CN115968780B - 石榴人工种子及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了石榴人工种子及其制备方法，具体方法步骤如下：S1：预培养；S2：胚状体培养：剪取S1中预培养后的石榴组培苗的幼嫩茎段0.5‑0.8cm平放至胚状体培养基中培养20d；S3：人工胚乳的制备；S4：人工种皮的制备：以2.5％海藻酸钠+纳米硅(40mg·L‑1)作为人工种皮；S5：人工种子的制备；S6：人工种子的储藏。本发明打破了木本植物不易获得易萌发的胚性愈伤导致的人工种子萌发不理想的僵局；较早提出了人工种子萌发整齐度的要求，便于田间管理，有利于技术成果在生产上的应用和推广；对人工种子保存方式及时间进行研究，获得人工种子最佳保存体系，更有利于工业化生产、储存及相关技术推广。
Description
技术领域
本发明涉及人工种子技术领域，尤其涉及石榴人工种子及其制备方法。
背景技术
人工种子是指将植物离体培养产生的胚状体或能发育成完整植株的分生组织，用含有营养物质的胚乳和具有保护功能的种皮包埋而形成的颗粒体；其优点制作简单、方便储存、且能够将脱毒的组培苗以种子形式直接播种，操作简单，不需要炼苗过程，是组培技术的重要延伸。
但是，由于目前人工种子的研究多围绕于人工种子的萌发率，而不是种子发芽整齐度。种子发芽整齐度的欠缺，极易出现播种之后出苗不整齐的现象，导致田间管理困难，不能大规模应用及推广。且相较于草本植物，该技术在木本植物中的研究应用更少，究其原因有三：(1)木本植物组培中极易出现褐化现象，导致组培体系较难建立；(2)木本植物较难培养出易分化的胚性愈伤细胞，不定芽分化较难且分化时间较长，在人工种子中发育缓慢，极易出现种胚发育迟缓，导致人工种子出苗时间不一致，造成后期管理极易出现问题；(3)木本植物愈伤分化时出现较多的酚类物质，人工种子一旦保存条件不适极易出现褐化现象，导致种胚死亡，导致人工种子出苗率较低。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了石榴人工种子及其制备方法，打破了木本植物不易获得易萌发的胚性愈伤导致的人工种子萌发不理想的僵局；较早提出了人工种子萌发整齐度的要求，便于田间管理，有利于技术成果在生产上的应用和推广；对人工种子保存方式及时间进行研究，获得人工种子最佳保存体系，更有利于工业化生产、储存及相关技术推广。
本发明提出的石榴人工种子的制备方法，方法步骤如下：
S1：预培养；
S2：胚状体培养；
S3：人工胚乳的制备；
S4：人工种皮的制备
以2.5％海藻酸钠+30-40mg·L-1纳米硅作为人工种皮；
S5：人工种子的制备；
S6：人工种子的储藏。
优选地，S1中预培养的方法为将石榴的茎尖于茎尖培养基中培养，然后选择茎尖接种后的石榴组培苗接种于继代培养基中进行预培养。
优选地，所述茎尖培养基为WPM+0.7-0.9mg/L6-BA+活性炭0.4-0.6g/L。
优选地，所述继代培养基为WPM+0.6-0.7mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+20g·L-1蔗糖+6g·L-1琼脂。
优选地，S2中胚状体培养的方法为：剪取S1中预培养后的石榴组培苗的幼嫩茎段0.5-0.8cm平放至胚状体培养基中培养15-25d。
优选地，所述胚状体培养基为WPM+0.21mg·L-16-BA+0.6mg·L-1IBA+20-30g·L-1蔗糖+6g·L-1琼脂。
优选地，S3中人工胚乳制备方法为以WPM+0.7-0.9mg·L-1IBA+20-30g·L-1蔗糖+400mg·L-1青霉素作为人工胚乳。
优选地，S5中人工种子制备的方法为：将人工种胚、人工胚乳和人工种皮充分混合后，加入4％氯化钙溶液中，络合5-15min后将人工种子取出，冲洗后再将人工种子表面的水分吸去，即可获得石榴人工种子。
优选地，S6中人工种子的储藏方法为：在4-7℃冷藏条件下，于液体石蜡溶液中密封黑暗保存。
本发明提出的上述方法制备的石榴人工种子。
本发明的有益技术效果：
(1)本发明通过预培养和胚状体培养条件及时间的确定，获得了萌发率高、萌发时间较为一致的石榴人工种子，为后续的研究及大工业生产提供了极好的基础。
(2)本发明通过在人工种皮中添加Nano-Si，在与海藻酸钠协同作用下进一步提高的了石榴人工种子的萌发率。
(3)本发明将石榴人工种子在低温冷藏条件下，于液体石蜡溶液中密封黑暗保存，解决了木本植物人工种子储藏容易出现褐化的问题，进而提高了人工种子的出苗率。
(4)本发明打破了木本植物不易获得易萌发的胚性愈伤导致的人工种子萌发不理想的僵局；较早提出了人工种子萌发整齐度的要求，便于田间管理，有利于技术成果在生产上的应用和推广；对人工种子保存方式及时间进行研究，获得人工种子最佳保存体系，更有利于工业化生产、储存及相关技术推广。
附图说明
图1为本发明提出的茎尖接种生长状态图；
图2为本发明提出的胚状体培养的不同时间的生长状态图；
图3为本发明提出的不同胚状体培养基培养60d后的胚状体生长状态图；
图4为本发明提出的人工种子存放10d后的情况；
图5为本发明提出的人工种子萌发生长状态图。
具体实施方式
实施例
本发明提出的石榴人工种子的制备方法，方法步骤如下：
S1：预培养
(1)茎尖接种：将采集的石榴嫩茎尖端作为外植体置于烧杯中清水冲洗15-30min，后用75％酒精洗涤30s，再用无菌水冲洗3次，除去表面灰尘及其他杂质。将冲洗后的材料置于超净工作台内，选取0.1％HgCl2为消毒剂，经不同10min消毒处理后，最后使用灭菌水冲洗4次，在显微镜下，用解剖针将外植体茎尖拨开，拨至只剩下叶原基生长点，其直径约为0.4mm。再用手术刀切下茎尖生长点接种于配置好的培养基中，接种培养基选用：WPM+0.8mg/L 6-BA+0.5g/L活性炭。其中图1为本实施例的茎尖接种7d、14d和28d后的生长状态图。
(2)预培养：选择上述茎尖接种后的石榴组培苗，切成1.5cm茎段，每个茎段含有1个腋芽分生点，接种于继代培养基中，继代培养基选用：WPM+0.6mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+20g·L-1蔗糖+6g·L-1琼脂。
S2：胚状体培养
剪取S1中预培养后的石榴组培苗的幼嫩茎段0.5-0.8cm平放至胚状体培养基WPM+0.21mg·L-16-BA+0.6mg·L-1IBA+30g·L-1蔗糖+6g·L-1琼脂中培养20d。图2为茎段接种在该胚状体培养基中培养0、15、30、45和55d后的胚状体生长状态。
S3：人工胚乳的制备
以WPM+0.8mg·L-1IBA+30g·L-1蔗糖+400mg·L-1青霉素作为人工胚乳。
S4：人工种皮的制备
以2.5％海藻酸钠+40mg·L-1纳米硅作为人工种皮；
S5：人工种子的制备
将人工种胚、人工胚乳和人工种皮充分混合后，采用分液漏斗滴定法，滴入4％氯化钙溶液中，络合10min后将人工种子取出，蒸馏水冲洗3次后再将人工种子表面的水分用无菌吸水纸吸去，即可获得石榴人工种子；
S6：人工种子的储藏
在4℃冷藏条件下，于液体石蜡溶液中密封黑暗保存。其中图4为人工种子采用该方法储藏10d后的照片，从照片中可以看出该人工种子并未出现褐化的问题。
为了提高人工种子的出芽率，对胚状体培养的条件进行优化试验，分别对胚状体培养基中6-BA和IBA的浓度进行筛选，使用的胚状体培养基为WPM+0.18-0.23mg·L-16-BA+0.4-0.7mg·L-1IBA+30g·L-1蔗糖+6g·L-1琼脂，试验条件和结果如表1所示，每组重复培养3次，结果取平均值。接种时在超净工作台上将外植体接种到已灭菌的培养基上，培养过程中记录出芽数量、出芽时间等数据。
表1胚状体培养基激素组合筛选试验结果
从表1可以看出不同激素浓度对愈伤组织的再分化具有很大的影响，受激素浓度影响，C15激素配比下胚状体不定芽平均出芽数为5.11，出芽时间最短，仅需55d。C1、C3、C4、C7、C8、C11六组与C15组虽差异不显著，但胚状体不定芽出芽数等均小于C15组且出芽时间晚于20d。因此选用WPM+0.21mg·L-16-BA+0.6mg·L-1IBA+30g·L-1蔗糖+6g·L-1琼脂作为胚状体培养的培养基。图3为茎段接种于C15、C3、C4、C8、C11培养基60d后胚状体生长状态。
此外，在以WPM+0.21mg·L-16-BA+0.6mg·L-1IBA+30g·L-1蔗糖+6g·L-1琼脂作为胚状体进行培养的情况下，对其培养时间进行优化，分别培养10、15、20、25、30d后，每个胚状体培养时间为一个处理组，每组包括100粒人工种子，计算人工种子制成后20-25d出芽率，结果如表2所示。
表2胚状体不同培养时间试验结果
经试验后，确定选取幼嫩茎段采用WPM+0.21mg·L-16-BA+0.6mg·L-1IBA+30g·L-1蔗糖+6g·L-1琼脂培养基进行胚状体培养，获得胚状体时间较短，预培养20d后，人工种子第20天开始萌发，并于5天内发芽率达到91％，在第28天内完全萌发，种子出芽整齐度良好，可以作为人工种子进行播种，方便后期田间统一管理。图5为预培养20d后，人工种子萌发15、25和35d的生长状况。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.石榴人工种子的制备方法，其特征在于，方法步骤如下：
S1：预培养；
S2：胚状体培养；
S3：人工胚乳的制备；
S4：人工种皮的制备
以2.5%海藻酸钠+30-40mg·L-1纳米硅作为人工种皮；
S5：人工种子的制备；
S6：人工种子的储藏；
S1中预培养的方法为将石榴的茎尖于茎尖培养基中培养，然后选择茎尖接种后的石榴组培苗接种于继代培养基中进行预培养；
所述茎尖培养基为WPM+0.7-0.9 mg/L6-BA+活性炭0.4-0.6 g/L；
所述继代培养基为WPM+0.6-0.7 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+20 g·L-1蔗糖+6 g·L-1琼脂；
S2中胚状体培养的方法为：剪取S1中预培养后的石榴组培苗的幼嫩茎段0.5-0.8cm平放至胚状体培养基中培养15-25d；
所述胚状体培养基为WPM+0.21mg·L-1 6-BA+0.6 mg·L-1 IBA+20-30g·L-1蔗糖+6g·L-1 琼脂；
S3中人工胚乳制备方法为以WPM+0.7-0.9mg·L-1 IBA+20-30g·L-1蔗糖+400mg·L-1青霉素作为人工胚乳；
S5中人工种子制备的方法为：将人工种胚、人工胚乳和人工种皮充分混合后，加入4%氯化钙溶液中，络合5-15min后将人工种子取出，冲洗后再将人工种子表面的水分吸去，即可获得石榴人工种子；
S6中人工种子的储藏方法为：在4-7℃冷藏条件下，于液体石蜡溶液中密封黑暗保存。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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