CN115950863A - 单分子荧光检测*** - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单分子荧光检测***，包括荧光激发单元、待测液单元、荧光收集单元和信号处理单元；荧光激发单元包括激光器、传导光纤和第一折射率渐变透镜，激光器产生的激光光束经传导光纤传导至第一折射率渐变透镜，得到激发光束；待测液单元包括微管路，微管路允许单分子通过，待测液通过微管路，激发光束照射微管路，激发位于微管路中的单分子荧光标记物发出荧光光子；荧光收集单元包括第二折射率渐变透镜和检测光纤，第二折射率渐变透镜暗场收集荧光光子，并传导至检测光纤；检测光纤与信号处理单元相连接，信号处理单元对通过检测光纤的荧光光子进行处理得到荧光标记物的信息。本发明提供一种微型、低成本、高效率的单分子荧光检测***。

Description

单分子荧光检测***

技术领域

本发明涉及单分子荧光检测技术领域，更具体地，涉及一种单分子荧光检测***。

背景技术

荧光检测主要是利用检测带有荧光标记的特殊蛋白，通过对其浓度的检测可以用于呼吸道、自身免疫等疾病的诊断，也是体外诊断中最为常见的一种检测方式。目前随着医学和生物学的不断发展，对于快速、精确和可靠性的要求的不断提高，传统的检测手段(包括目前流行的化学发光法、ELISA和免疫共沉淀法等等)已经满足不了现在的需求，单分子荧光检测的出现填补了人们对快速、高灵敏和高可靠性等优点的需求，也被称作为下一代荧光检测技术。单分子荧光检测可将最低检出限优化至100倍乃至1000倍以上。

目前，市场上有两种单分子荧光检测装置，一种是由Quanterix公司开发，其利用半导体工艺制备具有微孔阵列的芯片结构，将分析物限制在各个微孔里面，再利用成像***来探测每一个微孔中是否有分析物，从而可以得到分析物的含量信息，然而，微孔阵列的加工工艺要求高，推高了芯片成本。另一种由Singulex开发，利用共聚焦显微镜观察焦点范围内，通过激光激发该区域，然后收集该区域的荧光强度来分析该区域内分析物的含量，然而，共聚焦显微镜结构复杂、体积大、价格昂贵且不易维护。

另，上述两种单分子荧光检测装置均是对分析物进行空间分割，将分析物分割为较小单元或者个体进行观测，受到高本底噪声的影响，每单步需要长时间的累计曝光，从而达到接收器可观测的阈值，因此使得最终测量时间远超过化学发光法。

因此，单分子荧光检测装置受到成本、测量效率和仪器体积等问题的影响，目前市场占有率较低，难以推广。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种微型、低成本、高效率的单分子荧光检测***。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种单分子荧光检测***，包括荧光激发单元、待测液单元、荧光收集单元和信号处理单元；

所述荧光激发单元包括激光器、传导光纤和第一折射率渐变透镜，所述激光器产生的激光光束经所述传导光纤传导至所述第一折射率渐变透镜，经所述第一折射率渐变透镜聚焦后得到用于激发待测液产生荧光的激发光束；

所述待测液单元包括微管路，所述微管路允许单分子通过，待测液通过所述微管路，所述激发光束照射所述微管路，激发位于所述微管路中的单分子荧光标记物发出荧光光子；

所述荧光收集单元包括第二折射率渐变透镜和检测光纤，所述第二折射率渐变透镜设置于非所述激发光束的光路上，所述第二折射率渐变透镜暗场收集所述荧光光子，所述荧光光子经所述第二折射率渐变透镜聚焦后传导至所述检测光纤；

所述检测光纤与所述信号处理单元相连接，所述信号处理单元对通过所述检测光纤的所述荧光光子进行处理得到荧光标记物的信息。

实施本发明实施例，将具有如下有益效果：

本发明实施例通过设置第一折射率渐变透镜和第二折射率渐变透镜，替代现有技术中由多个曲面透镜构成的复杂光学镜片聚焦结构，有效的缩小了光路传播的空间大小，且由于折射率渐变透镜的体积可控制在毫米量级，因此，本发明极大地缩小了单分子荧光检测***的体积和结构复杂度；通过将第二折射率渐变透镜设置于非激发光束的光路上，暗场收集荧光光子，避免激发光束的光被第二折射率渐变透镜收集，形成较大的本底噪声，容易淹没部分较弱的单分子荧光信号，提高单分子荧光信号的检测速度和精度；通过设置第二折射率渐变透镜和检测光纤，第二折射率渐变透镜的前端对产生的荧光光子进行收集，荧光光子经第二折射率渐变透镜的折射聚焦后，耦合到检测光纤，检测光纤的光纤口径的限制起到了光阑去噪的作用，即相当于现有共聚焦显微镜中的共聚焦针孔的作用，本申请利用第二折射率渐变透镜和检测光纤的组合实现了现有共聚焦显微镜的共聚焦作用，能够显著降低单分子荧光检测***的体积和成本；通过采用微流道的空间限制的方式使每次检测的样品体积内只存在一个分析物分子，然后通过统计得到待测液中荧光标记的待测分子的浓度、含量等信息，避免对待测液进行空间分割，避免延长检测时间。

综上，本发明在保证单分子荧光检测技术具有的超灵敏、高效率优点前提下，利用折射率渐变透镜极有效的简化了超敏荧光检测***，获得微型单分子荧光检测***。该微型***为全固态结构，***稳定，易于与其他功能模块集成，制作成本也远低于大型显微***，从而克服了现有单分子荧光检测装置复杂、设计难度大、不易维护和成本高的缺点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

其中：

图1是本发明一具体实施例的单分子荧光检测***的结构示意图。

图2是本发明一具体实施例的第一/第二折射率渐变透镜的径向半径r上任一点的折射率N(r)的曲线关系图。

图3是本发明一具体实施例的第一/第二折射率渐变透镜的光线传输示意图。

图4是本发明一具体实施例的待测液单元的结构示意图。

图5是本发明一具体实施例的微管路的结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

参考图1，本发明公开了一种单分子荧光检测***，包括荧光激发单元10、待测液单元20、荧光收集单元30和信号处理单元40。

荧光激发单元10包括激光器、传导光纤11和第一折射率渐变透镜12，激光器产生的激光光束经传导光纤11传导至第一折射率渐变透镜12，经第一折射率渐变透镜12聚焦后得到用于激发待测液产生荧光的激发光束。

待测液单元20包括微管路21，微管路21允许单分子通过，待测液通过微管路21，激发光束照射微管路21，激发位于微管路21中的单分子荧光标记物发出荧光光子。

荧光收集单元30包括第二折射率渐变透镜31和检测光纤32，第二折射率渐变透镜31设置于非激发光束的光路上，暗场收集荧光光子，荧光光子经第二折射率渐变透镜31聚焦后传导至检测光纤32。

检测光纤32与信号处理单元40相连接，信号处理单元40对通过检测光纤32的荧光光子进行处理得到荧光标记物的信息。

在上述实施方式中，通过设置第一折射率渐变透镜12和第二折射率渐变透镜31，替代现有技术中由多个曲面透镜构成的复杂光学镜片聚焦结构，有效的缩小了光路传播的空间大小，且由于折射率渐变透镜的体积可控制在毫米量级，因此，本发明极大地缩小了单分子荧光检测***的体积和结构复杂度；通过将第二折射率渐变透镜31设置于非激发光束的光路上，暗场收集荧光光子，避免激发光束的光被第二折射率渐变透镜31收集，形成较大的本底噪声，容易淹没部分较弱的单分子荧光信号，提高单分子荧光信号的检测速度和精度；通过设置第二折射率渐变透镜31和检测光纤32，第二折射率渐变透镜31的前端对产生的荧光光子进行收集，荧光光子经第二折射率渐变透镜31的折射聚焦后，耦合到检测光纤32，检测光纤32的光纤口径的限制起到了光阑去噪的作用，即相当于现有共聚焦显微镜中的共聚焦针孔的作用，本申请利用第二折射率渐变透镜31和检测光纤32的组合实现了现有共聚焦显微镜的共聚焦作用，能够显著降低单分子荧光检测***的体积和成本；通过采用微流道的空间限制的方式使每次检测的样品体积内只存在一个分析物分子，然后通过统计得到待测液中荧光标记的待测分子的浓度、含量等信息，避免现有技术对待测液进行空间分割，避免延长检测时间。

综上，本发明在保证单分子荧光检测技术具有的超灵敏、高效率优点前提下，利用折射率渐变透镜极有效的简化了超敏荧光检测***，获得微型单分子荧光检测***。该微型***为全固态结构，***稳定，易于与其他功能模块集成，制作成本也远低于大型显微***，从而克服了现有单分子荧光检测装置复杂、设计难度大、不易维护和成本高的缺点。

在上述实施方式中，第一折射率渐变透镜12和第二折射率渐变透镜31均为具有两平面端面的圆柱结构，圆柱结构的中心为高折射率，从圆柱结构的中心沿径向方向向外折射率逐渐降低。

具体的，第一或第二折射率渐变透镜31径向方向上的折射率N(r)的公式为：

N(r)＝(0)(1-r²/2)

其中，N(0)为折射率渐变透镜中心的折射率，r为折射率渐变透镜的半径，A为折射率渐变透镜的折射率分布常数的平方，径向半径r上任一点的折射率N(r)的曲线参考图2。第一折射率渐变透镜12的参数和第二折射率渐变透镜31的参数可以相同，也可以不相同。

上述折射率渐变透镜自聚焦的原理为：由于透镜介质折射率发生变化，导致进入透镜的光线规律的弯曲，进而使得光线能汇聚到一点。可以通过调解折射率渐变透镜的径向折射率的变化梯度来调解光线在折射率渐变透镜内部传播方向变化的剧烈程度，进而决定一束光在折射率渐变透镜内部变化一个周期的长度和径向变化的最大直径。

在一具体实施例中，第一折射率渐变透镜12的长度为四分之一节距的整数倍，光线在折射率渐变透镜中完成一个正选波周期变化的长度为节距，节距P满足以下关系式：

其中，Z为第一折射率渐变透镜12的长度。第一折射率渐变透镜12使经传导光纤11传输的平行光聚焦到第一折射率渐变透镜12的中心主轴上出射，如图3所示。

在一具体实施例中，第二折射率渐变透镜31的长度也为四分之一节距的整数倍，P也满足上述关系式，荧光光子平行入射第二折射率渐变透镜31，经第二折射率渐变透镜31折射后从第二折射率渐变透镜31的中心主轴上出射至检测光纤32。

在一具体实施例中，信号处理单元40包括单光子探测器、单光子计算器和数据处理模块，单光子探测器与检测光纤32相连接，单光子探测器将通过检测光纤32的单个荧光光子转化成TTL电信号，并送入单光子计数器，单光子计算器记录单个荧光光子到达的时间，数据处理模块将TTL电信号和单个荧光光子到达的时间处理成光强随时间的变化的信息，根据光强随时间的变化的信息计算通过微管路21的荧光标记物信息。在本发明中，由于单分子从时间上分立的通过微管路21，因此，TTL电信号是TTL电平脉冲信号，在时间上显示为脉冲的光强包络。

在一具体实施例中，根据光强随时间的变化的信息计算通过微管路21的荧光标记物信息，包括以下过程：

1)根据光强随时间的变化的信息计算计算单位时间内获得的光强包络数目，光强包络数目即代表荧光标记物数量。

2)根据单位时间内获得的光强包络数目计算待测液中荧光标记物的浓度。待测液中荧光标记物的浓度c的计算公式为：c＝N/Q，其中，N为单位时间内测得的光强包络数目，Q为流量。流量Q可通过流量计测量或观察一定体积液体通过微管路21的体积计算得到。

具体的，单光子探测器可使用光子计数PMT、硅光电倍增管、单光子计数APD或单光子计数MPPC等。单光子计数器可利用高速FPGA实时数据传输程序模块实现或使用时间数字转换卡实现。

参考图4，在一具体实施例中，待测液单元20包括微管路21、废液池和泵，泵驱动待测液进入微管路21，并经微管路21流入废液池，所有待测液均通过微管路21，则可获得待测液中的所有荧光标记物数目。

参考图5，在一具体实施例中，微管路21为毛细管，毛细管的直径可根据实际需要探测的荧光标记物的尺寸来确定，毛细管相比芯片易获取，且成本低。当然，微管路21也可以为其它各种类型、材质的微尺寸通道。

继续参考图5，进一步的，待测液单元20包括透明基底22，透明基底22内设有微管路21，液体管路通过转接头23与微管路21相连接。

进一步的，在一具体实施例中，透明基底22的材料为PDMS材料，当然，也可以为其它透光材料，例如二氧化硅、石英等。

在一具体实施例中，微管路21的直径为1μm～50μm，可以检测直径范围为5nm～10μm的荧光检测完。在一具体实施例中，微管路21为边长为4μm～10μm的方形管路，可以使得20nm左右直径的PS荧光小球在压力的作用下单个通过微管路21。

在一具体实施例中，第二折射率渐变透镜31的靠近检测光纤32的端面上设置有长通滤光薄膜，长通滤光薄膜用来透过长于截止波长的光，以去除进入的激发光的噪声光线，提高信噪比。

在一具体实施例中，荧光激发单元10还包括反射镜13，且反射镜13的出射面设置有带通滤光薄膜，反射镜13设置于第一折射率渐变透镜12的远离传导光纤11的一端，反射镜13用于将从第一折射率渐变透镜12出射的激发光束弯折，使得激发光束的光路方向沿待测液流动方向，带通滤光薄膜用于过滤激发光束中的杂光，杂光主要由激光经过的组件产生。

在一具体实施例中，传导光纤11为单模光纤，主要传输单一波长的激发光束。

在一具体实施例中，检测光纤32为多模光纤，激发光束激发荧光标记物产生的荧光光子为多波长的荧光光子，采用多模光纤可以收集一定波长范围内的荧光光子。检测光纤32的光纤口径可随共聚焦视场大小来决定。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种单分子荧光检测***，其特征在于，包括荧光激发单元、待测液单元、荧光收集单元和信号处理单元；

所述荧光激发单元包括激光器、传导光纤和第一折射率渐变透镜，所述激光器产生的激光光束经所述传导光纤传导至所述第一折射率渐变透镜，经所述第一折射率渐变透镜聚焦后得到用于激发待测液产生荧光的激发光束；

所述待测液单元包括微管路，所述微管路允许单分子通过，待测液通过所述微管路，所述激发光束照射所述微管路，激发位于所述微管路中的单分子荧光标记物发出荧光光子；

所述荧光收集单元包括第二折射率渐变透镜和检测光纤，所述第二折射率渐变透镜设置于非所述激发光束的光路上，暗场收集所述荧光光子，所述荧光光子经所述第二折射率渐变透镜聚焦后传导至所述检测光纤；

所述检测光纤与所述信号处理单元相连接，所述信号处理单元对通过所述检测光纤的所述荧光光子进行处理得到所述荧光标记物的信息。

2.根据权利要求1所述的单分子荧光检测***，其特征在于，所述信号处理单元包括单光子探测器、单光子计算器和数据处理模块，所述单光子探测器与所述检测光纤相连接，所述单光子探测器将通过所述检测光纤的单个荧光光子转化成TTL电信号，并送入所述单光子计数器，所述单光子计算器记录单个荧光光子到达的时间，所述数据处理模块将所述TTL电信号和所述单个荧光光子到达的时间处理成光强随时间的变化的信息，根据所述光强随时间的变化的信息计算通过所述微管路的所述荧光标记物的信息。

3.根据权利要求1所述的单分子荧光检测***，其特征在于，所述单光子探测器为光子计数PMT、硅光电倍增管、单光子计数APD或单光子计数MPPC；

所述单光子计数器为高速FPGA实时数据传输程序模块或时间数字转换卡。

4.根据权利要求1所述的单分子荧光检测***，其特征在于，所述微管路为毛细管。

5.根据权利要求1或4所述的单分子荧光检测***，其特征在于，所述待测液单元还包括泵和废液池，所述泵驱动所述待测液进入所述微管路，并经所述微管路流入所述废液池。

6.根据权利要求1所述的单分子荧光检测***，其特征在于，所述待测液单元包括透明基底，所述透明基底内设有所述微管路。

7.根据权利要求1所述的单分子荧光检测***，其特征在于，所述第二折射率渐变透镜的靠近所述检测光纤的端面上设置有长通滤光薄膜。

8.根据权利要求7所述的单分子荧光检测***，其特征在于，所述荧光激发单元还包括反射镜，且所述反射镜的出射面设置有带通滤光薄膜，所述反射镜设置于所述第一折射率渐变透镜的远离所述传导光纤的一端，所述反射镜用于将从所述第一折射率渐变透镜出射的所述激发光束弯折，所述带通滤光薄膜用于过滤所述激发光束中的杂光。

9.根据权利要求1所述的单分子荧光检测***，其特征在于，所述传导光纤为单模光纤。

10.根据权利要求1所述的单分子荧光检测***，其特征在于，所述检测光纤为多模光纤。

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