CN102533804B - 白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶(As FAD2)基因及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶(As FAD2)基因的序列，以及这种基因序列的制备方法和用途。白沙蒿FAD2基因的制备是用白沙蒿的RNA反转录为cDNA，再根据其它植物的FAD2基因保守区设计相应的简并引物与巢式引物进行扩增得到白沙蒿FAD2基因的全长翻译区核苷酸序列；利用转基因技术进行的功能验证说明该基因表达可以使烟草叶片亚油酸升高3.57倍，并且转基因植物抗冻性明显提高。本发明的白沙蒿FAD2基因可用在油料作物、牧草作物以及其它的植物或非植物的转基因工作中。

Description

白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶(As FAD2)基因及用途

技术领域

本发明涉及一种新的基因序列，以及这种基因序列的制备方法和用途，确切讲本发明涉及白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶(As FAD2)及其制备与用途。

背景技术

Δ12脂肪酸脱氢酶(FAD2)是植物控制亚油酸合成的关键酶，利用相关植物的FAD2基因进行基因重组，所得到的转基因植物或者植物以外其它转基因生物将在脂质代谢、细胞识别、免疫反应、耐寒等诸多方面将有新的表现。例如：中国发明专利申请200580048074.1公开的编码植物脂肪酸去饱和酶基因的核酸分子及其使用方法中涉及了植物中种子贮存化合物的存在相关的蛋白质的编码核酸序列，涉及到在转基因植物中的用途。如：脂质代谢相关化合物的操作方法，以及在植物和种子中提高油水平和改变脂肪酸组成的方法；以及应用这些新的植物多肽刺激植物生长和/或提高产率和/或种子贮存，等内容。中国发明专利申请200810186867.5公开的双途径基因表达同步抑制获得高油酸低芥酸油菜的方法中介绍了利用改良的RNA干扰技术和基因工程手段，对油酸转化为其它脂肪酸的两条代谢途径①和②上的基因表达同时进行干扰沉默，最大限度阻止油酸转化为其它类型的脂肪酸，实现大幅度提高油酸含量和大幅度降低芥酸含量的方法。

在GenBank中已公布花生、芸薹、拟南芥、欧芹、茄和棉花等植物的FAD2基因的核苷酸序列和氨基酸序列。

发明内容

本发明提供一种取自沙生植物-白沙蒿的FAD2基因，以及这种基因的制备方法及用途。

本发明所述的白沙蒿FAD2基因序列为基因序列表中的SEQ 1。

本发明所涉及的白沙蒿FAD2基因制备方法是：首先提取白沙蒿的RNA，再反转录为cDNA；利用GenBank中已公布的其它植物的FAD2基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物P1、P2；以得到的白沙蒿cDNA为模板扩增得到白沙蒿FAD2核心片段核苷酸序列；根据测序得到的FAD2基因核心片段序列分别设计白沙蒿FAD2基因特异引物5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的5’P和5’NP 配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行5’外侧和巢式PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同样根据测序得到的白沙蒿FAD2基因核心片段序列分别设计白沙蒿FAD2基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的3’P和3’NP配对，以白沙蒿cDNA为模板，进行3’外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端核苷酸序列；根据已克隆到的白沙蒿AsFAD25’和3’末端核苷酸序列，设计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到白沙蒿FAD2基因的全长翻译区核苷酸序列。在引物的5’端分别加入BamHI和SacI酶切位点序列，便于后期的基因编码区与植物表达载体重组。

实验表明，构建AsFAD2的表达载体，转染烟草后得到的转基因植物叶片中亚油酸含量提高了3.57倍；在冷冻胁迫(2℃)进行的12小时期间，转基因植物抗冻性明显升高。

据报道，不饱和脂肪酸的增加与植物抗生物(病原体、植物病原体互做等)和非生物胁迫(低温、干旱、盐、重金属等)密切相关，参见：Robert G.Upchurch“Fatty acid unsaturation，mobilization，and regulation in the response of plants to stress”Biotechnol Lett(2008)30：967-977，因此，白沙蒿Δ-12脂肪酸脱氢酶基因有可能在这些过程中发挥作用。

本发明具体采用的相关引物均由大连宝生物合成(宝生物工程有限公司，辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号，邮编116600)，序列如下：

P1：5’-AARAARGYYATYCCRCCVCAYTG-3’，

P2：5’-TKCCAYCRYIKSATWATRWKG-3’；

P3为：5’-ACATTCATGAGCAATAAGCCAAAGACCC-3’，

P4为：5’-TGAGGGAGCTGTGGAATATAAGTTGTGG-3’，

5’P为：5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’，

5’NP为：5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’；

P5为：5’-ACATTCATGAGCAATAAGCCAAAGACCC-3’，

P6为：5’-TGAGGGAGCTGTGGAATATAAGTTGTGG-3’，

3’P为：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’，

3’NP为：5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’。

P7：5’-AGAGGATCCATGGGCGCTGGT-3’

P8：5’-GCGGAGCTCTCAGTCGTACTTGCTTC-3’

其中：R＝Aor G；Y＝C or  T；V＝A or C or G；K＝G orT；S＝C or G；W＝Aor T。

本发明所涉及的白沙蒿FAD2基因可在油料作物的转基因工作中应用，也可在牧草等作物的转基因工作中应用，可在除油料作物和牧草等作物外的其它植物的转基因工作中应用，也可在除植物外的其它生物的转基因工作中应用。

白沙蒿(Artemisia sphaerocephala krasch)是一种优良超旱生固沙植物，是我国沙区畜牧业的重要饲料之一，是我国西北、华北、东北荒漠半荒漠地区的特有植物，其抗风沙，耐旱、耐寒、耐贫瘠性能极强。白沙蒿叶、籽中均含亚油酸乙酯，水解后可得到亚油酸，白沙蒿籽油中亚油酸含量可达80％以上，总不饱和脂肪酸含量可达90％，是籽油中亚油酸含量最高的植物，参见：白寿宁，云秀芳“沙蒿油开发利用探讨”《粮食与油脂》，2000(3)：31-33。白沙蒿籽油中亚油酸含量极高，植物油中亚油酸含量最高的就是沙蒿油(参见表1)。

表1沙蒿油与其他植物油亚油酸含量

油名	亚油酸含量(％)	油名	亚油酸含量.(％)
				沙蒿油	77.4～78.3	棉籽油	40～52
葡萄籽油	58～78	芝麻油	35.2～48.4
				红花油	74.5	花生油	33.4～42
构祀籽油	66.6～67.8	米糠油	28～42
				葵花籽油	66.2	沙棘籽油	40.3
小麦胚芽油	44～65	米胚芽油	38
				核桃油	62.2	橄榄油	3.9～15.0
大麦胚芽油	62	茶籽油	11.4
				玉米胚芽油	36～62	棕搁油	5～11
大豆油	49.5～54.5	椰子油	1.5～2.5

亚油酸作为一种不饱和脂肪酸，对于人类和动物具有不可忽视的营养价值，而不饱和脂肪酸又是植物生物体基本组成之一，具重要生理功能。它们既是细胞膜脂的主要成分，又是重要的能源物质，还是一些信号分子的前体。例如不饱和脂肪酸是生物膜功能所必需的。在生理温度下，仅含饱和脂肪酸的极性甘油脂不能在生物膜中形成双分子层排列。在饱和脂肪酸的适当位置引入一定数目的双键，可增加膜的流动性，这对激活一些结合在膜上的酶是非常重要的，反应了不同温度下生物膜流动性的维持能力。我们推测由于白沙蒿生长在干旱荒漠地区，长期经历干旱、高温、冻害等逆境胁迫，使其自身进化出一定的防御机制，从而提高亚油酸合成量。其亚油酸含量提高的作用机制之一有可能是其FAD2基 因核苷酸编码的氨基酸在催化活性上有特殊性。其次，在干旱、高温、冻害和贫瘠等逆境胁迫下生长的白沙蒿具有抗旱、耐高温、耐冻和耐贫瘠性的品质。因此白沙蒿FAD2基因是一种可对植物，如油料作物，或者牧草作物，或其它的植物，甚至非植物的其它生物进行基因改造的最佳材料。 

根据通常的作法，一般多是采用植物的籽种提取RNA。本发明经相关实验表明，采用白沙蒿的叶片提取其RNA较采用白沙蒿的其它组织提取RNA更为方便，并且本发明提取的FAD2基因在叶片中表达，因此在植物抗逆过程中保持膜脂流动性，发挥着更重要的作用；牧草最大利用部位是其叶片，提高其叶片中亚油酸含量，有利于家畜采食、吸收。经反复试验表明，采用白沙蒿的叶片，特别是用3周龄的嫩叶提取会有极好的效果。

将得到的白沙蒿FAD2基因的全长翻译区构建真核表达载体，在模式植物烟草中验证其功能，结果发现其表达显著的提高了烟草亚油酸含量，并显著增加了其对低温的抗性。

附图说明：

图1：图3-1.AsFAD2基因开放阅读框扩增琼脂糖凝胶电泳图

注：M：DNA分子量标准；1：AsFAD2基因开放阅读框PCR扩增产物2：阳性克隆PCR产物

用引物P7和P8经RT-PCR方法扩增含有BamHI和SacI酶切位点的AsFAD2基因ORF，得到一条清晰的约1200bp的单一亮带，与推测的1175bp一致。将该片段与pSIMPLE-18EcoR V/BAP克隆载体连接后，进行菌落PCR鉴定，结果得到的片段大小与RT-PCR扩增得到的一致(图1)。将该阳性克隆命名为pSI-AsFad2。

图2：图3-2.pSI-AsFad2和PBI121双酶切图

注：M：DNA分子量标准；1：SacI和BamHI双酶切质粒PBI121；2：SacI和BamHI双酶切重组质粒pSI-AsFad2；

将阳性克隆pSI-AsFad2和植物表达载体pBI121提取质粒后分别用SacI和BamHI进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示，pSI-AsFad2经双酶切后有两个片段，大片段为粘性末端pSIMPLE-18EcoR V/BAP载体，小片段为AsFad2基因ORF；pBl121经双酶切后也有两个片段，大片段为粘性末端pBl121载体，小片段为Gus基因片段，说明质粒pSI-AsFad2和pBI121已经切割完全。

图3：白沙蒿PBI121-AsFad2植物表达载体构建示意图

将粘性末端pBl121载体和AsFad2基因ORF进行连接(图3)，转化大肠杆菌反应，然后将阳性克隆质粒进行特异PCR扩增和限制性酶切，结果如图3-4所示，PCR 扩增出的片段和质粒的限制性酶切片段长度均在1200bp左右，大小一致，初步认为AsFad2基因ORF已正确地连接到PBI121表达载体上。阳性克隆菌液送至上海生工测序，测序结果显示目的基因序列正确，***方向准确无误，表明已得到植物表达载体PBI121-AsFad2。

图4重组质粒PBI121-AsFad2双酶切和菌落PCR鉴定

注：M：DNA分子量标准；1：SacI和BamHI双酶切质粒PBI121-AsFad2；2：阳性克隆PCR产物；

图5重组质粒PBI121-AsFad2农杆菌GV3101转化PCR检测图

注：M：DNA分子量标准；1、2、3、4：阳性克隆PCR产物

利用电击转化法，将载体PBI121-AsFad2质粒DNA导入农杆菌GV3101感受态细胞，经PCR扩增，凝胶电泳检测，扩增得到的片段的大小与AsFAD2基因ORF片段大小一致(图5)。表明目的基因已经重组到农杆菌，获得了农杆菌工程菌。

图6：转基因烟草的转化和植株再生过程

注：A烟草与农杆菌共培养；B、C愈伤组织诱导；D、E芽分化；F根分化；

图7：质谱测得的亚油酸结构式。

图8：转基因植物的抗寒性比对照照片。

具体实施方式

以下提供本发明的具体实施方式及相关实验数据：

一、以白沙蒿为材料提取RNA，反转录为cDNA

白沙蒿(Artemisia sphaerocephala)种子采自内蒙古阿拉善左旗，播种在营养钵内，置于温室，按常规方法培养，3周龄时，取幼嫩的叶片为材料，按上海生工(上海生工生物工程技术服务有限公司，上海市松江区车墩工业区香闵路698号，邮编201611)UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒说明书进行RNA提取。按照按宝生物(宝生物工程有限公司，辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号，邮编116600)PrimeScript^TM 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行反转录，得到cDNA。

根据通常的作法，一般多是采用植物的籽种提取RNA。但实验表明，采用白沙蒿的籽种提取RNA非常的困难，经常无法实现操作，经反复试验表明，采用白沙蒿的叶片，特别是用3周龄的嫩叶提取会有极好的效果。

二、核心片段RT-PCR扩增

利用GenBank中已公布的花生、芝麻、芸薹、向日葵、拟南芥、欧芹、茄和棉花等植物FAD2基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计一对简并引物P1、P2。

在200μl PCR管中依次加入下列组分配置PCR反应液：

轻轻混匀，PCR反应条件为：

胶纯化和回收获得的目的基因产物，连接到pGM-T Vector，转化至E.coliDH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定后选取阳性克隆由上海生工进行测序。得到长度大约为880bp白沙蒿FAD2核心片段。

三、白沙蒿FAD2基因5’和3’末端的克隆(5’-RACE和3’-RACE)

3.1白沙蒿总RNA反转录前处量(按照Invitrogen RACE试剂盒操作指南进行)

3.1.1白沙蒿总RNA脱磷酸基团

脱磷酸基团反应：

(1)取1.5ml离心管置于冰上，依次加入下列试剂：

(2)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(3)50℃温育1h，短暂离心后置于冰上。

RNA沉淀反应：

(1)加入90μl DEPC水、100μl酚∶氯仿(25∶24)，漩涡震荡30s。

(2)20℃下12000rpm离心5min，吸取上清(约100μl)转移至新的离心管中。

(3)依次加入2μl 10mg·ml^-1 Mussel Glycogen、10μl 3mol·L^-1NaAc(pH5.2)和220μl 95％乙醇，颠倒混匀，冰浴10min。

(4)4℃、12000rpm离心20min，弃上清，小心不要弃掉沉淀，加入500μl 70％乙醇，颠倒混匀。

(5)4℃、12000rpm离心20min，小心吸去乙醇，再次离心弃去残留乙醇。

(6)20℃下干燥沉淀1-2min，加入7μl DEPC水溶解，为下步去帽反应备用。

3.1.2白沙蒿mRNA去除帽子结构

去帽反应：

(1)取1.5ml离心管置于冰上，依次加入下列试剂：

(2)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(3)37温育1h，短暂离心后置于冰上。

RNA沉淀反应：方法同3.1.1。

3.1.3去帽后的白沙蒿mRNA和RNA oligo连接

连接反应：

(1)在含有0.25μg GeneRacer^TM RNA Oligo的离心管中加入7μl上述反应液，轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(2)65℃温育5min，消除RNA二级结构。

(3)冰浴2min，短暂离心。

(4)依次加入以下试剂：

(5)轻轻混匀，短暂离心。

(6)37℃温育1h，短暂离心后置于冰上。

RNA沉淀反应：方法同3.1.1。沉淀用10μl DEPC水溶解。

3.2第一链cDNA的合成

(1)在上述获得的10μl ligated RNA中加入下列试剂：

(2)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(3)65℃温育5min以除去RNA二级结构，冰浴1min，短暂离心收集液体。

(4)于冰上依次加入下列试剂：

(5)轻轻混匀，短暂离心收集液体。

(6)25℃温育5min，50℃温育1h，70℃温育5min，冰浴2min，短暂离心收集液体。

(7)加入1μl RNase H(2U·μl^-1)，37℃温育20min，短暂离心收集液体。

(8)-20℃保存备用或即可进行5’和3’外侧PCR扩增反应。

3.35’末端PCR扩增

根据已测序得到的FAD2基因核心片段序列分别设计5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的5’P和5’NP配对。以3.2中所述获得的白沙蒿cDNA为模板进行5’外侧和巢式PCR扩增反应。

5’外侧PCR扩增

在200μl PCR管中按下列组分配置PCR反应液：

轻轻混匀，短暂离心，PCR反应体系如下：

取5μl PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的片段。

5’巢式PCR扩增

在200μl PCR管中按下列组分配置PCR反应液：

轻轻混匀，短暂离心，PCR反应体系如下：

取5μl PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的片段。

胶纯化和回收获得的目的基因5’端PCR产物，连接到pGM-T Vector，转化至E.coli DH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定后选取阳性克隆由上海生工进行测序。

3.43’末端PCR扩增

根据已测序得到的白沙蒿FAD2基因核心片段序列分别设计3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的3’P和3’NP配对。以3.2中获得的白沙蒿cDNA为模板进行3’外侧和巢式PCR扩增。

3’外侧PCR扩增

在200μl PCR管中依次配置下列PCR反应液：

轻轻混匀后短暂离心，PCR反应条件如下：

取5μl PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的片段。

3’巢式PCR扩增

在200μl PCR管中依次配置下列PCR反应液：

轻轻混匀后短暂离心，PCR反应条件如下：

取5μl PCR 产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的片段。

胶纯化和回收获得的目的基因5’端PCR产物，连接到pGM-T Vector，转化至E.coli DH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定后选取阳性克隆由上海生工进行测序。

经过测序，5’和3’RACE巢式PCR扩增产物分别为344bp和512bp，与前述所得到的白沙蒿Δ12-脂肪酸脱氢酶核心片段都有部分核苷酸重叠，并且在与GeneBank中比对发现扩增出来的片段与其他植物Δ12-脂肪酸脱氢酶基因5’和3’端具有同源性。因此，扩增得到的5’和3’RACE-PCR产物分别为同一cDNA的5’和3’端。

四、PCR扩增翻译区全长序列

根据已克隆到的白沙蒿AsFAD25’和3’末端核苷酸序列，设计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，扩增得到白沙蒿FAD2基因的全长翻译区核苷酸序列(图1)。在引物的5’端分别加入BamHI和SacI酶切位点序列，便于后期的基因编码区与植物表达载体重组。

在200μl PCR管中依次配置下列PCR反应液：

轻轻混匀后短暂离心，PCR反应条件如下：

取5μl PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的片段。

胶纯化和回收获得的目的基因产物，连接到pGM-T Vector，转化至E.coliDH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定后选取阳性克隆由上海生工进行测序。得到全长为1158bp的白沙蒿FAD2基因全长翻译区cDNA序列，参见基因序列表 中SEQ1。

五、白沙蒿Δ12-脂肪酸脱氢酶基因植物高效表达载体构建及在烟草中的转化

5.1材料

5.1.1植物材料：烟草NC89。

5.1.2菌株及载体

大肠杆菌TOP10感受态细胞，PGM-T载体克隆试剂盒购自北京天根。

农杆菌菌株GV1301，植物表达载体PBI121均为本室保存。

5.1.3酶及分子生物学试剂

UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit、高保真DNA聚合酶、TaKaRa DNA Kination Kit均购自TaKaRa。质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。DNA快速纯化/回收试剂盒、6-BA、NAA均购自北京鼎国生物技术有限公司。限制性内切酶、T4DNA连接酶购自Fermentas。卡那霉素(Kan)，头孢霉素(Cefo)和利福平(Rif)购自Sigma。其它试剂均为国产分析纯。引物合成和序列测定由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

5.1.4主要仪器

SW-CJ-1G型单人超净工作台，RXZ智能型人工气候箱，紫外分光光度计( ND-1000)，恒温培养摇床(SUKUN SKY-2102C)，电转化仪(BLO-RAD Micropulserim)。

5.1.5培养基

YEB培养基；MS培养基

分化培养基：

MS+Kan(100mg/L)+Cefo(200mg/L)+NAA(0.1mg/L)+6-BA(1.5mg/L)

生根培养基：

1/2MS+Kan(100mg/L)+Cefo(200mg/L)+NAA(0.02mg/L)

5.2方法

5.2.1植物表达载体构建(图2)

5.2.1.1引物设计与合成

根据已克隆到的白沙蒿fad2全长基因核苷酸序列，设计与该基因编码区两端特异的引物P7、P8，在引物的5’端分别加入BamHI和SacI酶切位点序列。

4.2.1.2PCR扩增

在200μl PCR管中依次配置下列PCR反应液：

取5μl PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，检测目的片段。

5.2.1.3PCR反应液中DNA片段的5’末端磷酸化反应

参照TaKaRa DNA KinationKit试剂盒说明书，方法如下：

(1)在200μl离心管中配制下列反应液，全量为20μl。

(2)37℃反应30min。

(3)70℃加热5-10min使酶失活。

(4)取5μl的上述溶液在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳，对上述溶液中的DNA进行粗定量。

5.2.1.45’末端磷酸化的DNA片段与pSIMPLE-18EcoR V/BAP Vector的连接及转化

参照TaKaRa DNA Kination Kit试剂盒说明书，方法如下：

(1)在200μl离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μl。

(2)加入5μl的Solution I。

(3)16℃反应1h。

(4)全量转化至DH5α感受态细胞中。

5.2.1.5阳性克隆的筛选、鉴定和序列分析

选取序列分析正确的活性较高的重组质粒菌液命名为pSI-AsFad2，进行后续实验。

5.2.1.6pSI-AsFad2和PBI 121的质粒提取

参照北京天根质粒大提试剂盒说明书进行。

5.2.1.7pSI-AsFad2和PBI 121质粒的酶切回收(图3) 

将含有目的片段的质粒pSI-Fad2与PBI121质粒分别进行BamHI和SacI双酶切，二者方法相同，如下：

(1)在200μl离心管中按下列酶切体系加入各试剂：

(2)混合均匀，轻微短暂离心，将液体收集到管底。

(3)37℃温育2h。

(4)1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果、回收酶切目的片段。混匀后短暂离心。

5.2.1.8酶切片段连接

(1)在200μl离心管中按下列酶切体系加入各试剂：

(2)混合均匀，轻微短暂离心3-5秒。

(3)22℃温育18h。

(4)65℃，10min，使T4DNA Ligase失活。

(5)吸取10μl转化至DH5α感受态细胞中。

5.2.1.9重组质粒的筛选、鉴定和序列分析(图4)

选取一管序列分析正确的活性较高的重组质粒菌液菌液命名为PBI121-AsFad2，提取质粒，进行后续实验。

5.2.2烟草的遗传转化

5.2.2.1农杆菌GV3101感受态细胞的制备(山梨醇法)

(1)挑取单菌落接种于10mL YEB液体培养基中，28℃过夜震荡培养14～16h。

(2)4℃，6000rpm，5min，弃上清，收集菌体，在无菌滤纸上控干后置于冰上。

(3)加入预冷的1mL 10％甘油重新悬浮菌体，冰水浴5min。

(4)4℃，6000rpm，5min，弃上清，离心收集菌体，控干。

(5)重复步骤(4)两次。

(6)用0.5mL预冷的1M 山梨醇重新悬浮菌体。

(7)每管40μl分装，液氮速冻后放入-70℃保存或4℃保存备用。

5.2.2.2农杆菌GV3101转化(电击法)

(1)取40μl冰上刚刚溶解的GV3101感受态细胞，加入10μl冰上预冷的PBI121-Fad2重组质粒轻弹混匀。

(2)电击转化仪选“bacterial protocol screen”中的“A.tumefaciens”。

(3)将步骤(1)混匀的样品加入无菌、干燥预冷处理过的电击杯，将电击杯 放入ShockPod，盖上盖子。

(4)按下“plus”键后取出电击杯，立即加入1mL YEB液体培养基，转移至1.5mL离心管中，记录并检查电击时间、电压是否正确。

(5)30℃，200rpm震荡培养3h。

(6)取500μl菌液涂于含有卡那霉素(终浓度100μg/mL)和利福平(终浓度50μg/mL)的YEB固体培养基平板上，28℃暗培养2～3d，观察转化效率。5.2.2.3含有重组质粒PBI121-Fad2的农杆菌PCR鉴定(图5) 

挑取YEB平板上的单菌落，接种于2mLYEB液体培养基(含有卡那霉素100μg/mL和利福平50μg/mL)，28℃200rpm暗培养1～2d，以未转化的农杆菌作对照，进行菌落PCR鉴定。

5.2.2.4烟草的遗传转化(叶盘法)(图6)

(1)将含有植物表达载体的农杆菌菌液均匀涂与YEB平板(含有卡那霉素100μg/mL和利福平50μg/mL)，28℃培养过夜。

(2)用枪头轻轻刮取菌体，转入MS液体培养基中，使悬浮液OD600≈0.5。

(3)将烟草无菌苗叶片剪去叶缘和主叶脉，剪成0.5cm大小方块。

(4)将切好的外植体在悬浮好的农杆菌菌液(OD600≈0.5)中浸泡5-10分钟。

(5)在无菌滤纸上将叶片表面菌液吸干，上表面朝下转入表面铺有一层滤纸的MS固体培养基上，28℃暗培养3天。

(6)将叶片从共培养基上转接至分化培养基上，每两周继代一次。

(7)待抗性芽长至2-3cm高时，将芽转接至生根培养基上进行生根培养。

六、转白沙蒿Δ12-脂肪酸脱氢酶基因烟草亚油酸含量测定

6.1亚油酸前处理方法：

将烟草叶片于液氮中研磨成粉状后，取1g(精确到0.1g)样置于带盖子的离心管中，加入12ml氯仿/甲醇/甲酸(体积比为10∶10∶1)，于-20℃冰箱中过夜。离心，取上清液，再加入4.4ml氯仿/甲醇/水(体积比为5∶5∶1)后离心，合并两次上清液。加入6ml含浓度0.2M H₃PO₄和1M KCl溶液，清洗有机相。将有机相用N2吹干后，加入0.5ml氯仿溶解，转移至圆底烧瓶中加入1ml2.5％的硫酸甲醇溶液，于80℃水浴下回流反应90分钟，冷却至室温，加入1.5ml0.9％氯化钠和1ml正己烷，振摇后用胶头滴管取上清液，过0.45微米的滤膜后于4℃保存，待测。

6.2脂肪酸的检测：

使用美国Agilent公司6890N型气相色谱仪和5975C质谱仪，采用自动进样，每个样品连续进样六次。

色谱条件：采用石英毛细管柱(Agilent DB-FFAP，30.0m×250.0μm×0.5μm，最高温度250℃)进样量为0.2μl；分流比为10∶1；进样口温度为200℃；程序升温：从150℃开始，保持3min，以15℃/min升至210℃，保持12分钟；柱流速为1.1ml/min；载气为高纯氦气(99.999％)。

质谱条件：电离源为70eV；离子源温度230℃；四级杆温度150℃；界面温度为250℃；溶剂延迟为1.5min。

6.3样品的测定(图7)

通过NIST谱图库检索，并配合脂肪酸标准物质比对，进行脂肪酸定性，通过标准曲线进行定量。

6.4对照与转基因植物亚油酸含量检测

表1对照与转基因植物亚油酸含量检测

经过GC-MS检测，发现转白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶基因显著增加了其叶片的亚油酸含量。转基因植物叶片亚油酸含量是非转基因植物的3.57倍。

6.5对照与转基因植物抗冻性检测

结果表明转基因植物的抗寒性比对照有明显增加：2℃处理12小时，对照发生了明显的萎蔫，而转基因植物表型基本正常(图8)。

表2对照与转基因植物脯氨酸及丙二醛含量

低温处理后，脯氨酸作为一种渗透保护物质在转基因植物中含量未发生明显变化，而野生型烟草中其含量只有正常温度下的42％。膜脂过氧化产物丙二醛在野生型烟草冷冻处理后显著升高，是对照的2.86倍；而转基因烟草丙二醛含量没有明显变化。这些都充分说明白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶在烟草中的表达提高了其抗冻性。

Claims (7)

1.一种白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶基因的制备方法，其特征是首先提取白沙蒿的RNA，再反转录为cDNA；利用GenBank中已公布的其它植物的FAD2基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，根据保守区设计合成一对简并引物P1、P2；以得到的白沙蒿cDNA为模板扩增得到白沙蒿FAD2核心片段核苷酸序列；根据测序得到的FAD2基因核心片段序列分别设计白沙蒿FAD2基因特异引物5’端外侧引物P3和巢式引物P4，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的5’P和5’ NP配对，以白沙蒿cDNA为模板, 进行5’外侧和巢式PCR扩增反应，得到5’末端核苷酸序列；同样根据测序得到的白沙蒿FAD2基因核心片段序列分别设计白沙蒿FAD2基因特异引物3’端外侧引物P5和巢式引物P6，分别与GeneRacer^TM试剂盒中自带的3’P和3’ NP配对，以白沙蒿cDNA为模板, 进行3’外侧和巢式PCR扩增，得到3’末端核苷酸序列；将所得到的三段序列：白沙蒿FAD2核心片段核苷酸序列、5’末端核苷酸序列和3’末端核苷酸序列进行拼接，得到目标基因，所使用的引物为：

上游引物P1为：

5’-AARAARGYYATYCCRCCVCAYTG-3’，

下游引物P2为：

5’-TKCCAYCRYIYSATWATRW KG-3’，

P3为：5’-ACATTCATGAGCAATAAGCCAAAGACCC -3’，

P4为：5’-TGAGGGAGCTGTGGAATATAAGTTGTGG -3’，

5’P为：5’-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3’，

5’NP为：5’-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3’，

P5为：5’-ACATTCATGAGCAATAAGCCAAAGACCC -3’，

P6为：5’-TGAGGGAGCTGTGGAATATAAGTTGTGG -3’，

3’P为：5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3’，

3’NP为：5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3’，

其中：R=A or G；Y=C or T；V=A or C or G；K=G or T；S=C or G；W=A or T。

2.根据权利要求1所述的白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶基因的制备方法，其特征是采用白沙蒿的叶片提取RNA。

3.权利要求2所述的白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶基因的制备方法，其特征在于制备的白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶基因序列为SEQ ID No1。

4.权利要求3所述的白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶基因在油料作物的转基因工作中的应用。

5.权利要求3所述的白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶基因在牧草作物的转基因工作中的应用。

6.权利要求3所述的白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶基因在除权利要求4或5所述的植物外的植物中的转基因工作中的应用。

7.权利要求3所述的白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶基因在除植物外的其它生物的转基因工作中的应用。