CN115975944A - 年轻化非多能性细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及细胞领域。具体而言，本发明涉及一种年轻化、非多能性细胞，产生所述年轻化、非多能性细胞的方法，以及所述细胞的应用。

Description

年轻化非多能性细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及非多能性细胞领域。具体而言，本发明涉及一种年轻化非多能性细胞的方法，以及所述细胞在细胞移植、组织修复和/或组织再生细胞治疗和基因治疗的用途。

背景技术

衰老与组织的进行性退化有关，这对重要器官的结构和功能有负面影响，是大多数慢性病最重要的已知危险因素之一。鉴于世界上60岁以上人口的比例将在未来40年内翻倍，与年龄相关的慢性疾病发病率的增加将给医疗资源带来巨大负担。衰老的特点是损伤的逐渐累积，导致生理完整性的丧失、功能受损和死亡的脆弱性增加。衰老过程影响整个有机体，包括人类生殖系。在经历二十年或以上的活跃代谢后，包括人类生殖系在内的所有人类细胞都会积累分子损伤，例如经过修饰的长寿蛋白质、遗传和表观遗传突变、代谢副产物以及其他与年龄相关的有害变化，然后才能产生再次年轻化的后代。最近，通过使用表观遗传时钟的概念，科学家们观察到在早期胚胎发生期间，细胞的生物年龄显著降低，即发生了一次年轻化事件(Kerepesiet al.，2021)。

然而这过程中所涉及的通路和因子对于体外非多能性细胞的影响，仍然是个谜。在生物学中，虽然有很多促进生长、增殖和再生因子曾被报道过，但是这些因子一般上都不具备逆转衰老、耗竭、无能性、表观时钟的功能。尽管我们对多能性、重编程和转分化的理解有了巨大的进步，但是我们对成体干细胞、体内祖细胞或非多能性细胞的年轻化和/或延长自我更新能力的分子基础仍然知之甚少。尤其是，我们仍然还没有发现任何一个可以使体细胞部分年轻化的因素或因子。

发明内容

本申请的发明人经过大量实验和反复摸索，获得了一种年轻化的非多能性细胞，以及其制备方法和试剂，以及其细胞和试剂在细胞治疗的应用。通过一项令人惊讶的发现，发明人发现，在非多能性细胞调控以上过程所涉及的某些通路和基因，不仅能够使非多能性细胞部分逆转细胞衰老、耗竭、无能性、表观时钟、生物年龄，也能够让非多能性细胞延长自我更新能力和细胞寿命。

年轻化非多能性细胞、细胞群和药物组合

本申请提供一种分离的、工程化非多能性细胞，其具备以下特征：

(i)其Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4的任一基因或多个基因的表达有所增加

(ii)可以稳定传代至少5次，例如至少10次、至少15次、至少20次、至少25次、至少30次或更多。

在某些实施方案中，本申请所提供所提供的分离的工程化非多能性细胞，可以稳定传代至少5次、例如至少10次、至少15次、至少20次、至少25次、至少30次或更多；其年轻化转录因子网络：Grhl2,Zic5,Zic2,Utf1,Otx2,Snai3,Lmo2,Hopx的任一基因或多个基因的表达相对于未经修饰的非多能性细胞有所增加。在某些实施方案中，除了以上所述年轻化转录因子网络的基因外，LIN28(包括LIN28A或LIN28B)的表达相对于未经修饰的非多能性细胞同时有所增加。在某些实施方案中，本申请所提供所提供的分离的工程化非多能性细胞，可以稳定传代至少5次、例如至少10次、至少15次、至少20次、至少25次、至少30次或更多；其年轻化表观遗传修饰网络：Bcl11a,Bcl11b,Dnmt3b,Mettl20,Arid3c的任一基因或多个基因的表达相对于未经修饰的非多能性细胞有所增加。在某些实施方案中，除了以上所述年轻化表观遗传修饰网络基因外，LIN28(包括LIN28A或LIN28B)的表达相对于未经修饰的非多能性细胞同时有所增加。在某些实施方案中，本申请所提供所提供的分离的工程化非多能性细胞，可以稳定传代至少5次、例如至少10次、至少15次、至少20次、至少25次、至少30次或更多；其年轻化信号配体、受体及相关激酶网络：Fgf5,Wnt3,Calcr,Epha1,Epor,Galr2,Piezo2,Ripk4,Pak6,Map3k15,Pdzd4,Shc4的任一基因或多个基因的表达相对于未经修饰的非多能性细胞有所增加。在某些实施方案中，除了以上所述年轻化信号配体、受体及相关激酶网络的基因外，LIN28(包括LIN28A或LIN28B)的表达相对于未经修饰的非多能性细胞同时有所增加。在某些实施方案中，本申请所提供所提供的分离的工程化非多能性细胞，可以稳定传代至少5次、例如至少10次、至少15次、至少20次、至少25次、至少30次或更多；其年轻化核酸结合因子网络：Foxr2,Hif3a,Pbx1,Zfp946,Batf3,Pabpc4l,Celf4,Lin28的任一基因或多个基因的表达相对于未经修饰的非多能性细胞有所增加。在某些实施方案中，除了以上所述年轻化核酸结合因子基因外，LIN28(包括LIN28A或LIN28B)的表达相对于未经修饰的非多能性细胞同时有所增加。在某些实施方案中，本申请所提供所提供的分离的工程化非多能性细胞，可以稳定传代至少5次、例如至少10次、至少15次、至少20次、至少25次、至少30次或更多；其LIN28(包括LIN28A或LIN28B)的基因表达相对于未经修饰的非多能性细胞有所增加。在某些实施方案中，本申请所提供所提供的分离的工程化非多能性细胞，可以稳定传代至少5次、例如至少10次、至少15次、至少20次、至少25次、至少30次或更多；其年轻化因子：Bcl11a，Bcl11b,Otx2,Lmo2,Pbx1,Pabpc4l,Lin28的任一基因或多个基因的表达相对于未经修饰的非多能性细胞有所增加。

在某些实施方案中，本发明的非多能性细胞在选自以下的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个或36个)基因的表达水平上相比于未经修饰的非多能性细胞中这些基因的表达水平显示至少约1.5倍、至少约2倍的增加：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。在某些实施方案中，本发明的非多能性细胞在选自以下的一个或多个年轻化转录因子网络基因的表达水平上相比于未经修饰的非多能性细胞中这些年轻化转录因子网络基因的表达水平显示至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍的增加：Grhl2,Zic5,Zic2,Utf1,Otx2,Snai3,Lmo2,Hopx。在某些实施方案中，除了以上所述年轻化转录因子网络基因以外，同时本发明所述的工程化非多能性细胞的LIN28(LIN28A或LIN28B)基因表达水平相比于未经修饰非多能性细胞的至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍。在某些实施方案中，本发明的非多能性细胞在选自以下的一个或多个年轻化表观遗传修饰网络基因的表达水平上相比于未经修饰的非多能性细胞中这些年轻化表观遗传修饰网络基因基因的表达水平显示至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍的增加：Bcl11a,Bcl11b,Dnmt3b,Mettl20,Arid3c。在某些实施方案中，除了以上所述年轻化表观遗传修饰网络以外，同时本发明所述的工程化非多能性细胞的LIN28(LIN28A或LIN28B)基因表达水平相比于未经修饰非多能性细胞的至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍。在某些实施方案中，本发明的非多能性细胞在选自以下的一个或多个年轻化信号配体、受体及相关激酶网络基因的表达水平上相比于未经修饰的非多能性细胞中这些年轻化信号配体、受体及相关激酶网络基因的表达水平显示至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍的增加：Fgf5,Wnt3,Calcr,Epha1,Epor,Galr2,Piezo2,Ripk4,Pak6,Map3k15,Pdzd4,Shc4。在某些实施方案中，除了以上所述年轻化信号配体、受体及相关激酶网络的基因以外，同时本发明所述的工程化非多能性细胞的LIN28(LIN28A或LIN28B)基因表达水平相比于未经修饰非多能性细胞的至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍。在某些实施方案中，本发明的非多能性细胞在选自以下的一个或多个年轻化核酸结合因子网络基因的表达水平上相比于未经修饰的非多能性细胞中这些年轻化核酸结合因子网络基因的表达水平显示至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍的增加：Foxr2,Hif3a,Pbx1,Zfp946,Batf3,Pabpc4l,Celf4,Lin28。在某些实施方案中，除了以上所述年轻化核酸结合因子网络基因以外，同时本发明所述的工程化非多能性细胞的LIN28(LIN28A或LIN28B)基因表达水平相比于未经修饰非多能性细胞的至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍。在某些实施方案中，本发明的非多能性细胞在LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达水平上相比于未经修饰的非多能性细胞中LIN28的表达水平显示至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍的增加。在某些实施方案中，本发明的非多能性细胞在选自以下的一个或多个年轻化因子基因的表达水平上相比于未经修饰的非多能性细胞中这些年轻化因子基因的表达水平显示至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍的增加、至少约1000倍的增加：Bcl11a,Bcl11b,Otx2,Lmo2,Pbx1,Pabpc4l,Lin28。

在细胞上，增加某个基因的表达或表达水平有很多方式。最常见的方式是通过转基因，向细胞递送编码某基因的核酸(例如DNA或RNA)，其中也包括在调控某基因表达量的原件(启动子、药物调控启动子、蛋白调控启动子、组织特异启动子、蛋白内含子(intein)、转座子、核酸内切酶(例如cre-lox***)、逆转座子。)来提高基因在细胞内的表达。这些都是已知的。另外，向细胞递送基因的方式也有很多种，譬如但不限于利用病毒、转座子、纳米颗粒、脂质囊泡等等。增加基因表达的非转基因模式的方式包括利用CRISPRa对内源基因进行调控，上调某基因的表达。某个基因在细胞内的表达量是可以通过生物学中已知的方式去测量，譬如但不限于蛋白质印迹法、免疫荧光、荧光定量PCR、RNA或DNA测序等。

在某些实施方案中，所述非多能性细胞在以下任一或多个基因的表达是通过转基因方式提高，表达持续至少12小时：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。在某些实施方案中，所述非多能性细胞在以下任一或多个年轻化转录因子网络基因的表达是通过转基因方式提高，表达持续至少12小时：Grhl2,Zic5,Zic2,Utf1,Otx2,Snai3,Lmo2,Hopx。在某些实施方案中，所述非多能性细胞LIN28(LIN28A或LIN28B)的基因表达水平同时也通过转基因方式提高，表达持续至少12小时。在某些实施方案中，所述非多能性细胞在以下任一或多个年轻化表观遗传修饰网络基因的表达是通过转基因方式提高，表达持续至少12小时：Bcl11a,Bcl11b,Dnmt3b,Mettl20,Arid3c。在某些实施方案中，所述非多能性细胞LIN28(LIN28A或LIN28B)的基因表达水平同时也通过转基因方式提高，表达持续至少12小时。在某些实施方案中，所述非多能性细胞在以下任一或多个年轻化信号配体、受体及相关激酶网络基因的表达是通过转基因方式提高，表达持续至少12小时：Fgf5,Wnt3,Calcr,Epha1,Epor,Galr2,Piezo2,Ripk4,Pak6,Map3k15,Pdzd4,Shc4。在某些实施方案中，所述非多能性细胞LIN28(LIN28A或LIN28B)的基因表达水平同时也通过转基因方式提高，表达持续至少12小时。在某些实施方案中，所述非多能性细胞在以下任一或多个年轻化核酸结合因子网络基因的表达是通过转基因方式提高，表达持续至少12小时：Foxr2,Hif3a,Pbx1,Zfp946,Batf3,Pabpc4l,Celf4,Lin28。在某些实施方案中，所述非多能性细胞LIN28(LIN28A或LIN28B)的基因表达水平同时也通过转基因方式提高，表达持续至少12小时。在某些实施方案中，本发明的非多能性细胞在LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达是通过转基因方式提高，表达持续至少12小时。在某些实施方案中，所述非多能性细胞在以下任一或多个年轻化因子基因的表达是通过转基因方式提高，表达持续至少12小时：Bcl11a,Bcl11b,Otx2,Lmo2,Pbx1,Pabpc4l。在某些实施方案中，所述非多能性细胞LIN28(LIN28A或LIN28B)的基因表达水平同时也通过转基因方式提高，表达持续至少12小时。在某些实施方案中，所述基因的表达是瞬时基因表达。在某些实施方案中，所述基因表达是组成性基因表达。

在某些实施方案中，所述非多能性细胞能够在体外持续扩增至少4天、5天、6天、8天、9天、10天、20天、30天、40天、50天、100天、150天、200天、300天、400天或甚至更多天。

在某些实施方案中，所述非多能性细胞是选自内胚层、外胚层、中胚层来源或生殖细胞(germ cells)。在某些实施方案中，所述非多能性细胞不包括肌肉细胞、和成纤维细胞。优选地，所述非多能性细胞是神经细胞(例如但不限于神经外胚层祖细胞、神经胶质细胞(包括小胶质细胞、星型胶质细胞))。优选地，所述非多能性细胞是神经嵴细胞(neuralcrest细胞以及其所衍生出来的子细胞)。优选地，所述非多能性细胞是间充质干细胞。优选地，所述非多能性细胞是血液细胞(例如造血干细胞、造血干祖细胞、红细胞、白细胞、中性粒细胞、血小板、嗜酸性粒细胞)。优选地，所述非多能性细胞是免疫细胞(例如白细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、T细胞、γδT细胞、NKT细胞、巨噬细胞、B细胞、小胶质细胞、脾脏免疫细胞)。优选地，所述非多能性细胞是皮肤细胞(例如角质形成细胞)。优选地，所述非多能性细胞是肝脏细胞(例如但不限于肝脏前体细胞)。优选地，所述非多能性细胞是胰腺细胞(例如胰腺前体细胞或胰腺祖细胞)。优选地，所述非多能性细胞选自***细胞(包括精原干细胞)或***。在某些实施方案中，所述非多能性细胞仍然保留未经修饰细胞部分或全部功能或增强其的功能，例如工程化的免疫细胞(譬如自然杀伤细胞)具备肿瘤癌症细胞杀伤能力。

在某些实施方案中，所述非多能性细胞，其MDM4和TEP1的表达相比于非多能性细胞的至少约5倍、10倍、20倍、30倍或甚至更高。

在某些实施方案中，所述细胞的生物年龄相比于未经修饰多能性细胞，显著降低，其生物年龄能够通过测试其细胞的基因表达或表观遗传修饰(如表观遗传时钟)来衡量。生物年龄与实际时间年龄不一样，因为两个同样实际岁数的动物也可能存在衰老率差异，也就是生物年龄差异，会导致动物患上衰老相关疾病的风险也有所差异。近年来，表观遗传时钟已成为哺乳动物衰老过程的有力生物标志物，包括人类、小鼠、狗和狼以及座头鲸。表观遗传时钟是一种数学模型，经过大数据训练可以利用基因组中少量基因组位点的表观遗传修饰状态来预测岁数和生物年龄(Horvath and Raj,2018；Bell et al.,2019)。2013年，Steve Horvath开发了人类最广泛使用的多组织表观遗传时钟(Horvath2013)。有趣的是，表观遗传时钟预测的生物年龄与实际时间年龄(又称表观遗传年龄加速或EAA)的偏差与死亡时间和人类的许多早衰疾病有极强相关性，包括艾滋病毒感染、唐氏综合征、肥胖、沃纳综合征和亨廷顿病。表观遗传钟可以被理解为一种用来量化表观基因组随衰老变化的代表(Martin-Herranz et al.,2019)，比如利用CpG位点的DNA甲基化状态来预测人类生物年龄(Horvath clock；Horvath 2013)、小鼠生物年龄(Stubbs multi-t.clock；Stubbs et al.,2017)、小鼠血液生物年龄(Petkovitch blood clock；Petkovitch et al.,2018)、小鼠多器官生物年龄(Thompson multi-t.EN clock；Thompson et al.,2018),或利用核糖体核酸rDNA甲基化状态来预测小鼠血液生物年龄(Wang blood rDNA clock；Wang and Lemos,2019)，或利用染色质组蛋白H3甲基化状态来预测生物年龄(Martin-Herranz et al.,2019；Jeffries et al.,2019)。另外，基因组的表达图谱也会随着衰老相关的表观遗传变化而有所改变(Martin-Herranz et al.,2019)，而衡量这些基因的表达也能测量物种或细胞的生物年龄。

在另一方面，本发明提供一种分离的细胞群体，其包含以上所述的非多能性细胞或其任意组合；优选地，所述细胞群体中至少50％(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或约100％)的细胞是以上所述的非多能性细胞。

在另一方面，本发明也提供一种药物组合，其包含以上所述的非多能性细胞或细胞群体，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。在某些实施方案中，本发明所述的药物组合可以应用于细胞治疗，包括将本发明所述细胞配上药学上可接受的载体和/或腑剂施予患者(譬如但不限于利用本发明所述的免疫细胞来治疗癌症、或利用本发明所述的血液细胞提供给失血过多的患者。)目前，细胞治疗在医学领域应用广泛，本发明所产生的细胞能够为细胞治疗提供优质、年轻化的细胞，并提高细胞的产量。

制备年轻化细胞或逆转非多能性细胞衰老的方法

在另一方面，本发明提供了一种逆转细胞衰老的方法，其中包括增加以下任一基因或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个或29个)基因的表达：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。在某些实施方案中，本发明提供了一种逆转细胞衰老的方法，其中包括增加以下任一个或多个年轻化转录因子网络基因的表达：Grhl2,Zic5,Zic2,Utf1,Otx2,Snai3,Lmo2,Hopx。在某些实施方案中，本发明所提供逆转细胞衰老的方法，除了增加以上所述年轻化转录因子网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，本发明提供了一种逆转细胞衰老的方法，其中包括增加以下任一个或多个年轻化表观遗传修饰网络基因的表达：Bcl11a,Bcl11b,Dnmt3b,Mettl20,Arid3c。在某些实施方案中，本发明所提供逆转细胞衰老的方法，除了增加以上所述年轻化表观遗传修饰网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，本发明提供了一种逆转细胞衰老的方法，其中包括增加以下任一个或多个年轻化信号配体、受体及相关激酶网络基因的表达：Fgf5,Wnt3,Calcr,Epha1,Epor,Galr2,Piezo2,Ripk4,Pak6,Map3k15,Pdzd4,Shc4。在某些实施方案中，本发明所提供逆转细胞衰老的方法，除了增加以上所述年轻化信号配体、受体及相关激酶网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，本发明提供了一种逆转细胞衰老的方法，其中包括增加以下任一个或多个年轻化核酸结合因子网络基因的表达：Foxr2,Hif3a,Pbx1,Zfp946,Batf3,Pabpc4l,Celf4,Lin28。在某些实施方案中，本发明所提供逆转细胞衰老的方法，除了增加以上所述年轻化核酸结合因子网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，本发明提供了一种逆转细胞衰老的方法，其中包括增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，本发明提供了一种逆转细胞衰老的方法，其中包括增加以下任一个或多个年轻化因子基因的表达：Bcl11a,Bcl11b,Otx2,Lmo2,Pbx1,Pabpc4l。在某些实施方案中，本发明所提供逆转细胞衰老的方法，除了增加以上所述年轻化因子基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方案是通过转基因的方式来提高基因的表达，表达持续至少12小时。在某些实施方案中，所述基因的表达是瞬时基因表达。在某些实施方案中，所述基因表达是组成性基因表达。

如本文中所使用，术语“细胞衰老″是指细胞虽保持一定的活力和代谢活性但丧失了增殖能力和分化能力等正常细胞活性。细胞衰老可能由各种刺激或因素引起，包括由于DNA末端复制导致的端粒缩短、DNA损伤、肿瘤抑制基因和癌基因的活性改变、氧化应激、炎症、化疗剂以及暴露于紫外线照射或电离辐射(Kuilman等人,Genes&Development.(2010)24:2463-2479)。如本文所述，“逆转细胞衰老″或“逆转衰老”指的是让细胞恢复增殖能力和/或分化能力。在生物学上，测量细胞衰老一般上可以利用β半乳糖苷酶活性试剂鉴定。如本文所述，“逆转细胞衰老″或“逆转衰老”指的是让细胞恢复增殖能力和/或分化能力等正常细胞活性，同样也可以用β半乳糖苷酶活性试剂来测量鉴定。

在某些实施方案中，本发明也提供了制备以上年轻化非多能性细胞的方法，其中包括增加以下任一基因或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个或29个)基因的表达：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4；其细胞的生物年龄能够通过测试细胞的基因表达或遗传修饰(如表观遗传时钟)来衡量。在某些实施方案中，本发明提供了制备以上年轻化细胞的方法，其中包括增加以下任一个或多个年轻化转录因子网络基因的表达：Grhl2,Zic5,Zic2,Utf1,Otx2,Snai3,Lmo2,Hopx。在某些实施方案中，本发明所提供制备以上年轻化细胞的方法，除了增加以上所述年轻化转录因子网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，本发明提供制备以上年轻化细胞的方法，其中包括增加以下任一个或多个年轻化表观遗传修饰网络基因的表达：Bcl11a,Bcl11b,Dnmt3b,Mettl20,Arid3c。在某些实施方案中，本发明所提供制备以上年轻化细胞的方法，除了增加以上所述年轻化表观遗传修饰网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，本发明提供了制备以上年轻化细胞的方法，其中包括增加以下任一个或多个年轻化信号配体、受体及相关激酶网络基因的表达：Fgf5,Wnt3,Calcr,Epha1,Epor,Galr2,Piezo2,Ripk4,Pak6,Map3k15,Pdzd4,Shc4。在某些实施方案中，本发明所提供制备以上年轻化细胞的方法，除了增加以上所述年轻化信号配体、受体及相关激酶网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，本发明提供了制备以上年轻化细胞的方法，其中包括增加以下任一个或多个年轻化核酸结合因子网络基因的表达：Foxr2,Hif3a,Pbx1,Zfp946,Batf3,Pabpc4l,Celf4,Lin28。在某些实施方案中，本发明所提供制备以上年轻化细胞的方法，除了增加以上所述年轻化核酸结合因子网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，本发明提供了一种制备以上年轻化细胞的方法，其中包括增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，本发明提供制备以上年轻化细胞的方法，其中包括增加以下任一个或多个年轻化因子基因的表达：Bcl11a,Bcl11b,Otx2,Lmo2,Pbx1,Pabpc4l。在某些实施方案中，本发明所提供制备以上年轻化细胞的方法，除了增加以上所述年轻化因子基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方案是通过转基因的方式来提高基因的表达，表达持续至少12小时。在某些实施方案中，所述基因的表达是瞬时基因表达。在某些实施方案中，所述基因表达是组成性基因表达。

如本文中所使用的，术语“年轻化″是指细胞或物种的生物年龄有所降低或者具备年轻细胞具有的生物特征如更强大的自我更新能力、再生能力、生长能力、更接近胚胎期的基因表达或表观遗传修饰图谱或更好的生物功能。以上所述细胞的生物年龄能够通过测试细胞的基因表达或遗传修饰(如表观遗传时钟)来衡量。

在某些实施方案中，所述方法能够在非多能性细胞逆转细胞耗竭，其中包括增加以下任一基因或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个)基因的表达：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。在某些实施方案中，所述方法能够在非多能性细胞逆转细胞耗竭，其中包括增加以下任一个或多个年轻化转录因子网络基因的表达：Grhl2,Zic5,Zic2,Utf1,Otx2,Snai3,Lmo2,Hopx。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化转录因子网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够在非多能性细胞逆转细胞耗竭，其中包括增加以下任一个或多个年轻化表观遗传修饰网络基因的表达：Bcl11a,Bcl11b,Dnmt3b,Mettl20,Arid3c。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化表观遗传修饰网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够在非多能性细胞逆转细胞耗竭，其中包括增加以下任一个或多个年轻化信号配体、受体及相关激酶网络基因的表达：Fgf5,Wnt3,Calcr,Epha1,Epor,Galr2,Piezo2,Ripk4,Pak6,Map3k15,Pdzd4,Shc4。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化信号配体、受体及相关激酶网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够在非多能性细胞逆转细胞耗竭，其中包括增加以下任一个或多个年轻化核酸结合因子网络基因的表达：Foxr2,Hif3a,Pbx1,Zfp946,Batf3,Pabpc4l,Celf4,Lin28。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化核酸结合因子网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够在非多能性细胞逆转细胞耗竭，其中包括增加以下任一个或多个年轻化因子基因的表达：Bcl11a,Bcl11b,Otx2,Lmo2,Pbx1,Pabpc4l。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化因子基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够在非多能性细胞逆转细胞耗竭，其中包括增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方案是通过转基因的方式来提高基因的表达，表达持续至少12小时。在某些实施方案中，所述基因的表达是瞬时基因表达。在某些实施方案中，所述基因表达是组成性基因表达。

如本文中所使用，术语“细胞耗竭″是指细胞在长期激活的过程中，丧失部分功能，一般上可以利用细胞功能测试鉴定，譬如免疫细胞与体外肿瘤癌症细胞共培养后，免疫细胞针对体外肿瘤癌症细胞的杀伤能力等。

如本文中所使用，术语“逆转细胞耗竭“是指让细胞恢复功能，一般上可以利用细胞功能测试鉴定，譬如免疫细胞与体外肿瘤癌症细胞共培养后，免疫细胞针对体外肿瘤癌症细胞的杀伤能力等。

在某些实施方案中，所述方法能够在非多能性细胞逆转无能性，其中包括增加以下任一基因或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个)基因的表达：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。在某些实施方案中，所述方法能够在非多能性细胞逆转无能性，其中包括增加以下任一个或多个年轻化转录因子网络基因的表达：Grhl2,Zic5,Zic2,Utf1,Otx2,Snai3,Lmo2,Hopx。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化转录因子网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够在非多能性细胞逆转无能性，其中包括增加以下任一个或多个年轻化表观遗传修饰网络基因的表达：Bcl11a,Bcl11b,Dnmt3b,Mettl20,Arid3c。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化表观遗传修饰网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够在非多能性细胞逆转无能性，其中包括增加以下任一个或多个年轻化信号配体、受体及相关激酶网络基因的表达：Fgf5,Wnt3,Calcr,Epha1,Epor,Galr2,Piezo2,Ripk4,Pak6,Map3k15,Pdzd4,Shc4。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化信号配体、受体及相关激酶网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够在非多能性细胞逆转无能性，其中包括增加以下任一个或多个年轻化核酸结合因子网络基因的表达：Foxr2,Hif3a,Pbx1,Zfp946,Batf3,Pabpc4l,Celf4,Lin28。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化核酸结合因子网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够在非多能性细胞逆转无能性，其中包括增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够在非多能性细胞逆转无能性，其中包括增加以下任一个或多个年轻化因子基因的表达：Bcl11a,Bcl11b,Otx2,Lmo2,Pbx1,Pabpc4l。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化因子基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方案是通过转基因的方式来提高基因的表达，表达持续至少12小时。在某些实施方案中，所述基因的表达是瞬时基因表达。在某些实施方案中，所述基因表达是组成性基因表达。

如本文中所使用，术语“无能性”是指细胞无法针对外界信号启动应有的反应，譬如免疫细胞无能性指的是免疫细胞无法针对免疫抗原启动应有的免疫反应，无法针对免疫抗原而大量增殖，一般上可以通过免疫细胞增殖数量测试。

如本文所使用，术语“逆转无能性″是指让细胞能够恢复对于外界信号应有的反应与功能，也包括增殖，譬如逆转免疫细胞无能性指的是让免疫细胞恢复针对免疫抗原启动应有的免疫反应，针对免疫抗原而大量增殖，一般上可以通过免疫细胞增殖数量测试。

在某些实施方案中，所述方法能够延长非多能性细胞的寿命，其中包括增加以下任一基因或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个)基因的表达：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。在某些实施方案中，所述方法能够延长非多能性细胞的寿命，其中包括增加以下任一个或多个年轻化转录因子网络基因的表达：Grhl2,Zic5,Zic2,Utf1,Otx2,Snai3,Lmo2,Hopx。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化转录因子网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够延长非多能性细胞的寿命，其中包括增加以下任一个或多个年轻化表观遗传修饰网络基因的表达：Bcl11a,Bcl11b,Dnmt3b,Mettl20,Arid3c。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化表观遗传修饰网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够延长非多能性细胞的寿命，其中包括增加以下任一个或多个年轻化信号配体、受体及相关激酶网络基因的表达：Fgf5,Wnt3,Calcr,Epha1,Epor,Galr2,Piezo2,Ripk4,Pak6,Map3k15,Pdzd4,Shc4。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化信号配体、受体及相关激酶网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够延长非多能性细胞的寿命，其中包括增加以下任一个或多个年轻化核酸结合因子网络基因的表达：Foxr2,Hif3a,Pbx1,Zfp946,Batf3,Pabpc4l,Celf4,Lin28。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化核酸结合因子网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够延长非多能性细胞的寿命，其中包括增加以下任一个或多个年轻化因子基因的表达：Bcl11a,Bcl11b,Otx2,Lmo2,Pbx1,Pabpc4l。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化因子基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够延长非多能性细胞的寿命，其中包括增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方案是通过转基因的方式来提高基因的表达，表达持续至少12小时。在某些实施方案中，所述基因的表达是瞬时基因表达。在某些实施方案中，所述基因表达是组成性基因表达。

在一般情况下，细胞的寿命可以通过细胞存活的时间长短来衡量，而细胞是否存活可以通过染色(譬如碘化丙啶)来鉴定，本领域的技术人员也可以通过显微镜下的细胞形态的观察来鉴定。

在某些实施方案中，所述方法能够让细胞体外持续扩增至少4天、5天、6天、8天、9天、10天、20天、30天、40天、50天、100天、150天、200天、300天、400天或甚至更多天，其中包括增加以下任一基因或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个)基因的表达：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。在某些实施方案中，所述方法能够让细胞体外持续扩增至少4天、5天、6天、8天、9天、10天、20天、30天、40天、50天、100天、150天、200天、300天、400天或甚至更多天，其中包括增加以下任一个或多个年轻化转录因子网络基因的表达：Grhl2,Zic5,Zic2,Utf1,Otx2,Snai3,Lmo2,Hopx。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化转录因子网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够让细胞体外持续扩增至少4天、5天、6天、8天、9天、10天、20天、30天、40天、50天、100天、150天、200天、300天、400天或甚至更多天，其中包括增加以下任一个或多个年轻化表观遗传修饰网络基因的表达：Bcl11a,Bcl11b,Dnmt3b,Mettl20,Arid3c。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化表观遗传修饰网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够让细胞体外持续扩增至少4天、5天、6天、8天、9天、10天、20天、30天、40天、50天、100天、150天、200天、300天、400天或甚至更多天，其中包括增加以下任一个或多个年轻化信号配体、受体及相关激酶网络基因的表达：Fgf5,Wnt3,Calcr,Epha1,Epor,Galr2,Piezo2,Ripk4,Pak6,Map3k15,Pdzd4,Shc4。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化信号配体、受体及相关激酶网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够让细胞体外持续扩增至少4天、5天、6天、8天、9天、10天、20天、30天、40天、50天、100天、150天、200天、300天、400天或甚至更多天，其中包括增加以下任一个或多个年轻化核酸结合因子网络基因的表达：Foxr2,Hif3a,Pbx1,Zfp946,Batf3,Pabpc4l,Celf4,Lin28。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化核酸结合因子网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够延长非多能性细胞的所述方法能够让细胞体外持续扩增至少4天、5天、6天、8天、9天、10天、20天、30天、40天、50天、100天、150天、200天、300天、400天或甚至更多天，其中包括增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够让细胞体外持续扩增至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、8天、9天、10天、20天、30天、40天、50天、100天、150天、200天、300天、400天或甚至更多天，其中包括增加以下任一个或多个年轻化因子基因的表达：Bcl11a,Bcl11b,Otx2,Lmo2,Pbx1,Pabpc4l。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化因子基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方案是通过转基因的方式来提高基因的表达，表达持续至少12小时。在某些实施方案中，所述基因的表达是瞬时基因表达。在某些实施方案中，所述基因表达是组成性基因表达。

在某些实施方案中，所述方法能够让非多能性细胞稳定传代至少5次，例如至少10次、至少15次、至少20次、至少25次、至少30次或更多，其中包括增加以下任一基因或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个)基因的表达：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。在某些实施方案中，所述方法能够让非多能性细胞稳定传代至少5次，例如至少10次、至少15次、至少20次、至少25次、至少30次或更多，其中包括增加以下任一个或多个年轻化转录因子网络子基因的表达：Grhl2,Zic5,Zic2,Utf1,Otx2,Snai3,Lmo2,Hopx。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化转录因子网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够让非多能性细胞稳定传代至少5次，例如至少10次、至少15次、至少20次、至少25次、至少30次或更多，其中包括增加以下任一个或多个年轻化表观遗传修饰网络基因的表达：Bcl11a,Bcl11b,Dnmt3b,Mettl20,Arid3c。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化表观遗传修饰网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够让非多能性细胞稳定传代至少5次，例如至少10次、至少15次、至少20次、至少25次、至少30次或更多，其中包括增加以下任一个或多个年轻化信号配体、受体及相关激酶网络基因的表达：Fgf5,Wnt3,Calcr,Epha1,Epor,Galr2,Piezo2,Ripk4,Pak6,Map3k15,Pdzd4,Shc4。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化信号配体、受体及相关激酶网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够让非多能性细胞稳定传代至少5次，例如至少10次、至少15次、至少20次、至少25次、至少30次或更多，其中包括增加以下任一个或多个年轻化核酸结合因子网络基因的表达：Foxr2,Hif3a,Pbx1,Zfp946,Batf3,Pabpc4l,Celf4,Lin28。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化核酸结合因子网络基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够让非多能性细胞稳定传代至少5次，例如至少10次、至少15次、至少20次、至少25次、至少30次或更多，其中包括增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方法能够让非多能性细胞稳定传代至少5次，例如至少10次、至少15次、至少20次、至少25次、至少30次或更多，其中包括增加以下任一个或多个年轻化因子基因的表达：Bcl11a,Bcl11b,Otx2,Lmo2,Pbx1,Pabpc4l。在某些实施方案中，所述方法除了增加以上所述年轻化因子基因的表达，同时增加LIN28(LIN28A或LIN28B)的表达。在某些实施方案中，所述方案是通过转基因的方式来提高基因的表达，表达持续至少12小时。在某些实施方案中，所述基因的表达是瞬时基因表达。在某些实施方案中，所述基因表达是组成性基因表达。

在某些实施方案中，所述非多能性细胞是选自内胚层、外胚层、中胚层来源或生殖细胞(germ cells)。在某些实施方案中，所述非多能性细胞不包括肌肉细胞和成纤维细胞。优选地，所述非多能性细胞是神经细胞(例如但不限于神经外胚层祖细胞、神经胶质细胞(包括小胶质细胞、星型胶质细胞))。优选地，所述非多能性细胞是神经嵴细胞(neuralcrest细胞以及其所衍生出来的子细胞)。优选地，所述非多能性细胞是间充质干细胞。优选地，所述非多能性细胞是血液细胞(例如造血干细胞、造血干祖细胞、红细胞、白细胞、中性粒细胞、血小板、嗜酸性粒细胞)。优选地，所述非多能性细胞是免疫细胞(例如白细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、T细胞、γδT细胞、NKT细胞、巨噬细胞、B细胞、小胶质细胞、脾脏免疫细胞)。优选地，所述非多能性细胞是皮肤细胞(例如角质形成细胞)。优选地，所述非多能性细胞是肝脏细胞(例如但不限于肝脏前体细胞)。优选地，所述非多能性细胞是胰腺细胞(例如胰腺前体细胞或胰腺祖细胞)。优选地，所述非多能性细胞选自***细胞(包括精原干细胞)或***。在某些实施方案中，所述非多能性细胞仍然保留未经修饰细胞部分或全部功能或增强其的功能，例如工程化的免疫细胞(譬如自然杀伤细胞)具备肿瘤癌症细胞杀伤能力。

在某些实施方案中，所述方法包括转基因的方式来提高细胞以下一个或多个基因的表达：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。

在某些实施例中，对细胞进行处理(例如，基因工程)，以使非多能细胞所表达的再生因子高于在没有这种处理的情况下的水平。在某些一些实施例中，对细胞进行处理，以使非多能细胞过表达以下一个或多个基因：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。一种细胞处理方法是用病毒(如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒)感染细胞或用病毒载体(如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒)转染细胞包含可操作地连接到合适的表达控制元件的因子序列，以在感染或转染后驱动细胞中的表达，并任选地整合到本领域已知的基因组中。在某些实施方案中，处理细胞的方法也包括利用转座子或你转座子来递送以上所述基因以及控制基因表达量的启动子。在某些实施方案中，所述处理细胞的方案可利用电穿孔法来递送包含转座子或逆转座子、控制蛋白表达的原件(启动子、蛋白内含子(intein)、核酸内切酶(例如cre-lox***))和编码Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4一个或多个蛋白的核酸序列的载体。下面提供关于本发明的组合物和方法的进一步细节。

在某些实施方案中，所述方法所利用的转基因方法包含利用医学上所知的任何一个载体譬如但不限于病毒载体、转座子、纳米颗粒、反转座子、核算内切酶)。

非多能性细胞年轻化或逆转细胞衰老的试剂和试剂盒

本发明也提供了一个试剂盒或试剂组合，所述试剂盒或试剂组合能够用于产生以上所述的年轻化非多能性细胞，其中包括：

(i)编码以下任一或多个蛋白的核酸(例如脱氧核糖核酸、核糖核酸)：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4

和

(ii)医学上可接受的载体(例如病毒载体、纳米颗粒、脂质囊泡、转座子、逆转座子、外泌体等)。

在某些实施方案中，所述试剂盒或试剂组合也包含调控以上所述基因或蛋白的表达量的原件，例如但不限于启动子、药物调控启动子、蛋白调控启动子、组织特异启动子、蛋白内含子(intein)、转座子、核酸内切酶(例如cre-lox***)、逆转座子。在某些实施方案中，所述的试剂盒或试剂组合，所包含的载体等，同时包含以上所述任一调控以上所述基因或蛋白的表达量的原件，以及编码Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4一个或多个蛋白的核酸。在某些实施方案中，所述的试剂盒或试剂组合，所包含的载体等，同时包含以上所述任一调控以上所述基因或蛋白的表达量的原件，以及编码Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4一个或多个蛋白的核酸。在某些实施方案中，所述试剂或试剂组合是用病毒(如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒)感染细胞或用病毒载体(如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒)转染细胞包含可操作地连接到合适的表达控制元件的因子序列，以在感染或转染后驱动细胞中的表达，并任选地整合到本领域已知的基因组中。在某些实施方案中，所述试剂或试剂组合包含利用转座子或逆转座子来递送以上所述基因以及控制基因表达量的启动子。在某些实施方案中，所述试剂或试剂组合得通过利用电穿孔法来递送包含转座子或逆转座子、控制蛋白表达的原件(启动子、蛋白内含子(intein)、核酸内切酶(例如cre-lox***))和编码Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4一个或多个蛋白的核酸序列的载体。

在某些实施方案中，所述试剂或试剂盒可以在受试者体外使用，也可以在受试者的体内使用。

术语定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的干细胞、生物化学、核酸化学、免疫学等领域的实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文所述，术语“非多能性细胞“指的是胚层命运已定，不能够分化成多种胚层不同细胞类的细胞，例如成体细胞、生殖细胞、成体干细胞等，且不是胚胎干细胞、诱导多能干细胞。

如本文所使用，术语“前体细胞″或“组细胞”是指已有特定命运，只能分化成某个特定成体细胞或某个胚层的细胞。

如本文中所使用的，术语”生物年龄“是指通过物种的健康指标和衰老指标来确定物种的衰老或年轻程度。

如本文所述，术语“表观时钟“或″表观遗传时钟“是指利用表观遗传修饰为生物指标来衡量物种的生物年龄。

如本文中所使用的，术语“自我更新能力″是指细胞能够在多次传代中自我维持细胞特性，其细胞命运等性质没有显著变化。在一些实施方案中，传代的数量为至少约5，至少约10，至少约20、至少约30、至少约50或至少约100。

如本文中所使用的，术语“扩增″或“增殖″是指基本上不分化地维持细胞及最终细胞生长，即，使细胞群增加(例如至少2倍)而不存在伴随增加的分化。

如本文中所使用的，术语“体外″指人为环境，和在其中的过程和反应。体外环境通过试管和细胞培养进行例证，但不限制于此。

如本文中所使用的，术语“体内″指自然环境(即动物或细胞)和在其中的过程和反应。

如本文中所使用的，术语“基础培养基”是指能够支持细胞生长的任何培养基，通常包含无机盐、维生素、葡萄糖、缓冲体系和必需氨基酸，并且通常具有约280-330mOsmol的渗透压。

如本文中所使用的，术语“血清替代物″具有本领域技术人员公知的含义，其是指在维持未分化状态的情况下对干细胞进行培养的过程中，作为血清的替代物而使用的组合物或调配物。也即，血清替代物能够支持未分化干细胞的生长而无需补充血清。在某些示例性实施方案中，所述血清替代物包含：一种或多种氨基酸、一种或多种维生素、一种或多种微量金属元素。在一些情况下，血清替代物可以进一步包含一种或多种选自下列的成分：白蛋白、还原型谷胱甘肽、转铁蛋白、胰岛素等。血清替代物的非限制性实例包括但不限于，KnockOut^TM SR(简称为KSR)、N-2、B-27、Physiologix^TM XF SR、StemSure^TM SerumSubstitute Supplement等。

如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体或赋形剂″是指，在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，离子强度增强剂，维持渗透压的试剂，延迟吸收的试剂，稀释剂，佐剂，防腐剂等。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液。表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。维持渗透压的试剂包括但不限于糖、NaCl及其类似物。延迟吸收的试剂包括但不限于单硬脂酸盐和明胶。稀释剂包括但不限于水，水性缓冲液(如缓冲盐水)，醇和多元醇(如甘油)等。佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)等。防腐剂包括但不限于各种抗细菌试剂和抗真菌试剂，例如硫柳汞，2-苯氧乙醇，对羟苯甲酸酯，三氯叔丁醇，苯酚，山梨酸等。在某些实施方案中，所述药学上可接受的载体或赋形剂是无菌等渗水性或非水性溶液(例如，平衡盐溶液或生理盐水)、分散液、悬浮液或乳液。在某些实施方案中，“药学上可接受的载体“也包含递送核酸的工具例如但不限于病毒载体、纳米颗粒、脂质囊泡、外泌体等。

如本文中所使用的，术语“约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值或组成可接受的误差范围内的值或组成，这将部分地取决于值或组成如何测量或确定，即测量***的限制。例如，当“约″用于描述可测量的值(例如，物质的浓度、质量比等)时，意味着包含给定值的±10％、±5％、或±1％的范围。

下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得明显。

附图说明

图1显示Lin28a在睾丸和胎盘里的表达。A.位于生精小管***的Lin28a-tdTO+PLZF+spermatogonia精原干细胞相较于所有PLZF+spermatogonia精原干细胞的比例。B.Lin28a-tdTO+trophoblast giant cells(TGCs),胎盘巨细胞。C.Lin28a-tdTO+glycogentrophoblast cells(Gly-T),胎盘糖原滋养细胞。D.Lin28a-tdTO+sycytiotrophoblastcells(Syn),胎盘合体滋养层细胞，处于LZ迷宫层。E.Lin28a-tdTO+intraplacental yolksac cells(IPYS),胎盘内卵黄囊细胞。

图2显示Lin28a在胎盘母胎界面里的表达。A.Lin28a-tdTO+decidual naturalkiller cells(dNK cells),蜕膜自然杀伤细胞。B.Lin28a-tdTO+decidual macrophages蜕膜巨噬细胞。C.Lin28a-tdTO+extravillous trophoblast cells(EVT),胎盘绒毛外滋养层细胞，处于子宫母血窦螺旋动脉壁。

图3显示Lin28a在胚胎肺部的表达。在胚胎发育E11.5-16.5之间，肺部出现Lin28a-tdTO+(用tdTomato抗体染色，绿色)bronchial epithelial stem cells,肺支气管壁干细胞。

图4显示Lin28a在胚胎肝脏的表达。在胚胎发育E7.5-16.5之间，肝脏出现大量Lin28a-tdTO+(用tdTomato抗体染色，绿色；用tdTomato自身荧光，红色)hepatoblasts,肝脏祖细胞。

图5显示Lin28a在胚胎体节的表达。A.在胚胎发育E11.5-12.5之间，体节ossification cartilage primordia出现大量Lin28a-tdTO+软骨干细胞。B.在胚胎发育E11.5-12.5之间，尾芽tail bud出现大量Lin28a-tdTO+生皮肌干细胞。副中肾管paramesonephric duct也出现大量肾脏祖细胞。

图6显示Lin28a在胚胎脑的表达。A.在胚胎发育E11.5-12.5之间，小脑原基cerebellar primordium出现大量Lin28a-tdTO+神经干细胞。B.在胚胎发育E14.5-15.5之间，侧脑室的脉络丛lateral ventricle choroid plexus出现大量Lin28a-tdTO+室管膜祖细胞。C.在胚胎发育E11.5-16.5之间，大脑纹状体(脑室下区的尾神经节***)stiratumganglionic eminence出现大量Lin28a-tdTO+神经干细胞。

图7显示Lin28a在胚胎食道的表达。A.在胚胎发育E14.5-15.5之间，牙原基teethprimordia和触须毛囊原基primordia of follicles of vibrissae出现大量Lin28a-tdTO+干细胞。B.在胚胎发育E11.5-16.5之间，十二指肠duodenum出现大量Lin28a-tdTO+肠胃干细胞。

图8显示流式分析Lin28a+细胞在不同器官占比。A.LsL-tdTO单杂合鼠的血液被作为本次流式分析的阴性对照(NC)。B.Lin28a-creERT2:LSL-tdTO双杂合鼠肌肉做为本次流式分析的阳性对照(PC)。C.Lin28a+细胞分别在小鼠肝脏，脑，心脏和胰腺中的百分比。根据荧光强度，td+细胞被分为两群，荧光较弱的td-low和荧光较强的td-high。相对于阴性对照，4个器官的td-low群都显著增多，意味4个成年器官都含有极少量的Lin28a+干细胞。

图9显示成年心脏Lin28a+细胞的培养与鉴定。A.心脏Lin28a+细胞的体外培养形态。B.qRT-PCR鉴定心脏不同类型细胞标记基因在Lin28a-/+细胞中的表达。对照样品为Lin28a+肌肉干细胞(MuSCs)。其中，Myh6,Myh7,Acta1,Tnnt2,Nkx2.5,为心肌细胞的标记基因；Pdgfra,Col1a1,Tcf21为成纤维细胞的标记基因；Sirpa2,Sirpa3为造血细胞标记基因；Pecam1,Cdh5,Fabp4为内皮细胞标记基因；Acta2,Myh11,Actg2为平滑肌细胞标记基因；Pax6，Sox9为神经干细胞标记基因；Nestin,Msi1,Msi2，Sox9,Sox10,Foxc1,Foxc2为神经嵴细胞标记基因；Tubb3,Map2,Fabp4为成熟神经元标记基因；Olig2为神经胶质细胞标记基因；GFAP为星形胶质细胞标记基因；mGAPDH为内参对照。综上所述，断定心脏Lin28a+细胞是类似神经嵴的干细胞。

图10显示2个月大的鼠血液中Lin28a+细胞流式分析。血液细胞裂红后，共染了4个细胞表面标记基因抗体，CD3(T细胞)，CD49b(NK自然杀伤细胞)，CD11b(髓系来源的粒细胞，巨噬细胞等)，B220(B细胞)。A.未损伤：未损伤鼠血液td+细胞，大约有50％NK(CD49b+)，10％T(CD3+)细胞，24％粒细胞(CD11b+)，14％B细胞(B220+)。B.损伤后7天：损伤鼠血液td+细胞激增数倍，大约有96％NK(CD49b+)，0.8％T(CD3+)细胞，5％粒细胞(CD11b+)，1.5％B细胞(B220+)。

图11显示5个月大的鼠血液中Lin28a+细胞流式分析。A.损伤后小鼠血液中Lin28a-tdTO+细胞进一步分析鉴定，大部分(>93％)为CD11b+。中性粒细胞(Ly6G+F40/80-)，巨噬细胞(Ly6G-F4/80+)。B.中性粒细胞和巨噬细胞百分比统计。

图12显示Lin28a在体内NK自然杀伤细胞里的作用。2个月大的鼠血液中Lin28a+NK细胞数量随损伤后激增。

图13显示Lin28a在体外NK自然杀伤细胞里的作用。人NK细胞激活20天后，再过表达Lin28a3天后，自我更新能力和增值率显著上升率。

图14显示Lin28a在体外NK自然杀伤细胞里的作用。293T癌症细胞作为靶细胞检测的人类NK杀伤率，显示Lin28a提升人类NK细胞杀伤率。

图15显示Lin28a在多种造血干细胞源性和/或免疫细胞中重新激活和表达，包括NK细胞、T细胞、B细胞和中性粒细胞。Lin28a也在极少量的心脏神经嵴细胞(0.951％)和角质形成细胞(0.12％)中表达。Lin28a也在大量***细胞和***中表达。Lin28a也在造血干细胞和造血干祖细胞中表达。反之，Lin28a在间充质干细胞(MSCs)或成纤维细胞中不表达。

图16显示Lin28a过表达可显著增加原代造血干细胞来源和/或免疫细胞(包括自然杀伤细胞、T细胞、B细胞和中性粒·细胞，以及心脏神经嵴细胞和相关心肌细胞)的寿命(％原始离体寿命，以天为单位)，皮肤角质形成细胞、造血干细胞、造血干祖细胞、***细胞和相关***、***和相关生殖细胞。反之，Lin28a并没有增加间充质干细胞(MSCs)或成纤维细胞的寿命。

图17显示了年轻化基因的表，包括年轻化转录因子网络基因、年轻化表观修饰网络基因、年轻化信号配体、受体及相关激酶网络的基因、年轻化核酸结合因子网络基因，其表达能够使非多能性细胞年轻化、逆转衰老、逆转非多能性细胞耗竭、逆转非多能性细胞的无能性、延长非多能性细胞寿命、增加非多能性细胞传代的次数。

图18显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老小鼠心肌细胞(心肌细胞(6病毒))和空载体对照的衰老小鼠心肌细胞(心肌细胞(对照))在FGF2刺激后的3天增殖率与细胞寿命。衰老小鼠心肌细胞显然已无能，到了寿命终点，无法增殖，无法传代。转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老小鼠心肌细胞(心肌细胞(6病毒))则恢复了FGF2感应能力和增殖能力，还能传代>10次。

图19显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老小鼠神经胶质细胞(6病毒)和空载体对照的衰老小鼠神经胶质细胞(对照)在血清刺激后的24小时增殖率与细胞寿命。衰老小鼠心肌细胞显然已无能，到了寿命终点，无法增殖，无法传代。转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老小鼠神经胶质细胞(6病毒)则恢复了血清感应能力和增殖能力，还能传代>5次。

图20显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老人类间充质干细胞(6病毒)和空载体对照的衰老小鼠间充质干细胞(对照)在血清刺激后的3天增殖率与细胞寿命。衰老小鼠间充质干细胞显然已无能，到了寿命终点，无法增殖，无法传代。转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老小鼠间充质干细胞(6病毒)则恢复了血清感应能力和增殖能力，还能传代>10次。

图21显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老人类神经细胞(6病毒)和空载体对照的衰老人类神经细胞(对照)在FGF2刺激后的3天增殖率与细胞寿命。衰老小鼠神经细胞显然已无能，到了寿命终点，无法增殖，无法传代。转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老人类神经细胞(6病毒)则恢复了FGF2感应能力和增殖能力，还能传代>5次。

图22显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老小鼠肝脏细胞(6病毒)和空载体对照的衰老小鼠肝脏细胞(对照)在胰岛素刺激后的3天增殖率与细胞寿命。衰老小鼠肝脏细胞显然已无能，到了寿命终点，无法增殖，无法传代。转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老小鼠肝细胞(6病毒)则恢复了胰岛素感应能力和增殖能力，还能传代>5次。

图23显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老小鼠脾脏免疫细胞(红色)和空载体对照的衰老小鼠脾脏免疫细胞(蓝色)在α-CD3/α-CD28刺激后的3天增殖率与细胞寿命。衰老小鼠脾脏免疫细胞(蓝色)显然已无能，到了寿命终点，无法增殖，无法传代。转染了6个基因的衰老小鼠脾脏免疫细胞(红色)则恢复了α-CD3/α-CD28感应能力而继续增殖，稀释CFSE信号，位于3x10³的峰向左偏移了～12％。位于10²的峰代表破裂的凋亡细胞。结果显示衰老小鼠脾脏免疫细胞(蓝色)显然已开始凋亡，到了寿命终点。转染了6个基因的衰老小鼠脾脏免疫细胞(红色)则逆转了凋亡、逆转了免疫细胞衰老。

图24显示Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l病毒(免疫细胞-6病毒)对比空载体病毒(免疫细胞-对照)，在感染48小时后，激活Lin28a-tdTomato+阳性免疫细胞的程度。

图25A显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老人类间充质干细胞(间充质干细胞(6病毒))和空载体对照的衰老人类间充质干细胞(间充质干细胞(对照))在血清刺激后的％衰老细胞面积。图25B显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老人类间充质干细胞(间充质干细胞(6病毒))和空载体对照的衰老人类间充质干细胞(间充质干细胞(对照))在血清刺激后的％衰老细胞数量。6个基因显著逆转了衰老细胞比例。图25A数据：P值＝0.009921，图25B数据：P值＝0.012727

图26A显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)衰老人类肝脏前体细胞(肝前体细胞(6病毒))和空载体对照的衰老人类肝脏前提细胞(肝前体细胞(对照))在胰岛素刺激后的％衰老细胞面积。图26B显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老人类肝脏前体细胞(肝前体细胞(6病毒))和空载体对照的衰老人类肝脏前体细胞(肝前体细胞(对照))在胰岛素刺激后的％衰老细胞数量。6个基因显著逆转了衰老细胞比例。图26A数据：P值＝0.0000，图26B数据：P值＝0.0001

图27A显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)衰老人类神经前体细胞(神经前体细胞(6病毒))和空载体对照的衰老人类神经前体细胞(神经前体细胞(对照))在FGF2刺激后的％衰老细胞面积。图27B显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老人类神经前体细胞(神经前体细胞(6病毒))和空载体对照的衰老人类神经前体细胞(神经前体细胞(对照))在FGF2刺激后的％衰老细胞数量。6个基因显著逆转了衰老细胞比例。图27A数据：P值＝0.262，图27B数据：P值＝0.293

图28A显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)衰老人类胰腺前体细胞(胰腺前体细胞(6病毒))和空载体对照的衰老人类胰腺前体细胞(胰腺前体细胞(对照))在EGF刺激后的％衰老细胞面积。图28B显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老人类胰腺前体细胞(胰腺前体细胞(6病毒))和空载体对照的衰老人类胰腺前体细胞(胰腺前体细胞(对照))在EGF刺激后的％衰老细胞数量。6个基因显著逆转了衰老细胞比例。图28A数据：P值＝0.495，图28B数据：P值＝0.639

图29A显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)衰老人类心肌前体细胞(心肌前体细胞(6病毒))和空载体对照的衰老人类心肌前体细胞(心肌前体细胞(对照))在B27刺激后的％衰老细胞面积。图29B显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老人类心肌前体细胞(心肌前体细胞(6病毒))和空载体对照的衰老人类心肌前体细胞(心肌前体细胞(对照))在B27刺激后的％衰老细胞数量。6个基因显著逆转了衰老细胞比例。。图29A数据：P值＝0.0000，图29B数据：P值＝0.0000

图30显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老人类间充质干细胞(6病毒)和空载体对照的衰老人类间充质干细胞(空载对照)都显著过表达了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)。＊＊＊P<0.001

图31显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老肝细胞(6病毒)和空载体对照的衰老肝细胞(空载对照)都显著过表达了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)。***P<0.001

图32显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老心肌细胞(6病毒)和空载体对照的衰老心肌细胞(空载对照)都显著过表达了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)。***P<0.001

图33显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老神经胶质细胞(6病毒)和空载体对照的衰老神经胶质细胞(空载对照)都显著过表达了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)。***P<0.001，＊＊P<0.01

图34显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老脾脏T细胞(6病毒)和空载体对照的衰老脾脏T细胞(空载对照)都显著过表达了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)。＊＊＊P<0.001，**P<0.01

图35显示被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老脾脏NK细胞(6病毒)和空载体对照的衰老脾脏NK细胞(空载对照)都显著过表达了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)。＊＊＊P<0.001，＊＊P<0.01

图36显示染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老小鼠T细胞(感染组)在α-CD3、α-CD28刺激后的5天增殖率与细胞寿命，比起衰老小鼠T细胞对照(未感染)，都有所显著提升。

图37显示转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老小鼠NK细胞(感染组)在α-CD3、α-CD28刺激后的5天增殖率与细胞寿命，比起衰老小鼠NK细胞对照(未感染)，都有所显著提升。

图38显示被感染单子中6个基因(分别含有Bcl11a,Bcl11b,Otx2,Lmo2,Pbx1,Pabpc4l的载体)的衰老小鼠T细胞在5天内，Lin28a+比例都显著高于对照组(0.016％vs0.007％)。

图39显示被感染单子中6个基因(分别含有Bcl11a,Bcl11b,Otx2,Lmo2,Pbx1,Pabpc4l的载体)的衰老小鼠NK细胞在5天内，Lin28a+比例都显著高于对照组(0.022％vs0.012％)。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。

以下实施例涉及的主要试剂的来源如下：

案例1

介绍

尽管我们对多能性、体细胞重编程和转分化的理解取得了巨大进步，但干细胞自我更新的分子基础仍不清楚。特别是，没有发现单个因子可以使体细胞重返青春。利用Oct4、Sox2、Klf4、Myc等多个重编程因子实现体细胞重返青春的潜在风险是：若细胞彻底重返青春，获得多能性的干性，就会产生畸胎瘤。若能发现哪一个单个干细胞因子能让细胞部分重返或维持青春，且在成体细胞正常表达又不致癌，将会是这个领域的突破。Lin28是最早被发现与幼年发育和生长程序相关的基因之一，这一概念与干细胞自我更新和分化相关。

为了测试Lin28a是否在特定的细胞类型中发挥作用，我们对所有胚胎和成年组织进行了Lin28a的谱系追踪。我们使用同源重组在Lin28a蛋白C端偶联了“自切割”T2A-CreERT2，构建了人工Lin28a-T2A-CreERT2转基因小鼠，并与Rosa26-loxp-stop-loxp-tdTomato(tdTO)报告小鼠杂交，以追踪Lin28a+细胞的命运。为了确保我们的Lin28a-tdTO+谱系追踪可以特异且真实的反应内源Lin28a的表达，我们检查了tdTO+细胞在睾丸中的分布。结果，我们发现在谱系追踪20天后，有～30％位于生精小管***的PLZF+精原干细胞和～61％的***细胞被特异性标记为Lin28a-tdTO+细胞，表明Lin28a-tdTO的分布正确(图1A,15)。虽然分布正确，但人工操作依然可干扰Lin28a末端和3’UTR，Lin28a活性有可能略微提升。为了确保内源性Lin28a的表达不受偶联的T2A-CreERT2的干扰，我们检查了杂合Lin28a-T2A-CreERT2小鼠的总Lin28a蛋白表达，发现野生型和Lin28a-T2A-CreERT2；LSL-tdTO小鼠之间虽有些差异，但差异不太大。因此我们利用tamoxifen(TMX)对胚胎组织各时间点进行谱系追踪。我们发现在胚胎里，Lin28a-tdTO+细胞遍布于胎盘(图1B-E)，母胎界面(图2)，胚胎肺支气管壁干细胞(图3)，肝脏祖细胞(图4)，体节软骨干细胞，生皮肌干细胞，肾脏祖细胞(图5)，室管膜祖细胞，神经干细胞(图6)，牙原基和触须毛囊原基的干细胞，肠胃干细(图7)等细胞。

如图8所示，我们通过FACSAria(Becton Dickinson)细胞分选在成体小鼠里发现Lin28a-tdTO+(简称td+)细胞在不同成年小鼠器官的占比。根据荧光强度，td+细胞被分为两群，荧光较弱的td-low和荧光较强的td-high。相对于阴性对照，Lin28a+细胞分别在小鼠肝脏，脑，心脏和胰腺中的的td-low群都比阴性对照显著更多，意味4个成年器官都含有极少量的Lin28a+干细胞。

如图9所示，成年心脏存在Lin28a+细胞(图9A)。qRT-PCR鉴定显示心脏Lin28a+细胞是类似神经嵴的干细胞(图9B)。qRT-PCR鉴定显示心脏Lin28a+细胞是类似神经嵴的干细胞(图9B)。成年小鼠血液细胞里也存在大量的Lin28a+细胞，包括CD3+T细胞，CD49b+NK细胞，CD11b+髓系来源的粒细胞，巨噬细胞等，B220+B细胞，Ly6G+F40/80-中性粒细胞，Ly6G-F4/80+巨噬细胞(图10、11)。我们进一步发现2个月大的鼠血液中Lin28a+NK细胞数量会随损伤后激增，提示Lin28a能在体内促进NK细胞增殖(图12)。我们在体外人类NK细胞过表达Lin28a超过2倍，3后发现Lin28a能促进NK自然杀伤细胞的自我更新能力和增殖率(图13)，且能提升NK自然杀伤细胞针对293T癌症细胞的杀伤力(图14)。

如图15所示，Lin28a-tdTomato在多种造血干细胞源性和/或免疫细胞中重新激活和表达，包括NK细胞、T细胞、B细胞和中性粒细胞。Lin28a也在极少量的心脏神经嵴细胞(0.951％)和皮肤角质形成细胞(0.12％)中表达。Lin28a也在大量***细胞和***中表达。Lin28a也在造血干细胞和造血干祖细胞细胞中表达。反之，Lin28a在间充质干细胞(MSCs)或成纤维细胞中不表达。

为了进一步测试我们的Lin28a是否能延长这些特定细胞类型的细胞寿命，将其年轻化，我们利用带有CMV启动子和G418抗性转基因的FUGW慢病毒载体，在多种未经修饰的成年细胞类型中过度表达了Lin28a。FUGW慢病毒感染2天后，再进行2天G418筛选后，将过表达成功的细胞传代，在合适的细胞培养基里养殖。如图16所示，我们发现相较于未经修饰的成年细胞，Lin28a过表达可显著增加成年造血干细胞来源和/或免疫细胞(包括自然杀伤细胞、T细胞、B细胞和中性粒细胞，以及心脏神经嵴细胞和相关心肌细胞)、皮肤角质形成细胞、造血干细胞、造血干祖细胞细胞、***细胞、***和相关生殖细胞的寿命(％原始离体寿命，以天为单位)。反之，Lin28a并没有增加间充质干细胞(MSCs)或成纤维细胞的寿命。根据谱系追踪的结果，Lin28a也能特异地延长胎盘细胞、肺细胞、肝脏细胞、肾脏细胞、软骨细胞、室管膜细胞、神经细胞、牙齿细胞、肠胃细胞等的细胞寿命。

根据我们的基因组与表观遗传生物信息分析，我们发现一系列的基因网络与Lin28a有互作关系，在介导Lin28a年轻化细胞过程中扮演年轻化因子的重要角色。如图17所示，这些网络可分为年轻化转录因子网络(Grhl2,Zic5,Zic2,Utf1,Otx2,Snai3,Lmo2,Hopx)、年轻化表观遗传修饰网络(Bcl11a,Bcl11b,Dnmt3b,Mettl20,Arid3c)、年轻化信号配体、受体及相关激酶网络(Fgf5,Wnt3,Calcr,Epha1,Epor,Galr2,Piezo2,Ripk4,Pak6,Map3k15,Pdzd4,Shc4)、以及年轻化核酸结合因子网络(Foxr2,Hif3a,Pbx1,Zfp946,Batf3,Pabpc4l,Celf4,Lin28a,Lin28b)。过表达一个或多个上述年轻化因子也能实现细胞年轻化，降低生物年龄，尤其是逆转细胞衰老、逆转耗竭、逆转无能性、延长细胞寿命和自我更新能力(增加传代次数)。

案例2

从上述细胞表达图谱，我们得到了与Lin28a共表达的基因单子：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。案例1显示了Lin28a+细胞具有逆转衰老的能力。因此我们利用Lin28a-tdTomato作为报告基因预测非多能性细胞是否得以延长寿命。作为案例，我们测试了单子中的以下6个基因：Bcl11a,Bcl11b,Lmo2,Otx2,Pbx1,Pabpc4l是否能够让衰老小鼠非多能性细胞逆转衰老，并延长其寿命。众所周知，衰老细胞一般上会丢失细胞因子感应能力、增殖能力、传代能力，并且开始表达SA-Bgal。因此，我们想测试Bcl11a,Bcl11b,Otx2,Lmo2,Pbx1,Pabpc4l可否在小鼠衰老细胞促进细胞因子感应能力、增殖能力、传代能力，从而逆转衰老。我们利用已知的方法提取衰老的小鼠获人类非多能性细胞(心肌细胞、神经胶质细胞(包括小胶质细胞、星型胶质细胞)、间充质干细胞、神经细胞、肝脏细胞、脾脏免疫细胞)并分别转染了6个病毒(分别含有Bcl11a,Bcl11b,Otx2,Lmo2,Pbx1,Pabpc4l的载体)和空载体的病毒，在24小时、48小时、72小时测量细胞的增殖倍数，并在72小时内测量了衰老细胞的Lin28a+比列，SA-Bgal+比列，以及衰老细胞的面积％与数量％。如图18、图19、图20、图21、图22所示，我们利用Operetta高内涵显微镜(PerkinElmer)发现能够通过转基因模式(转染含有单子中6个基因的病毒载体)促进同等量衰老细胞感应培养基FGF2(GeminiBio，10ng/ml)或牛血清(BI，10％)或B27(Gibco，1％)或胰岛素(BI，4ug/ml)或α-CD3/α-CD28抗体(Invitrogen，2-4ug/ml)或EGF(Peprotech)的能力，以及增殖能力和传代能力。空载体对照组衰老肌肉细胞在1代内就停止增殖了，但6病毒的衰老非多能性细胞可再传代>5次，而且增殖倍数在24小时、48小时、72小时都显著提高。与此同时，如图23所示，被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老小鼠免疫细胞(红色)和空载体对照的衰老小鼠免疫细胞(蓝色)在α-CD3/α-CD28刺激后的3天增殖率与细胞寿命。衰老小鼠脾脏免疫细胞(蓝色)显然已无能，到了寿命终点，无法增殖，无法传代。转染了6个基因的衰老小鼠脾脏免疫细胞(红色)则恢复了α-CD3/α-CD28感应能力而继续增殖，稀释CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，Invitrogen，10uM)信号，位于3x10³的峰向左偏移了～12％。位于10²的峰代表破裂的凋亡细胞。结果显示衰老小鼠脾脏免疫细胞(蓝色)显然已开始凋亡，到了寿命终点。转染了6个基因的衰老小鼠脾脏免疫细胞(红色)则逆转了凋亡、逆转了免疫细胞衰老。如图24所示，我们利用流式分析(Becton Dickinson,Flowjo)，发现被转染单子中6个基因(分别含有Bcl11a,Bcl11b,Otx2,Lmo2,Pbx1,Pabpc4l的载体)的衰老小鼠脾脏细胞在48-72小时内，Lin28a+比例都显著高于空载体对照组。由此可见，单子中的基因都具有启动Lin28a表达，逆转衰老，逆转无能性，恢复增殖能力、传代能力，并延长其寿命的能力。

我们进一步测试了单子中6个基因是否能够在人类非多能性细胞逆转衰老。我们利用已知的方案(Ang et al.,2018,Koh et al.,2016,Liu et al.,2020,Martin et al.,2020)，将胚胎多能干细胞分化成不同种类的非多能性细胞(间充质干细胞、肝脏前体细胞、神经前体细胞、胰腺前体细胞和心肌前体细胞)，并在这些细胞衰老后(停止增殖的时候)，分别转染了含有单子中6个基因和包含空载体的病毒，并在72小时内，利用β-半乳糖苷酶染色(Solarbio#G1580)标记衰老细胞，再用Operetta高内涵显微镜(PerkinElmer)测量衰老细胞的百分比。如图25、图26、图27、图28、图29所示，我们可以通过转基因方式(病毒转染)，过表达单子中6个基因，且成功逆转人类非多能性细胞的衰老面积％和衰老数量％。由此可见，单子中的基因都具有逆转衰老，逆转无能性，恢复增殖能力、传代能力，并延长其寿命的能力。

我们进一步采用荧光定量核酸扩增检测(qRT-PCR)，测试了被转染6个基因(分别含有Bcl11a,Bcl11b,Otx2,Lmo2,Pbx1,Pabpc4l的载体)的衰老非多能性细胞(间充质干细胞、肝细胞、心肌细胞、神经胶质细胞、脾脏T细胞、脾脏NK细胞)Bcl11a,Bcl11b,Otx2,Lmo2,Pbx1,Pabpc4l基因的表达。如图30、图31、图32、图33、图34、图35分别所示，被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的非多能性细胞(6病毒)和空载体对照的衰老非多能性细胞(空载对照)都显著过表达了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)。

我们还进一步用已知方案对Lin28a-tdTomato衰老小鼠的脾脏进行免疫细胞流式分选(Becton Dickinson)。如图36所示，我们进一步发现被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老小鼠T细胞(感染组)在α-CD3(Invitrogen#16-0031-81，4ug/ml)和α-CD28(Invitrogen#16-0281-81，2ug/ml)刺激后的5天增殖率与细胞寿命，比起衰老小鼠T细胞对照(未感染)，都有所显著提升。衰老小鼠T细胞(未感染)则显然已无能，到了寿命终点，无法增殖，无法传代。如图37所示，我们进一步发现被转染了6个基因(Bcl11a、Bcl11b、Lmo2、Otx2、Pbx1、Pabpc4l)的衰老小鼠NK细胞(感染组)在α-CD3(Invitrogen#16-0031-81，4ug/ml)和α-CD28(Invitrogen#16-0281-81，2ug/ml)刺激后的5天增殖率与细胞寿命，比起衰老小鼠NK细胞对照(未感染)，都有所显著提升。衰老小鼠NK细胞(未感染)则显然已无能，到了寿命终点，无法增殖，无法传代。如图38所示，我们进一步利用流式分析(Becton Dickinson,Flowjo)发现被感染单子中6个基因(分别含有Bcl11a,Bcl11b,Otx2,Lmo2,Pbx1,Pabpc4l的载体)的衰老小鼠T细胞在5天内，Lin28a-tdTomato+比例都显著高于对照组(0.016％vs 0.007％)。如图39所示，我们进一步利用流式分析(Becton Dickinson,Flowjo)发现被感染单子中6个基因(分别含有Bcl11a,Bcl11b,Otx2,Lmo2,Pbx1,Pabpc4l的载体)的衰老小鼠NK细胞在5天内，Lin28a-tdTomato+比例都显著高于对照组(0.022％vs 0.012％)。由此可见，单子中的基因都具有启动Lin28a表达，逆转衰老，逆转无能性，逆转免疫细胞耗竭，恢复增殖能力、传代能力，并延长细胞寿命的能力。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (22)

1.一种分离的工程化非多能性细胞，其具备以下特征：

(i)其Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4的任一基因或多个基因的表达相对于未经修饰的非多能性细胞有所增加。

(ii)可以稳定传代至少5次，例如至少10次、至少15次、至少20次、至少25次、至少30次或更多。

2.权利要求1所述的非多能性细胞，其Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4的任一基因或多个基因的表达相比于未修饰的非多能性细胞，至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、100、150、200倍或甚至更高。

3.权利要求1-2所述非多能性细胞，能够持续扩增至少4天、5天、6天、8天、9天、10天、20天、30天、40天、50天、100天、150天、200天、300天、400天或甚至更多天。

4.权利要求1-3所述非多能性细胞，其生物年龄相比于未修饰的非多能性细胞显著降低。

5.权利要求1-4任一项所述的非多能性细胞，所述细胞源自于内胚层、外胚层、中胚层或生殖细胞。

6.权利要求1-5任一项所述的非多能性细胞，所述细胞选自神经嵴细胞(neuralcrest细胞及其所衍生出来的子细胞)、神经细胞(例如神经前体细胞、神经胶质细胞)、血液细胞(例如造血干细胞、造血干祖细胞、红细胞、白细胞、中性粒细胞、血小板、嗜酸性粒细胞)、免疫细胞(例如白细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、T细胞、γδT细胞、NKT细胞、巨噬细胞、B细胞、小胶质细胞、脾脏前体细胞)、肝脏细胞(例如肝脏前体细胞)、胰腺细胞(胰腺前体细胞)、心肌细胞(例如心肌前体细胞)、皮肤细胞(例如角质形成细胞)、***细胞(包括精原干细胞)、***。

7.权利要求1-6任一项所述的非多能性细胞，其MDM4和TEP1的表达相比于非多能性细胞的至少约5倍、10倍、20倍、30倍或甚至更高。

8.一种分离的细胞群体，其包含权利要求1-7任一项所述的非多能性细胞或其任意组合；

优选地，所述细胞群体中至少50％(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或约100％)的细胞是权利要求1-7任一项所述的非多能性细胞。

9.一种药物组合物，其包含权利要求1-7任一项所述的非多能性细胞或权利要求8所述的细胞群体，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。

10.一种用于生产权利要求1-7任一项所述细胞或权利要求8所述细胞群的方法，其中通过提高以下一个或多个基因的表达：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。

11.一种用于让非多能性细胞年轻化或降低非多能性细胞生物年龄的方法，其中通过提高以下一个或多个基因的表达：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。

12.一种能够在非多能性细胞逆转衰老的方法，其中通过提高以下一个或多个基因的表达：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4I、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。

13.一种能够在非多能性细胞逆转细胞耗竭的方法，其中通过提高以下一个或多个基因的表达：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4I、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。

14.一种能够在非多能性细胞逆转细胞无能性的方法，其中通过提高以下一个或多个基因的表达：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4I、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。

15.一种能够延长非多能性细胞寿命的方法，其中通过提高以下一个或多个基因的表达：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4I、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。

16.一种能够让细胞体外持续扩增至少4天、5天、6天、8天、9天、10天、20天、30天、40天、50天、100天、150天、200天、300天、400天或甚至更多天的方法，其中通过提高以下一个或多个基因的表达：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。

17.一种能够让非多能性细胞稳定传代至少5次，例如至少10次、至少15次、至少20次、至少25次、至少30次或更多次的方法，其中通过提高以下一个或多个基因的表达：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。

18.权利要求10-17任一项所述方法，其方法能用于的细胞选自内胚层、外胚层、中胚层来源或生殖细胞。优选地，所述非多能性细胞选自神经嵴细胞(neural crest细胞及其所衍生出来的子细胞)、神经细胞(例如神经前体细胞、神经胶质细胞(包括小胶质细胞、星型胶质细胞))、血液细胞(例如造血干细胞、造血干祖细胞、红细胞、白细胞、中性粒细胞、血小板、嗜酸性粒细胞)、免疫细胞(例如白细胞、淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、T细胞、γδT细胞、NKT细胞、巨噬细胞、B细胞、小胶质细胞、脾脏前体细胞)、间充质干细胞、肝脏细胞(例如肝脏前体细胞)、胰腺细胞(胰腺前体细胞)、心肌细胞(例如心肌前体细胞)、皮肤细胞(例如角质形成细胞)、***细胞(包括精原干细胞)、***。

19.权利要求10-18任一项所述方法，其包括转基因的方式来提高细胞以下一个或多个基因的表达：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。

20.一种用于产生权利要求1-7任何一项所描述的细胞或细胞群或逆转非多能性细胞衰老的试剂或试剂盒，其中包含

(i)编码以下任一蛋白的核酸(例如脱氧核糖核酸、核糖核酸)：Bcl11a、Fgf5、Wnt3、Batf3、Lin28a、Lin28b、Dnmt3b、Arid3c、Bcl11b、Lmo2、Grhl2、Zic5、Foxr2、Hif3a、Zic2、Pbx1、Snai3、Zfp946、Mettl20、Hopx、Utf1、Otx2、Aadat、Mal2、Pabpc4l、Calcr、Epha1、Epor、Galr2、Ripk4、Pak6、Map3k15、Celf4、Pdzd4、Piezo2、Shc4。

和

(ii)医学上可接受的载体(例如病毒载体、纳米颗粒、脂质囊泡、外泌体等)。

21.权利要求所述的试剂或试剂盒、其中也包括调控以上基因的表达量的原件，例如但不限于启动子、药物调控启动子、蛋白调控启动子、组织特异启动子、蛋白内合子(intein)、转座子、核酸内切酶(例如cre-lox***)、逆转座子。

22.权利要求20-21所述的试剂或试剂盒、其中包含在体内或体外的用途。

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