CN115927629A

CN115927629A - 一种尿液脱落细胞膀胱癌多靶点甲基化基因检测试剂及方法

Info

Publication number: CN115927629A
Application number: CN202211280264.8A
Authority: CN
Inventors: 肖国伟; 龚伟伟
Original assignee: Shanghai Changdao Antibody Diagnostic Reagent Co ltd
Current assignee: Shanghai Changdao Antibody Diagnostic Reagent Co ltd
Priority date: 2022-10-19
Filing date: 2022-10-19
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明提供一种尿液脱落细胞膀胱癌多靶点甲基化基因检测试剂及方法。本发明公开了一种诊断膀胱癌或膀胱癌前病变、筛查膀胱癌形成或形成的风险或评估膀胱癌进展或预后的试剂，所述试剂包含检测对象样本中的DNA序列或其片段或其中一个或多个CpG二核苷酸甲基化水平的试剂，所述DNA序列包括以下基因序列中的一种或多种或全部：SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1。本发明的方法、试剂盒和***提供了一种早期筛查膀胱癌患者的非创伤性、低成本、高效益、高灵敏度的方法。

Description

一种尿液脱落细胞膀胱癌多靶点甲基化基因检测试剂及方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种尿液脱落细胞膀胱癌多靶点甲基化基因检测试剂及方法。

背景技术

膀胱癌是最常见的泌尿***恶性肿瘤，也是男性癌症死亡的主要原因之一。膀胱癌分为非肌层浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)。大多数膀胱癌(80％)为NMIBC，即癌位于膀胱内层的细胞，级别较低，早期诊断，易于治疗，而转入肌肉侵袭性MIBC，发展到晚期预后极差。膀胱癌如果能在早期做出诊断，病人的5年存活率将高达95％，而当膀胱癌形成多处扩散，或远处传播则5年生存率仅49％。

膀胱癌是一种高复发率的肿瘤，70％病人复发，是实体肿瘤中复发率最高的肿瘤，约25％的病人复发最后发展为MIBC，患者术后通常每年需进行3～4次膀胱镜检查。由于术后需持续的复查随访及高复发率，使得膀胱癌成为诊治费用最高的癌种。

膀胱癌高复发还存进一步恶化的风险，早诊断，早治疗，以及术后的监测对提高膀胱癌患者生存率十分重要。如何早发现以及术后如何早监测到***的复发具有非常重要的临床意义。

膀胱镜检查是诊断膀胱癌的金标准。将膀胱镜***患者尿道显示膀胱壁，对可疑病变进行组织活检。该技术有侵入性，属创伤性检查，常导致病人疼痛和不适，接受程度低，费用高，其结果还会受操作者主观判断带来一定的误差，有高达10％的漏诊率，且在肿瘤早期难以做出诊断。因此，膀胱镜检查不适用于筛查膀胱癌高风险人群。

目前无创性膀胱癌检测方法有：尿液脱落细胞学、荧光原位杂交(FISH)、***标志物(如NMP22和BTA)检测等。但这些传统的膀胱癌检测方法均存在不足，敏感性和特异性不高，容易出现漏诊和误诊，难以满足临床需求。

尿脱落细胞学检查作为一种常见的非侵入性检查，对高级别膀胱癌的特异性高，但对低级别膀胱癌敏感性低，仅为17％。细胞学检查必须由专业的病理学家或细胞学家进行，根据他们的经验判断尿液中是否有癌细胞，且由于炎症或放化疗影响会有一定的假阳性率。尿液细胞学检查的灵敏度不高，阳性率较低，临床检出率低及准确性差等不足给临床实际应用带来不便。

荧光原位杂交(FISH)技术检测尿液中脱落细胞，利用DNA探针识别3、7、17染色体的非整数倍体以及检测9p21位点上的p16抑癌基因的丢失。UroVysion(雅培公司)荧光原位杂交已广泛用于膀胱癌的常规临床检测，灵敏度可达60-80％，但对低级别或微小膀胱癌的灵敏度较低。

血尿是膀胱癌病人最常见的症状，但在接受膀胱镜检查的血尿患者中，只有3-23％的人被最终诊断为膀胱癌。出现血尿并不一定表明患有膀胱癌，在剧烈的活动后或食用某些食物或服用药物(如利福平和非那吡啶等)后，可以观察到粉红色或红色的尿液。在低风险患者中使用这种侵入性检查存在过度使用。美国每年有23万例患者接受了不必要的膀胱镜检查。因此，临床上需要更好地筛查患者以减少不必要的膀胱镜检查，无创、高灵敏、高特异性是未来检测和监控膀胱癌的发展方向。

近年来，基因诊断在人类多种肿瘤的早诊以及预后评估中受到广泛重视。对膀胱癌相关基因的研究，亦使得通过检测尿液脱落细胞癌源性DNA辅助诊断膀胱癌成为一种可能。

DNA甲基化是一种在DNA序列中的胞嘧啶核苷酸上发生的甲基(-CH3)修饰。在正常细胞，位于特定启动子区域的富含CpG部分(CpG岛)通常未甲基化，基因得以转录，而该区域发生甲基化往往导致基因沉默。基因甲基化与人类发育、基因转录调节、遗传印记和肿瘤疾病的密切关系，特别是CpG岛异常甲基化与肿瘤抑癌基因的转录失活有关。异常DNA甲基化是肿瘤发生过程中最早也是最常见的表观遗传学变化之一，可以在癌前病变中检测到。

迄今为止，已发现有超过1000多个基因高甲基化与癌症有关。近年来DNA甲基化标志物被广泛应用于恶性肿瘤的诊断和预后评估。由于异常DNA甲基化发生在癌前或者癌症早期阶段，因此已成为癌症早期诊断的理想标志物，可作为设计肿瘤诊断试剂的基础。

同所有其他肿瘤一样，异常DNA甲基化在膀胱癌中亦多见。膀胱癌一般发生在膀胱上皮组织中，先向膀胱内生长，在其生长过程中，不断地有肿瘤细胞脱落至膀胱内并随着尿液排出。由于肿瘤细胞比正常细胞更新速度快，粘附力差更易脱落，并可在尿液中收集(尿液沉积物)，因此检测尿沉渣中的肿瘤细胞成分就可以提供一种无创的膀胱癌筛查诊断方法。通过检测脱落细胞DNA中独特的癌源性甲基化DNA标记物，可以判断出尿液样本中是否存在膀胱癌细胞。

尿脱落细胞DNA甲基化检测作为一种无创伤，非侵入性(只需患者尿液)诊断膀胱癌的方法，其敏感性远高于细胞学检查，可用于膀胱癌的早期辅助诊断和疾病监测，且特别适合复发率很高的膀胱癌的诊断与随访。欧洲临床使用的膀胱癌EpiCheck通过检测相关基因位点是否甲基化来判断NMIBC复发，在多中心大样本研究中显示敏感性为67％，特异性为88％。

膀胱癌无创检测的关键在于寻找高灵敏高特异性生物标记物。由于膀胱癌发生机制多样性，不同膀胱癌中检出发生异常甲基化的基因也不尽相同，存在很大差异。目前已报道的膀胱癌相关甲基化基因多达120种以上，单个甲基化基因敏感性普遍不高，至今仍无比较满意的膀胱癌特有甲基化基因。

发明内容

本发明的目的在于提供新的膀胱癌标志物(尿液标志物)。本发明的检测方法采用多靶点基因联合检测，在每个标志物的特异性都比较高的前提下，使用多个标志物联用的方式来提高检测所需的敏感性和特异性。这些特定的DNA标记物包括SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1基因中CpG岛胞嘧啶甲基化。

本发明第一方面提供诊断膀胱癌或膀胱癌前病变、筛查膀胱癌形成或形成风险、评估膀胱癌进展或预后的试剂，所述试剂包含检测一个或多个目标标志物的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平的试剂，所述一个或多个目标标志物包括基因或其片段，所述基因包括选自以下的1、2、3、4、5或全部6种：SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1。

在一个或多个实施方案中，所述基因包括选自以下的至少2种：SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1。

在一个或多个实施方案中，所述基因包括ZNF671以及选自以下的至少1种：SOX1、HOXA9、VIM、IRAK3和RASSF1。

在一个或多个实施方案中，所述基因包括SOX1和ZNF671，任选还包含选自以下的至少1种：HOXA9、VIM、IRAK3和RASSF1。在一些这样的实施方案中，所述基因包含SOX1、HOXA9和ZNF671。在一些这样的实施方案中，所述基因包含SOX1、HOXA9、ZNF671和VIM。在一些这样的实施方案中，所述基因包含SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM和IRAK3。在一些这样的实施方案中，所述基因包含SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM和RASSF1。在一些这样的实施方案中，所述基因包含SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1。

在一个或多个实施方案中，所述基因包括HOXA9和ZNF671，任选还包含选自以下的至少1种：SOX1、VIM、IRAK3和RASSF1。在一些这样的实施方案中，所述基因包含HOXA9、ZNF671、IRAK3、RASSF1。在一些这样的实施方案中，所述基因包含HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3。在一些这样的实施方案中，所述基因包含HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3、RASSF1。在一些这样的实施方案中，所述基因包含HOXA9、ZNF671、RASSF1。

在一个或多个实施方案中，所述基因包括ZNF671、VIM和RASSF1，任选还包含选自以下的至少1种：SOX1、HOXA9和IRAK3。在一些这样的实施方案中，所述基因包含ZNF671、VIM、IRAK3、RASSF1。

在一个或多个实施方案中，所述基因包括HOXA9以及选自以下的一种多种：SOX1、VIM、RASSF1。在一些这样的实施方案中，所述基因包含SOX1、HOXA9。在一些这样的实施方案中，所述基因包含SOX1、HOXA9、RASSF1。在一些这样的实施方案中，所述基因包含SOX1、HOXA9、VIM、RASSF1。在一些这样的实施方案中，所述基因包含HOXA9、RASSF1。

在一个或多个这样的实施方案中，所述基因包含选自以下的任一组：

(1)SOX1和ZNF671，

(2)SOX1、HOXA9和ZNF671，

(3)SOX1、HOXA9、ZNF671和VIM，

(4)SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM和IRAK3，

(5)SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM和RASSF1，

(6)SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1。

(7)HOXA9和ZNF671，

(8)HOXA9、ZNF671、IRAK3和RASSF1，

(9)HOXA9、ZNF671、VIM和IRAK3，

(10)HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1，

(11)HOXA9、ZNF671和RASSF1，

(12)ZNF671、VIM和RASSF1，

(13)ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1。

(14)SOX1和HOXA9，

(15)SOX1、HOXA9和RASSF1，

(16)SOX1、HOXA9、VIM和RASSF1，

(17)HOXA9和RASSF1。

在一个或多个实施方案中，所述膀胱癌是MIBC，所述基因包括ZNF671以及选自以下的至少1种：SOX1、HOXA9、VIM、IRAK3和RASSF1，在一些这样的实施方案中，所述基因包含SOX1和ZNF671，任选还包含选自HOXA9、VIM和IRAK3中的一种或多种；在一些这样的实施方案中，所述基因包含HOXA9和ZNF671，任选还包含IRAK3和RASSF1中的一种或多种；在一些这样的实施方案中，所述基因包含ZNF671、VIM，任选还包含IRAK3和RASSF1中的一种或多种；在一些这样的实施方案中，所述基因包含HOXA9、RASSF1。

在一个或多个实施方案中，所述膀胱癌是MIBC，所述基因包含选自以下的任一组：

(1)SOX1和ZNF671，

(2)SOX1、HOXA9和ZNF671，

(3)SOX1、HOXA9、ZNF671和VIM，

(4)SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM和IRAK3，

(5)HOXA9、ZNF671和RASSF1，

(6)HOXA9、ZNF671、IRAK3和RASSF1，

(7)ZNF671、VIM和RASSF1，

(8)ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1，

(9)HOXA9和RASSF1。

在一个或多个实施方案中，所述膀胱癌是NMIBC，所述基因包括HOXA9以及选自以下的至少1种：SOX1、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1。

在一个或多个实施方案中，所述膀胱癌是NMIBC，所述基因包含HOXA9和SOX1，任选还包含选自ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1中的一种或多种；在一些实施方案中，所述基因包含HOXA9、SOX1和ZNF671，任选还包含选自VIM、IRAK3和RASSF1中的一种或多种；在一些实施方案中，所述基因包含HOXA9、SOX1、ZNF671、VIM，任选还包含选自IRAK3和RASSF1中的一种或多种；在一些实施方案中，所述基因包含HOXA9、ZNF671，任选还包括选自VIM、IRAK3、RASSF1中的一种或多种；在一些实施方案中，所述基因包含HOXA9、ZNF671、VIM，任选还包括选自IRAK3、RASSF1中的一种或多种；在一些实施方案中，所述基因包含HOXA9、RASSF1。

在一个或多个实施方案中，所述膀胱癌是NMIBC，所述基因包含选自以下的任一组：

(1)HOXA9、SOX1，

(2)HOXA9、SOX1、ZNF671，

(3)HOXA9、SOX1、ZNF671、VIM，

(4)HOXA9、SOX1、ZNF671、VIM、RASSF1，

(5)HOXA9、SOX1、ZNF671、VIM、IRAK3、RASSF1，

(6)HOXA9、SOX1、RASSF1，

(7)HOXA9、SOX1、VIM、RASSF1，

(8)HOXA9、ZNF671，

(9)HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3，

(10)HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3、RASSF1，

(11)HOXA9、RASSF1。

在一个或多个实施方案中，所述片段是所述基因序列的包含CpG岛的片段。

在一个或多个实施方案中，所述的片段长度为1-1000bp，优选1-700bp。

在一个或多个实施方案中，所述片段是基因序列的启动子区域。

在一个或多个实施方案中，所述片段包含至少1个，优选至少3个CpG二核苷酸。

在一个或多个实施方案中，所述试剂是与所述目标标志物或它们经转化的序列杂交的引物分子。所述引物分子能扩增出所述目标标志物或它们经转化的变体。在一个或多个实施方案中，所述引物序列为甲基化特异的。所述引物分子至少9bp。

在一个或多个实施方案中，所述引物具有选自以下任1、2、3、4、5组或全部6组的序列：(1)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，(2)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，(3)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，(4)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，(5)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，(6)SEQID NO:11和SEQ ID NO:12。

在一个或多个实施方案中，所述试剂是与所述目标标志物或它们经转化的序列杂交的检测探针。在一个或多个实施方案中，所述检测探针还含有可检测物。在一个或多个实施方案中，所述可检测物是5’端荧光报告基团和3’端标记淬灭基团。优选地，所述可检测物选自FAM、HEX、ROX、CY5中的一种或多种或全部。

在一个或多个实施方案中，所述检测探针是特异性荧光标记的探针，所述检测探针具有SEQ ID NO:15-20中任一项或多项或全部所示的序列。

在一个或多个实施方案中，所述样品来自哺乳动物，优选人。优选地，所述样品来自哺乳动物的尿液。

本发明第二方面还提供物质在制备用于诊断膀胱癌或膀胱癌前病变、筛查膀胱癌形成或形成风险、评估膀胱癌进展或预后的试剂盒中的用途，所述物质包含：

(a)用于确定对象样品中一个或多个目标标志物的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平的试剂或装置，和

任选的(b)所述目标标志物经处理的核酸分子，所述处理使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，

任选的(c)，处理DNA的转化试剂，其中所述转化试剂能够区分所述DNA中的未甲基化位点和甲基化位点，例如将能够未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，

所述一个或多个目标标志物包括基因或其片段，所述基因包括选自以下的1、2、3、4、5或全部6种：SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1。在一个或多个实施方案中，所述目标标志物或基因如本文第一方面所述。

在一个或多个实施方案中，所述基因包含选自以下的任一组：(1)SOX1和ZNF671，(2)SOX1、HOXA9和ZNF671，(3)SOX1、HOXA9、ZNF671和VIM，(4)SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM和IRAK3，(5)SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM和RASSF1，(6)SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1。(7)HOXA9和ZNF671，(8)HOXA9、ZNF671、IRAK3和RASSF1，(9)HOXA9、ZNF671、VIM和IRAK3，(10)HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1，(11)HOXA9、ZNF671和RASSF1，(12)ZNF671、VIM和RASSF1，(13)ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1。(14)SOX1和HOXA9，(15)SOX1、HOXA9和RASSF1，(16)SOX1、HOXA9、VIM和RASSF1，(17)HOXA9和RASSF1。

在一个或多个实施方案中，所述膀胱癌是MIBC，所述基因包含选自以下的任一组：(1)SOX1和ZNF671，(2)SOX1、HOXA9和ZNF671，(3)SOX1、HOXA9、ZNF671和VIM，(4)SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM和IRAK3，(5)HOXA9、ZNF671和RASSF1，(6)HOXA9、ZNF671、IRAK3和RASSF1，(7)ZNF671、VIM和RASSF1，(8)ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1，(9)HOXA9和RASSF1。

在一个或多个实施方案中，所述膀胱癌是NMIBC，所述基因包含选自以下的任一组：(1)HOXA9、SOX1，(2)HOXA9、SOX1、ZNF671，(3)HOXA9、SOX1、ZNF671、VIM，(4)HOXA9、SOX1、ZNF671、VIM、RASSF1，(5)HOXA9、SOX1、ZNF671、VIM、IRAK3、RASSF1，(6)HOXA9、SOX1、RASSF1，(7)HOXA9、SOX1、VIM、RASSF1，(8)HOXA9、ZNF671，(9)HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3，(10)HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3、RASSF1，(11)HOXA9、RASSF1。

在一个或多个实施方案中，(a)所述试剂包含引物分子和/或探针分子。

在一个或多个实施方案中，(a)所述试剂包含与所述目标标志物或它们经转化的序列杂交的引物分子。所述引物分子能扩增出所述目标标志物或它们经转化的变体。在一个或多个实施方案中，所述引物序列为甲基化特异的。所述引物分子至少9bp。在一个或多个实施方案中，针对SOX1或其片段的引物具有SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示的序列；针对HOXA9或其片段的引物具有SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4所示的序列；针对ZNF671或其片段的引物具有SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6所示的序列；针对VIM或其片段的引物具有SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8所示的序列；针对IRAK3或其片段的引物具有SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10所示的序列；针对RASSF1或其片段的引物具有SEQ ID NO:11和/或SEQID NO:12所示的序列。

在一个或多个实施方案中，(a)所述试剂包含与所述目标标志物或它们经转化的序列杂交的检测探针。在一个或多个实施方案中，所述检测探针还含有可检测物。在一个或多个实施方案中，所述可检测物是5’端荧光报告基团和3’端标记淬灭基团。优选地，所述可检测物选自FAM、HEX、ROX、CY5中的一种或多种或全部。

在一个或多个实施方案中，针对SOX1或其片段的检测探针具有SEQ ID NO:15所示的序列；针对HOXA9或其片段的检测探针具有SEQ ID NO:16所示的序列；针对ZNF671或其片段的检测探针具有SEQ ID NO:17所示的序列；针对VIM或其片段的检测探针具有SEQ IDNO:18所示的序列；针对IRAK3或其片段的检测探针具有SEQ ID NO:19所示的序列；针对RASSF1或其片段的检测探针具有SEQ ID NO:20所示的序列。

在一个或多个实施方案中，针对SOX1或其片段的检测探针具有可检测物FAM；针对HOXA9或其片段的检测探针具有可检测物HEX；针对ZNF671或其片段的检测探针具有可检测物ROX；针对VIM或其片段的检测探针具有可检测物FAM；针对IRAK3或其片段的检测探针具有可检测物HEX；针对RASSF1或其片段的检测探针具有可检测物ROX。

在一个或多个实施方案中，(c)所述转化试剂包含亚硫酸氢盐试剂。更优选地，所述转化试剂包含：亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢根离子，及其任意组合。

在一个或多个实施方案中，所述对象是哺乳动物，优选人。

在一个或多个实施方案中，所述样品来自哺乳动物的尿液样品。

在一个或多个实施方案中，所述样品包括基因组DNA。

在一个或多个实施方案中，所述目标标志物经转化，其中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。所述转化使用亚硫酸氢盐试剂进行，优选用亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢根离子，及其任意组合处理。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括PCR反应试剂。优选地，所述PCR反应试剂包括DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP、Mg²⁺。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括检测DNA甲基化的其他试剂，所述其他试剂是选自以下方法中的一个或多个所用的试剂：基于重亚硫酸盐转化的PCR(例如甲基化特异性PCR)、DNA测序(如亚硫酸氢盐测序、全基因组甲基化测序、简化甲基化测序)、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱(例如飞行质谱)。优选地，所述其他试剂选自以下一种或多种：重亚硫酸盐、亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐或焦亚硫酸盐或其衍生物，荧光染料，荧光淬灭剂，荧光报告剂，内标，对照物。

在一个或多个实施方案中，PCR的反应液包含Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTPs、KCl、MgCl₂和(NH₄)₂SO₄。优选地，Taq DNA聚合酶为热启动Taq DNA聚合酶。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括样本处理试剂，包括尿液保存液和/或DNA提取试剂。尿液保存液含有乙二胺四乙酸(EDTA)，任选还含有抗生素。DNA提取试剂包括QIAamp mini DNA Kits、PBS或TE。

本发明另外一方面还提供一种诊断膀胱癌或膀胱癌前病变、筛查膀胱癌形成或形成风险、评估膀胱癌进展或预后的方法，包括：(1)检测对象样品中的一种或多种目标标志物中的一个或多个CpG二核苷酸的甲基化水平，(2)将所述甲基化水平与对照比较，从而实现所述诊断、筛查和评估，所述一个或多个目标标志物包括基因或其片段，所述基因包括选自以下的1、2、3、4、5或全部6种：SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1。其中，若以下目标标志物的甲基化水平提高，则表明所述个体患有膀胱癌或膀胱癌前病变，或者所述个体有形成膀胱癌或膀胱癌病变的风险，或者所述个体的膀胱癌预后不良。在一个或多个实施方案中，所述目标标志物或基因如本文第一和第二方面所述。

在一个或多个实施方案中，所述对照是健康对象的所述目标标志物的甲基化水平。

在一个或多个实施方案中，所述方法还包含DNA抽提和/或质检。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括使用本文所述的引物分子、检测探针进行所述检测。

在一个或多个实施方案中，(1)所述检测包括但不限于：基于重亚硫酸盐转化的PCR、DNA测序、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱。

在一个或多个实施方案中，所述样品来自哺乳动物的尿液样品。所述哺乳动物优选为人。

在一个或多个实施方案中，所述样品包括基因组DNA。

在一个或多个实施方案中，步骤(1)包括：用转化试剂处理样品中的所述目标标志物的步骤，使未甲基化的胞嘧啶转化为与鸟嘌呤结合能力低于胞嘧啶的碱基(尿嘧啶)，然后使用引物进行PCR扩增，所述引物适用于扩增所述目标标志物。

在一个或多个实施方案中，所述方法还包括用样品处理试剂处理尿液样品的步骤。样本处理试剂包括尿液保存液和/或DNA提取试剂。尿液保存液含有乙二胺四乙酸(EDTA)，任选还含有抗生素。DNA提取试剂包括QIAamp mini DNA Kits、PBS或TE。

在一个或多个实施方案中，所述方法包括：

(a)从个体尿液获取含有DNA的生物样品，

(b)用转化试剂处理步骤(a)中获取的所述生物样品中的DNA，所述试剂能够区分所述DNA中的未甲基化位点和甲基化位点，从而获得经转化试剂处理的DNA；优选地，用转化试剂处理所述DNA，使未甲基化的胞嘧啶转化尿嘧啶；所述转化试剂包括亚硫酸氢盐试剂，优选包括亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢根离子，及其任意组合，

(c)用荧光定量PCR扩增从步骤(b)获取的所述经处理的DNA中的至少一个目标标志物的至少一部分，所述一个或多个目标标志物包括基因或其片段，所述基因包括选自以下的1、2、3、4、5或全部6种：SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1；优选地，使用SEQ IDNO:1-12所述的引物和SEQ ID NO:15-20所述的探针进行所述荧光定量PCR扩增；更优选地，使用SEQ ID NO:1-14所述的引物和SEQ ID NO:15-21所述的探针进行所述荧光定量PCR扩增；

(d)从步骤(c)获取的DNA来分别定量分析所述至少一个目标标志物的甲基化水平；优选地，步骤(d)包括：通过扩增产物的有或无、或者序列鉴定(例如基于探针的PCR检测鉴定或DNA测序鉴定)确定至少一个CpG的甲基化水平，

(e)分别比较步骤(c)中的所述至少一个目标标志物的甲基化水平和相应的参考水平，实现所述诊断、筛查和评估；优选地，分别定量比较步骤(c)中的所述至少一个目标标志物的甲基化水平和相应的参考水平，其中一个或多个目标标志物相对于其相应的参考水平具有相同或更高的甲基化水平表明所述个体患有膀胱癌或膀胱癌前病变、或者所述个体有形成膀胱癌或膀胱癌前病变的风险、或者所述个体的膀胱癌预后不良。

在一个或多个实施方案中，使用SEQ ID NO:1-12所示的引物和SEQ ID NO:15-20所示的探针通过荧光定量PCR检测靶基因DNA，若检测到扩增信号则诊断对象患有肠癌或肠癌前病变。

本发明另一方面还提供诊断膀胱癌或膀胱癌前病变、筛查膀胱癌形成或形成风险、评估膀胱癌进展或预后的试剂盒，包含：

其中，所述一个或多个目标标志物包括基因或其片段，所述基因包括选自以下的1、2、3、4、5或全部6种：SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1。在一个或多个实施方案中，所述目标标志物或基因如本文第一和第二方面所述。

在一个或多个实施方案中，(b)用作阳性对照。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒适用于本文任一实施方案所述的用途。

在一个或多个实施方案中，(a)所述试剂包含引物分子和/或检测探针。

在一个或多个实施方案中，(a)所述试剂包含与所述目标标志物或它们经转化的序列杂交的引物分子。所述引物分子能扩增出所述目标标志物或它们经转化的变体。在一个或多个实施方案中，所述引物序列为甲基化特异的。所述引物分子至少9bp。在一个或多个实施方案中，所述引物具有选自以下任1、2、3、4、5组或全部6组的序列：(1)SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，(2)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，(3)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，(4)SEQID NO:7和SEQ ID NO:8，(5)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，(6)SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含扩增ATCB的引物，例如SEQ ID NO:13和14所示。

在一个或多个实施方案中，(a)所述试剂包含与所述目标标志物或它们经转化的序列杂交的检测探针。在一个或多个实施方案中，所述检测探针还含有可检测物。在一个或多个实施方案中，所述可检测物是5’端荧光报告基团和3’端标记淬灭基团。优选地，所述可检测物选自FAM、HEX、ROX、CY5中的一种或多种或全部。在一个或多个实施方案中，所述检测探针是特异性荧光标记的探针，所述检测探针具有SEQ ID NO:15-20中任一项或多项或全部所示的序列。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含与ATCB杂交的检测探针，例如SEQID NO:21所示。

在一个或多个实施方案中，针对SOX1或其片段的检测探针具有可检测物FAM；针对HOXA9或其片段的检测探针具有可检测物HEX；针对ZNF671或其片段的检测探针具有可检测物ROX；针对VIM或其片段的检测探针具有可检测物FAM；针对IRAK3或其片段的检测探针具有可检测物HEX；针对RASSF1或其片段的检测探针具有可检测物ROX，针对ATCB的探针具有可检测物CY5。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒包含第一容器和第二容器，其中第一容器含有针对基因SOX1、HOXA9、ZNF671和任选的ACTB的引物和检测探针，第二容器含有针对基因VIM、IRAK3、RASSF1和任选的ACTB的引物和检测探针。优选地，第一容器含有SEQ ID NO:1-6所示的引物和15-17所示的检测探针，第二容器含有SEQ ID NO:7-12所示的引物和18-20所示的检测探针；更优选地，第一容器和第二容器还分别含有SEQ ID NO:13和14所示的引物和21所示的检测探针。

在一个或多个实施方案中，所述对象是哺乳动物，优选人。

在一个或多个实施方案中，所述样品是尿液样品。

在一个或多个实施方案中，所述样品包括基因组DNA。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包含处理DNA的转化试剂，其中所述转化试剂能够区分所述DNA中的未甲基化位点和甲基化位点。在一个或多个实施方案中，所述转化试剂使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。优选地，所述转化试剂包含亚硫酸氢盐试剂。更优选地，所述转化试剂包含：亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢根离子，及其任意组合。

在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括检测DNA甲基化的试剂，所述试剂是选自以下方法的一个或多个中所用的试剂：基于重亚硫酸盐转化的PCR(例如甲基化特异性PCR)、DNA测序(如亚硫酸氢盐测序、全基因组甲基化测序、简化甲基化测序)、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱(例如飞行质谱)。优选地，所述试剂选自以下一种或多种：重亚硫酸盐及其衍生物、荧光染料、荧光淬灭剂、荧光报告剂、内标、对照物。

具体实施方式

应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。

本发明针对目前膀胱癌无创检测方法灵敏度和特异性较低或侵入性强且有潜在损伤等问题，提供一种用甲基化基因组合诊断膀胱癌或筛查膀胱癌高危人群的分子检测方法。具体地，本发明采用多靶点甲基化基因检测尿液中与膀胱以及膀胱癌前病变相关的DNA标记物，这些特定DNA标记物包括SRY相关高迁移率族蛋白1(SRY-related HMG box 1，SOX1)、同源盒A9(homebox A9，HOXA9)、锌指蛋白671(ZNF671)、波形蛋白(Vimentin，VIM)、白介素1受体相关激酶1(interleukin-1receptor-associated kinase 1，IRAK1)、RAS相关区域家族1(ras-association domain family 1，RASSF1)基因中CpG岛胞嘧啶甲基化。同时选择ACTB作为检测内参基因，评估尿液人员DNA的质量。

本文中，“诊断”和“筛查”膀胱癌或膀胱癌前病变包括：鉴定个体是否患有膀胱癌或膀胱癌前病变，或者个体是否有形成膀胱癌或膀胱癌前病变的风险，或者个体的膀胱癌或膀胱癌前病变的可能性是否增加，或者个体是否有膀胱癌或膀胱癌前病变预后不良的风险。

如本文所用，术语“甲基化标志物”或“目标标志物”是指这样的目的核酸、基因区域或甲基化位点：其甲基化水平指示着膀胱癌或膀胱癌前病变。因此，“甲基化标志物”或“目标标志物”包括作为标记物的相应基因，其DNA序列或片段或它们经转化的序列，这些序列具有能指示膀胱癌的甲基化修饰。甲基化标志物应被认为包括其所有转录变体及其所有启动子和调控元件。另外，应当理解，甲基化标志物应既包括标志物或基因的正义链序列，也包括标志物或基因的反义链序列。本文所用的术语“甲基化标志物”被广泛地解释为既包括1)在生物样品或基因组DNA中发现的原始标志物(处于特定的甲基化)，也包括2)其经过处理的序列(例如亚硫酸氢盐转化后的对应区域)。亚硫酸氢盐转化后的对应区域与基因组序列中的目标标志物不同之处在于，一个或多个未甲基化的胞嘧啶残基被转化为尿嘧啶碱基、胸腺嘧啶碱基或在杂交行为上与胞嘧啶不同的其他碱基。

发明人的研究表明，膀胱癌的性质与以下基因(例如启动子区域)的甲基化有关：SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1中的一个或多个或全部。本发明提供了对样本的上述基因进行甲基化检测，实现膀胱癌筛查目的。

因此，本发明的方案基于如下事实：膀胱癌的性质至少与选自以下的至少2种目标标志物的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态或水平有关：SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF。

在一些实施方案中，所述目标标志物包括ZNF671以及选自以下的至少1种：SOX1、HOXA9、VIM、IRAK3和RASSF1。优选地，所述目标标志物包括SOX1和ZNF671，任选还包含选自以下的至少1种：HOXA9、VIM、IRAK3和RASSF1；或者所述目标标志物包括HOXA9和ZNF671，任选还包含选自以下的至少1种：SOX1、VIM、IRAK3和RASSF1；或者所述目标标志物包括ZNF671、VIM和RASSF1，任选还包含选自以下的至少1种：SOX1、HOXA9和IRAK3。在另一些实施方案中，所述目标标志物包括HOXA9以及选自以下的一种多种：SOX1、VIM、RASSF1。

在一个或多个实施方案中，所述目标标志物包含选自以下的任一组：(1)SOX1和ZNF671，(2)SOX1、HOXA9和ZNF671，(3)SOX1、HOXA9、ZNF671和VIM，(4)SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM和IRAK3，(5)SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM和RASSF1，(6)SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1，(7)HOXA9和ZNF671，(8)HOXA9、ZNF671、IRAK3和RASSF1，(9)HOXA9、ZNF671、VIM和IRAK3，(10)HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1，(11)HOXA9、ZNF671和RASSF1，(12)ZNF671、VIM和RASSF1，(13)ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1。(14)SOX1和HOXA9，(15)SOX1、HOXA9和RASSF1，(16)SOX1、HOXA9、VIM和RASSF1，(17)HOXA9和RASSF1。

在一个或多个实施方案中，所述膀胱癌是MIBC，所述目标标志物包含选自以下的任一组：(1)SOX1和ZNF671，(2)SOX1、HOXA9和ZNF671，(3)SOX1、HOXA9、ZNF671和VIM，(4)SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM和IRAK3，(5)HOXA9、ZNF671和RASSF1，(6)HOXA9、ZNF671、IRAK3和RASSF1，(7)ZNF671、VIM和RASSF1，(8)ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1，(9)HOXA9和RASSF1。

在一个或多个实施方案中，所述膀胱癌是NMIBC，所述目标标志物包含选自以下的任一组：(1)HOXA9、SOX1，(2)HOXA9、SOX1、ZNF671，(3)HOXA9、SOX1、ZNF671、VIM，(4)HOXA9、SOX1、ZNF671、VIM、RASSF1，(5)HOXA9、SOX1、ZNF671、VIM、IRAK3、RASSF1，(6)HOXA9、SOX1、RASSF1，(7)HOXA9、SOX1、VIM、RASSF1，(8)HOXA9、ZNF671，(9)HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3，(10)HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3、RASSF1，(11)HOXA9、RASSF1。

SRY相关高迁移率族蛋白1(SRY-related HMG box 1，SOX1)位于2号染色体，具有调控神经***及晶状体发育等作用。SOX1在多种肿瘤组织中因甲基化水平上升而呈低表达，能够调控肿瘤的增殖、侵袭与转移能力，且在调节肿瘤干细胞的分化过程中起着重要的作用。

同源盒A1(homebox A1，HOXA9)基因位于7号染色体，编码一个DNA结合转录因子，它可以调节基因的表达、形态发生和分化。近年来研究发现此基因与癌症的发生密切相关。在一些具体实施方案中，HOXA9的甲基化对尿液中脱落细胞中的膀胱癌具有80％的敏感性。

锌指蛋白671(ZNF671)被认为与大肠癌、***、鼻咽癌等恶性肿瘤相关。ZNF671是一种潜在的肿瘤抑制因子，其下调通过促进细胞周期进展来促进癌细胞增殖和致瘤性，其表观遗传通过癌症中的启动子甲基化沉默。90％的膀胱癌患者在尿液脱落细胞中检出有甲基化ZNF671。

波形蛋白(Vimentin，VIM)基因位于10号染色体，编码细胞骨架的一种蛋白质。VIM被认为是间充质来源细胞和癌细胞在侵袭和转移过程中经历上皮-间充质转化的生物标记物。60％的膀胱癌患者在尿液脱落细胞中检出有甲基化VIM。

白介素1受体相关激酶1(interleukin-1receptor-associated kinase 1，IRAK1)位于X染色体上，IRAK-1通过负反馈调节抑制NF-kB信号通路，从而抑制癌细胞系的侵袭和转移。IRAK1甲基化在膀胱癌组中的敏感性为40％-50％。

RAS相关区域家族1(ras-association domain family 1，RASSF1)基因位于染色体3p21.3，在包括肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、膀胱癌等常见肿瘤细胞系和癌组织中转录表达异常下调，启动子高甲基化，且点突变率极低。在膀胱癌尿液脱落细胞样本中，DNA甲基化率为40％。

本文中，术语“基因”包括所涉基因在其基因组上的编码序列和非编码序列。其中非编码序列包括内含子、启动子和调节元件或序列等。

在一个或多个实施方案中，膀胱癌与上述基因片段的甲基化有关。所述片段长度1bp-1kb，优选1bp-700bp；所述片段包含相应基因染色体区域中的一个或多个甲基化位点。所述片段例如是上述基因的启动子区域。通常，转录起始位点为启动子区。在一些实施方案中，检测的片段中含有至少3个CpG二核苷酸。在示例性的方法中，使用基于重亚硫酸盐转化的PCR检测上述基因或其片段的甲基化水平。

因此，本发明涉及检测DNA甲基化的试剂。本领域周知检测DNA甲基化方法中所用的试剂。在涉及DNA扩增(例如PCR)的检测方法中，检测DNA甲基化的试剂包括引物。本文所述“引物”是指在核苷酸聚合作用起始时，引导合成的一种具有特定核苷酸序列的核酸分子。引物通常至少9bp。引物序列可为甲基化特异的或非特异的。通常，引物被设计为扩增的产物长度为1-2000bp、10-1000bp、30-900bp、40-800bp、50-700bp、或至少150bp、至少140bp、至少130bp、至少120bp。示例性的实施方案中，针对SOX1或其片段的引物具有SEQ IDNO:1和/或SEQ ID NO:2所示的序列；针对HOXA9或其片段的引物具有SEQ ID NO:3和/或SEQID NO:4所示的序列；针对ZNF671或其片段的引物具有SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6所示的序列；针对VIM或其片段的引物具有SEQ ID NO:7和/或SEQ ID NO:8所示的序列；针对IRAK3或其片段的引物具有SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10所示的序列；针对RASSF1或其片段的引物具有SEQ ID NO:11和/或SEQ ID NO:12所示的序列。

检测DNA甲基化的试剂还可包括与待测序列杂交的检测探针。通常，检测探针的序列的5’端标记荧光报告基团，3’端标记淬灭基团。本文所述“杂交”主要指在严谨条件下的核酸序列配对。示例性严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。在示例性实施方案中，针对SOX1或其片段的检测探针具有SEQ ID NO:15所示的序列；针对HOXA9或其片段的检测探针具有SEQ ID NO:16所示的序列；针对ZNF671或其片段的检测探针具有SEQ ID NO:17所示的序列；针对VIM或其片段的检测探针具有SEQID NO:18所示的序列；针对IRAK3或其片段的检测探针具有SEQ ID NO:19所示的序列；针对RASSF1或其片段的检测探针具有SEQ ID NO:20所示的序列。检测探针可以是特异性荧光标记的探针(例如TaqMan探针)，示例性地，针对SOX1或其片段的检测探针具有可检测物FAM；针对HOXA9或其片段的检测探针具有可检测物HEX；针对ZNF671或其片段的检测探针具有可检测物ROX；针对VIM或其片段的检测探针具有可检测物FAM；针对IRAK3或其片段的检测探针具有可检测物HEX；针对RASSF1或其片段的检测探针具有可检测物ROX。

如本文所述，DNA或RNA的碱基之间可发生转化。本文所述“转化”、“胞嘧啶转化”或“CT转化”是利用非酶促方法处理DNA，将未修饰的胞嘧啶碱基(cytosine,C)转化为与鸟嘌呤结合能力低于胞嘧啶的碱基(例如尿嘧啶碱基(uracil,U))的过程。本领域周知进行胞嘧啶转化的非酶促方法。非酶促方法主要是指重亚硫酸盐转化。示例性地，非酶促方法包括使用转化试剂例如亚硫酸氢盐、酸式亚硫酸盐或焦亚硫酸盐处理，例如亚硫酸氢钙、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢铵、重硫酸钠、重硫酸钾和重硫酸铵等。经转化的DNA任选经纯化。适用于本文的DNA纯化方法本领域周知。

本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本文所述的引物和/或探针，用于检测尿液标本脱落细胞DNA中膀胱癌相关基因或序列的甲基化水平，进而鉴定膀胱癌或筛查膀胱癌高危人群。所述试剂盒还可包含本文所述，特别是发明内容第一方面所述的核酸分子作为内标或阳性对照。

因此，在优选实施方案中，所述试剂盒包括本文所述的SEQ ID NO:1-12所示的引物和SEQ ID NO:15-20所示的检测探针。此外，所示试剂盒还包括本文所述的SEQ ID NO:13和14所示的ACTB引物和SEQ ID NO:21所示的ACTB检测探针。

除了所述引物、探针、核酸分子之外，试剂盒还包含检测DNA甲基化所需的其他试剂。示例性地，检测DNA甲基化的其他试剂可包含以下的一种或多种：重亚硫酸盐及其衍生物、PCR缓冲液、聚合酶、dNTP、引物、探针、Mg²⁺、荧光染料、荧光淬灭剂、荧光报告剂、内标、对照物。所述试剂盒还可包括经转化的阳性标准品，其中未甲基化的胞嘧啶转化为不与鸟嘌呤结合的碱基。所述阳性标准品可以是完全甲基化的。

为了保存尿液样本中DNA，所述试剂盒还可包括尿液保存液，所述尿液保存液含有乙二胺四乙酸(EDTA)以及抗生素(例如青霉素和链霉素)。

基于发明人的发现，本发明提供一种诊断膀胱癌或膀胱癌前病变、筛查膀胱癌形成或形成风险、评估膀胱癌进展或预后的方法，包括：(1)检测对象样品中的本文所述的一种或多种目标标志物中的一个或多个CpG二核苷酸的甲基化水平，(2)将所述甲基化水平与对照比较，从而实现所述诊断、筛查和评估。其中，若以下目标标志物的甲基化水平提高，则表明所述个体患有膀胱癌或膀胱癌前病变，或者所述个体有形成膀胱癌或膀胱癌病变的风险，或者所述个体的膀胱癌预后不良。通常，所述方法之前还包括：样品DNA的抽提、质检、和/或将DNA上未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。所述样品包括来自哺乳动物的细胞，特别是尿液样品。

在具体实施方案中，步骤(1)包括：用DNA捕获探针提取检测的靶基因DNA，用转化试剂处理基因组DNA，使未甲基化的胞嘧啶转化尿嘧啶；使用引物进行PCR扩增，所述引物适用于扩增本文所述肠癌相关序列的经转化的序列；通过扩增产物的有或无、或者序列鉴定(例如基于探针的PCR检测鉴定或DNA测序鉴定)确定至少一个CpG的甲基化水平。

为了从粪便样品中获取DNA，所述方法还可包括用样品处理试剂处理尿液样品的步骤。示例性的样品处理试剂包括尿液保存液和/或DNA提取试剂。尿液保存液含有乙二胺四乙酸(EDTA)，任选还含有抗生素。DNA提取试剂包括QIAamp mini DNA Kits、PBS或TE。

在一个实施方案中，所述膀胱癌或膀胱癌前病变的筛查方法包括步骤：

(a)尿液样本采集：收集膀胱癌病人尿液，加入尿液样本体积1/20的尿液保存液；所述尿液保存液含有EDTA和抗生素(例如0.1M EDTA、青霉素和链霉素)；

(b)充分混匀样本(例如使用振荡器)；

(c)离心去除上清液，在细胞沉淀中加入PBS悬浮液，转移至离心管；

(d)离心去除上清液，提取沉淀中的细胞DNA(例如使用DNA提取试剂盒)。

本文所述“甲基化水平”指所涉CpG位点的甲基化水平或所涉序列中多个或所有CpG位点的平均甲基化水平。本发明的示例性实施方案中，位点的甲基化水平通常是指该位点甲基化C的百分比，如果该CpG位点所有C都是未甲基化的，其甲基化水平就为零。甲基化水平还可以是其他类型的计算结果，这在本领域技术人员的知识范围内。本领域知晓将检测DNA甲基化的方法(例如简化甲基化测序)所得结果转化为甲基化水平的过程。例如，根据每个基因启动子区检测到的CpG位点的甲基化水平，计算平均甲基化，将其作为该基因启动子区DNA甲基化水平。

以下将以具体实施例的方式对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非用于限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域的常规方法和试剂。

实施例1：尿液脱落细胞DNA提取

尿液脱落细胞DNA提取步骤如下：

(1)尿液样本采集：收集20例膀胱癌病人尿液40ml，加2ml尿液保存液混匀，另收集10例正常人尿液样本做对照；所述的尿液保存液由0.1M EDTA，以及青霉素和链霉素配制而成；

(2)样本收到后，将容器在震荡器上充分混匀样本；

(3)3000g离心10min；

(4)弃上清液，细胞沉淀加1.5ml PBS悬浮转移至Eppendorf管；

(5)3000g离心5min；

(6)弃上清液留沉淀，细胞DNA提取采用QIAamp mini DNA Kits(Qiagen51304)；

(7)DNA洗脱：40μL TE；

(8)测OD值定量：DNA浓度为100～200ng/μL，OD260/280值1.6～2.0。

实施例2：DNA亚硫酸盐转化处理

在0.5ml PCR管中配制亚硫酸盐转化反应体系，具体配制体系如下:

DNA样品 20μl

DNA保护液 10μl

10M亚硫酸盐转化溶液130μl

反应体系配制好后，在PCR仪设置温度变化程序进行亚硫酸盐转化，PCR程序为：[95℃ 5min，60℃ 20min]x 2循环，4℃保持。

DNA亚硫酸盐处理后的纯化步骤如下：

(1)经过简短离心将管中反应体系转移至干净的1.5ml离心管中；

(2)加入1ml 6M盐酸胍和40μl磁珠，涡旋混匀10sec，室温静置5min；

(3)将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠吸附后弃去液体；

(4)加入600μl漂洗液(80％ ETOH/50mM Tris Buffer)，涡旋混匀10sec；

(5)将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠吸附后弃去液体；

(6)加入600μl脱硫液(0.3N NaOH/90％ EtOH)，涡旋混匀10sec，室温放置15min；

(7)将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠吸附后弃去液体；

(8)加入600μl漂洗液(80％ ETOH/50mM Tris Buffer)，涡旋混匀10sec；

(9)将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠吸附后弃去液体；

(10)重复漂洗液漂洗一次；

(11)短暂离心将残余液体收集至管底，尽量去尽液体；

(12)室温晾干3～5min至无液体残余；

(13)加入20～40μl预热1x TE缓冲液(50℃)并混匀磁珠，室温放置3min；

(14)将离心管置于磁力架上静置1min，待磁珠吸附后收集洗脱产物(即为转化DNA)。

实施例3：荧光定量PCR检测6个靶基因甲基化

(1)采用荧光PCR法检测膀胱癌尿液脱落细胞基因甲基化指标，所述PCR检测甲基化基因引物如下：

SEQ ID NO.1:SOX1_MF：TTTTCGGGTATTTGGGATTAGT

SEQ ID NO.2:SOX1_MR：CTATCTCCTTCCTCCTACGCTC

SEQ ID NO.3:HOXA9_MF：ATGAAATTTGTAGTTTTATAATTTT

SEQ ID NO.4:HOXA9_MR：ATTACCCAAAACCCCAATAATAAC

SEQ ID NO.5:ZNF671_MF：CGGAGGACGTAGTATTTATTCGC

SEQ ID NO.6:ZNF671_MR：CTACGTCCCCGATCGAAACG

SEQ ID NO.7:VIM_MF：GCGGCGGTTCGGGTATCG

SEQ ID NO.8:VIM_MR：GCCGTAATCACGTAACTCCGACT

SEQ ID NO.9:IRAK3 MF：AGGAGATCGTTTAGTCGTGGGGTAC

SEQ ID NO.10:IRAK3 MR：ACCTCTACGATAAAAACGAAACTACCG

SEQ ID NO.11:RASSF1_MF：GGGTTTTGCGAGAGCGCG

SEQ ID NO.12:RASSF1_MR：GCTAACAAACGCGAACCG

SEQ ID NO.13:ACTB_MF:TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT

SEQ ID NO.14:ACTB_MR:AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA

所述TaqMan探针如下：

SEQ ID NO.15(SOX1):FAM-AGAAGTTGTAGTTTTCGAGTTGGAGG-BHQ1

SEQ ID NO.16(HOXA9):HEX-GGGTCGGGTCGGGCGGGTTA-BHQ1

SEQ ID NO.17(ZNF671):ROX-CGTGGGCGCGGATAGTTGTCGGGAGCG-BHQ2

SEQ ID NO.18(VIM):FAM-GCAGTCGGTCGAGTT-BHQ1

SEQ ID NO.19(IRAK3):HEX-TTAGTTCGTATTTTGTTTGT-BHQ1

SEQ ID NO.20(RASSF1):ROX-GGGAGGCGTTGAAGTCGGGG-BHQ2

SEQ ID NO.21(ACTB):CY5–TGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGTGGTGGT-BHQ3

(2)经亚硫酸盐转化的DNA用于荧光定量PCR；

6个靶点基因检测分2组PCR反应，引物+荧光探针混合液-1：SOX1、HOXA9、ZNF671、ACTB，引物+荧光探针混合液-2：VIM、IRAK3、RASSF1、ACTB，各取0.25μl 10μM引物，0.125μl10μM荧光探针。

PCR反应体系(25μl)为：

5μl	亚硫酸盐转化DNA
		6μl	4x HU MP Buffer
2.5μl	引物+荧光探针混合液-1/或混合液-2
		9.5μl	<![CDATA[H<sub>2</sub>O]]>
2μl	Enzyme Mix

同时取未转化DNA设置为对照。设置基因甲基化PCR反应条件为：95℃5min，45cycles(95℃15sec,61℃30sec)，72℃30sec。

(3)PCR反应结束，检测荧光信号

甲基化ACTB及6个靶基因甲基化的PCR在未经亚硫酸盐转化的膀胱癌病人及正常人尿液样本DNA中，均未检测到扩增信号(Ct值≥38或无数值)。

甲基化ACTB在转化膀胱癌病人及正常人样本DNA均检测到扩增信号Ct值在25～32之间。ACTB的Ct值≤35提示待检DNA样品有效，Ct值>35提示待检样品无效，需重新制备DNA。

在10例正常人尿液脱落细胞转化的DNA中6个靶基因甲基化未见有扩增信号(Ct值≥38或无数值)；20例膀胱癌病人尿液脱落细胞转化的DNA样本基因甲基化检测结果见表1，其中，6个靶基因甲基化检测Ct值≤35为扩增，Ct值≥38为无扩增，35<Ct值<38为临界值。结果表明，样品中有2个及2个以上基因甲基化扩增提示该病例为阳性，1个为可疑供临床参考。

表1：DNA样本甲基化检测结果

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.物质在制备用于诊断膀胱癌或膀胱癌前病变、筛查膀胱癌形成或形成风险、评估膀胱癌进展或预后的试剂盒中的用途，所述物质包含：

所述一个或多个目标标志物包括基因或其片段，所述基因包括选自以下的1、2、3、4、5或全部6种：SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述基因包括选自以下的至少2种：SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1；

优选地，

所述基因包括ZNF671以及选自以下的至少1种：SOX1、HOXA9、VIM、IRAK3和RASSF1，或

所述基因包括HOXA9以及选自以下的一种多种：SOX1、VIM、RASSF1；

更优选地，

所述基因包括SOX1和ZNF671，任选还包含选自以下的至少1种：HOXA9、VIM、IRAK3和RASSF1，或

所述基因包括HOXA9和ZNF671，任选还包含选自以下的至少1种：SOX1、VIM、IRAK3和RASSF1，或

所述基因包括ZNF671、VIM和RASSF1，任选还包含选自以下的至少1种：SOX1、HOXA9和IRAK3。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述膀胱癌是MIBC，

所述基因包括ZNF671以及选自以下的至少1种：SOX1、HOXA9、VIM、IRAK3和RASSF1，或者

所述基因包含HOXA9、RASSF1，任选还包含选自以下的至少1种：SOX1、ZNF671、VIM、IRAK3，

优选地，

所述基因包含SOX1和ZNF671，任选还包含选自HOXA9、VIM和IRAK3中的一种或多种；

所述基因包含HOXA9和ZNF671，任选还包含IRAK3和RASSF1中的一种或多种；

所述基因包含ZNF671、VIM，任选还包含IRAK3和RASSF1中的一种或多种。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述膀胱癌是NMIBC，所述基因包括HOXA9以及选自以下的至少1种：SOX1、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1，

优选地，

所述基因包含HOXA9和SOX1，任选还包含选自ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1中的一种或多种；

所述基因包含HOXA9、SOX1和ZNF671，任选还包含选自VIM、IRAK3和RASSF1中的一种或多种；

所述基因包含HOXA9、SOX1、ZNF671、VIM，任选还包含选自IRAK3和RASSF1中的一种或多种；

所述基因包含HOXA9、ZNF671，任选还包括选自VIM、IRAK3、RASSF1中的一种或多种；

所述基因包含HOXA9、ZNF671、VIM，任选还包括选自IRAK3、RASSF1中的一种或多种；

所述基因包含HOXA9、RASSF1，任选还包含选自以下的至少1种：SOX1、ZNF671、VIM、IRAK3。

5.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其特征在于，

所述片段是所述基因序列的包含CpG岛的片段，和/或

所述片段是基因序列的启动子区域，和/或

所述片段包含至少1个，优选至少3个CpG二核苷酸，和/或

(a)所述试剂包含与所述目标标志物或它们经转化的序列杂交的引物分子，和/或

(a)所述试剂包含与所述目标标志物或它们经转化的序列杂交的检测探针，

优选地，

所述引物具有选自以下任1、2、3、4、5组或全部6组的序列：(1)SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2，(2)SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，(3)SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，(4)SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，(5)SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10，(6)SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，

所述检测探针具有SEQ ID NO:15-20中任一项或多项或全部所示的序列。

6.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其特征在于，

所述对象是哺乳动物，

所述样品来自哺乳动物的尿液样品，

所述试剂盒还包括PCR反应试剂，

所述试剂盒还包括检测DNA甲基化的其他试剂，所述其他试剂是选自以下方法中的一个或多个所用的试剂：基于重亚硫酸盐转化的PCR、DNA测序、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱，

所述试剂盒还包括样本处理试剂，包括尿液保存液和/或DNA提取试剂。

7.诊断膀胱癌或膀胱癌前病变、筛查膀胱癌形成或形成风险、评估膀胱癌进展或预后的试剂盒，包含：

其中，所述一个或多个目标标志物包括基因或其片段，所述基因包括选自以下的1、2、3、4、5或全部6种：SOX1、HOXA9、ZNF671、VIM、IRAK3和RASSF1。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，

(a)所述的试剂或装置如权利要求1-7的任一项中所述，和/或

所述试剂盒还包含处理DNA的转化试剂，其中所述转化试剂能够区分所述DNA中的未甲基化位点和甲基化位点；优选地，所述转化试剂包含亚硫酸氢盐试剂；更优选地，所述转化试剂包含：亚硫酸氢铵、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾、亚硫酸氢钙、亚硫酸氢镁、亚硫酸氢铝、亚硫酸氢根离子，及其任意组合。

9.如权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，

所述试剂盒还包含扩增ATCB的引物和/或与ATCB杂交的检测探针，和/或

所述试剂盒包含第一容器和第二容器，其中第一容器含有针对基因SOX1、HOXA9、ZNF671和任选的ACTB的引物和检测探针，第二容器含有针对基因VIM、IRAK3、RASSF1和任选的ACTB的引物和检测探针。

10.如权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，

所述对象是哺乳动物，和/或

所述样品是尿液样品，和/或

所述试剂盒还包括PCR反应试剂，和/或

所述试剂盒还包括检测DNA甲基化的试剂，所述试剂是选自以下方法的一个或多个中所用的试剂：基于重亚硫酸盐转化的PCR、DNA测序、甲基化敏感的限制性内切酶分析法、荧光定量法、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线法、基于芯片的甲基化图谱分析、质谱，和/或