CN115916840A - 用于监测多特异性分子的形成物的反相高效液相色谱（rp-hplc）的***、材料和方法 - Google Patents

用于监测多特异性分子的形成物的反相高效液相色谱（rp-hplc）的***、材料和方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了用于在多特异性分子制造或开发过程之后检测多特异性分子形成物的高压液相色谱(HPLC)方法。HPLC方法提供对多特异性分子形成物的快速、定量、实时处理。

Description

用于监测多特异性分子的形成物的反相高效液相色谱（RP-HPLC）的***、材料和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年4月16日提交的美国临时申请序列号63/010,907、 63/010,912、63/010,920和63/010,926的权益。上述申请的全部内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及一种用于在多特异性分子制造或开发过程之后检测多特异性分子形成物的高压液相色谱(HPLC)方法。HPLC方法提供了对多特异性分子形成物的快速、定量、实时处理。
背景技术
在多特异性分子(例如，多特异性抗体)的制造或过程研究与开发 (R&D)期间，无论制造过程如何，多特异性分子(例如，多特异性抗体)的不完整形成物的可能性都仍然存在。先前已采用非还原毛细管十二烷基硫酸钠(NR-cSDS)来监测不完整的多特异性抗体形成物；然而，该技术无法提供在过程制造环境中研究多特异性形成物时或在多特异性分子(例如，多特异性抗体)开发期间所需的快速、定量、实时结果。因此，需要一种快速、定量、实时的监测多特异性分子(例如，多特异性抗体) 形成物的过程。
发明内容
本文提供了检测多特异性分子的形成物的方法。所述方法包括：(a)获得多特异性分子样品；(b)获得反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；(c)将多特异性分子样品在极性水性流动相A中与RP-HPLC柱接触，其中极性水性流动相包含离子配对剂；(d)将有机非极性流动相B与RP-HPLC柱接触，其中有机非极性相包含离子配对剂；(e)洗脱该多特异性分子样品；以及(f) 监测所洗脱的多特异性分子样品中多特异性分子形成物的量。在某些实施方案中，多特异性分子为多特异性抗体。
本文还提供了在执行用以产生多特异性抗体的制造过程的同时检测多特异性抗体的形成物的方法。所述方法包括：(a)执行用以产生多特异性抗体的制造过程，其中该制造过程产生包含一定量的多特异性抗体的多特异性抗体样品；(b)搭建反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；(c)将多特异性分子样品在极性水性流动相A中注入RP-HPLC柱中，其中极性水性流动相包含离子配对剂；(d)将有机非极性流动相B施加到RP-HPLC柱以形成梯度洗脱，其中有机非极性流动相包含离子配对剂；(e)洗脱该多特异性抗体样品；以及(f)监测所洗脱的样品中多特异性抗体形成物的量。
本文还提供了在执行用以产生双特异性抗体的受控FAB臂交换 (cFAE)的同时检测双特异性抗体的形成物的方法。所述方法包括：(a)执行用以产生cFAE样品的受控FAB臂交换(cFAE)，其中cFAE样品包含一定量的双特异性抗体；(b)搭建反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；(c)将 cFAE样品在极性水性流动相A中注入RP-HPLC柱中，其中极性水性流动相包含离子配对剂；(d)将有机非极性流动相B施加到RP-HPLC柱以形成梯度洗脱，其中有机非极性流动相包含离子配对剂；(e)洗脱该cFAE样品；以及(f)监测所洗脱的样品中双特异性抗体形成物的量。
还提供了设计稳定的多特异性抗体的方法。所述方法包括：(a)执行用以产生多特异性抗体的制造过程，其中该制造过程产生包含一定量的多特异性抗体的多特异性抗体样品；(b)搭建反相高效液相色谱(RP-HPLC) 柱；(c)将多特异性分子样品在极性水性流动相A中注入RP-HPLC柱中，其中极性水性流动相包含离子配对剂；(d)将有机非极性流动相B施加到 RP-HPLC柱以形成梯度洗脱，其中有机非极性流动相包含离子配对剂；(e) 洗脱该多特异性抗体样品；以及(f)监测所洗脱的样品中多特异性抗体形成物的量，其中与对照相比，多特异性抗体形成物的增加的量指示稳定的多特异性抗体的设计。
还提供了在用以产生多特异性抗体的制造过程期间获得多特异性抗体的稳定性曲线的方法。所述方法包括：(a)执行用以产生多特异性抗体的制造过程，其中在该制造过程期间在不同的时间点获得一定量的多特异性抗体样品；(b)搭建反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；(c)将来自每个时间点的多特异性分子样品在极性水性流动相A中注入RP-HPLC柱中，其中极性水性流动相包含离子配对剂；(d)将有机非极性流动相B施加到RP-HPLC 柱以形成梯度洗脱，其中有机非极性流动相包含离子配对剂；(e)洗脱该多特异性抗体样品；以及(f)监测所洗脱的样品中多特异性抗体形成物的量，其中在每个时间点的多特异性抗体形成物的量提供多特异性抗体的稳定性曲线。
还提供了在用以产生多特异性抗体的制造过程期间获得多特异性抗体的降解片段物质曲线的方法。所述方法包括：(a)执行用以产生多特异性抗体的制造过程，其中在该制造过程期间在不同的时间点获得一定量的多特异性抗体样品；(b)搭建反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；(c)将来自每个时间点的多特异性分子样品在极性水性流动相A中注入RP-HPLC柱中，其中极性水性流动相包含离子配对剂；(d)将有机非极性流动相B施加到RP-HPLC柱以形成梯度洗脱，其中有机非极性流动相包含离子配对剂；(e)洗脱该多特异性抗体样品；以及(f)监测所洗脱的样品中降解片段物质的量，其中在每个时间点的降解片段物质的量提供多特异性抗体制造过程的降解片段物质曲线。
还提供了包括用于检测多特异性分子的形成物的反相高效液相色谱 (RP-HPLC)构件的***。所述***包括：(a)极性水性流动相A中的多特异性分子样品，其中极性水性流动相包含离子配对剂；(b)RP-HPLC柱；和 (c)有机非极性流动相B，其中该有机非极性流动相包含离子配对剂。RP- HPLC柱被配置为与在极性水性流动相A中的多特异性分子样品接触，并且RP-HPLC被进一步配置为与有机非极性流动相B接触以洗脱多特异性分子样品。能够在所洗脱的多特异性分子样品中识别多特异性分子形成物的量。
还提供了用于多特异性分子形成物的反相高效液相色谱(RP-HPLC) 检测的装置，该装置包括：(a)极性水性流动相A中的多特异性分子样品，其中极性水性流动相包含离子配对剂；(b)RP-HPLC柱；和(c)有机非极性流动相B，其中有机非极性流动相包含离子配对剂。RP-HPLC柱被配置为与在极性水性流动相A中的多特异性分子样品接触，并且RP-HPLC被进一步配置为与有机非极性流动相B接触以洗脱多特异性分子样品。能够在所洗脱的多特异性分子样品中识别多特异性分子形成物的量。
在某些实施方案中，极性水性流动相A为包含约1％至约5％异丙醇的溶液。例如，该溶液可包含约2％异丙醇。
在某些实施方案中，极性水性流动相A中的离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。在某些实施方案中，离子配对剂为TFA。例如，TFA可以约0.1％至约2％存在于极性水性流动相A中。在某些实施方案中，TFA以约0.1％存在于极性水性流动相A 中。
在某些实施方案中，有机非极性流动相B为包含约60％至约80％异丙醇和约15％至约25％乙腈的溶液。例如，该溶液可包含约70％异丙醇。例如，该溶液可包含约20％乙腈。
在某些实施方案中，有机非极性流动相B中的离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。在某些实施方案中，离子配对剂为TFA。例如，TFA可以约0.1％至约2％存在于有机非极性流动相B中。在某些实施方案中，TFA以约0.1％存在于有机非极性流动相B中。
在某些实施方案中，梯度洗脱包括在多特异性(例如，双特异性)抗体样品注入RP-HPLC柱时包含约75％的极性流动相A溶液和约25％的有机非极性流动相B溶液的溶液。例如，梯度洗脱可包括在多特异性抗体样品注入RP-HPLC柱后约16分钟时包含约66％的极性流动相A溶液和约 34％的有机非极性流动相B溶液的溶液。例如，梯度洗脱可包括在多特异性抗体样品注入RP-HPLC柱后约20分钟时包含约5％的极性流动相A溶液和约95％的有机非极性流动相B溶液的溶液。例如，梯度洗脱可包括在多特异性抗体样品注入RP-HPLC柱后约21分钟时包含约75％的极性流动相 A溶液和约25％的有机非极性流动相B溶液的溶液。
在某些实施方案中，用以产生多特异性抗体的制造过程选自由以下项组成的组：杵臼过程、链交换工程化结构域过程、化学连接双特异性抗体 (BsAb)过程、免疫球蛋白结构域交叉过程和受控Fab臂交换(cFAE)和双可变结构域过程。
在某些实施方案中，多特异性抗体为双特异性抗体。
附图说明
结合附图进行阅读时，能够更好地理解前述发明内容和以下对本专利申请的优选实施方案的详细说明。但是，应当理解，本专利申请不限于附图中示出的精确实施方案。
图1示出了反相高效液相色谱(RP-HPLC)单堆叠配置的示意图。
图2示出了展示代表性空白色谱图的图表。
图3示出了展示抗GPRC5D/抗CD3双特异性抗体的参考材料(完全氧化)的代表性色谱图的图表。
图4示出了展示部分氧化的抗GPRC5D/抗CD3双特异性抗体的代表性色谱图的图表。
图5示出了展示抗CD33/抗CD3双特异性抗体的参考材料(完全氧化)的代表性色谱图的图表。
图6示出了展示部分氧化的抗CD33/抗CD3双特异性抗体的代表性色谱图的图表。
图7示出了展示抗TMEFF2/抗CD3双特异性抗体的参考材料(完全氧化)的代表性色谱图的图表。
图8示出了展示部分氧化的抗TMEFF2/抗CD3双特异性抗体的代表性色谱图的图表。
图9示出了展示抗CD123/抗CD3双特异性抗体的参考材料(完全氧化)的代表性色谱图的图表。
图10示出了展示部分氧化的抗CD123/抗CD3双特异性抗体的代表性色谱图的图表。
图11示出了展示抗BCMA/抗CD3双特异性抗体的参考材料(完全氧化)的代表性色谱图的图表。
图12示出了展示部分氧化的抗BCMA/抗CD3双特异性抗体的代表性色谱图的图表。
具体实施方式
背景以及说明书全篇中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一者全文均以引用方式并入本文。本说明书中包括的对文件、行为、材料、装置、文章等的讨论旨在为本发明提供上下文。此类讨论并不是承认这些事项中的任一事项或全部事项均相对于所公开或受权利要求书保护的任何发明形成现有技术的一部分。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。
应该注意的是，除非上下文清楚地指明，否则如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一个/一种”和“所述/该”包括复数引用物。
除非另有说明，否则任何数值，例如本文所述的浓度或浓度范围，应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，数值通常包括所述值的±10％。例如，1mg/mL的浓度包括0.9mg/mL至1.1mg/mL。同样，1％至 10％(w/v)的浓度范围包括0.9％(w/v)至11％(w/v)。除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，使用的数值范围明确地包括所有可能的子范围、该范围之内的所有单个数值，包括此类范围之内的整数和该范围之内的分数。
除非另有说明，否则在一系列元素之前的术语“至少”应理解为指代系列中的每个元素。本领域的技术人员将会认识到、或仅使用常规实验就能够确定本文所述发明的具体实施方案的多种等同物。此类等同物旨在由本发明所涵盖。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”或“含有”或其任何其他变型应被理解为是指包括指明的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组，并且旨在是非排他性的或开放式的。例如，包含元素列表的组合物、混合物、过程、方法、制品或设备不一定仅限于那些元素，而是可以包括这些组合物、混合物、过程、方法、制品或设备未明确列出或固有的其他元素。此外，除非明确地指明相反，否则“或”是指包括性的或而不是指排他性的或。例如，条件A或B由以下任一项满足：A为真 (或存在)而B为假(或不存在)，A为假(或不存在)而B为真(或存在)，以及A和B两者为真(或存在)。
如本文所用，多个列举的要素之间的连接术语“和/或”被理解为包含单个选项和组合选项两者。例如，在两个要素由“和/或”连接的情况下，第一种选项是指在没有第二个要素的情况下适用第一个要素。第二种选项是指在没有第一个要素的情况下适用第二个要素。第三种选项是指适合一起使用第一要素和第二要素。这些选项中的任一种均被理解为落在含义内，并且因此满足如本文所用的术语“和/或”的要求。多于一种选项的并行适用性也被理解为落在含义内，并且因此满足术语“和/或”的要求。
如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语“由……组成”表示包括任何列举的整数或整数组，但不能将附加的整数或整数组添加到指定的方法、结构或组成中。
如本文所用，在说明书和权利要求书中通篇使用的术语“基本上由……组成”表示包括任何列举的整数或整数组，并且任选地包括不会实质上改变指定方法、结构或组成的基本或新型特性的任何列举的整数或整数组。参见M.P.E.P.§2111.03。
还应当理解，当提及优选发明的部件的尺寸或特性时，本文使用的“约”、“大约”、“大致”、“基本上”和类似的术语表示所描述的尺寸/特性不是严格的边界或参数，并且不排除在功能上相同或相似的微小变化，如本领域普通技术人员所理解的。至少，包括数值参数的这种参考将包括使用本领域已接受的数学和工业原理(例如，舍入、测量或其他***误差、制造公差等)的变化，不会改变最低有效数字。
如本文所用，同义地称为“核酸分子”、“核苷酸”或“核酸”的术语“多核苷酸”是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可为未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于单链和双链的DNA、为单链区和双链区的混合物的DNA、单链和双链的 RNA以及为单链区和双链区的混合物的RNA、包含可为单链或更典型地为双链或者为单链区和双链区的混合物的DNA和RNA的杂合分子。此外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。术语多核苷酸还包括含有一个或多个修饰的碱基的DNA或RNA，以及具有出于稳定性或其他原因而被修饰的主链的DNA或RNA。“修饰的”碱基包括例如三苯甲基化的碱基和稀有碱基诸如肌苷。可以对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括通常天然存在的多核苷酸的化学修饰、酶修饰或代谢修饰形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”也包括相对短的核酸链，通常被称为寡核苷酸。
如本文所用，术语“载体”是复制子，其中可以可操作地***另一核酸区段以引起该区段的复制或表达。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指包含本发明的核酸分子的细胞。“宿主细胞”可为任何类型的细胞，例如，原代细胞、培养中的细胞或来自细胞系的细胞。在一个实施方案中，“宿主细胞”是用本发明的核酸分子转染的细胞。在另一个实施方案中，“宿主细胞”是此类经转染细胞的后代或潜在后代。细胞的后代可以或不可与亲本细胞相同，例如，由于可在后代中发生的突变或环境影响或者由于核酸分子整合到宿主细胞基因组中。
如本文所用，术语“表达”是指基因产物的生物合成。该术语涵盖基因到RNA的转录。该术语还涵盖RNA到一个或多个多肽的翻译，并且还涵盖所有天然存在的转录后和翻译后修饰。表达的双特异性抗体可处于宿主细胞的细胞质内，处于胞外环境诸如细胞培养物的生长培养基中，或锚定至细胞膜。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”可指由氨基酸组成的分子，并且可被本领域的技术人员识别为蛋白质。本文使用氨基酸残基的常规单字母或三字母代码。术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可为直链或支链的，其可包含经修饰的氨基酸，并且其可夹杂有非氨基酸。该术语还涵盖已被天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物；天然修饰或干预修饰为例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，诸如与标记组分缀合。该定义还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物 (包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
如本文所用，术语“检测(detecting/detect)”或其变体在最广义上包括对目标分子(例如，多特异性抗体)的定性测量和定量测量两者。检测包括识别样品中仅存在目标分子，以及确定目标分子是否以可检测的水平存在于样品中。
如本文所用，术语“样品”是指大量材料的一小部分。一般来讲，根据本文所述方法进行的测试是对样品执行的。样品通常是从多特异性分子制剂(例如，多特异性抗体制剂)获得的，该多特异性分子制剂例如从用以产生多特异性分子的制造过程中获得，如下所述。
如本文所用，术语“注入(inject/injecting)”可指将样品在水相中装载到HPLC柱中。在注入和/或装载待检测和/或待纯化的组合物之前，可使用平衡缓冲液对样品进行平衡。
如本文所用，术语“洗脱(elute、eluting和/或elution)”可指从色谱材料中去除产物(例如，多特异性抗体)。洗脱缓冲液是用于从色谱材料中洗脱多特异性抗体的缓冲液。
用于检测多特异性分子形成物的***、材料和方法
本文提供了检测多特异性分子的形成物的方法。所述方法包括：(a)获得多特异性分子样品；(b)获得反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；(c)将多特异性分子样品在极性水性流动相A中与P-HPLC柱接触，其中极性水性流动相包含离子配对剂；(d)将有机非极性流动相B与RP-HPLC柱接触，其中有机非极性相包含离子配对剂；(e)洗脱该多特异性分子样品；以及(f) 识别所洗脱的多特异性分子样品中多特异性分子形成物的量。在某些实施方案中，多特异性分子为多特异性抗体。在某些实施方案中，多特异性抗体为双特异性抗体。
本文提供了在执行用以产生多特异性抗体的制造过程的同时检测多特异性抗体的形成物的方法。所述方法包括：(a)执行用以产生多特异性抗体的制造过程，其中该制造过程产生包含一定量的多特异性抗体的多特异性抗体样品；(b)搭建反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；(c)将多特异性分子样品在极性水性流动相A中注入RP-HPLC柱中，其中极性水性流动相包含离子配对剂；(d)将有机非极性流动相B施加到RP-HPLC柱以形成梯度洗脱，其中有机非极性流动相包含离子配对剂；(e)洗脱该多特异性抗体样品；以及(f)监测所洗脱的样品中多特异性抗体形成物的量。
本文还提供了在执行用以产生双特异性抗体的受控FAB臂交换 (cFAE)期间检测双特异性抗体的形成物的方法。所述方法包括(a)执行用以产生cFAE样品的受控FAB臂交换(cFAE)，其中cFAE样品包含一定量的双特异性抗体；(b)搭建反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；(c)将 cFAE样品在极性水性流动相A中注入RP-HPLC柱中，其中极性水性流动相包含离子配对剂；(d)将有机非极性流动相B施加到RP-HPLC柱以形成梯度洗脱，其中有机非极性流动相包含离子配对剂；(e)洗脱cFAE样品；以及(f)监测所洗脱的样品中双特异性抗体形成物的量。
在某些实施方案中，形成的多特异性抗体的量可通过制备和测试参考样品来确定。部分形成的多特异性抗体的量可通过与参考样品(完全形成)进行比较来确定。参考样品可包括具有80％-100％完全形成的多特异性抗体的样品。将过程制造样品与参考样品进行比较，可通过能够确定完全形成的多特异性抗体及其部分形成的抗体片段的量来确定用以产生多特异抗体的制造过程的效率和有效性。
还提供了在过程开发动力学研究中利用该测定来开发多特异性抗体的方法。该方法包括：(a)执行用以产生多特异性抗体的研究和开发过程，其中该研究和开发过程产生包含一定量的多特异性抗体的多特异性抗体样品；(b)搭建反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；(c)将多特异性分子样品在极性水性流动相A中注入RP-HPLC柱中，其中极性水性流动相包含离子配对剂；(d)将有机非极性流动相B施加到RP-HPLC柱以形成梯度洗脱，其中有机非极性流动相包含离子配对剂；(e)洗脱多特异性抗体样品；以及(f) 监测所洗脱的样品中多特异性抗体形成物的量，其中与参考样品相比，多特异性抗体形成物的增加的量指示多特异性抗体的成功设计。
还提供了在用以产生多特异性抗体的制造过程期间获得多特异性抗体的稳定性曲线的方法。所述方法包括：(a)执行用以产生多特异性抗体的制造过程，其中在该制造过程期间在不同的时间点获得一定量的多特异性抗体样品；(b)搭建反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；(c)将来自每个时间点的多特异性分子样品在极性水性流动相A中注入RP-HPLC柱中，其中极性水性流动相包含离子配对剂；(d)将有机非极性流动相B施加到RP-HPLC 柱以形成梯度洗脱，其中有机非极性流动相包含离子配对剂；(e)洗脱该多特异性抗体样品；以及(f)监测所洗脱的样品中多特异性抗体形成物的量，其中在每个时间点的多特异性抗体形成物的量提供该多特异性抗体的稳定性曲线。
将过程制造样品与参考样品进行比较，可通过能够确定完全形成的多特异性抗体及其部分形成的抗体片段的量来确定用以产生多特异抗体的制造过程的效率和有效性。与参考样品相比，完全形成的多特异性抗体的量的增加可指示多特异性抗体的设计有利于产生不包含未形成和/或部分形成的多特异性抗体片段的多特异性抗体。
还提供了包括用于检测多特异性分子的形成物的反相高效液相色谱 (RP-HPLC)构件的***。所述***包括：(a)极性水性流动相A中的多特异性分子样品，其中极性水性流动相包含离子配对剂；(b)RP-HPLC柱；和 (c)有机非极性流动相B，其中有机非极性流动相包含离子配对剂。RP- HPLC柱被配置为与在极性水性流动相A中的多特异性分子样品接触，并且RP-HPLC被进一步配置为与有机非极性流动相B接触以洗脱多特异性分子样品。能够在所洗脱的多特异性分子样品中识别多特异性分子形成物的量。
还提供了用于多特异性分子形成物的反相高效液相色谱(RP-HPLC) 检测的装置，该装置包括：(a)极性水性流动相A中的多特异性分子样品，其中极性水性流动相包含离子配对剂；(b)RP-HPLC柱；和(c)有机非极性流动相B，其中有机非极性流动相包含离子配对剂。RP-HPLC柱被配置为与在极性水性流动相A中的多特异性分子样品接触，并且RP-HPLC柱被进一步配置为与有机非极性流动相B接触以洗脱多特异性分子样品。能够在所洗脱的多特异性分子样品中识别多特异性分子形成物的量。
如本文所公开，反相高压液相色谱(RP-HPLC)是一种使用疏水性固定相(例如，包含与固定相颗粒共价键合的烷基链的固定相)的色谱技术。疏水性固定相的使用与正相色谱相反，因为流动相和固定相的极性相反。RP-HPLC采用极性水性流动相。因此，极性流动相中的疏水性分子倾向于吸附到疏水性固定相上，并且流动相中的亲水性分子将穿过柱，并首先被洗脱。可通过使用有机(非极性)溶剂降低流动相的极性来从柱中洗脱疏水性分子，这减少了疏水相互作用。分子疏水性越强，其与固定相的结合越强，洗脱分子所需的有机溶剂浓度越高。
在某些实施方案中，极性水性流动相为包含约1％至约5％异丙醇的溶液。例如，该溶液可包含约1％、约2％、约3％、约4％、约5％或其间任何值的异丙醇。在优选的实施方案中，极性水性流动相包含约2％异丙醇。
在某些实施方案中，极性水性流动相为包含选自由乙腈、丙醇和四氢呋喃(THF)组成的组的至少一种组分的溶液。例如，该溶液可包含约 1％、约2％、约3％、约4％、约5％或其间任何值的乙腈、丙醇和/或四氢呋喃(THF)。在优选的实施方案中，极性水性流动相包含约2％乙腈、丙醇和/或四氢呋喃(THF)。
在某些实施方案中，流动相A中的离子配对剂选自由三氟乙酸 (TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。
在某些实施方案中，离子配对剂为TFA。例如，TFA可以约0.1％至约 2％存在于极性水性流动相中。例如，TFA可以约0.1％、约0.2％、约 0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约 1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约 1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％或其间任何值存在于极性水性流动相中。在优选的实施方案中，TFA以约0.1％存在于极性水性流动相中。
在某些实施方案中，离子配对剂为DFA。例如，DFA可以约0.1％至约2％存在于极性水性流动相中。例如，DFA可以约0.1％、约0.2％、约 0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约 1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约 1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％或其间任何值存在于极性水性流动相中。在优选的实施方案中，DFA以约0.1％存在于极性水性流动相中。
在某些实施方案中，离子配对剂为FA。例如，FA可以约0.5％至约 5％存在于极性水性流动相中。例如，FA可以约0.5％、约0.6％、约 0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约 1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％、约 2.1％、约2.2％、约2.3％、约2.4％、约2.5％、约2.6％、约2.7％、约 2.8％、约2.9％、约3.0％、约3.1％、约3.2％、约3.3％、约3.4％、约 3.5％、约3.6％、约3.7％、约3.8％、约3.9％、约4.0％、约4.1％、约 4.2％、约4.3％、约4.4％、约4.5％、约4.6％、约4.7％、约4.8％、约 4.9％、约5.0％或其间任何值存在于极性水性流动相中。
在某些实施方案中，有机非极性流动相B为包含约60％至约100％异丙醇和约0％至约25％乙腈的溶液。例如，有机非极性流动相溶液可包含约 60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约90％、约100％或其间任何值的异丙醇。在优选的实施方案中，有机非极性流动相溶液包含约70％异丙醇。例如，有机非极性流动相溶液可包含约0％、约5％、约10％、约 15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约 23％、约24％、约25％或其间任何值的乙腈。在优选的实施方案中，有机非极性流动相包含约20％乙腈。
在某些实施方案中，有机非极性流动相为包含选自由乙腈、异丙醇和丙醇(例如，正丙醇(n-丙醇))组成的组的至少一种组分的溶液。例如，该溶液可包含约0％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％或其间任何值的乙腈、异丙醇和/或丙醇。在某些实施方案中，有机非极性流动相包含约70％异丙醇、约20％乙腈和约10％水；约70％n-丙醇、约20％乙腈和约10％水；约70％乙腈、约20％异丙醇和约10％水；约80％异丙醇和约20％乙腈；约80％乙腈和约20％异丙醇；约75％异丙醇和约25％乙腈；约25％异丙醇和约75％乙腈；以及约50％异丙醇和约50％乙腈。
在某些实施方案中，流动相B中的离子配对剂选自由三氟乙酸 (TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。
在某些实施方案中，离子配对剂为TFA。例如，TFA可以约0.1％至约 2％存在于极性水性流动相中。例如，TFA可以约0.1％、约0.2％、约 0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约 1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约 1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％或其间任何值存在于极性水性流动相中。在优选的实施方案中，TFA以约0.1％存在于极性水性流动相中。
在某些实施方案中，离子配对剂为DFA。例如，DFA可以约0.1％至约2％存在于极性水性流动相中。例如，DFA可以约0.1％、约0.2％、约 0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约 1.0％、约1.1％、约1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约 1.7％、约1.8％、约1.9％、约2.0％或其间任何值存在于极性水性流动相中。在优选的实施方案中，DFA以约0.1％存在于极性水性流动相中。
在某些实施方案中，离子配对剂为FA。例如，FA可以约1.0％至约 5％存在于极性水性流动相中。例如，FA可以约1.0％、约1.1％、约 1.2％、约1.3％、约1.4％、约1.5％、约1.6％、约1.7％、约1.8％、约 1.9％、约2.0％、约2.1％、约2.2％、约2.3％、约2.4％、约2.5％、约2.6％、约2.7％、约2.8％、约2.9％、约3.0％、约3.1％、约3.2％、约 3.3％、约3.4％、约3.5％、约3.6％、，约3.7％、约3.8％、约3.9％、约 4.0％、约4.1％、约4.2％、约4.3％、约4.4％、约4.5％、约4.6％、约4.7％、约4.8％、约4.9％、约5.0％或其间任何值存在于极性水性流动相中。
在某些实施方案中，梯度洗脱包括在多特异性抗体样品注入RP-HPLC 柱时包含约75％的极性流动相A溶液和约25％的有机非极性流动相B溶液的溶液。例如，梯度洗脱可包括在多特异性抗体样品注入RP-HPLC柱后约 16分钟时包含约66％的极性流动相A溶液和约34％的有机非极性流动相B 溶液的溶液。例如，梯度洗脱可包括在多特异性抗体样品注入RP-HPLC柱后约20分钟时包含约5％的极性流动相A溶液和约95％的有机非极性流动相B溶液的溶液。例如，梯度洗脱可包括在多特异性抗体样品注入RP- HPLC柱后约21分钟时包含约75％的极性流动相A溶液和约25％的有机非极性流动相B溶液的溶液。
抗体
本文提供了在执行用以产生多特异性抗体的制造过程的同时检测多特异性抗体成物的方法、设计稳定的多特异性抗体的方法以及在用以产生多特异性抗体的制造过程期间获得稳定性曲线或获得降解片段物质曲线的方法。在某些实施方案中，多特异性抗体为双特异性抗体。
如本文所用，术语“抗体”广义地使用，并且包括免疫球蛋白或抗体分子，包括人抗体、人源化抗体、复合抗体和嵌合抗体以及单克隆或多克隆抗体片段。一般来讲，抗体是蛋白质或肽链，其对于特定抗原表现出结合特异性。抗体结构是众所周知的。根据重链恒定结构域氨基酸序列，可将免疫球蛋白指定为五大类(即IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。IgA和 IgG进一步亚分类为同种型IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。因此，本发明的抗体可为五种主要种类或对应的亚类中的任一种。优选地，本发明的抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。基于其恒定结构域的氨基酸序列，可将脊椎物种的抗体轻链指定为两种完全不同的类型即κ和λ中的一种。因此，本发明的抗体可含有κ或λ轻链恒定域。根据特定实施方案，本发明的抗体包括来自大鼠或人抗体的重链和/或轻链恒定区。除了重链和轻链恒定结构域之外，抗体还含有由轻链可变区和重链可变区组成的抗原结合区，其中每个可变区含有三个结构域(即互补决定区1-3； CDR1、CDR2和CDR3)。轻链可变区结构域另选地被称为LCDR1、LCDR2和LCDR3，并且重链可变区结构域另选地被称为HCDR1、HCDR2 和HCDR3。
如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合两种或更多种抗原的分离的多特异性抗体基本上不含不结合两种或更多种抗原的多特异性抗体)。另外，分离的抗体可基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从一组基本上均质的抗体获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能天然存在的突变之外，构成该组的各个抗体是相同的。本发明单克隆抗体可以通过杂交瘤方法、噬菌体展示技术、单淋巴细胞基因克隆技术或通过重组DNA方法制备。例如，单克隆抗体可以由包括获自转基因非人动物诸如转基因小鼠或大鼠的B细胞的杂交瘤产生，转基因非人动物具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，诸如，双抗体、 Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫键稳定的双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、单结构域抗体(sdab)、scFv二聚体(二价双价抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或与抗原结合但不包含完整抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够结合至与亲本抗体或亲本抗体片段结合的抗原相同的抗原。根据具体实施方案，抗原结合片段包含轻链可变区、轻链恒定区和重链的Fd区段。根据其他具体实施方案，抗原结合片段包含Fab和F(ab’)。
如本文所用，术语“单链抗体”是指本领域中的常规单链抗体，其包含通过约15个至约20个氨基酸的短肽连接的重链可变区和轻链可变区。如本文所用，术语“单域抗体”是指本领域中的常规单域抗体，这种单域抗体包含重链可变区和重链恒定区或者仅包含重链可变区。
如本文所用，术语“人抗体”是指由人产生的抗体或具有与使用本领域已知的任何技术制备的人产生的抗体对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义包括完整或全长抗体、其片段以及/或者包含至少一种人重链多肽和/或轻链多肽的抗体。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指被修饰成提高与人抗体的序列同源性的非人抗体，使得抗体的抗原结合特性得以保留，但其在人体内的抗原性下降。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两个或更多个物种的抗体。轻链和重链两者的可变区经常对应于源自一个哺乳动物物种(例如，小鼠、大鼠、兔等)的具有期望的特异性、亲和力和能力的抗体的可变区，而恒定区对应于源自另一个哺乳动物物种 (例如，人)的抗体中的序列，以便避免在那个物种中引出免疫应答。
如本文所用，术语“多特异性抗体”是指包含多个免疫球蛋白可变结构域序列的抗体，其中该多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，并且该多个免疫球蛋白可变结构域序列中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在相同抗原例如相同蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一个实施方案中，第一表位和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位不重叠或基本上不重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在不同抗原例如不同蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一个实施方案中，多特异性抗体包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方案中，多特异性抗体是双特异性抗体分子、三特异性抗体分子或四特异性抗体分子。
如本文所用，术语“双特异性抗体”是指结合不超过两个表位或两个抗原的多特异性抗体。双特异性抗体的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在相同抗原例如相同蛋白质(或多聚体蛋白质的亚基)上。在一个实施方案中，第一表位和第二表位重叠或基本上重叠。在一个实施方案中，第一表位和第二表位在不同抗原例如不同蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基) 上。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一个实施方案中，双特异性抗体包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
本文提供了在执行用以产生多特异性抗体的制造过程之后检测多特异性抗体形成物的方法。还提供了获得多特异性抗体的稳定性曲线的方法和在用以产生多特异性抗体的制造过程期间获得降解片段物质曲线的方法。在某些实施方案中，用以产生多特异性抗体的制造过程选自由以下项组成的组：受控臂交换(cFAE)过程、杵臼过程、重链异源二聚化过程和体外二硫键异构化过程。
本发明的全长双特异性抗体可例如使用两个单特异性二价抗体之间的 Fab臂交换(或半分子交换)通过下列方式生成：在每个半分子中的重链 CH3交界处引入置换以促成两个在体外无细胞环境中或使用共表达而具有不同特异性的抗体半分子的异源二聚体形成。Fab臂交换反应是二硫键异构化反应和CH3结构域解离-缔合的结果。亲本单特异性抗体的铰链区中的重链二硫键减少。亲本单特异性抗体之一的所得游离半胱氨酸与第二亲本单特异性抗体分子的半胱氨酸残基形成重链间二硫键，同时亲本抗体的CH3 域通过解离-缔合而释放和重新形成。可以对Fab臂的CH3结构域进行工程改造，以促成异源二聚化而非同源二聚化。所得产物是具有两个Fab臂或半分子的双特异性抗体，这两个Fab臂或半分子各自结合不同的表位，即第一抗原上的表位和第二抗原上的表位。
如本文所用，“同源二聚化”是指具有相同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用，“同源二聚体”是指具有含有相同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。
如本文所用，“异源二聚化”是指具有不同CH3氨基酸序列的两条重链的相互作用。如本文所用，“异源二聚体”是指具有含有不同CH3氨基酸序列的两条重链的抗体。
“杵臼结构”策略(参见例如，PCT公布WO2006/028936)可用于生成全长双特异性抗体。简而言之，在人IgG中形成CH3结构域的交界的选定氨基酸可在影响CH3结构域相互作用的位置处突变，从而促进异源二聚体形成。将具有小侧链(杵)的氨基酸引入特异性地结合第一抗原的抗体的重链中，并将具有大侧链(杵)的氨基酸引入特异性地结合第二抗原的抗体的重链中。在两种抗体共表达后，由于具有“臼”的重链与具有“杵”的重链的优先相互作用而形成异源二聚体。形成杵臼结构的示例性 CH3置换对(表示为第一重链的第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二CH3结构域中的修饰位置)是：T366Y/F405A、T366W/F405W、 F405W/Y407A、T394W/Y407T、T394S/Y407A、T366W/T394S、 F405W/T394S和T366W/T366S_L368A_Y407V。
还可使用其他策略，诸如通过在一个CH3表面置换带正电荷的残基并在第二CH3表面置换带负电荷的残基使用静电相互作用促进重链异源二聚化，如美国专利公布US2010/0015133；美国专利公布US2009/0182127；美国专利公布US2010/028637；或美国专利公布US2011/0123532中所述。在其他策略中，可通过下面的置换(表示为第一重链的第一CH3结构域中的修饰位置/第二重链的第二CH3结构域中的修饰位置)促进异源二聚化： L351Y_F405AY407V/T394W、T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V、 T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V、L351Y_Y407A/T366A_K409F、 L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F或T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W，如美国专利公布US2012/0149876或美国专利公布US2013/0195849中所述。
除上述方法之外，本发明的双特异性抗体还可在体外无细胞环境中通过下列方式生成：在两种单特异性同源二聚抗体的CH3区中引入非对称突变，并且在还原条件下由两种亲本单特异性同源二聚抗体形成双特异性异源二聚抗体，从而允许根据国际专利公布WO2011/131746中所述的方法进行二硫键异构化。在所述方法中，将第一单特异性二价抗体(例如，抗 CD33抗体)和第二单特异性二价抗体(例如，抗CD3抗体)工程改造为在CH3结构域处具有促进异源二聚体稳定性的某些置换；将这些抗体在足以使铰链区中的半胱氨酸发生二硫键异构化的还原条件下一起温育；从而通过Fab臂交换生成双特异性抗体。温育条件可以任选地恢复到非还原条件。可使用的示例性还原剂为2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦 (TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基乙醇，优选地为选自由2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦组成的组的还原剂。例如，可使用如下条件：在至少25mM 2-MEA的存在下或在至少0.5mM二硫苏糖醇的存在下，在5至8的pH下，例如在7.0的pH下或在7.4的pH下，在至少20℃的温度下，温育至少90分钟。
实施方案
本发明提供了以下非限制性实施方案。
实施方案1是一种检测多特异性分子的形成物的方法，所述方法包括：
a.获得多特异性分子样品；
b.获得反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；
c.将所述多特异性分子样品在极性水性流动相A中与所述RP-HPLC 柱接触，其中所述极性水性流动相包含离子配对剂；
d.将有机非极性流动相B与所述RP-HPLC柱接触，其中所述有机非极性相包含离子配对剂；
e.洗脱所述多特异性分子样品；以及
f.监测所洗脱的多特异性分子样品中多特异性分子形成物的量。
实施方案2是根据实施方案1所述的方法，其中所述极性水性流动相 A为包含约1％至约5％异丙醇的溶液。
实施方案3是根据实施方案2所述的方法，其中所述溶液包含约2％异丙醇。
实施方案4是根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中所述极性水性流动相A中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸 (DFA)和甲酸(FA)组成的组。
实施方案5是根据实施方案4所述的方法，其中所述TFA以约0.1％至约2％存在于所述极性水性流动相A中。
实施方案6是根据实施方案5所述的方法，其中所述TFA以约0.1％存在于所述极性水性流动相A中。
实施方案7是根据实施方案1所述的方法，其中所述有机非极性流动相B为包含约60％至约80％异丙醇和约15％至约25％乙腈的溶液。
实施方案8是根据实施方案7所述的方法，其中所述溶液包含约70％异丙醇。
实施方案9是根据实施方案7或8所述的方法，其中所述溶液包含约 20％乙腈。
实施方案10是根据实施方案7至9中任一项所述的方法，其中所述有机非极性流动相B中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。
实施方案11是根据实施方案10所述的方法，其中所述TFA以约0.1％至约2％存在于所述有机非极性水性流动相B中。
实施方案12是根据实施方案11所述的方法，其中所述TFA以约0.1％存在于所述有机非极性水性流动相B中。
实施方案13是根据实施方案1至12中任一项所述的方法，其中所述多特异性分子为多特异性抗体，优选地其中所述多特异性抗体为双特异性抗体。
实施方案14是一种在执行用以产生多特异性抗体的制造过程的同时检测多特异性抗体的形成物的方法，所述方法包括：
a.执行用以产生多特异性抗体的制造过程，其中所述制造过程产生包含一定量的多特异性抗体的多特异性抗体样品；
b.搭建反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；
c.将所述多特异性分子样品在极性水性流动相A中注入所述RP- HPLC柱中，其中所述极性水性流动相包含离子配对剂；
d.将有机非极性流动相B施加到所述RP-HPLC柱以形成梯度洗脱，其中所述有机非极性流动相包含离子配对剂；
e.洗脱所述多特异性抗体样品；以及
f.监测所洗脱的样品中多特异性抗体形成物的所述量。
实施方案15是根据实施方案14所述的方法，其中所述极性水性流动相A为包含约1％至约5％异丙醇的溶液。
实施方案16是根据实施方案15所述的方法，其中所述溶液包含约2％异丙醇。
实施方案17是根据实施方案14至16中任一项所述的方法，其中所述极性水性流动相A中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。
实施方案18是根据实施方案17所述的方法，其中所述TFA以约0.1％至约2％存在于所述极性水性流动相A中。
实施方案19是根据实施方案18所述的方法，其中所述TFA以约0.1％存在于所述极性水性流动相A中。
实施方案20是根据实施方案14所述的方法，其中所述有机非极性流动相B为包含约60％至约80％异丙醇和约15％至约25％乙腈的溶液。
实施方案21是根据实施方案20所述的方法，其中所述溶液包含约 70％异丙醇。
实施方案22是根据实施方案20或21所述的方法，其中所述溶液包含约20％乙腈。
实施方案23是根据实施方案20至22中任一项所述的方法，其中所述有机非极性流动相B中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。
实施方案24是根据实施方案23所述的方法，其中所述TFA以约0.1％至约2％存在于所述非极性水性流动相中。
实施方案25是根据实施方案24所述的方法，其中所述TFA以约0.1％存在于所述非极性水性流动相中。
实施方案26是根据实施方案14至25中任一项所述的方法，其中所述梯度洗脱包括在所述多特异性抗体样品注入所述RP-HPLC柱时包含约75％的极性流动相A溶液和约25％的有机非极性流动相B溶液的溶液。
实施方案27是根据实施方案26所述的方法，其中所述梯度洗脱包括在所述多特异性抗体样品注入所述RP-HPLC柱后约16分钟时包含约66％的极性流动相A溶液和约34％的有机非极性流动相B溶液的溶液。
实施方案28是根据实施方案26所述的方法，其中所述梯度洗脱包括在所述多特异性抗体样品注入所述RP-HPLC柱后约20分钟时包含约5％的极性流动相A溶液和约95％的有机非极性流动相B溶液的溶液。
实施方案29是根据实施方案26所述的方法，其中所述梯度洗脱包括在所述多特异性抗体样品注入所述RP-HPLC柱后约21分钟时包含约75％的极性流动相A溶液和约25％的有机非极性流动相B溶液的溶液。
实施方案30是根据实施方案14至29中任一项所述的方法，其中用以产生多特异性抗体的所述制造过程选自由以下项组成的组：杵臼过程、链交换工程化结构域过程、化学连接双特异性抗体(BsAb)过程、免疫球蛋白结构域交叉过程和受控Fab臂交换(cFAE)和双可变结构域过程。
实施方案31是根据实施方案14至30中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体为双特异性抗体。
实施方案32是一种在执行用以产生双特异性抗体的受控FAB臂交换 (cFAE)的同时检测双特异性抗体的形成物的方法，所述方法包括：
a.执行用以产生cFAE样品的受控FAB臂交换(cFAE)，其中所述 cFAE样品包含一定量的双特异性抗体；
b.搭建反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；
c.将所述cFAE样品在极性水性流动相A中注入所述RP-HPLC柱中，其中所述极性水性流动相包含离子配对剂；
d.将有机非极性流动相B施加到所述RP-HPLC柱以形成梯度洗脱，其中所述有机非极性流动相包含离子配对剂；
e.洗脱所述cFAE样品；以及
f.监测所洗脱的样品中多特异性抗体形成物的量。
实施方案33是根据实施方案32所述的方法，其中所述极性水性流动相A为包含约1％至约5％异丙醇的溶液。
实施方案34是根据实施方案33所述的方法，其中所述溶液包含约2％异丙醇。
实施方案35是根据实施方案32至34中任一项所述的方法，其中所述极性水性流动相A中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。
实施方案36是根据实施方案35所述的方法，其中所述TFA以约0.1％至约2％存在于所述极性水性流动相A中。
实施方案37是根据实施方案36所述的方法，其中所述TFA以约0.1％存在于所述极性水性流动相A中。
实施方案38是根据实施方案32所述的方法，其中所述有机非极性流动相B为包含约60％至约80％异丙醇和约15％至约25％乙腈的溶液。
实施方案39是根据实施方案38所述的方法，其中所述溶液包含约 70％异丙醇。
实施方案40是根据实施方案38或39所述的方法，其中所述溶液包含约20％乙腈。
实施方案41是根据实施方案38至40中任一项所述的方法，其中所述有机非极性流动相B中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。
实施方案42是根据实施方案41所述的方法，其中所述TFA以约0.1％至约2％存在于所述非极性水性流动相中。
实施方案43是根据实施方案42所述的方法，其中所述TFA以约0.1％存在于所述非极性水性流动相中。
实施方案44是一种***，所述***包括用于检测多特异性分子的形成物的反相高效液相色谱(RP-HPLC)构件，所述***包括：
a.极性水性流动相A中的多特异性分子样品，其中所述极性水性流动相包含离子配对剂；
b.RP-HPLC柱；
c.有机非极性流动相B，其中所述有机非极性流动相包含离子配对剂；
其中所述RP-HPLC柱被配置为与极性水性流动相A中的所述多特异性分子样品接触，并且
其中所述RP-HPLC被进一步配置为与所述有机非极性流动相B 接触以洗脱多特异性分子样品，其中能够在所洗脱的多特异性分子样品中识别多特异性分子形成物的量。
实施方案45是根据实施方案44所述的***，其中所述极性水性流动相A为包含约1％至约5％异丙醇的溶液。
实施方案46是根据实施方案45所述的***，其中所述溶液包含约2％异丙醇。
实施方案47是根据实施方案44至46中任一项所述的***，其中所述极性水性流动相A中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。
实施方案48是根据实施方案47所述的***，其中所述TFA以约0.1％至约2％存在于所述极性水性流动相A中。
实施方案49是根据实施方案48所述的***，其中所述TFA以约0.1％存在于所述极性水性流动相A中。
实施方案50是根据实施方案44所述的***，其中所述有机非极性流动相B为包含约60％至约80％异丙醇和约15％至约25％乙腈的溶液。
实施方案51是根据实施方案50所述的***，其中所述溶液包含约 70％异丙醇。
实施方案52是根据实施方案50或51所述的***，其中所述溶液包含约20％乙腈。
实施方案53是根据实施方案50至52中任一项所述的***，其中所述有机非极性流动相B中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。
实施方案54是根据实施方案53所述的***，其中所述TFA以约0.1％至约2％存在于所述有机非极性水性流动相B中。
实施方案55是根据实施方案54所述的***，其中所述TFA以约0.1％存在于所述有机非极性水性流动相B中。
实施方案56是根据实施方案44至55中任一项所述的***，其中所述多特异性分子为多特异性抗体，优选地其中所述多特异性抗体为双特异性抗体。
实施方案57是一种用于多特异性分子形成物的反相高效液相色谱 (RP-HPLC)检测的装置，所述装置包括：
a.极性水性流动相A中的多特异性分子样品，其中所述极性水性流动相包含离子配对剂；
b.RP-HPLC柱；
c.有机非极性流动相B，其中所述有机非极性流动相包含离子配对剂；
其中所述RP-HPLC柱被配置为与极性水性流动相A中的所述多特异性分子样品接触，并且
其中所述RP-HPLC柱被进一步配置为与所述有机非极性流动相B 接触以洗脱多特异性分子样品，其中能够在所洗脱的多特异性分子样品中识别多特异性分子形成物的量。
实施方案58是根据实施方案57所述的用于多特异性分子形成物的反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测的装置，其中所述极性水性流动相A为包含约1％至约5％异丙醇的溶液。
实施方案59是根据实施方案58所述的用于多特异性分子形成物的反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测的装置，其中所述溶液包含约2％异丙醇。
实施方案60是根据实施方案57至59中任一项所述的用于多特异性分子形成物的反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测的装置，其中所述极性水性流动相A中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸 (DFA)和甲酸(FA)组成的组。
实施方案61是根据实施方案60所述的用于多特异性分子形成物的反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测的装置，其中所述TFA以约0.1％至约 2％存在于所述极性水性流动相A中。
实施方案62是根据实施方案61所述的用于多特异性分子形成物的反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测的装置，其中所述TFA以约0.1％存在于所述极性水性流动相A中。
实施方案63是根据实施方案57所述的用于多特异性分子形成物的反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测的装置，其中所述有机非极性流动相B 为包含约60％至约80％异丙醇和约15％至约25％乙腈的溶液。
实施方案64是根据实施方案63所述的用于多特异性分子形成物的反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测的装置，其中所述溶液包含约70％异丙醇。
实施方案65是根据实施方案63或64所述的用于多特异性分子形成物的反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测的装置，其中所述溶液包含约20％乙腈。
实施方案66是根据实施方案63至65中任一项所述的用于多特异性分子形成物的反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测的装置，其中所述有机非极性流动相B中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸 (DFA)和甲酸(FA)组成的组。
实施方案67是根据实施方案66所述的用于多特异性分子形成物的反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测的装置，其中所述TFA以约0.1％至约 2％存在于所述有机非极性水性流动相B中。
实施方案68是根据实施方案67所述的用于多特异性分子形成物的反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测的装置，其中所述TFA以约0.1％存在于所述有机非极性水性流动相B中。
实施方案69是根据实施方案57至68中任一项所述的用于多特异性分子形成物的反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测的装置，其中所述多特异性分子为多特异性抗体，优选地其中所述多特异性抗体为双特异性抗体。
实施方案70是一种设计稳定的多特异性抗体的方法，所述方法包括：
a.执行用以产生多特异性抗体的制造过程，其中所述制造过程产生包含一定量的多特异性抗体的多特异性抗体样品；
b.搭建反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；
c.将所述多特异性分子样品在极性水性流动相A中注入所述RP- HPLC柱中，其中所述极性水性流动相包含离子配对剂；
d.将有机非极性流动相B施加到所述RP-HPLC柱以形成梯度洗脱，其中所述有机非极性流动相包含离子配对剂；
e.洗脱所述多特异性抗体样品；以及
f.监测所洗脱的样品中多特异性抗体形成物的量，
其中与对照相比，多特异性抗体形成物的增加的量指示稳定的多特异性抗体的设计。
实施方案71是根据实施方案70所述的方法，其中所述极性水性流动相A为包含约1％至约5％异丙醇的溶液。
实施方案72是根据实施方案71所述的方法，其中所述溶液包含约2％异丙醇。
实施方案73是根据实施方案70至72中任一项所述的方法，其中所述极性水性流动相A中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。
实施方案74是根据实施方案73所述的方法，其中所述TFA以约0.1％至约2％存在于所述极性水性流动相A中。
实施方案75是根据实施方案74所述的方法，其中所述TFA以约0.1％存在于所述极性水性流动相A中。
实施方案76是根据实施方案70所述的方法，其中所述有机非极性流动相B为包含约60％至约80％异丙醇和约15％至约25％乙腈的溶液。
实施方案77是根据实施方案76所述的方法，其中所述溶液包含约 70％异丙醇。
实施方案78是根据实施方案76或77所述的方法，其中所述溶液包含约20％乙腈。
实施方案79是根据实施方案76至78中任一项所述的方法，其中所述有机非极性流动相B中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。
实施方案80是根据实施方案79所述的方法，其中所述TFA以约0.1％至约2％存在于所述非极性水性流动相中。
实施方案81是根据实施方案80所述的方法，其中所述TFA以约0.1％存在于所述非极性水性流动相中。
实施方案82是根据实施方案70至81中任一项所述的方法，其中用以产生多特异性抗体的所述制造过程选自由以下项组成的组：杵臼过程、链交换工程化结构域过程、化学连接双特异性抗体(BsAb)过程、免疫球蛋白结构域交叉过程和受控Fab臂交换(cFAE)和双可变结构域过程。
实施方案83是根据实施方案70至82中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体为双特异性抗体。
实施方案84是一种在用以产生多特异性抗体的制造过程期间获得多特异性抗体的稳定性曲线的方法，所述方法包括：
a.执行用以产生多特异性抗体的制造过程，其中在所述制造过程期间在不同时间点获得一定量的多特异性抗体样品；
b.搭建反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；
c.将来自每个时间点的所述多特异性分子样品在极性水性流动相A 中注入所述RP-HPLC柱中，其中所述极性水性流动相包含离子配对剂；
d.将有机非极性流动相B施加到所述RP-HPLC柱以形成梯度洗脱，其中所述有机非极性流动相包含离子配对剂；
e.洗脱所述多特异性抗体样品；以及
f.监测所洗脱的样品中多特异性抗体形成物的量，
其中在每个时间点的所述多特异性抗体形成物的所述量提供所述多特异性抗体的稳定性曲线。
实施方案85是根据实施方案84所述的方法，其中所述极性水性流动相A为包含约1％至约5％异丙醇的溶液。
实施方案86是根据实施方案85所述的方法，其中所述溶液包含约2％异丙醇。
实施方案87是根据实施方案84至86中任一项所述的方法，其中所述极性水性流动相A中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。
实施方案88是根据实施方案87所述的方法，其中所述TFA以约0.1％至约2％存在于所述极性水性流动相A中。
实施方案89是根据实施方案88所述的方法，其中所述TFA以约0.1％存在于所述极性水性流动相A中。
实施方案90是根据实施方案84所述的方法，其中所述有机非极性流动相B为包含约60％至约80％异丙醇和约15％至约25％乙腈的溶液。
实施方案91是根据实施方案90所述的方法，其中所述溶液包含约 70％异丙醇。
实施方案92是根据实施方案90或91所述的方法，其中所述溶液包含约20％乙腈。
实施方案93是根据实施方案90至92中任一项所述的方法，其中所述有机非极性流动相B中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。
实施方案94是根据实施方案93所述的方法，其中所述TFA以约0.1％至约2％存在于所述非极性水性流动相中。
实施方案95是根据实施方案94所述的方法，其中所述TFA以约0.1％存在于所述非极性水性流动相中。
实施方案96是根据实施方案84至95中任一项所述的方法，其中用以产生多特异性抗体的所述制造过程选自由以下项组成的组：杵臼过程、链交换工程化结构域过程、化学连接双特异性抗体(BsAb)过程、免疫球蛋白结构域交叉过程和受控Fab臂交换(cFAE)和双可变结构域过程。
实施方案97是根据实施方案84至96中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体为双特异性抗体。
实施方案98是一种在用以产生多特异性抗体的制造过程期间获得多特异性抗体的降解片段物质曲线的方法，所述方法包括：
a.执行用以产生多特异性抗体的制造过程，其中在所述制造过程期间在不同时间点获得一定量的多特异性抗体样品；
b.搭建反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；
c.将来自每个时间点的所述多特异性分子样品在极性水性流动相A 中注入所述RP-HPLC柱中，其中所述极性水性流动相包含离子配对剂；
d.将有机非极性流动相B施加到所述RP-HPLC柱以形成梯度洗脱，其中所述有机非极性流动相包含离子配对剂；
e.洗脱所述多特异性抗体样品；以及
f.监测所洗脱的样品中降解片段物质的量，
其中在每个时间点的所述降解片段物质的所述量提供所述多特异性抗体制造过程的降解片段物质曲线。
实施方案99是根据实施方案98所述的方法，其中所述极性水性流动相A为包含约1％至约5％异丙醇的溶液。
实施方案100是根据实施方案99所述的方法，其中所述溶液包含约 2％异丙醇。
实施方案101是根据实施方案98至100中任一项所述的方法，其中所述极性水性流动相A中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。
实施方案102是根据实施方案101所述的方法，其中所述TFA以约 0.1％至约2％存在于所述极性水性流动相A中。
实施方案103是根据实施方案102所述的方法，其中所述TFA以约 0.1％存在于所述极性水性流动相A中。
实施方案104是根据实施方案98所述的方法，其中所述有机非极性流动相B为包含约60％至约80％异丙醇和约15％至约25％乙腈的溶液。
实施方案105是根据实施方案104所述的方法，其中所述溶液包含约 70％异丙醇。
实施方案106是根据实施方案104或105所述的方法，其中所述溶液包含约20％乙腈。
实施方案107是根据实施方案104至106中任一项所述的方法，其中所述有机非极性流动相B中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。
实施方案108是根据实施方案107所述的方法，其中所述TFA以约 0.1％至约2％存在于所述非极性水性流动相中。
实施方案109是根据实施方案108所述的方法，其中所述TFA以约 0.1％存在于所述非极性水性流动相中。
实施方案110是根据实施方案98至109中任一项所述的方法，其中用以产生多特异性抗体的所述制造过程选自由以下项组成的组：杵臼过程、链交换工程化结构域过程、化学连接双特异性抗体(BsAb)过程、免疫球蛋白结构域交叉过程和受控Fab臂交换(cFAE)和双可变结构域过程。
实施方案111是根据实施方案98至110中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体为双特异性抗体。
实施例
实施例1：用于在受控FAB臂交换(FAB)之后确定双特异性抗体形成物的反相高效 液相色谱。
反相高效液相色谱(RP-HPLC)基于疏水性固体支持体上的疏水性吸收/解吸过程分离分子。使用极性增加的流动相，蛋白质与固体支持体之间的疏水结合作用导致分析物从柱中的解吸。在此特定方法中，通过亲本 mAb的再氧化建立抗体形成物，采用RP-HPLC对来自部分再氧化片段的完整的、完全氧化的双特异性
Figure BDA0004003733630000301
(抗GPRC5D/抗CD3、抗CD33/抗 CD3、抗TMEFF2/抗CD3、抗7959/抗CD3、抗BCMA/抗CD3)进行定量。在受控FAB臂交换(FAE)之后对测试制品进行采样，并在含有用于改善峰形和分子保留的离子配对剂(三氟乙酸)的高极性水性流动相中注入到柱上。然后，将增加的有机非极性流动相(也含有三氟乙酸)以梯度洗脱的方式施用于柱，以基于分子的疏水性洗脱分子。在280nm处连续监测柱洗脱液，并通过将峰面积计数和亚片段IgG物质进行比较来测量每个 IgG的相对量。
实施例2：双特异性抗体的试剂/溶液的制备
注A：可制备不同总体积的流动相A和流动相B，但必须保持各组分的比例。
注B：三氟乙酸(TFA)沸点低，且挥发性高。建议将TFA储存在 +2℃至8℃，以便通过移液精确分配。
表1：流动相A(98％水/2％异丙醇(IPA)/0.1％TFA)
Figure BDA0004003733630000311
为了制备流动相A，在通风柜中，向1升烧杯中加入约800mL去离子水。在50mL刻度量筒中加入20mL异丙醇。向1升烧杯中加入20mL异丙醇，并用搅拌棒将去离子水和异丙醇混合3分钟。小心移取1mL冷冻 TFA，并加入到装有异丙醇和去离子水的1升烧杯中。将TFA递送到溶液表面以下，并将混合物再搅拌3分钟。(注：由于TFA的高度挥发，将 TFA递送到溶液表面以下对于测定保留时间至关重要)。将来自1升烧杯的溶液转移到1升量筒中，并用去离子水填充至1升标记处。然后将溶液转移到流动相A瓶中。
表2：流动相B(70％ IPA、20％乙腈、9.9％水、0.1％ TFA)
Figure BDA0004003733630000312
为了制备流动相B，在通风柜中，向1升烧杯中加入约99mL去离子水，然后加入200mL乙腈。用搅拌棒将溶液混合3分钟。小心移取1mL冷冻TFA，并加入到装有乙腈和去离子水的1升烧杯中。将TFA递送到溶液表面以下，并将混合物再搅拌3分钟。(注：由于TFA的高度挥发，将 TFA递送到溶液表面以下对于测定保留时间至关重要)。将溶液从1升烧杯转移到1升刻度量筒，并用异丙醇填充至1升标记处。然后将溶液转移到流动相B瓶中。
实施例3：样品和标准制剂
通过还原亲本同源二聚体双特异性并经由cFAE将这些反应物再氧化以产生异源二聚体双特异性抗体来制备双特异性抗体。为了制备用于测试的cFAE后双特异性抗体工艺样品，根据表3，将工艺样品从A280确定的 cFAE UF/DF浓度稀释至2mg/mL的最终测试浓度(在流动相A中稀释)。
表3：抗CPRC5D/抗CD3双特异性抗体样品的示例性稀释(2mg/mL)
Figure BDA0004003733630000321
为了制备2mg/mL的参考材料样品，根据表4，在流动相A中作为样品稀释剂稀释双特异性抗体的储备液浓度。
表4：抗CPRC5D/抗CD3双特异性抗体的参考样品稀释的示例
Figure BDA0004003733630000322
实施例4：HPLC仪器设置
仪器参数提供于表5和表6中。柱模块恒温器控制在80℃，以加热右侧隔室和左侧隔室。连接恒温器毛细管材垂直于左侧(3μL)加热元件。为避免LC***过压和损坏柱，在任何流开始流向***之前，恒温器温度达到 80℃。
表5：双特异性仪器参数(通用)
Figure BDA0004003733630000323
Figure BDA0004003733630000331
表6：仪器参数(Agilent 1200或1260)
参数 Agilent 1200-1260
带宽 4
狭缝 4nm
参考波长，带宽 360nm，100nm
峰宽 >0.1min 
表7：抗CPRC5D/抗CD3双特异性抗体的示例性梯度
时间(min) A％ B％
0.0 75 25
2 70 30
16 66 34
17 66 34
17.1 5 95
20 5 95
21 75 25
28 75 25 
表8：抗CPRC5D/抗CD3双特异性抗体的示例性样品序列
注入类型 注入编号
柱条件(流动相A) 1
抗GPRC5D/抗CD3参考材料 2
FAE过程中样品 1-10
抗GPRC5D/抗CD3参考材料 2
空白(流动相A) 1 
注：序列可扩展到多个样品。
实施例5：整合结果
注：使用手动整合，并与处理方法整合。
参考材料的峰整合。
主要组分的整合：参考材料主要组分由2个峰构成，包括主要组分峰和主要组分肩峰(图3、图5、图7、图9和图11)。这2个峰在最后一个峰前的谷与主峰之间整合在一起，并在肩主峰的谷与第一峰后之间结束 (图3、图5、图7、图9和图11)。主峰的峰前和峰后以及主肩峰由参考材料(对照)中包含的未氧化片段和/或残余亲本同源二聚体双特异性抗体构成。
参考材料(RM)中峰前的整合被整合为1个峰。参考材料(RM)中峰后的整合被整合为1个峰。
cFAE后测试样品的峰整合
cFAE后测试制品主要组分的整合：cFAE后测试双特异性抗体由2个峰构成，包括主要组分峰和主要组分肩峰(图4、图6、图8、图10和图 12)。这2个峰在最后一个峰前的谷与主峰之间整合在一起，并在肩主峰的谷与第一峰后之间结束(图4、图6、图8、图10和图12)。
将主要组分之前的非基线解析的峰前簇整合在一起作为单个峰前，并且分别整合单独的基线解析峰。主要组分肩峰后的所有峰后被整合为1个峰。峰前和峰后代表未氧化的双特异性物质(图4、图6、图8、图10和图 12)。
参考材料的峰识别：将对应于双特异性抗体参考材料的2个峰标记为主要组分和主要组分肩峰。将双特异性抗体之前的多个簇峰整合在一起 (图3至图12)，并标记为峰前。将主要组分的峰后和主要组分肩峰整合在一起(图3至图12)，并标记为峰后。
本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的广义的发明构思的情况下，可对上述实施方案作出修改。因此，应当理解，本发明不局限于所公开的特定实施方案，但本发明旨在涵盖在本发明实质和范围内的修改，如本说明书所定义。

Claims (29)

1.一种检测多特异性分子的形成物的方法，所述方法包括：
a.获得多特异性分子样品；
b.获得反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；
c.将所述多特异性分子样品在极性水性流动相A中与所述RP-HPLC柱接触，其中所述极性水性流动相包含离子配对剂；
d.将有机非极性流动相B与所述RP-HPLC柱接触，其中所述有机非极性相包含离子配对剂；
e.洗脱所述多特异性分子样品；以及
f.监测所洗脱的多特异性分子样品中多特异性分子形成物的量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述极性水性流动相A为包含约1％至约5％异丙醇的溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述溶液包含约2％异丙醇。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述极性水性流动相A中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述TFA以约0.1％至约2％存在于所述极性水性流动相A中。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述TFA以约0.1％存在于所述极性水性流动相A中。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机非极性流动相B为包含约60％至约80％异丙醇和约15％至约25％乙腈的溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述溶液包含约70％异丙醇。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述溶液包含约20％乙腈。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述有机非极性流动相B中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述TFA以约0.1％至约2％存在于所述有机非极性水性流动相B中。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述TFA以约0.1％存在于所述有机非极性水性流动相B中。
13.一种在执行用以产生多特异性抗体的制造过程的同时检测多特异性抗体的形成物的方法，所述方法包括：
a.执行用以产生多特异性抗体的制造过程，其中所述制造过程产生包含一定量的多特异性抗体的多特异性抗体样品；
b.搭建反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；
c.将所述多特异性分子样品在极性水性流动相A中注入所述RP-HPLC柱中，其中所述极性水性流动相包含离子配对剂；
d.将有机非极性流动相B施加到所述RP-HPLC柱以形成梯度洗脱，其中所述有机非极性流动相包含离子配对剂；
e.洗脱所述多特异性抗体样品；以及
f.监测所洗脱的样品中多特异性抗体形成物的量。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述极性水性流动相A为包含约1％至约5％异丙醇的溶液。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述溶液包含约2％异丙醇。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述极性水性流动相A中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述TFA以约0.1％至约2％存在于所述极性水性流动相A中。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述TFA以约0.1％存在于所述极性水性流动相A中。
19.根据权利要求13所述的方法，其中所述有机非极性流动相B为包含约60％至约80％异丙醇和约15％至约25％乙腈的溶液。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述溶液包含约70％异丙醇。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述溶液包含约20％乙腈。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述有机非极性流动相B中的所述离子配对剂选自由三氟乙酸(TFA)、二氟乙酸(DFA)和甲酸(FA)组成的组。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述TFA以约0.1％至约2％存在于所述有机非极性水性流动相B中。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述TFA以约0.1％存在于所述有机非极性水性流动相B中。
25.根据权利要求13至15、17至21、23或24中任一项所述的方法，其中用以产生多特异性抗体的所述制造过程选自由以下项组成的组：杵臼过程、链交换工程化结构域过程、化学连接双特异性抗体(BsAb)过程、免疫球蛋白结构域交叉过程和受控Fab臂交换(cFAE)和双可变结构域过程。
26.根据权利要求13至15、17至21、23或24中任一项所述的方法，其中所述多特异性抗体为双特异性抗体。
27.一种在执行用以产生双特异性抗体的受控FAB臂交换(cFAE)的同时检测双特异性抗体的形成物的方法，所述方法包括：
a.执行用以产生cFAE样品的受控FAB臂交换(cFAE)，其中所述cFAE样品包含一定量的双特异性抗体；
b.搭建反相高效液相色谱(RP-HPLC)柱；
c.将所述cFAE样品在极性水性流动相A中注入所述RP-HPLC柱中，其中所述极性水性流动相包含离子配对剂；
d.将有机非极性流动相B施加到所述RP-HPLC柱以形成梯度洗脱，其中所述有机非极性流动相包含离子配对剂；
e.洗脱所述cFAE样品；以及
f.监测所洗脱的样品中双特异性抗体形成物的量。
28.一种***，包括用于检测多特异性分子的形成物的反相高效液相色谱(RP-HPLC)构件，所述***包括：
a.极性水性流动相A中的多特异性分子样品，其中所述极性水性流动相包含离子配对剂；
b.RP-HPLC柱；
c.有机非极性流动相B，其中所述有机非极性流动相包含离子配对剂；
其中所述RP-HPLC柱被配置为与极性水性流动相A中的所述多特异性分子样品接触，并且
其中所述RP-HPLC被进一步配置为与所述有机非极性流动相B接触以洗脱多特异性分子样品，其中能够在所洗脱的多特异性分子样品中识别多特异性分子形成物的量。
29.一种用于多特异性分子形成物的反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测的装置，包括：
a.极性水性流动相A中的多特异性分子样品，其中所述极性水性流动相包含离子配对剂；
b.RP-HPLC柱；
c.有机非极性流动相B，其中所述有机非极性流动相包含离子配对剂；
其中所述RP-HPLC柱被配置为与极性水性流动相A中的所述多特异性分子样品接触，并且
其中所述RP-HPLC柱被进一步配置为与所述有机非极性流动相B接触以洗脱多特异性分子样品，其中能够在所洗脱的多特异性分子样品中识别多特异性分子形成物的量。
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