CN115927077A - 一株贪铜菌berc-1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株贪铜菌Cupriavidussp.BERC‑1及其应用，该菌株于2022年7月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCCNO：62670，其16SrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。本发明提供的贪铜菌BERC‑1具有高镉耐受性，且保持很高的纤维素酶活性，可降解木质纤维素，因此可以广泛用于含木质纤维素物质的预处理，也可以在生活垃圾处理及重金属污染环境的修复中发挥作用，具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及环境微生物治理技术领域，具体涉及一株贪铜菌BERC-1及其应用。
背景技术
重金属污染问题也日益凸显，采矿、冶炼、电镀等重工业发展导致镉、铅、汞等重金属大量进入农田土壤，镉在土壤中的活性较强，容易被作物吸收，是目前危害农田最严重的重金属，长期摄入会导致骨软化症，甚至引起肺、***和睾丸等的恶性肿瘤，已经成为制约我国社会经济可持续发展的主要问题之一因此，
近年来，利用微生物修复重金属污染已成为研究热点，其研究原理是将镉吸附性微生物添加到污染土壤中，利用这些微生物对重金属的胞外络合、胞内积累、沉淀和氧化还原反应等作用，降低土壤中重金属的生物可利用率，进而降低农作物、农产品、土壤以及废水中镉的含量重金属污染，微生物治理和修复是目前环境领域研究的热点，微生物对土壤中重金属活性的影响主要体现在生物吸附、溶解与生物转化。微生物资源是微生物修复的基础，研究者都聚焦于菌株的吸附机理，而菌株资源的筛选易被忽视。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有高镉耐受性，同时具有纤维素酶活性的贪铜菌，为解决重金属污染尤其是镉污染环境的修复效率低效果差等问题，可应用于环境修复及生活垃圾处理。
为了达到上述目的，本发明提供了一株贪铜菌BERC-1，该菌株于2022年7月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：62670。该贪铜菌BERC-1具有纤维素酶活性，其可耐受镉、砷、铅、铬、汞中的任意一种或两种以上，其中，镉耐受最高浓度为260mg/L。
本发明还提供了一种菌剂，该菌剂包含上述的贪铜菌BERC-1，该菌剂可被用于重金属污染土壤和污染废水的处理。
本发明还提供了一种上述菌剂的制备方法，包含如下步骤：
步骤一：培养上述的贪铜菌BERC-1至菌液浓度不低于1.2*1010CFU/mL；
步骤二：离心步骤一所得的菌液，得到菌沉淀；
步骤三：将步骤二中所得的菌沉淀与无菌的甘油混合制备成菌悬液；
步骤四：以麸皮加硅藻土作为烘干载体，并与步骤三中所得的菌悬液以2:3的比例混合后，于50℃烘干，制得菌剂。
优选地，上述制备方法中的菌悬液，其是以菌沉淀与无菌的浓度为6％(v/v)的保护剂甘油以质量体积比为1:6(g:mL)的比例制成。
优选地，上述制备方法中的步骤四中，麸皮和硅藻土的比例为质量比为3:2。
优选地，上述制备方法中的步骤四中，烘干温度为50℃。
优选地，上述制备方法中的步骤一中培养，其培养条件为pH＝7、温度为30℃，培养基为如下的物质与水配制后灭菌所得；
其中，上述的物质包含15g/L的玉米淀粉、5g/L的葡萄糖、1g/L的MgSO4·7H2O、0.5g/L的K2HPO4、0.5g/L的Ca(NO3)2和1g/L的NaCl，其中，各浓度均为终浓度。
优选地，上述步骤一中培养的培养基为将15g的玉米淀粉、5g的葡萄糖、1g的MgSO4·7H2O、0.5g的K2HPO4、0.5g的Ca(NO3)2和1g的NaCl溶于1LH2O中灭菌制备而成。
本发明提供的贪铜菌BERC-1可被应用于重金属污染环境的处理，该重金属包括镉、砷、铅、铬、汞中的任意一种或两种以上，尤其可用于镉污染土壤和镉污染废水的处理。
本发明提供的贪铜菌BERC-1还可被应用于重金属污染环境中纤维素物质的处理。
本发明的贪铜菌BERC-1及其应用，解决了镉污染环境的修复效率低效果差等问题，具有以下优点：
本发明提供的贪铜菌BERC-1，具备镉、砷、铅、铬、汞的高耐受特性，尤其对镉离子的最高耐受浓度达到260mg/L，同时还具备纤维素降解的特性，该菌在滤纸酶活达到0.12U·mL-1、CMC酶活达到0.5U·mL-1，纤维二糖酶活达到0.01U·mL-1，既可以在生活垃圾处理及重金属污染环境修复中发挥作用，也可以在木质纤维素预处理过程中发挥作用，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为本发明中贪铜菌BERC-1的刚果红染色结果图。
图2为本发明中贪铜菌BERC-1在显微镜下的细胞形态图。
图3为本发明中贪铜菌BERC-1的镉离子耐受试验结果。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
说明：实施例中所用到的方法，未见特殊说明的均为常规方法，未见特殊说明的试剂均为常规试剂。
其中，所用到的培养基包含：
基础牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠5g/L、加蒸馏水至1000mL；调节pH值至7.0～7.2；1×105Pa灭菌20min所得。如配置固体培养基则在现有培养基基础上加2％的琼脂。
选择培养基：将配置好的镉母液加入基础牛肉膏蛋白胨培养基中，调节镉离子至相应浓度即为选择培养基。其中，镉母液为称取氯化镉溶于超纯水，用容量瓶定容至100mL，配置成的终浓度为100g/L。
CMC发酵产酶培养基：CMCNa 10g、蛋白胨5g，酵母粉1.0g添加琼脂18g常规制成固体培养基。
赫奇逊无机盐培养基(HM)：KH2PO41.0g、NaCl 0.1g、MgSO4·7H2O 0.3g、NaNO32.5g、FeCl30.01g、CaCl20.1g、CMC-Na 5g溶于蒸馏水中并定容于1L。
菌株培养用培养基：15g的玉米淀粉、5g的葡萄糖、1g的MgSO4·7H2O、0.5g的K2HPO4、0.5g的Ca(NO3)2和1g的NaCl溶于1L H2O中灭菌制备而成。
实验例1：菌株的分离、鉴定及分析
1.菌株分离
本发明是从蚯蚓肠道中分离菌株，将经无菌操作得到的蚯蚓肠道放入无菌水中充分匀浆，吸取5mL所得的匀浆液放入100mL的镉离子终浓度为10mg/L的选择培养基中，于30℃、150rmp/min，培养36h后，吸取5mL所得的培养液转移到100mL的镉离子终浓度为20mg/L的选择培养基中，相同条件下震荡培养，连续富集直至选择培养基中镉离子的浓度达到100mg/L，采用平板稀释涂布的方法分离菌株，将100μL菌液均匀涂布于牛肉膏蛋白胨培养基的平板上，30℃恒温倒置培养36h，挑取单菌落划线培养，直至纯化至单一菌株，挑取单一菌株点接到CMC发酵产酶固体平板，30℃培养3d后，进行刚果红染色。
经过镉离子耐受初筛，筛选到1株耐受镉离子的菌株，其刚果红染色结果如图1所示，同时，刚果红初筛显示，该菌为纤维素降解菌，命名为BERC-1，用25％甘油于-80℃冰箱保藏。
2.菌株鉴定
根据《伯杰明细菌鉴定手册》，对分离到的菌株进行形态学观察、生理生化试验、16S rRNA基因序列分析，实验对菌株进行鉴定。
由结果可知，菌株BERC-1是革兰氏阴性细菌，好氧，可移动。在TSA平板上菌落呈黄色、不透明、边缘光滑。其电子显微镜下的形态如图2所示，杆状，宽度为0.3～0.6μm，长度为1.5～3.5μm。生长温度耐受范围为15～45℃，pH耐受范围为5～9，NaCl耐受浓度为8％(W/V)。菌株BERC-1的部分生理生化实验结果如下表1所示，结果显示，还菌株具有还原亚硝酸盐和硝酸盐的能力；能够与H2O2发生作用产生气泡，为接触酶阳性；不产生淀粉酶和氧化酶，但能分解明胶；V.P测定、吲哚、络氨酸和吐温80实验结果均为阴性。
表1菌株BERC-1部分生理生化结果
经如下所述的通用引物对(27F、1492R)为引物对该菌种的16S rRNA进行PCR鉴定，测序获得1424bp的基因组序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，将菌株BERC-1的16SrDNA在Eztaxte网站比对分析，结果显示BERC-1与Cupriavidus taiwanensis LMG19424T、Cupriavidus oxalaticusDSM1105T的相似度分别为98.9％和98.9％，提交NCBI数据库菌株名称为cupriavidus oxalaticus strain BERC 20，其Sequence ID为ON935449.1。经生理生化鉴定，16S rRNA鉴定，确定BERC-1为贪铜菌属菌株，并于2022年7月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，名称为Cupriavidus sp.BERC-1，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：62670。
其中，所用到的引物如下所示(5’→3’)
27F(SEQ ID NO：1)：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；
1492R(SEQ ID NO：2)：TACGACTTAACCCCAATCGC。
3.菌株的耐受性分析
将筛选到的菌株分别接种到含有10、20、50、100、150、200、240、260、300mg/L含有镉离子浓度中的选择培养基中，每组三个重复，以不接种菌株的培养基作为空白对照，于30℃、150rmp/min条件下震荡培养3d，并在吸光值OD600下测定菌体生长情况。
菌株BERC-1耐受镉浓度结果分析如图3所示，由结果可知，当镉离子浓度达到260g/L时，生长受到完全抑制。高浓度的镉离子抑制了微生物的生长，菌株BERC-1可以耐受高浓度镉离子，这可以为微生物的重金属修复提供微生物资源及耐受基因资源。
4.菌株的纤维素酶活分析
单株菌株在改良赫奇逊无机盐培养基HM，30℃条件下培养3d后，8000rpm离心10min，上清液作为粗酶液，纤维素酶活性的测定采用DNS法。纤维素分解是在多种纤维素酶的协同作用下完成的，是一个复杂的生物学过程。因此，本试验选取了三种常用的酶，对其活性进行分析，包括滤纸酶、羧甲基纤维素酶和纤维二糖酶。
本发明分别对羧甲基纤维素酶、纤维二糖酶和滤纸酶的活性进行比较测定，其中，最能反映纤维素分解能力的指标是滤纸酶活。滤纸酶活性的测定用Whatman1号滤纸条(1cm*6cm)为底物，羧甲基纤维素酶活力的测定用1％羧甲基纤维素钠为底物，纤维二糖酶活力的测定用2％水杨素为底物。各底物分别采用pH值为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲(0.2mol·L-1)。取稀释酶液0.5mL与1mL上述底物及滤纸条充分混匀，在50℃水浴中分别温育30min、40min、60min后，加入DNS显色剂2mL，沸水浴显色10min，流水冷却，在540nm下测定OD值，每测定重复3次，取平均值，设定的空白对照中只有底物而不加菌剂。以试验条件下酶液蛋白含量在单位时间内酶促反应产生的还原糖(葡萄糖)量计算酶活性。
测定结果如下表2所示，可知本发明的菌株BERC-1的滤纸酶活、羧甲基纤维素酶活、纤维二糖酶活分别为0.12U·mL-1、0.5U·mL-1、0.01U·mL-1，表明其具有纤维素酶活力，在木质纤维素降解方面应用潜力巨大。
表2纤维素的酶活测定
实验例2：菌剂及其制备
在初始pH为7、温度30℃条件下，采用上述的菌株培养用培养基，按照接种量10％将贪铜菌BERC-1接种到培养基中，细菌数最高可达到1.2*1010CFU/mL；离心后，得到菌沉淀，将菌沉淀与浓度6％(v/v)的保护剂甘油以质量体积比为1:6(g:mL)的比例制成菌悬液，以质量比为3:2的麸皮和硅藻土作为烘干载体，将烘干载体与菌悬液以质量体积比为2:3(g:mL)的比例混合后，于50℃鼓风烘干5h，制得菌剂。
实验例3：应用
本发明采用蚯蚓对污泥的处理试验进行验证，在实验室进行，并将污泥堆成(长×宽×高＝100cm×25cm×20cm)。通过将蚯蚓接种于体系中，污泥中接种5％(g/g)实验例2所得的菌剂，黑色遮阳网覆盖于污泥上面，使污泥温度保持在(23±2)℃，此温度较适合蚯蚓的生长；试验同时设置对照组(接种蚯蚓不接种菌剂)。试验期间，每隔3d调节1次污泥水分，使之维持在一个相对恒定湿度以利蚯蚓生长。15d后，对三个分组从上到下采集适量的污泥，保存在4℃冰箱中，直到实验分析。收集其中的蚯蚓，留待测定分析。
首先将污泥风干，磨细过筛，待用。过筛后的土壤和污泥采用H2SO4-HClO4消化，定容后经0.45μm滤膜过滤，采用原子吸收分光光度计(Thermo SolarMKⅡ-6)测定重金属含量，测定结果如下表3所示。
表3重金属含量测定(mg/Kg)
由结果可知，样品经15d处理，相对污泥中重金属的初始含量，对照组及处理组中重金属含量均有下降，已有的报道表明蚯蚓对重金属有富集作用，蚯蚓的直接吸收富集作用，蚯蚓体内积累了一部分重金属，使污泥中重金属的量减少，添加菌剂的处理组重金属相比对照组下降明显，表明该菌剂对处理重金属污染(包括Cd、As、Pb、Cr、Hg等)有促进作用。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
Claims (9)
1.一株贪铜菌BERC-1，其特征在于，该菌株于2022年7月29日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：62670。
2.根据权利要求1所述的贪铜菌BERC-1，其特征在于，所述贪铜菌BERC-1具有纤维素酶活性。
3.根据权利要求1所述的贪铜菌BERC-1，其特征在于，所述贪铜菌BERC-1耐受镉、砷、铅、铬、汞中的任意一种或两种以上。
4.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂包含如权利要求1所述的贪铜菌BERC-1。
5.一种如权利要求4所述菌剂的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
步骤一：培养如权利要求1所述的贪铜菌BERC-1至菌液浓度不低于1.2*1010CFU/mL；
步骤二：离心步骤一所得的菌液，得到菌沉淀；
步骤三：将步骤二中所得的菌沉淀与无菌的甘油混合制备成菌悬液；
步骤四：以麸皮加硅藻土作为烘干载体，并与步骤三中所得的菌悬液混合后，烘干，制得菌剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中培养，其培养条件为pH＝7、温度为30℃，培养基为如下的物质与水配制后灭菌所得；其中，所述的物质包含15g/L的玉米淀粉、5g/L的葡萄糖、1g/L的MgSO4·7H2O、0.5g/L的K2HPO4、0.5g/L的Ca(NO3)2和1g/L的NaCl，其中，各浓度均为终浓度。
7.如权利要求1-3中任意一项所述的贪铜菌BERC-1在处理重金属污染环境中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的重金属为镉、砷、铅、铬、汞中的任意一种或两种以上。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，该应用包含重金属污染环境中含纤维素物质的处理。
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|---|---|---|---|---|
| CN116904361A (zh) * | 2023-07-14 | 2023-10-20 | 中国科学院南京土壤研究所 | 一种具有解磷能力的贪铜菌属菌株及其应用 |
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2022
- 2022-09-30 CN CN202211212857.0A patent/CN115927077A/zh active Pending
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| CN116904361A (zh) * | 2023-07-14 | 2023-10-20 | 中国科学院南京土壤研究所 | 一种具有解磷能力的贪铜菌属菌株及其应用 |
| CN116904361B (zh) * | 2023-07-14 | 2024-05-28 | 中国科学院南京土壤研究所 | 一种具有解磷能力的贪铜菌属菌株及其应用 |
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