CN115927033B

CN115927033B - 一种刺糖多孢菌菌株及其高产多杀菌素的方法

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Publication number: CN115927033B
Application number: CN202210636375.1A
Authority: CN
Inventors: 陈华; 葛春梅; 刘杰; 魏波; 常飞; 王晓飞
Original assignee: Hefei University
Current assignee: Hefei University
Priority date: 2022-06-07
Filing date: 2022-06-07
Publication date: 2024-06-11
Anticipated expiration: 2042-06-07
Also published as: CN115927033A

Abstract

本发明公开了一株刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）H‑2203，已于2022年04月11日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC No:M 2022404。本发明的刺糖多孢菌H‑2203是由原始菌株通过大气压等离子体、亚硝基胍、紫外线等物理、化学诱变处理，结合抗性选育筛选得到。本发明的刺糖多孢菌H‑2203，其在含有可同化的碳源、氮源和微量元素的发酵培养基中，并在通氧的条件下通过发酵可高产生物农药多杀菌素。本发明提供的菌株和发酵方法，可实现多杀菌素的工业化放大生产。

Description

一种刺糖多孢菌菌株及其高产多杀菌素的方法

技术领域

本发明涉及一种刺糖多孢菌菌株及其高产多杀菌素的方法，属于微生物和发酵技术领域。

背景技术

多杀菌素属于大环内酯类农用抗生素，主要活性组分是多杀菌素A和D，具有杀虫谱广，易降解、低残留、无抗药性、对人畜无害，环境污染少等优点，因此在农牧业有广阔的应用。多杀菌素的杀虫机理主要为：一是通过作用昆虫的神经***，导致非功能性的肌收缩、衰竭，并伴随颤抖和麻痹，表现为烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)被持续激活引起乙酰胆碱(Ach)延长释放反应。二是通过作用γ-氨基丁酸(GABA)受体，改变GABA门控通道的功能。多杀菌素独特的杀菌机理具有生物农药的安全性，对环境、农作物和哺乳动物无害，且多杀菌素具有易降解性。由于这些优异的性能和应用，多杀菌素曾三次获得美国“总统绿色化学品挑战奖”。

目前，多杀菌素由刺糖多孢菌通过有氧发酵生产。尽管有专利、文献报道通过培养基和发酵工艺优化来提升多杀菌素的产量，但始终效果不佳，严重制约了多杀菌素的工业化生产。生产菌株的产量高低，是实现多杀菌素的发酵放大、使产品具有经济竞争力的关键。因此，有必要选育能够高产多杀菌素的微生物菌株和建立高效的发酵工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产多杀菌素的刺糖多孢菌及其发酵方法。

本发明菌株所产生的多杀菌素，其主要成分为多杀菌素A和多杀菌素D，其结构式为：

多杀菌素A:R＝H

多杀菌素D:R＝CH₃

为实现上述目的，本发明提供的技术方案是：一株刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)H-2203，已于2022年04月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC no:M 2022404。

上述菌株主要生物学特征为：菌落颜色白色或灰白色，中心略有灰褐色，菌落形态圆整，表面突起，气生菌丝发达，易挑起。

本发明描述了菌株H-2203的形态学和分子水平上的特征，经过和已知的多杀菌素产生菌进行形态学和分子水平的比较，根据微生物分类学，可以鉴定菌株H-2203属于刺糖多孢菌。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法，包括一培养基，该培养基含有可同化的碳源、可同化的氮源和可同化的微量元素，然后将刺糖多孢菌接种于所述培养基进行有氧发酵。

优选的技术方案为：所述可同化的碳源为甘油、蔗糖、葡萄糖、淀粉、糖蜜、乳糖、麦芽糖、甘露醇、山梨醇、麦芽糊精、植物油、油酸甲酯中的至少一种。

优选的技术方案为：所述可同化的氮源为黄豆饼粉、玉米浆粉、蛋白胨、酵母粉、酵母浸出粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉中的至少一种。

优选的技术方案为：所述可同化的微量元素来源于七水硫酸镁、七水硫酸锌、七水硫酸亚铁、四水氯化锰、六水氯化钴、五水硫酸铜、无水氯化钙、二水钼酸钠、六水三氯化铁、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、维生素B₁、维生素B₉、维生素PP中的至少一种。

优选的技术方案为：所述菌株为刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)H-2203、刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)H-2203的自发突变株、刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)H-2203通过诱变或基因工程改造得到的高产突变菌株。

优选的技术方案为：所述培养基的pH为7.0-8.0，有氧发酵的温度为25-30℃，有氧发酵的时间为8-12d，相对湿度45-65％。

所述有氧发酵方式为液体深层发酵，通气比为0.5-1.0vvm(每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值)。

多杀菌素的液相检测方法：

色谱柱：安捷伦Eclipse XDB-C₁₈,4.6×250mm,5μm

流动相：400mL水+2000mL乙腈+1800mL甲醇

流速：1mL/min

波长：254nm

进样量：10μL

柱温：35℃

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：

1、提高多杀菌素产量。本发明所述菌种和发酵方法，多杀菌素产量较已报到菌种和发酵方法有了大幅度的提高，有利于实现工业化生产。

2、降低生产成本。本发明所述菌种和发酵方法有利于降低多杀菌素的生产成本，具备实现工业化大生产的潜力。

附图说明

图1：制备的多杀菌素HPLC图。

图2：多杀菌素的¹H-NMR谱。

图3：多杀菌素的¹³C-NMR谱。

图4：多杀菌素的LC-MS图谱。

图5：大气压氩气等离子体射流处理原始菌株。

图6：大气压等离子体处理时间对刺糖多孢菌的致死率。

图7：高产菌株的等离子体诱变流程。

图8：刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)H-2203的菌落形态。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本实施例所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

本文中使用的术语的目的仅在于说明特别实施例，并不意图对本发明做限制。除非上下文明确显示，否则本文中使用的单数形式“一”、“一个”亦包括复数形式。

在说明较佳实施例时，可能基于清楚的目的而使用特别的术语；然而，本说明书所揭露者并不意图被限制在所选择的该特别术语；并且应当理解，每一个特定元件包括具有相同功能、以相似方式操作并达成相似效果的所有等效技术。

实施例1：刺糖多孢菌的分离和多杀菌素的鉴定

一、菌株的分离

(1)土壤样品的采集

土壤样品采集自安徽黄山周边植物根际土壤样品，用药匙从野生植物根部的不同位置挖取5-10cm深处的土壤，盛放于牛皮纸袋中。共采集100份，将纸袋封好带回实验室，通风处放置一周，使其中的水分尽可能挥发。

(2)土壤悬液的配制

挑选晾干土样中的小块土壤，准确称取5g，用研杵研磨成粉末。倒入装有50mL无菌水和小玻璃珠的250mL锥形瓶中，超声30min，以此为原液。用无菌移液枪吸取100μL土样原液到装有900μL无菌水的EP管中，充分摇匀，即得浓度为10^-1的土壤悬液。依照上述方式进行稀释，依次得到浓度为10^-2、10^-3、10^-4和10^-5的土壤悬液，用这4种浓度的稀释液在分离培养基上进行放线菌的分离。

(3)土壤放线菌的分离

选择GS培养基：可溶性淀粉2％，KNO₃ 0.1％，NaCl 0.05％，K₂HPO₄·3H₂O 0.05％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，FeSO₄·7H₂O 0.001％，琼脂2％，消前pH 7.2-7.4；HV培养基：腐殖酸0.1％，KCl 0.17％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，FeSO₄·7H₂O 0.01％，Na₂HPO₄ 0.05％，CaCO₃0.02％，复合维生素0.1％(维生素B₁ 0.00005％，维生素B₂ 0.00005％，肌醇0.00005％，维生素B₅0.00005％，维生素B₆ 0.00005％，对氨基苯甲酸0.00005％，维生素H 0.000025％，尼克酸0.00005％，菌多糖2％)，琼脂2％，消前pH 7.2-7.4，作为放线菌的分离培养基。

配制好的两种分离培养基，在高压蒸汽锅中进行灭菌，当温度降至40-50℃时，用无菌移液管加入100μL抑制细菌生长的萘啶酮酸(10mg/L)和100μl抑制真菌生长的放线菌酮(10mg/L)，充分摇匀后倒平板。待培养基凝固后，用无菌移液枪分别取10^-2、10^-3、10^-4和10^-5浓度的稀释液100μL至两种分离培养基上，用涂布棒均匀涂开，把培养皿封好后置于28℃恒温培养箱中培养5-10d左右。

(4)土壤放线菌的纯化

培养过程中随时观察培养基上放线菌的长势，以免之后长出更多的菌落或长出细菌覆盖培养基或染有真菌影响挑取工作。如果培养基中菌株生长量较多，需要及时将培养基上可培养的放线菌挑出转移至空白的ISP2培养基(酵母浸出粉0.4％，麦芽抽提粉1.0％，葡萄糖0.4％，琼脂1.8％，消前pH 7.2-7.4)，进一步纯化。

菌落长出后，挑取形态颜色特征不同的菌落，转入ISP2培养基上进行纯化。如果ISP2培养基上生长的放线菌中有杂菌，需要将放线菌挑出转移至空白的ISP2培养基进一步纯化。

(5)土壤放线菌的抗菌活性检测

对上述分离得到的放线菌菌株125株进行初步的活性检测，用无菌打孔器在ISP2培养基上制得直径约为5mm的待测菌株琼脂块备用。

细菌采用琼脂块扩散法：

将细菌的菌悬液加入到约40℃的MYG培养基(麦芽糖0.5％，酵母浸出粉0.5％，葡萄糖1％，琼脂1.5％，消前pH 6.5)或NA培养基(蛋白胨1％，牛肉浸膏0.3％，氯化钠0.5％，琼脂1.5％，消前pH 7.2-7.4。)中混匀，倒入培养皿中制成带菌平板。待培养基凝固后，用无菌镊子将打好的待测菌块等距离置于其上，37℃培养过夜，根据抑菌圈的有无和直径大小判断有无抗菌活性和活性的相对强弱。

丝状真菌采用平板对峙法：

将真菌的琼脂块放置在PDA培养基的中央，并在菌块相对两侧且距离菌块相同位置上放置待测菌的琼脂块，置于28℃培养3-5d，根据菌丝的生长状况确定放线菌株的抗真菌活性。

(6)土壤放线菌的发酵

选择抗菌活性较好的菌株，刮取纯化后的单菌落孢子或菌丝接种到种子培养基中(麦芽抽提粉1％，酵母粉0.4％，葡萄糖0.4％，碳酸钙0.4％，消前调pH 7.2-7.4)，摇瓶装量为50mL/250mL三角瓶，接种量为1个菌落/瓶。在摇床转速250r/min，28℃下恒温振荡培养3d。

待菌丝成熟，且显微镜下镜检无染菌，从种子培养基中吸取5mL菌液转接到GYM培养基(酵母浸出粉0.4％，麦芽抽提粉1.0％，葡萄糖0.4％，玉米淀粉4％，CaCO₃ 0.2％，消前调pH 7.2-7.4)，每株菌株设置3个重复，摇瓶装量为50mL/250mL三角瓶，摇床转速250r/min，28℃下恒温振荡培养7d。

(7)土壤放线菌活性成分的薄层层析(TLC)

发酵培养7d后，镜检观察确定菌丝生长状态良好且无染菌现象，向发酵液中加入乙醇且定容至100mL，将摇瓶置于超声清洗器中超声30min。超声完成后对发酵液进行抽滤，将菌丝滤出，保留滤液。

每株菌株有3瓶发酵液，将3瓶发酵液的滤液合在一起，使用旋转蒸发仪浓缩至少量，转移至小玻璃瓶中，进行TLC检测。将浓缩液适当稀释后用毛细管取样，逐一点样在硅胶板上，之后将硅胶板置于展开剂中，对样品进行TLC展开。展开***氯仿:甲醇＝9:1(v/v)。TLC展开结果在波长为254nm的紫外线下观察。

(8)菌种的保藏

综合菌株的形态，TLC展开结果和抗菌活性检测结果等多种因素，将具有研究价值的放线菌原始菌株H-2035挑选出来，在其单菌落上刮取孢子于装有1.5mL，20％甘油的冻存管中，-20℃条件下保存，定期复苏。

(9)菌株在50L发酵罐发酵

取甘油管中保存的放线菌H-2035到ISP2培养基上进行复苏，待菌株长好后接种到种子培养基(配方如上)，摇瓶装液量250mL/1000mL三角瓶，28℃培养3d，镜检观察确定菌丝生长状态良好且无染菌现象后用于进发酵罐。用50L发酵罐发酵，配置发酵培养基30L(葡萄糖5％，麦芽抽提物1％，酵母提取物0.4％，玉米淀粉1％，CaCO₃ 0.3％，消前调pH 7.2-7.4)，121-125℃灭菌30min后，以接种量5％(v/v)进行接种，控制溶氧大于20％，28±0.5℃培养7d。

(10)代谢产物的分离提取

①发酵液前处理

上述培养结束的发酵液，4000r/min离心20min，得到发酵上清液和菌体。上清液过HP-20树脂柱(8×110cm，树脂装量1.5L)，洗脱流速控制在20mL/min，吸附结束后用清水冲洗树脂柱(树脂量的2倍体积)，洗脱掉树脂表面的糖分，然后用95％的乙醇进行洗脱，得到乙醇洗脱液。菌体先用95％的乙醇洗涤，将洗涤液与乙醇洗脱液合并，然后向菌体中加入无水甲醇并室温浸泡过夜，抽滤后在50℃下真空浓缩至干。乙醇洗脱液同样在50℃真空浓缩干，将两份膏体分别用少量的甲醇溶解，根据TLC检测，若两份的主点一致，将两份混合在一起。

将得到的膏体依次进行正相硅胶柱层析、葡聚糖柱层析、制备HPLC分离方法进行分离，最后得到纯的化合物。

②正相硅胶柱层析

拌样：将上述待分离样品溶解于氯仿和甲醇等体积混合的溶剂中，与适量硅胶(200-300目)在研钵中搅拌均匀，放置在通风橱中挥干溶剂，用研杵研磨硅胶使样品均匀分布，得到柱层析上样样品。

装柱：选择直径、长度适当的玻璃层析柱，用棉花堵住层析柱底部出口，加入约5倍样品体积的硅胶，用手轻拍层析柱外壁，使硅胶柱装填均匀。

上样：干法上样，将样品在柱面上铺匀，并在样品上面铺一层脱脂棉。加入适量的起始洗脱液(根据待分离样品的TCL检测结果，选择石油醚或氯仿)，使样品和硅胶柱慢慢润湿，等二者完全润湿后，加入洗脱液，

洗脱：根据待分离样品在TLC检测时的分离效果，选择适当的洗脱***、梯度变化幅度和最终梯度大小，按极性从小到大的顺序，进行梯度洗脱，分管收集洗脱液。各洗脱组分根据TLC检测结果合并相同组分，50℃下真空浓缩至干。

③葡聚糖凝胶柱层析

装柱：葡聚糖凝胶在使用前与氯仿和甲醇的等体积混合溶剂混合，超声30min，使之充分溶胀，并排尽混悬液中的气泡，此过程中要避免过分搅拌。选择直径、长度适当的玻璃层析柱，将混悬液慢慢倾入层析柱内，打开层析柱阀门，凝胶沉降时，轻轻振动层析柱外壁，使凝胶沉降均匀，直至凝胶沉降完全，关闭阀门。

上样：待分离样品溶解后，直接液体上样，待样品全部进入柱内后再加洗脱液。

洗脱：洗脱液选择氯仿和甲醇的等体积混合溶剂，根据层析柱大小控制流速，常压过柱。分管收集洗脱液，各洗脱组分根据TLC检测结果合并相同组分，50℃下真空浓缩至干。

④制备HPLC

先对待分离组分进行液相分析(图1)，流速固定在1.5mL/min，调整洗脱剂的组成(纯化水:乙腈:甲醇＝2:10:9,v/v)，使目标峰能与其他组分完全分离，确定合适的色谱分离条件，主要是洗脱剂的组成和检测波长。制备HPLC的进样量控制在0-5mL，流动相流速20mL/min，参考液相分析确定的色谱分离条件和检测波长，待分离组分能在短时间内大量分离。

根据出峰情况分管收集洗脱液，各洗脱组分根据TLC检测结果合并相同组分，50℃下真空浓缩至干。

⑤多杀菌素的结构鉴定

将上述分离的化合物进行结构鉴定，主要利用核磁共振NMR和质谱MS分析技术。分析化合物的¹H-NMR谱(图2)、¹³C-NMR谱(图3)，与多杀菌素的核磁数据进行对比。再根据质谱MS分析测定多杀菌素A(MW 731)和D(MW 745)的分子量(图4)，最终确定多杀菌素的组分。

实施例2：刺糖多孢菌高产菌株的选育

(1)菌种选育

以实施例1分离的H-2035为原始菌株，通过大气压等离子体、亚硝基胍、紫外线等物理、化学诱变处理，经过多轮选育，得到突变菌株H-2203。

优选的实施方式：大气压等离子体选育流程如下：

①取原始菌株H-2035的成熟斜面，用无菌水洗下斜面孢子，稀释制成孢子悬液。

②吸取100μL孢子悬液均匀涂布在直径8mm的无菌纸片上，并置于90mm无菌平皿的中央，在无菌超净台中自然风干备用。

③诱变实验在大气压等离子体发生装置上进行，以氩气作为工作气体处理样品(图5)，选择不同的处理时间(10、20、30、40、50、60s)进行辐照，气体流速为21.54L/min、等离子体气流温度为30-50℃，以不接受辐照的样品作为对照，不同处理时间对菌体的致死率如图6。

④辐照后将处理样品和对照样品均用1mL无菌水洗下，吸取100μL涂布于含有2g/L多杀菌素(或0.5％2-脱氧-葡萄糖、或2.5mg/L鼠李糖、或1.8％丙酸钠)的ISP2固体培养基中进行抗性选育，28℃培养7d，将单菌落用灭菌牙签挑到新鲜的ISP2固体培养基中扩大培养10-12d。挑选菌落形态较为规整的突变株进行摇瓶发酵实验。大气压等离子体选育流程如图7。

⑤将突变菌株接种于种子培养基中，种子培养基配方为：TSB(胰酪大豆蛋白胨)4.5％，葡萄糖1％，酵母粉0.8％，硫酸镁0.1％，摇瓶装量25mL/250mL三角瓶，115℃灭菌30min。置于250r/min、28℃恒温摇床中培养3d，再以20％接种量接种于发酵培养基中，发酵培养基配方为：葡萄糖8％，淀粉2％，棉籽饼粉3％，豆饼粉1％，玉米浆粉0.5％，酵母粉0.5％，碳酸钙0.5％，微量元素2.5mL/L(六水氯化钴0.28g，七水硫酸锌1.4g，二水钼酸钠0.1g，七水硫酸亚铁3.8g，定容至1L，摇匀保存4℃冰箱备用)，油酸甲酯4％，调pH 7.5，摇瓶装量25mL/250mL三角瓶，121℃灭菌20min。置于250r/min、28℃恒温摇床中培养8-12d，取发酵液1mL，以10倍无水甲醇浸泡，超声处理30min，过滤，液相测定多杀菌素的产量。经过多轮诱变、抗性筛选，选育出高产突变株H-2203。经过发酵摇瓶验证，多杀菌素产量达到4152mg/L，是原始菌株H-2035产量(215mg/L)的19.3倍，显示出良好的工业化应用前景。

突变株H-2203于2022年04月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No:M 2022404，并登记入册，证明存活。

(2)菌种鉴定

突变菌株H-2203的主要外观特征为：菌落颜色白色或灰白色，中心略有灰褐色，菌落形态圆整，表面突起，气生菌丝发达，易挑起(图8)。

根据放线菌16S rDNA保守序列的通用引物：

正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

反向引物：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’

利用上述引物对菌株H-2203的16S rDNA序列进行PCR扩增。PCR循环条件：94℃预变性2min，循环参数94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1.5min，重复31个循环后，72℃再延伸10min，最后4℃保温。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。选用条带清晰的产物送测序。结果显示该菌株16S rDNA一级结构序列为1422个碱基。通过在Genebank数据库中进行blast，结果发现H-2203与Saccharopolyspora spinosa strain:JCM 9375的基因序列(GenBank:LC149867.1)相似性为99％。根据以上结果，证明菌株H-2203属于刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)。

实施例3：多杀菌素的摇瓶发酵

种子培养基配方：淀粉2％，葡萄糖3％，黄豆饼粉2％，酵母粉1.5％，氯化铵0.1％，七水硫酸镁0.2％，三水磷酸氢二钾0.1％，摇瓶装量25mL/250mL三角瓶，115℃灭菌30min。将实施例2选育的突变菌株H-2203，用无菌接种铲接种于种子培养基中，置于250r/min、28℃恒温摇床中培养3d。发酵培养基配方：葡萄糖6％，淀粉2％，棉籽饼粉2％，豆饼粉1％，玉米浆0.5％，酵母粉0.5％，七水硫酸镁0.01％，七水硫酸亚铁0.0002％，六水氯化钴0.001％，二水钼酸钠0.0005％，氯化钙0.002％，七水硫酸锌0.0005％，五水硫酸铜0.0001％，碳酸钙0.5％，油酸甲酯4％，豆油4％，调pH 7.5，摇瓶装量25mL/250mL三角瓶，121℃灭菌20min。吸取5mL的种子培养液接入每个发酵摇瓶中，置于250r/min、28℃恒温摇床中培养8-12d。发酵液用无水甲醇提取后，液相测得多杀菌素产量为8628mg/L。

实施例4：发酵罐生产多杀菌素的方法

(1)一级种子液的制备

在10L种子罐中投入7L的种子培养基(菌种同实施例3，种子培养基的配比见实施例3，同时添加消泡剂0.05％,w/v)，开蒸汽阀门，将蒸汽通入夹套，预热罐内种子培养基，待罐温升至80-90℃，调节蒸汽阀门，保温20-30min后，关闭夹套蒸汽阀。打开种子罐底阀与进气管双路进蒸汽，待罐温上升到121-125℃，压力0.11-0.14MPa，调节各路蒸汽阀门及排气阀门，保温灭菌30min。灭菌结束后，调节排气阀门，关闭各路近罐阀门，再关相应蒸汽阀门，待罐压低于0.08MPa，通入无菌空气，对罐体进行保压，打开夹套进、出水阀门，对种子罐进行冷却，罐温冷却至28℃。在火焰保护下，接入200mL摇瓶种子液，培养温度28±0.5℃，通气量1vvm，设定溶氧范围20-40％，罐压0.045Mpa，初始搅拌转速200r/min，搅拌转速与溶氧联动，培养60-80h，此时pH6.5-7.5，菌丝浓度为30-40％。

(2)二级种子液的制备

在15L种子罐中投入10L的种子培养基(种子培养基的配比见实施例3，同时添加消泡剂0.08％,w/v)，开蒸汽阀门，将蒸汽通入夹套，升温蒸汽灭菌，罐压稳定在0.11-0.14MPa，温度控制在121-125℃，保温灭菌30min。冷却至28℃待接种。将移种管路保压在0.20-0.40MPa，灭菌60min。将一级种子罐约2l种子液移入二级种子罐中。开搅拌，控制空气流量、控制罐压。培养温度28±0.5℃，通气量1vvm，设定溶氧范围20-40％，罐压0.045Mpa，初始搅拌转速200r/min，搅拌转速与溶氧联动，培养40-60h，此时pH7.0-7.5，菌丝浓度为35-40％。

(3)发酵罐培养基的配制与培养

发酵培养基的配方与前述实施例3相同，添加0.08％(w/v)的聚醚类消泡剂，发酵罐50L，投料体积为30L，消前调pH7.5。开蒸汽阀门，升温蒸汽灭菌，罐压稳定在0.11-0.14MPa，温度控制在121-125℃，保温灭菌30min。冷却至26-30℃待接种。将移种管路保压在0.20-0.40MPa，灭菌60min。将二级种子罐约6L种子液移入发酵罐中。开搅拌，控制空气流量、控制罐压。发酵培养温度28±1℃，通气量0.8vvm，设定溶氧范围30-50％，罐压0.045Mpa，初始搅拌转速200r/min，搅拌转速与溶氧联动，发酵培养8-12d，待产量不增长时结束发酵。取样处理，液相检测多杀菌素产量为7364mg/L。

实施例5：发酵生产多杀菌素的方法

一株刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)H-2203，已于2022年04月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC no:M 2022404。

一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法，包括一培养基，具体为发酵培养基，该培养基含有可同化的碳源、可同化的氮源和可同化的微量元素，然后将刺糖多孢菌接种于所述培养基进行有氧发酵。其它培养基，以及发酵培养基的其它部分与实施例4相同。发酵条件也同实施例4。

优选的实施方式为：所述可同化的碳源为淀粉、葡萄糖、甘油按照质量比为1:3:1构成的混合物。

优选的实施方式为：所述可同化的氮源为棉籽饼粉、豆饼粉、玉米浆粉、酵母粉按照质量比为2:1:1:1构成的混合物。

优选的实施方式为：所述可同化的微量元素七水硫酸亚铁、六水氯化钴、二水钼酸钠、无水氯化钙、七水硫酸锌、五水硫酸铜之间的质量比例为2:10:5:10:5:1。

优选的实施方式为：所述菌株为刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)H-2203、刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)H-2203的自发突变株、刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)H-2203通过诱变或基因工程改造得到的高产突变菌株。

优选的实施方式为：所述培养基的pH为7.0-8.0，有氧发酵的温度为28-30℃，有氧发酵的时间为8-12d；通氧量为0.5-1vvm。

上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。

SEQUENCE LISTING

<110> 合肥学院

<120> 一种刺糖多孢菌菌株及其高产多杀菌素的方法

<140> 2022106363751

<141> 2022-06-07

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 正向引物

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 反向引物

<400> 2

tacggttacc ttgttacgac tt 22

<210> 3

<211> 1422

<212> DNA

<213> H-2203基因序列

<400> 3

gtgggagtcg gcgtgcttac acatgcagtc gaacgctgaa gcatcttcgg gtgtggatga 60

gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgggtaa tctgccctgc actctgggat aagccttgga 120

aacggggtct aataccggat atgacacatt atcgcatggt ggtgtgtgga aagttctggc 180

ggtgcaggat gagtccgcgg cctatcagct tgttggtggg gtgatggcct accaaggcga 240

cgacgggtag ccggcctgag agggtgaccg gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300

tcctacggga ggcagcagtg gggaatcttg cgcaatgggc gaaagcctga cgcagcaacg 360

ccgcgtgggg gatgacggcc ttcgggttgt aaacctcttt cgacatcgac gaagccttcg 420

ggtgacggta ggtgtagaag aagcaccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 480

tagggtgcga gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gtttgtcgcg 540

tcggccgtga aaacctgcag cttaactgtg ggcttgcggt cgatacgggc agacttgagt 600

tcggtagggg agactggaat tcctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac 660

accggtggcg aaggcgggtc tctgggccga tactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga 720

gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gttgggcgct aggtgtgggg 780

atgggttcca ctgtttccgt gccgtagcta acgcattaag cgccccgcct ggggagtacg 840

gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggcg gagcatgtgg 900

attaattcga tgcaacgcga agaaccttac ctggggtttg acatgcacta gacagctcca 960

gagatggggt ttcccttgtg gttggtgtac aggtggtgca tggctgtcgt cagctcgtgt 1020

cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgccctatgt tgccagcggg 1080

ttatgccggg gactcgtggg ggactgccgg ggtcaactcg gaggaaggtg gggatgacgt 1140

caagtcatca tgccccttat gcccagggct tcacacatgc tacaatggct ggtacagagg 1200

gtggcgatat cgtgaggtgg agcgaatccc ttaaagccgg tctcagttcg gatcggggtc 1260

tgcaactcga cctcgtgaag tcggagtcgc tagtaatcgc agatcagcat tgctgcggtg 1320

aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacgtca tgaaagtcgg taacacccga 1380

agcccatggc ccaacccttg tggggggagt ggtcgaaggt ga 1422

Claims

1.一株刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）H-2203，已于2022年04月11日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO: M 2022404。

2.一种利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法，其特征在于：包括培养基，该培养基含有可同化的碳源、可同化的氮源和可同化的微量元素，然后将刺糖多孢菌接种于所述培养基进行有氧发酵；刺糖多孢菌为刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）H-2203，已于2022年04月11日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO: M2022404；

所述可同化的碳源为甘油、葡萄糖、淀粉、麦芽糖、油酸甲酯中的至少一种；

所述可同化的氮源为黄豆饼粉、玉米浆粉、蛋白胨、酵母粉、酵母浸出粉、棉籽饼粉中的至少一种；

所述可同化的微量元素来源于七水硫酸镁、七水硫酸锌、七水硫酸亚铁、六水氯化钴、五水硫酸铜、无水氯化钙、二水钼酸钠、维生素B₁、维生素B₉中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的方法，其特征在于：所述培养基的pH为7.0-8.0，有氧发酵的温度为25-30℃，有氧发酵的时间为8-12 d，相对湿度45-65%。