菌的PHA生产性能的方法，所述方法包括：对PHA生产菌进行修饰以使得其Pel多糖合成基因或其编码蛋白的表达量和/或活性降低或丧失。
优选地，所述PHA生产性能选自菌株生长速率、生物量、PHA产量、PHA生产强度中的一种或多种。
第五方面，本发明提供Pel多糖合成基因或其编码蛋白的表达量和/或活性降低或丧失在提高PHA生产菌的PHA生产性能中的应用。
本发明中，所述Pel多糖合成基因为选自pelA、pelB、pelC、pelD、pelE、pelF、pelG中的一种或多种。
将Pel多糖合成基因pelA、pelB、pelC、pelD、pelE、pelF、pelG中的一种或多种或其编码蛋白的表达量和/或活性降低均会对Pel多糖的合成产生影响，进而影响PHA生产菌的生产性能。基于此，本发明所述的Pel多糖合成基因可选自pelA、pelB、pelC、pelD、pelE、pelF、pelG中的一种或多种。
具体地，所述Pel多糖合成基因为pelA、pelB、pelC、pelD、pelE、pelF、pelG中的任意一个或任意2~7个的组合。
细菌中的pelA、pelB、pelC、pelD、pelE、pelF、pelG基因多以基因簇形式存在。因此，所述Pel多糖合成基因为pelABCDEFG多糖合成基因簇中的部分基因或全部基因。
在本发明的一些实施方式中，所述Pel多糖合成基因为pelA、pelB、pelC、pelD、pelE、pelF和pelG。
在本发明的一些实施方式中，所述Pel多糖合成基因为pelABCDEFG多糖合成基因簇。
对于细菌中Pel多糖合成基因pelA、pelB、pelC、pelD、pelE、pelF、pelG及其编码蛋白的序列，本领域技术人员可通过Genbank等数据库获得。
本发明中，所述PHA生产菌是指能够合成并积累PHA的细菌。PHA生产菌包括但不限于罗尔斯通氏菌属细菌（例如罗氏真养菌）、假单胞菌属细菌（例如恶臭假单胞菌、铜绿假单胞菌）、产碱杆菌属细菌（例如真养产碱杆菌）、气单胞菌属细菌（例如嗜水气单胞菌）、埃希氏菌属细菌（例如大肠杆菌）、芽孢杆菌属细菌（例如枯草芽孢杆菌）、棒杆菌属细菌（例如谷氨酸棒杆菌）、嗜盐菌和酵母菌等。
在本发明的一些实施方式中，所述PHA生产菌为罗尔斯通氏菌属细菌或假单胞菌属细菌。优选地，所述PHA生产菌为罗氏真养菌、恶臭假单胞菌或铜绿假单胞菌。
罗氏真养菌（Ralstonia eutropha，也称为Cupriavidus necator）是研究PHA合成的重要模式细菌，也是目前研究较多的用于PHA工业生产的菌种。罗氏真养菌H16及其衍生菌株等可作为平台底盘，在工业条件下实现高细胞密度的分批补料发酵，以糖类、油脂等生物质原料为底物生产包括不同种类PHA在内的分子产物。本发明在具体实施方式中以罗氏真养菌作为示例，验证了Pel多糖合成基因对菌株的生长速率、生物量、PHA产量和生产强度的作用。基于模式菌对同属细菌以及其他属PHA生产菌的代表作用，本领域技术人员可以推知上述作用也同样适用于含有Pel多糖合成基因且能够合成并积累PHA的罗尔斯通氏菌属其他细菌以及其他属的PHA生产菌。
在本发明的一些实施方式中，所述PHA生产菌为罗氏真养菌。对于罗氏真养菌，Pel多糖合成基因pelA、pelB、pelC、pelD、pelE、pelF、pelG对应的罗氏真养菌基因的GenBanklocus_tag分别为H16_B2198~B2204，具体地，H16_B2198为pelG（蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示），H16_B2199为pelF（蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.3所示，基因序列如SEQ ID NO.4所示），H16_B2200为pelE（蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.5所示，基因序列如SEQ ID NO.6所示），H16_B2201为pelD（蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.7所示，基因序列如SEQ ID NO.8所示），H16_B2202为pelC（蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.9所示，基因序列如SEQ ID NO.10所示），H16_B2203为pelB（蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.11所示，基因序列如SEQ ID NO.12所示），H16_B2204为pelA（蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，基因序列如SEQ ID NO.14所示）。
上述应用中，表达量和/或活性降低或丧失包括减弱所述基因或蛋白的表达量和/或活性，或者使得所述基因或蛋白不表达或失活。
对于实现表达量和/或活性降低的方式和技术手段，本发明没有特殊限制，例如，可采用常用的基因工程手段和基因编辑方法对所述蛋白、其编码基因、其调控元件和/或其调节基因或蛋白进行修饰，以使得所述基因或蛋白的表达量和/或活性降低或丧失。
在本发明的一些实施方式中，所述基因或蛋白的表达量和/或活性降低或丧失通过以下（1）~（3）中的任意一种或多种方式的组合实现：
（1）对蛋白的氨基酸序列进行突变以使得基因或蛋白的表达量和/或活性降低或丧失；
（2）对基因的核苷酸序列进行突变以使得基因或蛋白的表达量和/或活性降低或丧失；
（3）将基因的转录和/或翻译调控元件替换为活性更弱的元件以使得基因或蛋白的表达量降低。
以上所述的氨基酸序列的突变包括缺失、***或替换一个或多个氨基酸。
以上所述的核苷酸序列的突变包括缺失、***或替换一个或多个核苷酸。
以上所述的转录、翻译调控元件包括启动子、核糖体结合位点等。
在本发明的一些实施方式中，所述基因或蛋白的表达量和/或活性降低或丧失通过失活所述基因或蛋白实现。所述失活可通过将所述基因全部敲除或敲除其部分序列实现。
第六方面，本发明提供一种PHA的生产方法，所述方法包括：培养以上所述的重组菌，收集包含PHA的培养物。
本发明的有益效果至少包括：本发明发现Pel多糖合成通路与PHA合成通路虽不存在相同的底物或中间代谢产物，但Pel多糖合成基因或其编码蛋白的表达量和/或活性降低却能够显著提高PHA生产菌的PHA生产性能，通过降低或丧失Pel多糖合成基因或其编码蛋白的表达量和/或活性构建的重组菌的生长速率和生物量显著提高，且PHA的产量和生产强度也显著提高。上述Pel多糖合成基因的新功能的发现为PHA生产菌的构建提供了新的改造靶点和策略，有利于降低PHA工业生产的成本，进而提升PHA在传统塑料和生物基可降解塑料市场中的竞争力及其商业化应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中重组菌株W01与对照菌株H16的生长曲线对比；其中，圆形数据点曲线代表对照菌株H16，方形数据点曲线代表重组菌株W01；t-test统计学检验：p<0.05，以表示；p<0.01，以/>表示。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中提取质粒所用的试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，相应的操作步骤严格按照产品说明书进行，所有培养基如无特殊说明均用去离子水配制。
以下实施例中使用的培养基配方如下：
种子培养基Ⅰ：10g/L蛋白胨（Peptone），5g/L酵母提取物（Yeast Extract），3g/L果糖（Fructose）。
种子培养基Ⅱ：0.15%棕榈油，10g/L蛋白胨（Peptone），5g/L酵母提取物（YeastExtract）。
生产培养基：1.0%棕榈油，9.85g/L Na2HPO4·12H2O，1.5g/L KH2PO4，3.0g/LNH4Cl，10mL/L微量元素溶液I和1mL/L微量元素溶液II。其中微量元素溶液I的组成为：20g/L MgSO4，2g/L CaCl2。微量元素溶液II的组成为：100mg/L ZnSO4·7H2O，30mg/L MnCl2·4H2O，300mg/L H3BO3，200mg/L CoCl2·6H2O，10mg/L CuSO4·5H2O，20mg/L NiCl2·6H2O，30mg/L NaMoO4·2H2O。上述试剂均购自国药集团化学试剂公司。
以下实施例中的实验数据均由3个及以上的平行组实验获得。
以下实施例中所述的平均生长速率的计算公式如下：
平均生长速率=终OD/生长时间；其中终OD为菌株培养结束时，600nm吸光度下检测的菌株OD值。
以下实施例中所述的PHA含量（PHA%）为PHA占细胞干重的质量百分比含量。
以下实施例中所述的PHA产量的计算公式如下：
PHA产量=CDW×PHA%；其中，CDW为细胞干重，PHA%为PHA占细胞干重的百分比。
以下实施例中所述的生产强度的计算公式如下：
生产强度=PHA产量/时间；其中PHA产量计算如上所述，时间为发酵全流程时间54h。
实施例1：罗氏真养菌ReΔB2198~B2204的构建与生长测试
本实施例以罗氏真养菌H16（简称H16）菌株为出发菌株，利用本领域常见的基因编辑方法将基因组上的H16_B2198、H16_B2199、H16_B2200、H16_B2201、H16_B2202、H16_B2203、H16_B2204共7个基因敲除，得到的多基因敲除重组菌株为罗氏真养菌W01，并对重组菌株进行菌株生长曲线测试。具体方法和结果如下：
步骤1：构建H16_B2198~B2204多基因敲除的重组菌株W01
1.1 以罗氏真养菌H16基因组为模板进行PCR扩增，获得B2198~B2204上游同源臂B2198~B2204-H1，B2198~B2204下游同源臂B2198~B2204-H2；以修饰后的质粒pK18mob(Orita I , Iwazawa R , Nakamura S , et al. Identification of mutation pointsin Cupriavidus necator NCIMB 11599 and genetic reconstitution of glucose-utilization ability in wild strain H16 for polyhydroxyalkanoate production[J]. Journal of Bioscience&Bioengineering, 2012, 113(1):63-69)为模板，通过PCR扩增得到载体片段。将B2198~B2204-H1、B2198~B2204-H2通过Gibson Assembly方法与载体片段连接，得到编辑质粒pKO-ΔB2198~B2204，编辑质粒的亚克隆构建由药明生物有限公司完成。其中同源臂B2198~B2204-H1和B2198~B2204-H2的序列分别如SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.16所示。
1.2 将重组质粒pKO-ΔB2198~B2204转化至大肠杆菌S17-1中，再通过接合转化方法转入罗氏真养菌H16中，利用***质粒无法在宿主菌内复制的特性，用同时含有250μg/mL卡那霉素与100μg/mL安普霉素的LB平板筛选出阳性克隆。该阳性克隆中携带同源片段的重组质粒整合到基因组的所在特定位置，由此得到第一次同源重组菌株。将第一次同源重组菌株在含有100mg/mL蔗糖的LB平板上划单克隆培养，从这些单克隆中筛选出不具有卡那霉素抗性的克隆，并进行PCR鉴定，测序确认重组菌株正确编辑，得到的重组菌株为罗氏真养菌ReΔB2198~B2204，命名为重组菌株W01，其中，H16_B2198、H16_B2199、H16_B2200、H16_B2201、H16_B2202、H16_B2203、H16_B2204共7个基因被敲除。
步骤2：以棕榈油为唯一碳源进行W01菌株生长测试
将甘油管保存的重组菌株H16、W01进行LB平板划线，获取单克隆后，使用24深孔板进行后续的种子培养与发酵培养。将单克隆接种于种子培养基Ⅰ中（2mL），进行15小时的种子一级培养，得到种子培养液Ⅰ；然后按10％（v/v）的接种量将种子培养液Ⅰ接种于种子培养基Ⅱ中（2mL），进行二级种子培养，培养5h，得到种子培养液Ⅱ；然后按15%（v/v）的接种量将种子培养液Ⅱ接种于装有3mL生产培养基的24深孔板中微量发酵，发酵培养箱温度30℃，450rpm转速连续培养24h，期间每隔2h进行取样测试600nm的吸光度值，计算得知该时间该菌株的生长OD。生长测试共计10个取样时间点，得到10个菌株生长OD，制作生长曲线，结果如图1所示。结果显示，相比对照菌株H16，重组菌株W01在24小时生长周期可以达到更高的OD浊度，平均生长速率也高于对照菌株H16。
实施例2：罗氏真养菌ReΔB2198~B2204的发酵性能测试
本实施例以罗氏真养菌H16（简称H16）为对照菌株，以棕榈油为唯一碳源进行罗氏真养菌ReΔB2198~B2204（W01菌株）的摇瓶发酵、发酵罐发酵的生产性能测试。
步骤1：重组菌株W01摇瓶发酵生产PHA的性能测试
1.1 将甘油管保存的对照菌株H16以及实施例1的步骤1得到的重组菌株W01进行LB平板划线，获取单克隆。将单克隆接种于种子培养基Ⅰ中（3mL），进行15小时的种子活化，得到活化种子液；然后按10％（v/v）的接种量将活化种子液接种于种子培养基Ⅰ中（10mL），进行一级种子培养，培养8h，得到种子培养液Ⅰ；然后按照10％（v/v）的接种量将种子培养液Ⅰ接种于种子培养基Ⅱ中（15mL）进行二级种子培养，培养15h，得到种子培养液Ⅱ；然后按照15%（v/v）的接种量将种子培养液Ⅱ接种于装有30mL生产培养基的250mL锥形瓶中，发酵培养箱温度30℃，220rpm转速连续培养24h。
1.2 取上述发酵液进行离心得到菌体。将菌体烘干至恒重。测定干燥菌体的重量记为干重。向所得的干燥菌体中加入3.3 mL氯仿，于室温搅拌一昼夜，抽提菌体内的聚酯。滤去菌体残渣后，用蒸发器浓缩至总容积为约1 mL，然后缓慢加入约3 mL的己烷，在缓慢搅拌下放置1小时。将析出的聚酯滤出后，真空干燥3小时。测定干燥聚酯的质量，计算菌体内的聚酯含量。
结果如表1所示，相比对照菌株H16，W01菌株的干重显著提升8.3%，PHA%显著提升4.8%，PHA产量显著提升13.6%。
表1
步骤2：重组菌株W01反应器发酵生产PHA的性能测试
2.1 将甘油管保存的实施例1构建的重组菌株W01和对照菌株H16（1000μL）分别接种于种子培养基Ⅰ中(20mL)，进行12小时的种子一级培养，得到种子培养液Ⅰ；然后，按1％（v/v）的接种量将种子培养液Ⅰ接种于种子培养基Ⅱ中（100mL），进行二级种子培养，培养13h，得到种子培养液Ⅱ；然后按10%（v/v）的接种量将种子培养液Ⅱ接种于装有250mL生产培养基的500mL小型发酵罐中。运行条件为培养温度30℃、搅拌速度800rpm、通气量1L/min，将pH控制为6.7～6.8之间。pH控制中使用了28％的氨水溶液。在培养过程中，持续的使用棕榈油作为碳源，培养时间为54小时。
2.2 取上述发酵液进行离心得到菌体。将菌体烘干至恒重。测定干燥菌体的重量记为干重。向所得的干燥菌体中加入25mL氯仿，于室温搅拌一昼夜，抽提菌体内的聚酯。滤去菌体残渣后，用蒸发器浓缩至总容积为约7.5mL，然后缓慢加入约22.5mL的己烷，在缓慢搅拌下放置1小时。将析出的聚酯滤出后，真空干燥3小时。测定干燥聚酯的质量，计算菌体内的聚酯含量。
结果如表2所示，重组菌株W01的以下3个PHA生产性能指标都显著优于对照菌株H16。相比对照菌株H16，重组菌株W01的干重显著提升10.02%，PHA产量显著提升11.77%，生产强度显著提升11.74%。
表2
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种生产PHA的重组菌，其特征在于，所述重组菌的H16_B2198、H16_B2199、H16_B2200、H16_B2201、H16_B2202、H16_B2203和H16_B2204基因被敲除，PHA生产性能因此而获得提升；
所述重组菌的出发菌株为罗氏真养菌H16。
2.权利要求1所述的重组菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括：对罗氏真养菌H16进行修饰，以敲除H16_B2198、H16_B2199、H16_B2200、H16_B2201、H16_B2202、H16_B2203和H16_B2204基因。
3.权利要求1所述的重组菌在PHA发酵生产中的应用。
4.一种提高PHA生产菌的PHA生产性能的方法，其特征在于，所述方法包括：对PHA生产菌进行修饰以敲除H16_B2198、H16_B2199、H16_B2200、H16_B2201、H16_B2202、H16_B2203和H16_B2204基因；
所述PHA生产菌为罗氏真养菌H16。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PHA生产性能为PHA产量和/或PHA生产强度。
6.H16_B2198、H16_B2199、H16_B2200、H16_B2201、H16_B2202、H16_B2203和H16_B2204基因的敲除在提高PHA生产菌的PHA生产性能中的应用；
所述PHA生产菌为罗氏真养菌H16。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述PHA生产性能为PHA产量和/或PHA生产强度。
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