CN115927325A - 柠檬酸合酶启动子突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域，具体涉及柠檬酸合酶基因启动子的突变体，包含启动子突变体的转录表达盒、重组表达载体、重组微生物宿主细胞，以及利用该启动子增强目标基因的表达、制备蛋白以及生产目标化合物的方法。本发明提供的具有增强的启动子活性的核酸分子表现出比野生型更高的启动子活性，可用于增强目的基因的表达，例如与gltA基因可操作地连接，可以增强柠檬酸合酶的表达强度，由此提高了重组菌株的氨基酸例如谷氨酸生产效率，具有较高的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及柠檬酸合酶基因启动子的突变体，包含启动子突变体的转录表达盒、重组表达载体、重组微生物宿主细胞，以及利用该启动子增强目标基因的表达、制备蛋白以及生产目标化合物的方法。
背景技术
谷氨酸是全球产量最大的氨基酸品种，作为构成蛋白的20种常见氨基酸之一，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，被广泛应用于医药、健康、食品、动物饲料和化妆品等行业中，主要由谷氨酸棒杆菌发酵生产。随着生物技术的不断发展，对棒杆菌进行代谢工程改造提高其谷氨酸产量的报道逐渐增多，如增强丙酮酸脱氢酶的活性，增强谷氨酸运输蛋白的活性，引入磷酸转酮酶活性等。
柠檬酸合酶，由
gltA基因编码，可催化草酰乙酸和乙酰辅酶A生成柠檬酸和辅酶A。据CN1261627A报道，在大肠杆菌中引入来自乳发酵短杆菌的柠檬酸合酶，可以提高大肠杆菌的谷氨酸产量。CN105695383B报道了在谷氨酸棒杆菌中利用内源强组成型启动子Ptuf过表达柠檬酸合酶，可以有效提高谷氨酸的产量。本领域技术人员都知晓，增强酶的表达的方法有很多，如增加拷贝数、替换强启动子等等。由于增加拷贝数会在一定程度上增加菌株的负担，可能导致菌株的基因组不稳定，而启动子对基因的表达调控不存在以上缺陷，因此，对于提高棒杆菌谷氨酸的生产效率来说，本领域需要开发适配于目标基因如
gltA的启动子，以便更高效地表达柠檬酸合酶，从而提高菌株谷氨酸的生产效率，较低生产成本。
发明内容
第一方面，本发明提供了具有启动子活性的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
其中，所述“多核苷酸”、“核酸分子”、“核酸”可以互换，均指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法（例如，使用克隆载体）识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列（即A、T、G、C）表示时，这也包括一个RNA序列（即A、U、G、C），其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸（单独的片段或整个片段）中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。
所述“野生型的”指在自然界中可以找到的对象。例如，一种存在于生物体中，可以从自然界的一个来源中分离出来并且在实验室中没有被人类有意修改的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。如本公开所用的，“天然存在的”和“野生型的”是同义词。在一些实施方式中，本公开中野生型的启动子是指野生型
gltA基因的启动子，也即如SEQ ID NO：1所示序列的多核苷酸。
所述“突变体”是指相对于“野生型”，或者“相比较的”多核苷酸或多肽，在一个或多个（例如，若干个）位置处包含改变（即，取代、***和/或缺的多核苷酸，其中，取代是指用不同的核苷酸置换占用一个位置的核苷酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸。***是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸之后添加核苷酸。在具体的实施方式中，所述“突变”为“取代”，是由一个或多个核苷酸中的碱基被另一个不同的碱基取代所引起的突变，也称为碱基置换突变（subsititution）或点突变（point mutation）。
所述“启动子”是指一种核酸分子，通常位于目的基因编码序列的上游，为RNA聚合酶提供识别位点，并位于mRNA转录起始位点的5’方向的上游。它是不被翻译的核酸序列，RNA聚合酶与这一核酸序列结合后启动目的基因的转录。所述“RBS”是指核糖体结合位点（ribosomebinding site），是指mRNA的起始AUG上游的一段非翻译区，可被16SrRNA识别，起始翻译。
本发明的启动子的突变体是改进的谷氨酸棒杆菌的
gltA基因的启动子，它比野生型启动子具有更高的启动子活性，如提高至少1.6倍以上。
第二方面，本发明提供了包含所述柠檬酸合酶基因启动子的突变体的表达盒、重组载体。
所述“表达盒”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即含有启动子、目的基因并且能够将目的基因进行表达的元件。在一个具体的实施方式中，目的基因是编码柠檬酸合酶的基因，更优选所述编码柠檬酸合酶的基因，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4所示的柠檬酸合酶。
术语“载体”指的是DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列，从而在合适的宿主中表达目的基因。本发明所使用的载体并没有特别的限制，可为本领域中已知的任何载体，只要它能够在宿主中进行复制即可。即所述载体包括但不限于质粒，噬菌体，例如本发明具体实施例中使用的pEC-XK99E质粒。一旦转化入合适的宿主之后，所述载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在某些情况下整合入基因组本身。
第三方面，本发明提供了含有所述柠檬酸合酶基因启动子的突变体的重组宿主细胞。
重组宿主细胞具体通过转化来实现。此处“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO4)沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
本发明所述“微生物宿主细胞”是具有本领域普通技术人员通常理解的含义，即，能够导入本发明的具有启动子活性的核酸分子的细胞，导入之后称为重组微生物宿主细胞。换言之，本发明可以利用任何宿主细胞，只要其细胞中含有本发明的具有启动子活性的核酸，并且与某一基因可操作性地连接介导该基因的转录。本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，优选肠杆菌或棒杆菌，更优选谷氨酸棒杆菌，包括但不限于谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067，以及由上述菌株制备的产生L-氨基酸的突变体或菌株。
示例地，所述生产谷氨酸的宿主细胞可以是在谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基础上，选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：
a. 编码α-酮戊二酸脱氢酶的
odhA基因。
b.编码琥珀酸脱氢酶的
sucA基因。
在一些实施方式中，示例地，所述宿主细胞中选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：
a. 编码丙酮酸羧化酶的
pyc基因；
b. 编码谷氨酸脱氢酶的
gdh基因；
c. 编码柠檬酸合酶的
gltA基因；
d. 编码天磷酸转酮酶的
fxpk基因；
e.编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的
ppc基因；
f. 编码磷酸盐转运蛋白的
pitA基因；
g.编码机械敏感通道蛋白的
yggB基因。
在本发明中，所述宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
第四方面，本发明提供了一种增强目的基因表达的方法，所述方法包括将所述谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体与目的基因可操作地连接。
本发明中的术语“可操作地连接”是指本发明的柠檬酸合酶基因启动子的突变体与编码基因功能性连接，以启动和介导所述基因的转录，表明本发明的柠檬酸合酶基因启动子的突变体与编码基因可操作地连接以控制操纵子基因的转录活性。所述可操作地连接的方式可以采用本领域技术人员所述的任何方式。本发明所述的增强目的基因表达的方法中，利用本发明的所述谷氨酸脱氢酶基因启动子的突变体的基础上，采用包括本领域技术人员通常使用的方法实现。
在一个具体实施方式中，所述编码基因是柠檬酸合酶的基因，所述柠檬酸合酶的基因如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
进而，第五方面，本发明提供了一种生产氨基酸的方法，所述方法包括培养含有所述柠檬酸合酶基因启动子的突变体与编码柠檬酸合酶的基因可操作地连接的宿主细胞，收集产生的氨基酸。其中，所述氨基酸包括脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、鸟氨酸、谷氨酸酰胺、5-氨基乙酰丙酸等。更优选地，所述氨基酸生产相关的基因包括但不限于
gdh基因，
lysC基因、
thrABC基因、
asd基因、
aspB基因、
hom基因、
metX基因、
dapA基因、
dapB基因、
ddh基因、
proB基因、
proA基因、
proC基因、
putA基因、
hemA基因等。通过本发明的方法，可以提高菌株的氨基酸，特别是脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、鸟氨酸、谷氨酸酰胺、5-氨基乙酰丙酸的产量。
本发明所述的生产氨基酸的方法中，利用本发明的所述柠檬酸合酶基因启动子的突变体的基础上，采用包括本领域技术人员通常使用的方法，同时也包括从细胞或培养液中回收氨基酸的步骤。从细胞或培养基中回收氨基酸的方法是本领域公知的，包括但不限于：过滤、阴离子交换色谱、结晶和HPLC。
在本发明的一个具体实施方式中，所述宿主细胞是谷氨酸棒杆菌，进一步地经过改良，具体地是在所述菌中的
NCgl1221同源基因（BBD29_06760或
yggB）中引入A111V突变，获得谷氨酸生产菌株SCgGC5。
本发明的有益效果：本发明提供的具有增强的启动子活性的核酸分子表现出比野生型更高的启动子活性，可用于增强目的基因的表达，例如与
gltA基因可操作地连接，可以增强柠檬酸合酶的表达强度，由此提高了重组菌株的氨基酸例如谷氨酸生产效率，具有较高的应用价值。
具体实施方式
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的意义相同。虽然可利用与本文所述相似或等价的任何方法和材料来实施或检验本发明，但优选此处提供的方法和材料。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (New York: Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例中所用的培养基如下：
TSB平板培养基成份为（g/L）：葡萄糖，5 g/L；酵母粉，5 g/L；大豆蛋白胨，9 g/L；尿素，3 g/L；丁二酸，0.5 g/L；K2HPO4·3H2O，1 g/L；MgSO4·7H2O，0.1 g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1 mg/L ；MOPS，20 g/L；琼脂粉，15 g/L。
TSB液体培养基成份为（g/L）：葡萄糖，5 g/L；酵母粉，5 g/L；大豆蛋白胨，9 g/L；尿素，3 g/L；丁二酸，0.5 g/L；K2HPO4·3H2O，1 g/L；MgSO4·7H2O，0.1 g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1 mg/L ；MOPS，20 g/L。
谷氨酸发酵实验使用的种子培养基成份为：葡萄糖，25 g/L；KH2PO4·3H2O，2.2 g/L；尿素，3 g/L；玉米浆，33 mL；MgSO4·7H2O，0.9 g/L；豆饼水解液，22 mL；MOPS，20 g/L；初始pH7.2。
谷氨酸发酵实验使用的发酵培养基成份为：葡萄糖，80 g/L；KH2PO4，1 g/L；尿素，10 g/L；玉米浆干粉，5 g/L；MgSO4·7H2O，0.4 g/L；FeSO4·7H2O，10 mg/L；MnSO4·4H2O，10mg/L；VB1，200 μg/L；MOPS，40 g/L；初始pH7.5。
实施例1 谷氨酸棒杆菌
gltA启动子的强度表征
（1）谷氨酸棒杆菌
gltA启动子表征载体构建
根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组（GenBank: CP016335.1）序列，设计扩增引物gltA-1/2，以ATCC 13869基因组为模板，扩增包含
gltA基因的野生型启动子PgltA-WT（序列如SEQ ID NO：1所示）以及N端162 bp序列的片段。以文献报道的pEC-XK99E-
rfp质粒（王迎春等. 基于时间序列转录组筛选谷氨酸棒杆菌内源高效组成型启动子 [J].生物工程学报,2018,34(11):1760-1771）为模板，分别以PEC-1/2为引物扩增pEC-XK99E质粒骨架，以RFP-1/2为引物扩增包含连接肽（DNA序列为：GGCGGTGGCTCTGGAGGTGGTGGGTCCGGCGGTGGCTCT）的红色荧光蛋白基因DNA片段。本实施例所用引物见表1。上述片段回收纯化后利用诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得pEC-XK99E-PgltA-WT-
rfp表征载体。
（2）谷氨酸棒杆菌
gltA突变启动子表征载体构建
对野生型
gltA启动子进行随机突变，发现在野生型启动子的475-476位的突变具有更高的启动活性。随后，对该启动子突变体进行如下表征。设计引物PgltA-Ts24-F/R，以上述pEC-XK99E-PgltA-WT-
rfp表征载体为模板反向扩增，片段经T4 PNK进行末端磷酸化处理后用T4连接酶进行连接，获得突变型启动子PgltA-Ts24（序列如SEQ ID NO：2所示）的表征载体pEC-XK99E-PgltA-Ts24-
rfp。
表1 构建表征载体引物
| 引物 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO： |
| gltA-1 | CCTGATGCGGTATTTTCTCCCCCAAACGATGAAAAACGCCC | SEQ ID NO：5 |
| gltA-2 | CCACCTCCAGAGCCACCGCCGGAGCCAGTGCTCACATAACCTG | SEQ ID NO：6 |
| PEC-1 | CTGCAGGCATGCAAGCTTGG | SEQ ID NO：7 |
| PEC-2 | GGAGAAAATACCGCATCAGGC | SEQ ID NO：8 |
| RFP-1 | GGCGGTGGCTCTGGAGGTGGTGGGTCCGGCGGTGGCTCTGCTTCCTCCGAAGACGTTATCAAAG | SEQ ID NO：9 |
| RFP-2 | CCAAGCTTGCATGCCTGCAGTTAAGCACCGGTGGAGTGACGAC | SEQ ID NO：10 |
| PgltA-Ts24-F | TATCGGTATAATGTGTTAACCGGACCA | SEQ ID NO：11 |
| PgltA-Ts24-R | AATGCGGTTTAGCCATATCCGAA | SEQ ID NO：12 |
（3）谷氨酸棒杆菌
gltA突变启动子强度表征
将上述表征载体分别转化至谷氨酸棒杆菌ATCC 13869，涂布于含有25 μg/mL卡那霉素的TSB固体平板，获得重组菌株。接种转化子至每孔含有800 μL TSB液体培养基的24孔板中，每个菌株3个平行，孔板摇床转速为800 rpm，30℃培养16 h后利用酶标仪检测菌株的荧光强度。荧光测定激发波长为560 nm，发射波长为607 nm；同时测定菌液OD600，计算菌株的荧光强度，结果见表2。可以看出，突变型启动子PgltA-Ts24的活性明显提高，比野生型启动子提高了1.6倍。
表2
gltA启动子突变体的荧光表征
| 启动子编号 | <![CDATA[荧光强度（RFU/OD<sub>600</sub>）]]> | 比野生型提高的倍数 | 启动子完整序列的序列号 |
| <![CDATA[P<sub><i>gltA-</i>WT</sub>]]> | 2452±90 | —— | SEQ ID NO：1 |
| <![CDATA[P<sub><i>gltA</i>-Ts24</sub>]]> | 6393±160 | 1.6 | SEQ ID NO：2 |
实施例2谷氨酸棒杆菌
gltA基因启动子突变体与GltAC361Y应用于L-谷氨酸生产
（1）谷氨酸棒杆菌
gltA基因过表达质粒的构建
根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组（GenBank: CP016335.1）序列，设计引物PgltA-UH-F/R和PgltA-DH-F/R，以ATCC 13869基因组为模板，扩增包含突变型启动子P gltA-Ts24的上游和下游重组片段。根据质粒pK18mob
sacB的序列信息设计引物pK-F/R，以质粒pK18mob
sacB为模板，通过PCR反向扩增获得线性化载体片段。上述三片段回收后重组连接，获得带有P gltA-Ts24突变启动子的编辑质粒pK18-P gltA-Ts24。
（2）谷氨酸棒杆菌GltAC361Y基因突变体质粒的构建
通过前期对柠檬酸合酶GltA蛋白结构的模拟，预测其361位是蛋白活性的关键靶点，通过对该位点的突变，获得了GltAC361Y突变体，因此，本实施例进一步对P gltA-Ts24突变启动子表达GltAC361Y突变体基因的情况进行了验证。
首先，根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组（GenBank: CP016335.1）序列，设计引物gltA-F1/R1和gltA-F2/R2，以ATCC 13869基因组为模板，扩增包含GltAC361Y突变体的上游和下游重组片段，野生型
gltA基因序列如SEQ ID NO：3所示，突变后的
gltA基因序列如SEQ ID NO：4所示。根据质粒pK18mob
sacB的序列信息设计引物pK-F/R，以质粒pK18mob
sacB为模板，通过PCR反向扩增获得线性化载体片段。上述三片段回收后重组连接，获得带有GltAC361Y突变体的编辑质粒pK18-GltAC361Y。
（3）L-谷氨酸生产菌株构建
已有文献报道了在谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组
NCgl1221同源基因（BBD29_06760或
yggB）中引入A111V突变，可以使菌株具备组成型合成分泌L-谷氨酸的能力。为了验证上述启动子在L-谷氨酸生产中的应用，首先在谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组中引入上述突变。
根据已公开的谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基因组（GenBank: CP016335.1）序列，设计引物A111V-UH-F/R和A111V-DH-F/R。以ATCC13869基因组为模板，分别利用上述引物通过PCR扩增获得带有YggBA111V突变的DNA片段；根据质粒pK18mob
sacB的序列信息设计引物pK-F/R，以质粒pK18mob
sacB为模板，通过PCR反向扩增获得线性化载体片段；上述三片段回收后重组连接，对化转后所获得的克隆进行收集并提取质粒，获得YggBA111V突变的编辑载体pK18-YggBA111V。
采用文献报道的方法制备
C. glutamicum ATCC 13869感受态细胞（Biotechnology Letters, 2015, 37: 2445-52.），向上述制备获得的13869感受态细胞电转化1 μg的pK18-YggBA111V质粒，加入1 mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6 min，30℃孵育3 h，涂布含有25 μg/mL卡那霉素的TSB固体培养基，30℃培养1天，获得第一次重组的转化子。正确转化子转接含有5 g/L葡萄糖的TSB培养基过夜培养，然后转接含有100 g/L蔗糖的TSB培养基，30℃培养6 h后涂布于添加100 g/L蔗糖的TSB培养基进行筛选，获得L-谷氨酸生产菌株SCgGC5。本实施例所用引物见表3。
采用文献报道的方法制备L-谷氨酸生产菌株SCgGC5感受态细胞（Improving theelectro-transformation efficiency of Corynebacterium glutamicum by weakeningits cell wall and increasing the cytoplasmic membrane fluidity, BiotechnologyLetters, 2015, 37: 2445-52.），向上述制备获得的SCgGC5感受态细胞电转化1 μg的pK18-GltAC361Y质粒，加入1 mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6 min，30℃孵育3 h，涂布含有25 μg/mL卡那霉素的TSB固体培养基，30℃培养24 h，获得第一次重组的转化子。正确转化子转接含有5 g/L葡萄糖的TSB培养基过夜培养，然后转接含有100 g/L蔗糖的TSB培养基，30℃培养4 h后涂布于添加100 g/L蔗糖的TSB培养基进行筛选，获得带有GltAC361Y突变体的菌株SCgGC7。
采用文献报道的方法制备L-谷氨酸生产菌株SCgGC5感受态细胞，向上述制备获得的SCgGC5感受态细胞电转化1 μg的pK18-P gltA-Ts24质粒，加入1 mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6 min，30℃孵育3 h，涂布含有25 μg/mL卡那霉素的TSB固体培养基，30℃培养24h，获得第一次重组的转化子。正确转化子转接含有5 g/L葡萄糖的TSB培养基过夜培养，然后转接含有100 g/L蔗糖的TSB培养基，30℃培养4 h后涂布于添加100 g/L蔗糖的TSB培养基进行筛选，获得带有突变型启动子P gltA-Ts24的L-谷氨酸生产菌株SCgGC8。
利用上述相同的方法制备L-谷氨酸生产菌株SCgGC8的感受态细胞，向上述感受态细胞电转化1 μg的pK18-GltAC361Y质粒，加入1 mL 46℃预热的TSB培养基，46℃孵育6 min，30℃孵育3 h，涂布含有25 μg/mL卡那霉素的TSB固体培养基，30℃培养24 h，获得第一次重组的转化子。正确转化子转接含有5 g/L葡萄糖的TSB培养基过夜培养，然后转接含有100g/L蔗糖的TSB培养基，30℃培养6 h后涂布于添加100 g/L蔗糖的TSB培养基进行筛选，获得带有突变型启动子P gltA-Ts24和GltAC361Y突变体的L-谷氨酸生产菌株SCgGC9。
表3本实施例所用引物
| 引物 | 核苷酸序列 | SEQ ID NO： |
| A111V-UH-F | tgacatgattacgaattcATCCACTGGAGTTTTGCCAATTCTC | SEQ ID NO：13 |
| A111V-UH-R | gtcttggtGTGcagtcgattgttgcg | SEQ ID NO：14 |
| A111V-DH-F | atcgactgCACaccaagaccaatggc | SEQ ID NO：15 |
| A111V-DH-R | cgacggccagtgccaagcttTGGAGGAATAGAGCGGGTCATACAC | SEQ ID NO：16 |
| pK-F | AAGCTTGGCACTGGCCGTCG | SEQ ID NO：17 |
| pK-R | GAATTCGTAATCATGTCATAGCTGT | SEQ ID NO：18 |
| PgltA-UH-F | tgacatgattacgaattcATTGAACCCACGACGTTTTTTACTG | SEQ ID NO：19 |
| PgltA-UH-R | tataccgataaatgcggtttagcca | SEQ ID NO：20 |
| PgltA-DH-F | gcatttatcggtataATgtgttaaccggacca | SEQ ID NO：21 |
| PgltA-DH-R | cgacggccagtgccaagcttATGTCTTCGAGCATCTCCAGAACAG | SEQ ID NO：22 |
| gltA-F1 | tgacatgattacgaattcTTTGACCCAGGTTATGTGAG | SEQ ID NO：23 |
| gltA-R1 | aatcatcagccagtgcaatttct | SEQ ID NO：24 |
| gltA-F2 | cactggctgatgattActtcatctcccgcaa | SEQ ID NO：25 |
| gltA-R2 | cgacggccagtgccaagcttCGGAAATCATAGAGCGACAA | SEQ ID NO：26 |
| pK-F | AAGCTTGGCACTGGCCGTCG | SEQ ID NO：27 |
| pK-R | GAATTCGTAATCATGTCATAGCTGT | SEQ ID NO：28 |
（4）
gltA基因启动子突变体及组合GltAC361Y突变体对L-谷氨酸合成的影响
为了验证
gltA启动子突变体及组合GltAC361Y突变体对谷氨酸产量的效果，对上述构建的SCgGC8和SCgGC9菌株进行发酵测试，同时以菌株SCgGC5作为对照。
首先将菌株接种到种子培养基中培养8 h，培养物作为种子接种到每孔含有800 μL发酵培养基的24孔板中，初始OD600控制约为0.5，孔板摇床转速为800 rpm，每个菌株3个平行，30℃培养，19 h和22h补加5 g/L尿素，25 h发酵结束，检测L-谷氨酸产量和葡萄糖消耗量，并计算从葡萄糖到L-谷氨酸的糖酸转化率。结果如表4所示。
表4L-谷氨酸生产
| 菌株 | L-谷氨酸（g/L） | 糖酸转化率（g/g，%） |
| SCgGC5 | 4.50±0.22 | 5.86±0.33 |
| SCgGC7 | 8.53±0.31 | 12.03±0.0.56 |
| SCgGC8 | 5.15±0.25 | 6.70±0.31 |
| SCgGC9 | 10.53±0.81 | 15.48±1.28 |
从表中可知，P gltA-Ts24能够明显提高L-谷氨酸产量及糖酸转化率，在此基础上整合GltAC361Y突变体，能进一步提高L-谷氨酸产量及糖酸转化率。可见，
gltA启动子突变体在L-谷氨酸及其衍生物生产中具有较好的应用前景。
Claims (10)
1.一种具有启动子活性的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
2.包含如权利要求1所述核酸分子的表达盒、重组载体。
3.含有如权利要求1所述核酸分子的重组微生物宿主细胞；优选地，微生物宿主细胞是谷氨酸棒杆菌，包括但不限于谷氨酸棒杆菌ATCC 13869、谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌B253、谷氨酸棒杆菌ATCC 14067，以及由上述菌株制备的产生L-氨基酸的菌株。
4.如权利要求3所述的重组微生物宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是在谷氨酸棒杆菌ATCC 13869基础上，选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：
a. 编码α-酮戊二酸脱氢酶的odhA基因；
编码琥珀酸脱氢酶的sucA基因；
更优选地，所述宿主细胞中选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：
a. 编码丙酮酸羧化酶的pyc基因；
b. 编码谷氨酸脱氢酶的gdh基因；
c. 编码柠檬酸合酶的gltA基因；
d. 编码天磷酸转酮酶的fxpk基因；
e.编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；
f. 编码磷酸盐转运蛋白的pitA基因；
g.编码机械敏感通道蛋白的yggB基因。
5.如权利要求3或4所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是将谷氨酸棒杆菌ATCC 13869中的NCgl1221基因或其同源基因（如BBD29_06760或yggB）中引入A111V突变获得的谷氨酸生产菌株。
6.一种增强目的基因表达的方法，所述方法包括将如权利要求1所述核酸分子与目的基因可操作地连接。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述目的基因是编码柠檬酸合酶的基因，更优选所述编码柠檬酸合酶的基因，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的柠檬酸合酶。
8.一种生产氨基酸的方法，所述方法包括培养含有如权利要求1所述核酸分子与编码氨基酸生产相关的基因可操作地连接的宿主细胞，收集产生的氨基酸。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述氨基酸包括脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、精氨酸、鸟氨酸、谷氨酸酰胺、5-氨基乙酰丙酸等；所述氨基酸生产相关的基因包括但不限于gdh基因，lysC基因、thrABC基因、asd基因、aspB基因、hom基因、metX基因、dapA基因、dapB基因、ddh基因、proB基因、proA基因、proC基因、putA基因、hemA基因等；
可选地，也包括从细胞或培养液中回收氨基酸的步骤。
10.如权利要求1所述的核酸分子、权利要求2所述的表达盒、重组载体，权利要求3-5任一所述的重组微生物宿主细胞在增强基因的表达、生产氨基酸中的用途。
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