CN115927453B - 苹果酸脱氢酶基因在提高植物甲醛吸收代谢能力中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了苹果酸脱氢酶基因AtMDH1在提高植物甲醛吸收代谢能力中的应用，所述苹果酸脱氢酶基因AtMDH1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；实验结果显示在相同浓度胁迫相同时间下，AtMDH1过表达的烟草和拟南芥吸收甲醛的效果比野生型的好；AtMDH1过表达的烟草和拟南芥叶片氧化损伤指标H202含量显著低于野生型；液体甲醛胁迫下野生型拟南芥的AtMDH1转录水平和蛋白水平都显著增加；实验证明At14‑3‑3PSI蛋白与AtMDH1发生了相互作用，At14‑3‑3PSI过表达降低AtMDH1转录水平，HCHO胁迫降低At14‑3‑3PSI蛋白与AtMDH1相互作用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学及基因工程技术领域，具体涉及一种拟南芥苹果酸脱氢酶基因AtMDH1在提高植物甲醛吸收代谢能力中的用途。
背景技术
甲醛(HCHO)是最简单的饱和醛，是一种最重要的常见致癌环境污染物。甲醛广泛存在于汽油尾气、烟雾、涂料和工业品中，导致产生大量含HCHO的废水以及HCHO空气污染。甲醛是最典型的环境污染物之一，有刺鼻的气味。由于甲醛在工业和消费品中的使用，广泛分布于生物体中。此外，甲醛已被国际癌症研究机构列为第一类人类致癌物。HCHO作为一种无处不在的环境污染物，可以与多种脂类、核酸和蛋白质非特异性结合。因此，长期接触甲醛可导致健康问题，如上呼吸道疾病、过敏、癌症、白血病和可能的死亡。甲醛也可能会导致动物和人类的许多组织和器官功能障碍。甲醛污染修复技术的发展受到了广泛关注，在实际应用的修复技术中，植物修复被认为是一种环境友好、可持续发展的技术。在植物净化***中，叶子可以吸收污染空气中的HCHO，并通过卡尔文循环和C1代谢将其转化为碳水化合物和氨基酸。现有的观点认为植物甲醛的吸收能力和其代谢甲醛能力有关联，因此，利用现代基因工程技术提高植物甲醛代谢水平，促进植物持续高水平代谢甲醛能力，是提高植物对甲醛吸收能力的重要途径。
苹果酸脱氢酶广泛存在于自然界，促进苹果酸向草酰乙酸的可逆转化，对能量平衡、植物生长和发育至关重要，并在非生物胁迫反应中发挥重要作用。苹果酸盐是一种重要的中间体，在植物营养、代谢和细胞能量供应中起着关键作用。ROS是含有氧的化学反应分子，由于氧化应激的产生，对植物细胞有害。在环境胁迫条件下，植物中多种氧化还原和活性氧(ROS)信号的调节需要不同细胞室中信号和代谢途径之间的高度协调和平衡。MDH反应参与细胞器隔间之间的中枢代谢和氧化还原稳态，胞质MDH被认为是植物细胞中叶绿体或线粒体向其他目的地转移还原当量的关键角色。研究表明过表达MDH植物胁迫后非酶抗氧化剂GSH含量上升有利于直接清除ROS，保护植物免受胁迫诱导的氧化应激。植物在遭受一些非生物胁迫时MDH表达量会增加。
目前还未见拟南芥苹果酸脱氢酶基因AtMDH1在提高植物吸收代谢甲醛过程中的作用以及At14-3-3PSI蛋白通过调控拟南芥苹果酸脱氢酶基因提高植物吸收代谢甲醛的相关报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种拟南芥苹果酸脱氢酶基因AtMDH1的新用途，即将拟南芥苹果酸脱氢酶基因AtMDH1应用在提高植物吸收代谢能力中，拟南芥苹果酸脱氢酶基因AtMDH1的GenBank登录号为：AT1G04410；利用AtMDH1基因构建甲醛吸收能力增强的转基因植物，可以用于对该基因的进一步研究，也可以种植于甲醛污染严重的土壤中。
为了实现本发明的上述目的，本发明的技术方案如下：
1、选择模式植物拟南芥的苹果酸脱氢酶基因AtMDH1作为实验材料，构建AtMDH1基因的原核表达载体pGEX-4T-1-AtMDH1
从拟南芥叶中克隆出苹果酸脱氢酶基因AtMDH1全长，成功构建了AtMDH1基因原核表达载体，并在BL21中诱导表达蛋白，纯化得到AtMDH1蛋白；酶学特性分析表明AtMDH1的最适温度为40℃，在65℃时可以看到酶由于变性，形成白色的絮状沉淀，基本测不到酶活；AtMDH1的最适pH值偏碱性，在8.0左右；K+对酶有明显的激活作用；Mg2+和Ca2+对酶活影响不大；Zn2+和Cu2+对酶活有不同程度的抑制作用；Cu2+抑制程度最强；并且用纯化的蛋白制备了多克隆兔抗，经检测可作为一抗进行后续分析；
2、构建AtMDH1基因的植物表达载体pSPYCE-AtMDH1
用RNAiso Plus(Takara)试剂按照说明书提取拟南芥总RNA；并反转录获得AtMDH1的cDNA；在NCBI查找Arabidopsis thaliana AtMDH1的CDS序列(AT1G04410)，通过DNAman软件设计其双酶切位点(Sal I和Sma I)和基因特异性引物；
上游引物5′-GTCGACATGGCGAAAGAACCAGTTCG(含SalⅠ酶切位点)
下游引物3′-CCCGGGAGAGAGGCATGAGTACGCC(含SmaⅠ酶切位点)；
使用上述引物进行PCR扩增，获得AtMDH1编码区全长DNA片段(999bp，如SEQ IDNO:1所示)；通过酶切连接到pMD18-T载体上，热激转化大肠杆菌DH5α，通过抗性筛选及测序获得含正确序列的TA克隆；再进行酶切连接将片段连接到pSPYCE-35S载体上，通过抗性筛选及测序获得植物表达载体pSPYCE-AtMDH1。用冻融法将pSPYCE-AtMDH1转入农杆菌，用筛选检测正确的农杆菌通过叶盘转化法转化野生型烟草以及浸花法转化野生型拟南芥，获得再生植株并进行以下筛选及检测；
3、通过抗性筛选获得的转基因植株，再进行基因组和蛋白表达水平的检测，获得多株转AtMDH1基因烟草和拟南芥，并扩繁；
4、从野生型烟草、野生型拟南芥、转AtMDH1基因烟草、转AtMDH1基因拟南芥、抑制AtMDH1表达的拟南芥突变体Atmdh1、转At14-3-3PSI基因烟草、抑制At14-3-3PSI表达的拟南芥突变体的植株中选出长势一致的健壮植株，取叶片1g，自来水清洗3-4次去除污尘，用无菌的吸水纸吸干表面残留的水分，转移至含有2mM HCHO的处理液50mL的培养瓶中，25℃下持续光照(100μmol·m-2·s-1)并在100rpm振荡培养0h、6h、12h、24h、36h、48h、60h，以未加植物叶片只加甲醛的样品作为对照(BC)，对不同类型烟草和拟南芥的甲醛吸收效率和生理生化指标进行比较；
5、通过酵母双杂、Pull-down、LCA及BiFC实验证明了At14-3-3PSI蛋白与AtMDH1发生了相互作用，HCHO胁迫减弱At14-3-3PSI蛋白与AtMDH1相互作用，说明At14-3-3PSI通过与该代谢关键酶互作改变酶的转录水平，来调节甲醛代谢；2mM HCHO液体处理野生型、转基因烟草和转基因拟南芥叶片24h的代谢产物种类相同，且过表达的代谢产物比野生型的含量高，结果表明过表达的转基因烟草和拟南芥比野生型烟草和拟南芥甲醛吸收能力强。
本发明的有益效果：
本发明将基因AtMDH1在烟草和拟南芥中过量表达，提高了植物对甲醛的抗性，同时代谢甲醛能力的也提高了，At14-3-3PSI通过与AtMDH1蛋白相互作用调节AtMDH1表达并增强植物甲醛耐受性，这有助于提高对植物吸收和代谢甲醛的能力，并且At14-3-3PSI和AtMDH1基因也可能作为提高植物甲醛耐受性中潜在的重要修饰目标，因此AtMDH1基因的应用为提高植物甲醛吸收代谢能力的分子育种提供了一条简便快捷的途径，栽培后获得的种子容易保存，便于推广种植，该转基因烟草和拟南芥可种植于甲醛污染严重的土壤中，对于甲醛污染净化具有重要意义。
附图说明
图1为pMD-18T-AtMDH1载体PCR验证(A)、pGEX-4T-1-AtMDH1载体验证(B)和BL21的转化检测(C)的电泳检测结果示意图；
图2为重组蛋白pGEX-4T-1-AtMDH1诱导表达(A)和纯化(B)检测结果示意图；
图3为温度对AtMDH1酶活力的影响；
图4为AtMDH1酶的热稳定性分析结果；
图5为pH对AtMDH1的酶活力的影响；
图6为AtMDH1抗体效价检测Western blot(A)、双向免疫扩散试验(B)；
图7为pMD-18T-AtMDH1载体PCR验证(A)、pSPYCE-AtMDH1植物表达载体验证(B)和农杆菌GV3101的转化检测(C)的电泳检测结果示意图；
图8为过表达AtMDH1基因烟草基因组PCR(A)和western blot(B)检测及AtMDH1基因拟南芥基因组PCR(C)和western blot(D)结果示意图；A图中3-12为烟草转基因株系，C图中2-11为拟南芥转基因株系；
图9为野生型拟南芥(Col-0)、At14-3-3PSI过表达拟南芥(At14PSI)、AtMDH1过表达拟南芥(AtMDH1)、抑制At14-3-3PSI表达的拟南芥(At14psi)、抑制AtMDH1表达的拟南芥(Atmdh1)叶片对浓度2mM甲醛液体吸收结果；
图10为野生型烟草(WT)和AtMDH1过表达烟草(M8)叶片对浓度2mM甲醛液体吸收结果；
图11为野生型拟南芥(Col-0)、At14-3-3PSI过表达拟南芥(At14PSI)、AtMDH1过表达拟南芥(AtMDH1)、抑制At14-3-3PSI表达的拟南芥(At14psi)和抑制AtMDH1表达的拟南芥(Atmdh1)叶片经过HCHO处理后H2O2(A图)和O2·-(B图)染色结果；
图12为野生型烟草(WT)和AtMDH1过表达烟草(M8)HCHO处理后H2O2(A图)和O2·-(B图)染色结果；
图13为液体HCHO处理后AtMDH1过表达拟南芥中AtMDH1的相对表达量(A图)及蛋白水平(B图)结果；
图14为酵母双杂交分析结果；
图15为荧光素酶互补实验(LCA)实验结果；
图16为野生型拟南芥(Col-0)、At14-3-3PSI过表达拟南芥(At14PSI)、AtMDH1过表达拟南芥(AtMDH1)、At14-3-3PSI表达抑制拟南芥(At14psi)、AtMDH1表达抑制拟南芥(Atmdh1)叶片经甲醛处理24h后的代谢谱；
图17为野生型烟草(WT)和AtMDH1过表达烟草(M8)叶片经甲醛处理24h的代谢谱；
图18为野生型拟南芥(Col-0)、At14-3-3PSI过表达拟南芥(At14PSI)、AtMDH1过表达拟南芥(AtMDH1)、At14-3-3PSI表达抑制拟南芥(At14psi)，AtMDH1表达抑制拟南芥(Atmdh1)叶片经甲醛处理后代谢产物的相对积分结果；其中A图为苹果酸的相对积分，B图为天冬酰胺的相对积分，C图为天冬氨酸的相对积分，D图为谷氨酰胺的相对积分；
图19为野生型烟草(WT)和AtMDH1过表达烟草(M8)叶片经过甲醛处理后代谢产物的相对积分结果，其中A图为苹果酸的相对积分，B图为天冬酰胺的相对积分，C图为天冬氨酸的相对积分，D图为谷氨酰胺的相对积分；
图20为At14-3-3PSI过表达拟南芥和At14-3-3PSI表达抑制拟南芥中AtMDH1基因的相对表达量结果；
图21为HCHO处理后At14-3-3PSI和AtMDH1互作水平实验结果，其中A图为LUC图像，B图为Westernblot分析结果。
具体实施方式
下面通过实施例和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。实施例中方法如无特殊说明，按常规操作进行，如无特殊说明使用试剂均为常规购试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1：AtIDH3基因原核表达载体的构建及蛋白表达纯化
采用RNAiso Plus试剂盒(Takara)按照说明书提取拟南芥总RNA；用HiScript II1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(Vazyme公司)反转录试剂盒按照说明书操作将RNA反转录成cDNA。在NCBI查找Arabidopsis thaliana MDH1的CDS序列(AT1G04410)，999bp，通过DNAman软件设计其双酶切位点(BamH I和Xho I)和基因特异性引物(F-GGATCCATGGCGAAAGAACCAGTTCG；R-CTCGAGTTAAGAGAGGCATGAGTACG)。以2μL cDNA为模板，使用设计好的特异性引物，按照2×Es Taq MasterMix(Dye)(康为世纪)说明书体系进行50μL PCR扩增AtMDH1片段(退火温度58℃)。胶回收AtMDH1基因片段(999bp)与pMD18-T(Takara)进行TA克隆获得pMD18-AtMDH1载体，热激转化DH5α，涂布接种于氨苄青霉素(Amp)固体培养基中，37℃恒温箱过夜培养。第二天挑取单菌落放于液体培养基中筛选培养，待菌液浑浊后，取1μL菌液为DNA模板进行PCR检测(图1A)，检测成功的菌液提取质粒送公司测序。用DNAman软件将测序结果与AtMDH1进行比对，将比对正确的pMD18-AtMDH1质粒和pGEX-4T-1载体使用BamH I和Xho I分别进行双酶切(25μL质粒、2.5μL BamH I、2.5μL Xho I、5μL10×Buffer K、15μL ddH2O)，凝胶电泳观察目的片段，对目的基因片段AtMDH1和被切开的pGEX-4T-1载体片段进行胶回收。回收得到片段在16℃金属浴中连接3h之后通过热激转入DH5α中，涂布于Amp固体培养基中，37℃恒温箱中过夜培养，挑取单菌落于Amp液体培养大量增殖培养，取1μL培养液进行PCR检测(图1B)，检测成功后提取质粒。将原核表达载体pGEX-4T-1-AtMDH1质粒通过热激转化转入大肠杆菌BL21蛋白表达菌中，涂布含有Amp固体培养基中于37℃恒温箱中过夜培养，挑取单菌落在Amp液体培养基中筛选培养，对菌体正常生长的培养基进行菌液PCR检测(图1C)。
将检测成功的菌液接种到25mL LB液体培养基中，在摇床中(37℃、200rpm)培养至菌液OD值为0.5，再加入IPTG，使其终浓度为1mmol/L；分别在25℃和37℃摇床中进行诱导表达，取诱导0、2、4、6、8h后菌液各2mL，12000rpm离心1min，收集菌体，加入2mL PBS重悬，取20μL重悬后的菌体加入5μL 5×蛋白质电泳上样缓冲液，沸水煮10min，冷却后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)泳分析蛋白表达情况(图2A)；实验发现AtMDH1蛋白在25℃、1mmol/LIPTG诱导8h蛋白表达量最大。
在25℃、1mmol/L IPTG诱导条件下，大量诱导菌株大量表达蛋白；4℃、12000rpm下离心15min收集菌体沉淀，加入PBS重悬，将重悬的菌体盛入50mL EP管，再将管置于冰中超声破碎细胞15min；破碎后的菌体离心后，将获得的含有大量目的表达蛋白的上清液过GST柱，得到纯化的AtMDH1融合蛋白，取20μL样品进行12％的SDS-PAGE分析(图2B)。
实施例2：苹果酸脱氢酶酶活力测定
蛋白浓度的测定使用北京康为世纪生物科技有限公司生产的BCA法蛋白定量试剂盒，以牛血清白蛋白(Bovineserumalbumin，BSA)为标准蛋白，参照试剂盒操作手册进行实验，采用分光光度法测定酶活性，AtMDH1的酶活测定体系含有0.1mol/L磷酸钾(pH 7.5)，0.01mol/LNADH、0.1mol/L草酰乙酸，在25℃下，使用紫外分光光度计检测反应过程中340nm处光吸收值的变化。
1、苹果酸脱氢酶AtMDH1的最适温度及其热稳定性
在上述反应体系中其他条件不变，在25℃、30℃、37℃、40℃、42℃、45℃、55℃、65℃，水浴10min，测定AtMDH1的相对酶活力；以温度为横坐标，以相对酶活力为纵坐标绘制曲线图，每个反应重复3次，取平均值计算获得AtMDH1酶的最适反应温度。将AtMDH1置于25℃、30℃、37℃、40℃、42℃、45℃、55℃、65℃水浴，保温1h，取出后立即放在冰上，测定ATMDH1酶的残余活力，以温度为横坐标，以酶的相对残余酶活力为纵坐标绘制曲线图，以确定酶的热稳定性；设定未经热处理的酶液的酶活力为100％，每个反应重复3次，取平均值，观察其在不同温度下的热稳定性。
结果如图3、4所示，结果显示，温度对酶催化反应速度的影响实际上是温度对反应速度的影响与促使酶变性的综合的结果，图3显示苹果酸脱氢酶在40℃时酶活力最高，可以达到该酶的最大比酶活。由此，我们可以判断40℃是该酶反应的最适温度。酶对温度的稳定性的研究中，选取了与测定酶比活相同的温度，结果如图4，发现该酶对于温度的变化比较敏感，42℃以后的酶活下降很快，45℃左右保温后相对酶活在50％左右，继续升温酶活下降迅速；在65℃时可以看到酶由于变性，形成白色的絮状沉淀，基本测不到酶活。
2、苹果酸脱氢酶的最适pH
在室温下将纯化得到的酶液分别在20mmol/L pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的Tris-HCl缓冲液中测定酶活，紫外分光光度计在340nm处分别测定AtMDH1的吸光值，通过观察确定酶反应的最适pH，每个反应重复3次，取平均值，结果见图5，图中显示pH 8.0时苹果酸脱氢酶的比酶活是最大的，可以确定苹果酸脱氢酶的最适反应pH值为8.0；
3、金属离子对苹果酸脱氢酶酶活力的影响
25℃条件下，保持其他组分不变的前提下，在反应体系中分别加入终浓度为5mmol/L的MgCl2、MnCl2、CoCl2、CaCl2、ZnSO4、CuCl2、NaCl和KCl测定AtMDH1酶活力，每个实验独立重复三次，统计结果并计算ATMDH1的相对酶活性。
各种金属离子对苹果酸脱氢酶活力的影响结果显示，K+对酶有明显的激活作用；Mg2+和Ca2+对酶活影响不大；Zn2+和Cu2+对酶活有不同程度的抑制作用；Cu2+抑制程度最强。不同的金属离子与AtMDH1产生亲和力的方式不同，而导致酶活性的变化。结果表明，不同金属离子对AtMDH1的活性的影响各不相同。实验指标均重复三次测定，结果见下表：
。
实施例3：AtMDH1蛋白兔抗的制备及效价检测
将纯化好的1mL重组蛋白(约含有5mg纯化的AtMDH1蛋白)与1mL弗氏佐剂以1:1比例进行乳化。在研钵里先加入弗氏佐剂，反复乳化数次；直至制备出合格的油包水剂，可进行兔免疫。初次对兔进行免疫时用等体积的完全弗氏佐剂乳化后，对兔全身进行少量多次免疫，每个点注射少量的抗原。通过肌肉、皮下或皮内注射等多种不同的方式将抗原尽量均匀的注射到每个免疫点。第一次免疫间隔两周后，用等体积的不完全弗氏佐剂乳化AtMDH1抗原，对兔进行加强免疫。进行每周的加强免疫，共加强免疫三次。
末次免疫后间隔一周，将兔麻醉，使其仰面，将兔的四肢固定，剪去心脏附近处的兔毛，用含酒精棉球对兔皮肤进行消毒。然后，触摸一般位于第三和第四肋骨之间的心脏搏动最强的部位，用50mL注射器连接16号针头，倾斜45°，对准兔心搏最强处进行心脏抽血。将抽取的血液立即注入无菌容器中，等待分离血清。将获得的兔血先置37℃恒温培养箱1h，然后置4℃冰箱内3-4h，直至血液凝固血块收缩，然后吸取血清；3000r/min离心15min，取上清加入终浓度0.02％叠氮纳防腐，用2mL灭菌的离心管分装后，置于-20℃冰箱中冷冻保存备用。
为了验证抗体是否有效，我们进行了AtMDH1抗体的特异性检测。取纯化的重组蛋白3μg、6μg和12μg进行SDS-PAGE电泳，用上述兔抗为一抗，商业化的羊抗兔为二抗进行western blot分析，结果如图6A，说明本实施例制备的多克隆兔抗体可以和AtMDH1抗原发生特异性反应，抗体制备成功。
为了进一步检测抗体的有效性，我们又做了双向免疫扩散试验，试验结果如图6B所示，可以看到一条弧形的白色沉淀线，说明以AtMDH1纯化的蛋白与AtMDH1的免疫血清有特异性，它们在琼脂糖凝胶中自由扩散，相遇后形成了抗原抗体复合物，而这条线沿着中间孔的边缘弯曲，且除了生理盐水、稀释32倍和稀释64倍处没有白线外，其他稀释不同倍数的孔都有白线，说明该兔抗体效价较高。
实施例4：真核表达载体pSPYCE-AtMDH1的构建及过表达AtMDH1基因烟草和拟南芥的鉴定
1、真核表达载体pSPYCE-AtMDH1的构建
本发明用酶切连接技术构建真核目的表达载体pSPYCE-AtMDH1；PCR扩AtMDH1基因目的片段(999bp)。将pMD18T和目的片段通过T/A克隆获得pMD18T-AtMDH1质粒，PCR检测是否连接成功(图7A)，对阳性克隆进行测序检测基因AtMDH1是否发生突变。检测成功的pMD18T-AtMDH1质粒和pSPYCE质粒经过Sal I和Sma I分别双酶切胶回收获得目的片段AtMDH1和被切开的pSPYCE，将两个片段16℃连接4h，形成真核表达载体pSPYCE-AtMDH1，PCR检测AtMDH1基因是否成功克隆到pSPYCE载体上(图7B)。
将构建成功的真核表达载体pSPYCE-AtMDH1通过冻融法转入农杆菌GV3101中，在卡那霉素(Km)固体培养基中筛选培养得到阳性克隆，挑选单菌落在含Km的LB液体培养基中筛选培养(终浓度50mg/L)，进行菌液PCR检测有外源植物表达载体质粒的阳性克隆(图7C)，通过叶盘转化法转化烟草和浸花法转化野生型拟南芥，将含有目的基因的表达载体pSPYCE-AtMDH1农杆菌转染烟草和拟南芥，在含Km抗性培养基(终浓度30μg/mL)筛选获得转基因烟草和拟南芥种子。
2、过表达AtMDH1基因烟草和拟南芥的鉴定
将抗性培养基中长根的转基因烟草和拟南芥通过CTAB法提取植物的基因组，凝胶电泳检测提取的基因组DNA。以提取的植物基因组DNA为模板，用AtMDH1基因的特异性引物，进行PCR反应，在1％琼脂糖凝胶电泳上对PCR产物进行检测；基因组PCR检测在基因组中有外源AtMDH1基因***的植株，再对其蛋白是否翻译进行检测，提取上述转基因烟草和拟南芥的植物总蛋白，以HA标签的兔抗为一抗，用western blot对AtMDH1蛋白水平进行检测。
用pSPYCE-AtMDH1转化烟草和拟南芥获得具有卡那霉素抗性的转基因株系，以基因组DNA为模板，用AtMDH1基因的特异性引物，检测外源基因的***情况；对基因组进行PCR反应后，结果见图8；图8A中显示5个株系烟草(编号4、8、10、11、12)的基因组中有AtMDH1基因***，图8C中8个株系拟南芥(编号2、3、4、5、6、7、8、11)的基因组中有AtMDH1基因***。
蛋白水平的western blot检测采用HA标签的兔抗为一抗，结果见图8B和8D，western blot分析结果说明烟草有3个(M8、M9、M10)株系和拟南芥有3个株系(4、5、6)转基因植株中外源AtMDH1基因都能够正常翻译。
通过DNA及蛋白水平检测分析结果说明外源AtMDH1基因已准确***烟草和拟南芥基因组中，并且在35S的启动子下，外源AtMDH1基因能够正确的转录，本实验选择表达水平较高的转基因烟草株系8(M8)和拟南芥株系6作为转基因植物试验材料。
实施例5：转基因烟草和拟南芥的甲醛胁迫处理
选出生长状况相同的植株，取叶片1g，自来水清洗3-4次去除污尘，用无菌的吸水纸吸干表面残留的水分，转移至含有2mM HCHO处理液各50mL的培养瓶中，25℃下持续光照(100μmol·m-2·s-1)并在100rpm振荡培养0h、6h、12h、24h、36h、48h、60h，以未加植物叶片只加甲醛的样品作为对照(BC)。
1、转基因烟草和拟南芥对液体甲醛吸收能力检测
为检测At14-3-3PSI表达改变拟南芥(At14-3-3PSI过表达拟南芥简称At14PSI、抑制At14-3-3PSI表达的拟南芥简称At14psi)、AtMDH1表达改变拟南芥(AtMDH1过表达的拟南芥AtMDH1、抑制AtMDH1表达的拟南芥Atmdh1)、AtMDH1过表达烟草吸收液体HCHO的影响，我们分别在At14-3-3PSI表达改变拟南芥、AtMDH1表达改变拟南芥、野生型拟南芥(Col-0)、AtMDH1过表达烟草、野生型烟草(WT)中各取1g叶片，分别浸没在浓度为2mM的50mL HCHO溶液中进行HCHO吸收的检测，以不放叶片的HCHO溶液为对照监测HCHO的挥发量，取测定后所得的平均值绘制转基因烟草和拟南芥的液体HCHO吸收曲线。通过比较转基因拟南芥与野生型拟南吸收HCHO的能力，结果发现在2mM HCHO溶液中(图9)At14-3-3PSI过表达拟南芥、AtMDH1过表达的拟南芥吸收HCHO能力相似，过表达拟南芥均略高于野生型拟南芥，抑制At14-3-3PSI表达的拟南芥、抑制AtMDH1表达的拟南芥Atmdh1略低于野生型拟南芥，其中At14PSI过表达拟南芥的HCHO吸收速率最快。
对比转基因烟草和野生型烟草在2mM HCHO溶液中的吸收曲线(图10)可以发现，AtMDH1过表达改变烟草和野生型烟草吸收HCHO的整体趋势相似，AtMDH1过表达略高于野生型的吸收能力。
2、甲醛胁迫下转基因烟草和转基因拟南芥H2O2和O2·-检测
ROS在植物胁迫响应中起着核心作用。ROS的积累可以作为衡量逆境胁迫程度的重要变量。我们用3,3’-二氨基联苯胺(DAB；H2O2)和硝基蓝四唑(NBT；O2·-)进行组织化学染色，研究了At14PSI过表达拟南芥、抑制At14-3-3PSI表达的拟南芥At14psi、AtMDH1过表达拟南芥、抑制AtMDH1表达的拟南芥、AtMDH1过表达烟草在HCHO胁迫前后两种主要活性氧(ROS)物质过氧化氢(H2O2)与过氧化氢阴离子(O2·-)的原位积累；
O2·-含量检测用硝基蓝四唑(NBT)进行组织化学染色，将样品置于含0.1mg/mLNBT的25mM K-HEPES缓冲液(pH7.8)中并在25℃的黑暗环境中处理8小时后，用80％乙醇溶液在70℃下洗涤5次。
H2O2含量检测用3,3'-二氨基联苯胺(DAB)进行组织化学染色，将样品置于含有1mg/mL DAB的50mM Tris-HCl(pH3.8)中并在25℃黑暗环境中处理24小时后，用80％乙醇溶液在70℃下洗涤5次。
转基因拟南芥系的DAB染色显示，植物在正常条件下积累了较低H2O2，野生型、At14-3-3PSI过表达拟南芥、抑制At14-3-3PSI表达的拟南芥和AtMDH1过表达拟南芥及抑制AtMDH1表达的拟南芥(图11)及AtMDH1过表达烟草(图12)在HCHO处理前H2O2含量没有显著差异。HCHO胁迫导致拟南芥和烟草株系中H2O2水平升高，但与野生型拟南芥相比，抑制At14-3-3PSI表达的拟南芥和抑制AtMDH1表达的拟南芥中H2O2的积累加快，At14-3-3PSI过表达拟南芥和过表达拟南芥AtMDH1叶片中H2O2的积累最慢。
蓝色着色，反映NBT染色，在HCHO处理之后，抑制At14-3-3PSI表达的拟南芥和抑制AtMDH1表达的拟南芥叶片中的蓝色着色比野生型和过表达叶片中的更深，表明抑制基因的拟南芥植物中O2·-积累更大(图11)。因此，当At14-3-3PSI和AtMDH1基因被抑制后，ROS积累被促进，但当AtMDH1、At14-3-3PSI过表达时，ROS积累被减少。与拟南芥中AtMDH1过表达相似，甲醛胁迫下，AtMDH过表达烟草ROS积累被减少(图12)。
3、HCHO胁迫对AtMDH1表达量的影响
为了检测AtMDH1过表达拟南芥经2mM甲醛胁迫后，AtMDH1表达量是否会受到影响，我们用经过甲醛处理不同时间(0、12h、24h、36h)的AtMDH1过表达拟南芥为材料，测定AtMDH1的转录水平和蛋白表达水平，结果如图13所示，经过甲醛处理后AtMDH1过表达拟南芥的AtMDH1转录水平升高，AtMDH1蛋白水平也随甲醛处理时间延长而增多。
4、AtMDH1与At14-3-3PSI互作分析
为了了解At14-3-3PSI与AtMDH1是否产生互作来影响甲醛代谢，首先进行了酵母双杂分析(如图14)，我们先将AtMDH1基因连到pGADT7载体中，转化Y187酵母菌株；将At14-3-3PSI基因的CDS序列克隆到pGBKT7载体中，转化Y2HGold酵母菌株。我们已确定在酵母双杂交试验中p35和大T抗原可以发生相互作用，我们用Y2HGold[pGBKT7-53]与Y187[pGADT7-T]互作设置为阳性对照，使用pGBKT7-Lam和pGADT7-T作为阴性对照，具体实验操作如下：
(1)载体的构建：用酶切连接将基因At14-3-3PSI连入pGBKT7载体、AtMDH1基因连入pGADT7载体，使At14-3-3PSI分别与GAL4的DNA结合结构域融合(BD-At14-3-3PSI)以及AtMDH1与GAL4的DNA激活结构域融合(AD-AtMDH1)；
转化：Y187或Y2HGold 10μL菌液加入2mL0.25×YPDA中，28℃、200rpm过夜培养12h；
(2)取250μL菌液，12000rpm速离15s，收集沉淀，加1mLddH2O重悬，速离收集沉淀；
(3)依次缓慢加入240μL PEG3350(50％w/v)、36μL LiAc(1M)、20μL ss-DNA(2mg/mL)；10μL重组质粒、54μL ddH2O涡旋1min；42℃水浴30min，3500rpm离心15s，去除上清液，加100μL ddH2O，轻轻吹打，将含BD-At14-3-3PSI质粒的涂布在缺Trp培养基上，将含AD-AtMDH1质粒的涂布在缺Leu培养基上，28℃恒温箱培养2到4天；
(4)挑单菌落分别在缺少Trp培养液和缺Leu培养液中28℃、200rpm过夜培养；
(5)杂交：上一步菌液两两混合于2mL的2×YPDA培养液中，28℃、200rpm过夜培养；
(6)取1mL菌液在3500rpm下离心1min，沉淀用ddH2O洗2次，轻轻吹打混匀，吸20μL涂布在缺少Leu和Trp的培养基上(二缺培养基)；
(7)挑单菌落至离心管中加入50-100μL ddH2O溶解，3500rpm离心1min后吸除ddH2O；再用ddH2O洗一次，加入30-50μL ddH2O混匀待用；吸1.5-2μL分别滴在-Leu和-Trp二缺培养基平板上和-Ade/-His/-Leu/-Trp四缺板上，28℃培养2-4天，观察；
以pGADT7-AtMDH1和pGBKT7-At14-3-3PSI为实验组，结果实验组和阳性对照一样能在含有四缺板上长出菌落，证明At14-3-3PSI和AtMDH1有相互作用。
其次，我们对At14-3-3PSI和AtMDH1重组蛋白进行了荧光素酶互补实验(LCA)，用同源重组将At14-3-3PSI基因连入pCAMBIA1300-nLUC载体、AtMDH1基因连入pCAMBIA1300-cLUC载体；
获得的pCAMBIA1300-nLUC-At14-3-3PSI和pCAMBIA1300-cLUC-AtMDH1通过冻融法转化农杆菌，将含有正确测序的融合载体的根癌农杆菌菌株GV3101细胞在LB液体培养基中培养至OD600＝1.0。以1:1的比例混合携带所示nLUC和cLUC构建体的两种培养物，以感染本氏烟草的叶片，并将一片叶片分成四个区域进行注射。将植物在黑暗中孵育12小时，然后进行16小时/8小时的光/暗转换，循环48小时，对于LUC活性成像，在叶片背面喷洒150μg/mL的D-荧光素钾盐，并在黑暗中保持5分钟。使用Tanon 5200多化学发光成像***(Tanon，中国)拍摄LUC图像。
结果见图15，结果显示注射了pCAMBIA1300-nLUC-At14-3-3PSI和pCAMBIA1300-cLUC-AtMDH1的叶片能观察到荧光，说明At14-3-3PSI和AtMDH1有相互作用。
5、At14-3-3PSI过表达、At14-3-3PSI表达抑制、AtMDH1过表达、AtMDH1表达抑制对烟草和拟南芥甲醛吸收代谢影响
利用13C-NMR技术分析了H13CHO在各种转基因拟南芥和烟草叶片的代谢情况，图16显示2mM液体H13CHO处理24h，野生型和转基因拟南芥叶片中主要代谢中间产物13C-NMR共振峰强度的变化情况；通过比较野生型和各种转基因拟南芥叶片H13CHO处理样品与对照样品中各中间产物含量的变化(图18)，结果发现经过H13CHO处理24h后的At14-3-3PSI过表达拟南芥(At14PSI)、AtMDH1过表达拟南芥(AtMDH1)比野生型拟南芥叶片(Col-0)和未经任何处理的野生型叶片(CK)的含量都高，并且两种转基因拟南芥的中间代谢产物比未经任何处理的要高；
图17显示2mM液体H13CHO处理24h时野生型和转基因烟草叶片中主要代谢中间产物13C-NMR共振峰强度的变化情况；通过比较野生型和AtMDH1过表达烟草叶片H13CHO处理样品与对照样品中各中间产物含量的变化(图19)，结果发现经过H13CHO处理24h后的AtMDH1过表达烟草比野生型烟草叶片(WT)、未经任何处理的野生型叶片(CK)的中间代谢产物含量都高。
本研究通过对核磁图谱中的各峰进行积分，分析了各主要代谢产物的相对含量，图18结果显示At14-3-3PSI过表达拟南芥叶片中的谷氨酰胺比野生型叶片(Col-0)的高出2倍，而苹果酸、天冬酰胺、天冬氨酸没有明显变化；At14-3-3PSI表达抑制拟南芥叶片中的苹果酸比野生型叶片(Col-0)的高出2.25倍，谷氨酰胺比野生型叶片(Col-0)的低出4.2倍；AtMDH1过表达拟南芥叶片中的苹果酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺分别比野生型叶片(Col-0)的高出6.58倍、4倍、2.5倍和5.65倍；AtMDH1表达抑制拟南芥叶片中的天冬氨酸比野生型叶片(Col-0)的高出19倍，基本没有苹果酸和天冬酰胺出现，谷氨酰胺比野生型叶片(Col-0)的低出4倍。通过这些结果我们推测，苹果酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺可能是烟草甲醛代谢2mM液体H13CHO的主要中间产物。
图19结果显示AtMDH1过表达烟草叶片中的苹果酸和谷氨酰胺分别比野生型叶片(WT)的高出1.83倍和1.3倍；
总之，At14-3-3PSI过表达和AtMDH1过表达后拟南芥和烟草叶片代谢低浓度甲醛(2mM)的能力比野生型强。
6、At14-3-3PSI表达改变对AtMDH1的表达量的影响
在At14-3-3PSI过表达拟南芥和At14-3-3PSI表达抑制拟南芥中测定AtMDH1的表达量，以野生型拟南芥Col-0的作为对照，结果如图20所示，At14-3-3PSI过表达拟南芥抑制AtMDH1的表达量，At14-3-3PSI表达抑制拟南芥中AtMDH1的表达量比野生型拟南芥、At14-3-3PSI过表达拟南芥高，At14-3-3PSI过表达抑制AtMDH1的表达量。
7、HCHO胁迫对At14-3-3PSI与AtMDH1互作的影响
(1)用含有重组质粒pCAMBIA1300-nLUC-At14-3-3PSI和pCAMBIA1300-cLUC-AtMDH1的农杆菌(1:1)注射本氏烟叶，以感染本氏烟草的叶片，将一片叶片分成两个区域进行注射。将植物在黑暗中孵育12小时，然后进行16小时/8小时的光/暗转换，循环48小时，之后将叶片剪为左右两半，左边叶片放在缓冲液(含0.5mM KHCO3和1mM MES)中，右边叶片放在2mM甲醛溶液中，6h后，在叶片背面喷洒150μg/mL的D-荧光素钾盐，并将叶片在黑暗中保持5分钟，使用Tanon 5200多化学发光成像***(Tanon，中国)拍摄LUC图像，结果见图21A。甲醛处理之后(右边叶片)比没有甲醛处理的叶片(左边叶片)的荧光信号弱，说明HCHO处理抑制了AtMDH1与At14-3-3PSI相互作用。
(2)为了进一步证实HCHO对它们在拟南芥中相互作用的影响，使用拟南芥叶片进行了Co-IP分析，利用免疫共沉淀来验证HCHO对AtMDH1与At14-3-3PSI蛋白互作的影响
用2mM HCHO甲醛处理At14-3-3PSI过表达拟南芥叶片0h、6h、24h、36h后分别提取其植物总蛋白，取200μg植物总蛋白中加入2μg Myc特异性抗体中，再加入20μL琼脂蛋白A/G，4℃摇床(40rpm)振摇过夜；第二天将其离心5min(4℃、3000rpm)，收集蛋白沉淀，用预冷的PBS(磷酸盐缓冲液)洗涤3次，再将清洗后的沉淀溶解于40μL 1×loadingbuffer，取40μL经SDS-PAGE(12％)电泳分离后，进行Westernblot分析。蛋白经半干电转仪将蛋白转移至PVDF膜上，ATMDH1特异性抗体为一抗4℃过夜孵育，羊抗兔二抗常温孵育2h，通过凝胶成像仪观察实验结果。根据凝胶成像结果分析AtMDH1和At14-3-3PSI蛋白互作水平，结果见图21B；从图中可以看出AtMDH1与At14PSI相互作用，这种相互作用被HCHO处理抑制；
上述结果表明HCHO处理可以削弱At14-3-3PSI与AtMDH1的关联，At14-3-3PSI和AtMDH1之间的相互作用受到HCHO胁迫的抑制，进而缓解At14-3-3PSI蛋白对AtMDH1转录的抑制，从而增强植物中甲醛的代谢；At14-3-3PSI与AtMDH1相互作用，以正调节拟南芥和烟草对HCHO胁迫的耐受性，而AtMDH1也是拟南芥代谢HCHO所必需的。
Claims (1)
1.一种苹果酸脱氢酶基因AtMDH1在提高拟南芥或烟草甲醛吸收代谢能力中的应用，所述苹果酸脱氢酶基因AtMDH1的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
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