CN115916216A - 用于治疗非人类动物的从草丝兰属制备的含有皂苷的提取物 - Google Patents

用于治疗非人类动物的从草丝兰属制备的含有皂苷的提取物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于从草丝兰属的非木本植物中除去水溶性提取物的方法，其中所述提取物含有至少一种皂苷。所述方法包括提供草丝兰属生物质，用溶剂碾磨并洗涤所述生物质以产生粗提物，以及任选地进一步纯化和/或浓缩所述粗提物。从草丝兰属生物质提取的所述皂苷可以包括25(27)‑脱氢岩藻抑素、5(6),25(27)‑二脱氢丝兰苷C和5(6)‑二脱氢丝兰苷C、岩藻抑素和丝兰苷C。本申请的一个实施方案提供了一种增强非人类动物对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括施用含有皂苷的草丝兰属提取物。另一个实施方案提供了含有一种或多种皂苷的草丝兰属源性免疫调节剂的施用，用于预防、治疗和控制非人类动物的一种或多种病症。优选地，可以将包含一种或多种皂苷的草丝兰属提取物口服施用于家禽，以预防和治疗球虫病。

Description

用于治疗非人类动物的从草丝兰属制备的含有皂苷的提取物
背景技术
植物产生种类繁多的有机化合物，其中绝大多数似乎并不直接参与植物的生长和发育。这些物质，传统上被称为次级代谢物或植物天然产物，通常分布在植物界的有限分类群中。次级代谢物的功能在很大程度上仍然未知，但许多化合物与对植物有用的属性有关，例如防止食草动物和防止微生物感染，作为传粉媒介和种子传播动物的引诱剂，以及作为影响植物物种间竞争的化合物(化感物质)。人们对植物天然产物越来越感兴趣，因为这些产物通常在不同种类的行业中具有广泛的应用，这些行业包括制药行业、化妆品行业、食品行业、洗涤剂行业等等。
一组特定的所关注的植物次级代谢物是皂苷。皂苷是糖基化的化合物，可以被分为三萜、类固醇或甾体糖苷生物碱。皂苷由一个或两个偶联至糖苷配基的糖部分组成(分别为单糖链皂苷和双糖链皂苷)。皂苷可以通过酸水解或酶促方法被水解为皂苷元和糖部分。皂苷一般是水溶性高分子量化合物，分子量在600至超过2,000道尔顿的范围内。
它们的疏水性(糖苷配基)和亲水性(糖)部分的不对称分布赋予这些化合物两亲特性，这在很大程度上决定了它们的类洗涤剂性质。降低表面张力的能力使皂苷有可能非常适合用于化妆品和洗涤剂行业。
皂苷还具有与胆固醇形成不溶性复合物的能力，这使得一些皂苷适合在制药行业中用作降胆固醇剂。其他皂苷与可用于疫苗策略的免疫刺激性复合物的形成有关。
目前，皂苷广泛开发的一个主要局限性是可商购获得的皂苷相对昂贵。花费很大一部分是由于含有大量皂苷的植物提取物的数量有限。目前，可商购获得的含有皂苷的植物提取物包括肥皂草(Saponaria officinalis)、皂树皮和茎、欧洲栗(Castanea sativa)种子以及各种丝兰属(Yucca)物种的提取物。
因此，含有皂苷的植物提取物在广泛的不同行业中受到普遍关注。因此，本领域越来越需要皂苷提取物的替代来源，并且这些植物来源应优选地是便宜的、容易获得的，并且优选地皂苷含量应相对较高。
发明内容
本发明涉及用于植物源性免疫调节剂的施用的组合物、方法和试剂盒。所述组合物可以用于使非人类受试者的先天和适应性免疫***敏感化，因此可以用于治疗感染或用作免疫的佐剂。优选地，本发明的植物源性免疫调节剂是含有皂苷的植物提取物。将这些免疫调节剂施用于受试者显著增强了细胞介导的免疫***并且增强了受试者的抗体产生。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗具有感染或处于感染风险的非人类动物的方法，所述方法通过将植物源性免疫调节剂以足以治疗所述感染的量施用于所述动物来进行。在特别优选的实施方案中，所述免疫调节剂包含至少一种从草丝兰属(Hesperaloe)的非木本植物中提取的皂苷。
在其他实施方案中，本发明提供了一种将植物源性免疫调节剂施用于非人类动物的方法，其中所述植物源性免疫调节剂的施用增强了宿主的适应性免疫***，并且保护了所述非人类动物免受感染因子导致的疾病。将含有一种或多种皂苷的植物源性免疫调节剂施用于受试者可以增加正在接受治疗的受试者的CD4 T辅助(Th)细胞尤其是Th1和Th17细胞的吞噬活性，所述免疫调节剂优选地从草丝兰属的非木本植物制备。
在另外其他实施方案中，本发明提供了含有一种或多种皂苷的植物源性免疫调节剂的施用，所述免疫调节剂优选地从草丝兰属的非木本植物制备，用于预防、治疗和控制非人类动物尤其是禽更特别地家禽的一种或多种病症。例如，可以将含有来源于草丝兰属的组合物的皂苷施用于非人类动物，以减少环境氨和气味，从而提供降胆固醇作用，减少炎症，促进体重增加，并且提高饲料转化效率。在一个特别优选的实施方案中，可以将包含一种或多种皂苷的草丝兰属提取物口服施用于家禽，以预防和治疗球虫病。
在另外其他实施方案中，本发明提供了一种增强非人类动物对抗原的免疫反应的方法，所述方法包括将含有皂苷的草丝兰属提取物以足以增强所述非人类动物的所述免疫反应的量施用于非人类动物。在一个特别优选的实施方案中，将含有皂苷的草丝兰属提取物施用于家禽，并且引起CD4 T辅助(Th)细胞尤其是Th1和Th17细胞的吞噬活性增加，并且提供针对免受艾美球虫属(Eimeria)感染的保护。
在其他实施方案中，本发明提供了一种免疫组合物，所述组合物可用于在非人类动物中诱导针对抗原的抗体的产生，所述组合物包含免疫原性有效量的抗原和从草丝兰属的非木本植物中提取的皂苷组合物，其中所述提取物中的皂苷的量以足以增强所述非人类动物对抗原的免疫反应的量提供。在特别优选的实施方案中，本发明的含有皂苷的提取物与艾美球虫属疫苗一起施用于有需要的家禽，以增加免疫反应、降低病变分数并且减少球虫病引起的卵囊脱落。
附图说明
图1A和1B分别展示了三萜皂苷和甾体皂苷；
图2A-C展示了根据本发明从草丝兰属的非木本植物中提取的各种新型皂苷，包括25(27)-脱氢岩藻抑素(图2A)、5(6),25(27)-二脱氢丝兰苷C(图2B)和5(6)-二脱氢丝兰苷C(图2C)；
图3是绘制处理组1至6的每个成员的盲肠扁桃体生发中心的计数的图；
图4是绘制处理组1至6中的每个的肠相关淋巴组织的分数的图；
图5是绘制处理组1至6的每个成员的固有层中的异嗜性粒细胞的数量的图；以及
图6是绘制处理组1至6的每个成员的ELISA效价的图，所述效价使用用于分析鸡血清的商业化ELISA(
Figure BDA0004005467760000021
Newcastle疾病抗体测试试剂盒,IDEXX)来测量。
定义
如本文所用，术语“生物质”通常指草丝兰属诸如假丝兰(H.funifera)、红丝兰(H.parviflora)、夜丝兰(H.nocturna)、江氏丝兰(H.chiangii)、细叶丝兰(H.tenuifolia)、英格曼丝兰(H.engelmannii)和钝叶丝兰(H.malacophylla)的整个植物和植物器官(即，叶、茎、花、根等)。在特别优选的情况下，本发明的含有皂苷的组合物可以从生物质制备，所述生物质基本上由植物的地上部分，更特别地植物的冠部以上的部分，还更优选地植物的叶组成。
如本文所用，术语“甘蔗渣”通常指已经经过提取过程的生物质，所述提取过程例如压榨或碾磨，以使得所得的生物质固体具有比其来源的生物质更少的水溶性固体。在某些实施方案中，甘蔗渣通过使生物质经受高压来制备，这可以通过使生物质通过一对或多对相对的辊、机械压力机、螺杆压力机以及通过直接液压和其他过程以将压力施加于生物质并从中除去胞间和胞内液来实现。
如本文所用，术语“碾磨”通常指施加足够的压力以迫使胞间和胞内液从生物质中分离出来。
如本文所用，术语“糖”可与术语“多糖”、“寡糖”和“糖类”互换使用，它们的定义是碳水化合物化学领域的技术人员熟知的。应当注意，糖可以是单糖、寡糖和/或多糖的形式。优选地，糖是水溶性的，并且不包括纤维素、半纤维素或者结合至其他化合物的单糖、寡糖和/或多糖，诸如结合至三萜以形成皂苷的糖苷(***糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和葡萄糖醛酸)。
如本文所用，术语“皂苷”通常指包含糖苷的糖组分(称为糖基)和非糖组分(称为糖苷配基)。根据糖苷配基的结构，皂苷可以分为三萜皂苷，如图1A所示，或甾体皂苷，如图1B所示。皂苷的糖苷配基部分可以是五环三萜或四环三萜，它们二者均含有30个碳原子。甾体皂苷或三萜皂苷可以是单糖链的、双糖链的或三糖链的。单糖链皂苷具有单个糖，通常连接在C-3处。双糖链皂苷具有两个糖，通常一个糖通过C-3处的醚键连接，另一个糖通过C-28处的酯键连接或通过C-20处的醚键连接(分别为五环三萜皂苷和四环三萜皂苷)或通过C-26处的醚键连接(呋甾烷皂苷)。在某些情况下，草丝兰属生物质可以包含基于生物质的绝干重计至少约5重量％的总皂苷，诸如约5至约15重量％，诸如约8至约12重量％。总皂苷可以如下文测试方法部分所述测定。
如本文所用，术语“水溶性固体”通常指在使提取物离心、过滤并且使所有水蒸发之后剩余的干物质。用于测量本发明的生物质提取物的水溶性固体的程序在下文测试方法部分中详细描述。水溶性固体可以相对于生物质的绝干质量以百分比表示。
如本文所用，术语“水不溶性固体”通常指在测量水溶性固体的过程中通过离心和过滤除去的提取物部分，如下文测试方法部分所述。
如本文所用，“增强免疫反应”是指在接受来源于草丝兰属的含有皂苷的组合物治疗的受试者中，如本文所述，与治疗前的同一受试者相比，CD4 T辅助(Th)细胞，尤其是Th1和Th17细胞的吞噬活性增加。
如本文所用，“药物组合物”是指以符合监管药物的制造和销售的政府机构要求的方式从草丝兰属中提取的并且与一种或多种药物级赋形剂一起配制的至少一种皂苷的组合物，作为用于治疗或预防非人类动物的疾病的治疗方案的一部分。药物组合物可以配制为例如用于以单位剂型(例如，片剂、胶囊剂、小胶囊剂、凝胶胶囊剂或糖浆剂)口服施用；用于局部施用(例如，作为霜剂、凝胶剂、洗剂或软膏剂)；用于静脉内施用(例如，作为不含颗粒栓塞的无菌溶液和在适用于静脉内使用的溶剂体系中)；或者本文所述的任何其他制剂。
如本文所用，术语“受试者”和“非人类动物”是指任何脊椎动物，包括但不限于牛、鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、鹅、猪和绵羊。
具体实施方式
本发明涉及新型药物、膳食补充剂和食品成分组合物，所述组合物包含至少一种选自来源于草丝兰属的非木本植物的提取物、级分、活性化合物和植物化学物质或它们的混合物的组分，所述草丝兰属包括例如假丝兰、红丝兰、夜丝兰、江氏丝兰、细叶丝兰、英格曼丝兰和钝叶丝兰，任选地含有药学上和饮食上可接受的植物化学活性物质、稀释剂、媒介物、载体和活性物质或者它们的混合物。在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了一种增加非人类动物中的CD4 T辅助(Th)细胞，尤其是Th1和Th17细胞的吞噬活性的方法，所述方法通过将含有一种或多种皂苷的草丝兰属源性免疫调节剂施用于非人类动物来进行。
本发明的组合物特别适用于治疗非人类动物，包括例如牛、鸡、猪、羊和马物种。例如，本发明的方法和组合物可以用于治疗牛、鸡、火鸡、鸭、鹌鹑、鹅、猪和绵羊。在一个特别优选的实施方案中，本发明的方法和组合物可以用于治疗家禽，具体而言用于预防和治疗球虫病和/或坏死性肠炎。
本发明的草丝兰属源性免疫调节剂可以包含基于组合物的绝干重计至少5重量％的皂苷，如通过下文测试方法部分中阐述的总皂苷测定法所测量。在一个特定实施方案中，根据本发明使用的含有皂苷的组合物包含至少10重量％的皂苷，更优选地至少约10重量％的皂苷，还更优选地至少约15重量％的皂苷，诸如约5至约30重量％的皂苷，诸如约15至约25重量％。据信，组合物的作用与所存在的皂苷的总量有关。因此，本领域的技术人员将理解，如果需要一定量的皂苷，则可以通过改变所施用的一定浓度组合物的体积、改变一定体积组合物的浓度或它们二者来实现。
还可以从草丝兰属的非木本植物中提取用于本发明的皂苷。草丝兰属源性皂苷一般具有甾体皂苷。来源于草丝兰属的皂苷可以具有至少一种以下糖苷配基或皂苷元：卡姆皂苷元(kammogenin)、门诺皂苷元(manogenin)、静特诺皂苷元(gentrogenin)、海柯皂苷元(hecogenin)、提果皂苷元(tigogenin)、萨尔萨皂苷元(sarsapogenin)、克洛皂苷元(chlorogenin)和吉托皂苷元(gitogenin)或者它们相应的异构体或氧化或还原形式，以及至少一种以下糖苷部分(酸或盐的形式)：葡萄糖、木糖、鼠李糖、***糖或半乳糖。在其他实施方案中，甾体皂苷可以包括苦参苷(agamenoside)、龙舌兰糖苷(agaveside)、龙舌兰皂苷(agavoside)、马圭皂苷(magueyside)、龙舌兰苷(agavasaponi)、康塔拉皂苷(cantalasaponin)、剑麻皂苷(sisalsaponin)、加布里酮苷(gabrittonoside)、东诺苷(dongnoside)或海葵苷(amolonin)，或者其他甾体皂苷。
提取物可以从草丝兰属的非木本植物中回收，所述回收通过使用至少一种溶剂来提取生物质，尤其是叶，更特别地植物的冠部以上的叶来进行，所述溶剂选自由以下各项组成的组：水、甲醇、乙醇、丁醇和异丙醇以及它们的混合物。例如，在一个实施方案中，所述方法包括使生物质与包含水的提取剂溶液接触，并且使水溶性级分与不溶性生物质级分分离。在其他实施方案中，除水之外，提取剂溶液还可以包含表面活性剂、溶剂和任选地含有提取物的汁液。含有提取物的汁液可以来自例如早期提取步骤或早期碾磨步骤。
草丝兰属生物质的简单水提取可以产生包含糖、多糖、无机盐、皂苷和皂苷元的粗制水提取物。粗提物还可以这样产生：使用甲醇或者甲醇和水的混合物作为溶剂来提取生物质，所述生物质可以此前已经用丙酮或***提取过，以除去脂质和色素。在其他情况下，生物质可以用4:1乙醇-水溶剂来提取，随后用非极性溶剂诸如己烷对提取物进行脱脂。在某些情况下，可以对脱脂的提取物进行进一步处理，以分离特定的水溶性组分，诸如皂苷，所述水溶性组分可以通过与丁醇混合并分离丁醇相而从脱脂的提取物中纯化，以产生基本上不含蛋白质和游离糖和多糖的皂苷的混合物。
还可以使用热水提取剂。例如，在一个实施方案中，水溶性固体可以从草丝兰属生物质，尤其是叶中提取，所述提取通过用热水乙醇或异丙醇(75至95重量％的醇)来进行。然后可以过滤和浓缩水性醇提取液，并且可以通过将提取液与非极性溶剂诸如己烷混合来除去脂溶性物质。然后可以通过用极性溶剂诸如丁醇进一步提取脱脂的提取物来制备基本上纯的皂苷组合物。
出于制备本发明的组合物和用于本方法的目的，简单水提取物可以是优选的，虽然其他提取方法也在本发明的范围内。在一个特别优选的实施方案中，可以将草丝兰属生物质切成一定大小、压榨并且用水性溶剂提取，以除去水溶性提取物，诸如无机盐、糖、多糖、有机酸和皂苷。收集水溶性提取物，并且可以通过本领域熟知的技术来浓缩水溶性提取物，所述技术例如蒸发、喷雾干燥、滚筒干燥等等。可以将提取物浓缩直到其具有约20至约100重量％固体，诸如约20至约95重量％固体，诸如约20至约80重量％固体的固含量。
在一个特别优选的实施方案中，水溶性提取物通过以下步骤来浓缩：将提取物溶液进料至雾化设备进行喷雾干燥。合适的雾化设备包括但不限于旋转轮雾化器、压力喷嘴雾化器和双流体喷嘴雾化器。旋转轮、压力喷嘴和双流体喷嘴雾化器是本领域的普通技术人员已知的并且包括可从许多来源诸如GEA Process Engineering商购获得的喷雾干燥器中的那些。
如将在下文更详细地描述，可以使用辊、螺杆和其他形式的压力机来碾磨生物质以分离甘蔗渣和水溶性固体。在某些优选的实施方案中，生物质在一个或多个相对的反向旋转辊的辊隙之间通过，以最大限度地机械除去汁液。然后甘蔗渣可以在随后的碾磨步骤中与汁液接触，如将在下文更全面地描述。在某些情况下，可以将生物质切成一定大小并在碾磨前清洁。可以使用本领域熟知的方法来进行切割和清洁。在一个特别优选的实施方案中，在不使用水或其他溶剂的情况下清洁生物质以除去碎片诸如污垢。虽然在提取之前将生物质切割成一定大小可以是优选的，但是在某些实施方案中，在碾磨之前不研磨、制浆、切碎或浸软生物质可以是有用的。虽然这种物理处理步骤可以是有利的，因为它们使更多的生物质表面暴露于提取剂溶液，但是它们会破坏植物细胞壁，过度缩短纤维长度，并产生过量的细屑。在提取阶段避免以这种方式对甘蔗渣产生负面影响通常是所期望的。通过这种方式，本发明的提取方法通常产生甘蔗渣纤维，所述甘蔗渣纤维可以诸如通过制浆进一步加工，以产生非常适合于纸产品制造的纸浆纤维。
在其他实施方案中，水溶性固体可以通过扩散从生物质中回收。在扩散过程中，使生物质与液体接触以提取液体组分。通常，生物质通过首先切割而不是剪切或压碎来制备，以尽量减少对纤维的损害并避免产生过量的细屑。然后将所制备的生物质反复洗涤，通常使用溶剂来洗涤，以提取生物质中所含的液体。溶剂可以是前述溶剂中的任一者。示例性处理溶剂是水，尤其是热水，诸如加热至约40至约90℃的温度的水。溶剂可以循环和重复使用，以使得用于第一次提取的溶剂被重复用作提取后续制备的生物质的溶剂。
各种类型的扩散器是本领域已知的，并且可以适用于如本文所述的生物质。合适的扩散器包括环形扩散器、塔式扩散器或滚筒扩散器。示例性扩散***例如在美国专利号4,182,632、4,751,060、5,885,539和6,193,805中有所讨论，这些专利的内容据此以与本公开一致的方式并入。许多其他扩散方法和用于所述扩散方法的装置是已知的并且可以适用于本文所述的方法。一个这种扩散器是连续回路、逆流、浅床冠型III渗滤提取器，可从Crown Iron Works,Blaine,MN商购获得。
可以通过上文讨论的任何合适的提取方法来提取切割的或未切割的生物质。在一个特别优选的实施方案中，用于提取的溶剂包括水。本领域的技术人员将认识到，提取溶剂与生物质的比率将根据溶剂、待提取的生物质的量和提取程序而变化。在某些优选的实施方案中，提取溶剂是水，并且提取溶剂与生物质的比率基于提取溶剂的升数与绝干生物质的千克数计为约1:5至约1:100，诸如约1:5至约1:50，更优选地约1:5至约1:20。
提取溶剂的pH可以在约pH 5.0和8.0之间，例如，在约pH 6.0和约pH 8.0之间，在约pH 6.5和约pH 7.5之间。在一个特定实施方案中，提取溶剂是具有在约pH 6.5和约pH7.5之间的pH的水。在其中提取包括用原汁液吸涨的那些实施方案中，吸涨流体可以具有约4.0至约5.0的pH。
提取可以在约25和约90℃之间的温度下进行，例如，在约30和约80℃之间、在约35和约75℃之间、在约40和约70℃之间、在约45和约65℃之间或在约50至约60℃之间。
在其中提取过程是分批提取过程的实施方案中，提取的持续时间范围可以是约0.25至约24小时，例如，约0.5至约2小时，约1至约8小时，或约1至约6小时。
在其中提取过程是连续过程的实施方案中，提取的持续时间范围可以是约0.25至约5小时，例如，约0.5至约3小时。
在提取后，可以通过过滤将水不溶性生物质材料与水溶性固体分离，以提供含有无机盐、糖、多糖、有机酸和皂苷的滤液(本文称为“第一滤液”)。分离可以通过任何合适的手段实现，包括但不限于重力过滤、板框式压滤机、错流过滤器、筛网过滤器、那斯克(Nutsche)过滤器、带式过滤器、陶瓷过滤器、膜式过滤器、微型过滤器、纳米过滤器、超滤器或离心。任选地各种过滤助剂诸如硅藻土、膨润土、沸石等等也可以用于该过程。
在分离后，可以调节第一滤液的pH以除去另外的杂质。在一个实施方案中，可以通过用碱处理来将第一滤液的pH调节至约8.5和约10.0之间并缓慢搅拌，所述碱例如氧化钙或氢氧化钙(滤液体积的约1.0％)。
在一个特别优选的实施方案中，从生物质，尤其是草丝兰属叶中除去水溶性固体，然后通过一系列碾磨机来制浆，诸如两个、三个、四个、五个、六个或七个串联布置的碾磨机机，任选地进行吸涨和/或脱髓。通常，根据本发明进行的生物质处理从生物质中除去至少约25％，更优选地至少约50％，还更优选地至少约75％，诸如约25％至约98％，诸如约50％至约90％，诸如约75％至约90％的水溶性固体。
从生物质中回收的水溶性固体的量可以根据提取效率而变化，然而，在某些情况下，每千克绝干生物质可以提取约100至约400克水溶性固体，诸如每千克可以提取约120至约350克，诸如每千克可以提取约150克至约300克。在所提取的水溶性固体中，基于水溶性固体的绝干重计，总皂苷可以占约5至约40重量％，诸如约10至约30重量％。在某些情况下，可以从生物质中提取的总皂苷的量的范围可以是每千克绝干生物质约10至约400克，诸如约20至约300克，诸如约25至约200克，诸如约10至约100克。在某些情况下，在提取过程中从生物质中除去的材料的量(基于绝干克/千克绝干生物质计)的范围可以如下表1所示。
表1
Figure BDA0004005467760000071
除皂苷之外，水溶性固体可以包含糖、蛋白质、脂质和无机盐。例如，在某些情况下，基于水溶性固体的绝干重计，水溶性固体可以包含至少约1重量％的糖，诸如约1至约15重量％，诸如约2至约10重量％。糖可以包括单糖和寡糖。在其他情况下，基于水溶性固体的绝干重计，水溶性固体可以包含至少约15重量％，诸如约15至约30重量％的无机盐。
通常碾磨通过添加水性溶剂诸如水来进行，pH值范围为约5至约9，诸如约6至约7至约8。水溶性固体通常作为粗提物从碾磨过程中回收，并且可以进行进一步加工以回收特定化合物，诸如糖、多糖、有机酸和皂苷。
悬浮固体，在本文中也称为水不溶性级分，可以任选地通过熟知的方法从粗提物中除去，所述方法包括例如澄清、过滤、离心或它们的组合。提取物中的水不溶性固体的量(基于绝干克数/千克绝干生物质计)的范围可以是约1.0至约30克，并且可以包含疏水性物质，诸如蜡等等。
在除去悬浮固体后，澄清汁液可以直接使用、浓缩或进行进一步加工，以分离一种或多种水溶性固体，诸如糖、多糖、有机酸、皂苷和皂苷元。在其他情况下，可以进一步纯化澄清汁液，以除去糖、多糖和有机酸，从而产生包含皂苷的组合物。
可以对由前述提取过程产生的汁液进行进一步提取，以获得粗皂苷提取物形式的皂苷或者它们的包含浓度为约30至约90重量％的皂苷的基本上纯化的形式。提取方法可以包括使从草丝兰属的非木本植物中提取的汁液与水不可混溶性极性溶剂混合。合适的水不可混溶性极性溶剂包括例如具有4至6个碳原子的醇，诸如丁醇、戊醇、己醇和环己醇。用水不可混溶性极性溶剂对汁液进行提取通常会除去残留在水相中的杂质，诸如蛋白质、碳水化合物和有机酸，而皂苷则会转移至溶剂相中。
可以对含有皂苷的溶剂相进行进一步处理，以使皂苷与醇相分离。这可以通过多种方式实现，包括例如通过冷却、通过使溶剂提取物脱水，或通过添加有机溶剂，所述有机溶剂可与醇溶剂混溶但是其中皂苷是不溶性的。合适的沉淀溶剂包括例如***、石油醚、丙酮和氯仿。
在一个特别优选的实施方案中，皂苷通过闪蒸从醇中分离。闪蒸是制备化学中已知的技术，用于从液体混合物中快速除去挥发性组分。通过在减压下在大表面积上产生溶液的薄膜而将挥发性液体快速转化为蒸气相，从而从溶液中除去挥发性液体，通常伴随着溶液温度升高至高于环境温度但是低于大气压下溶液的沸点。选择薄膜的实际厚度及其施用区域，以提供最佳蒸发和易用性，但是蒸发可以是基本上瞬时的(因此称为“闪蒸”)。闪蒸避免了可以降解目标产物的长时间高温使用，并且能够除去几乎所有醇组分，这使得剩余的溶液适用于下一步采用的喷雾干燥的优选规范。醇可从该步骤回收并在提取过程中重复使用。
通过超滤膜可以进一步增加醇提取物的皂苷含量，而不会显著改变皂苷组成或使皂苷组成丧失。这种皂苷含量在85％-90％范围内的浓缩皂苷级分可以在液态下进一步纯化或简化为干燥状态。可以通过反相固相提取和制备型反相HPLC的组合来回收单独的皂苷。或者，可以通过反相固相提取和制备型反相HPLC的组合来直接分离含有皂苷的醇提取物。
在另外其他实施方案中，皂苷可以从根据本发明制备的汁液中纯化，包括使汁液与盐和溶剂混合以形成第一溶液的步骤。溶剂可以包括一种或多种选自以下的溶剂：乙酸、丙酮、乙腈、苯、1-丁醇、2-丁醇、2-丁酮、叔丁醇、四氯化碳、氯苯、氯仿、环己烷、1,2-二氯乙烷、二乙二醇、***、二甘醇二甲醚、1,2-二甲氧基乙烷、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、1,4-二噁烷、乙醇、乙酸乙酯、乙二醇、甘油、庚烷、六甲基磷酰胺、六甲基磷三酰胺、己烷、甲醇、甲基叔丁基醚、二氯甲烷、N-甲基-2-吡咯烷酮、戊烷、全氯乙烯、石油醚、1-丙醇、2-丙醇、吡啶、四氢呋喃、甲苯、三乙胺、三氟甲苯、水、二甲苯或上述物质的任何组合。在一些实施方案中，溶剂是水。盐可以选自碱金属盐、碱土金属盐、过渡金属盐、铵盐或前述的组合。在某些优选的实施方案中，添加至植物提取物以形成溶液的盐是碱土金属盐。在特别优选的实施方案中，盐是氯化钙(CaCl2)、氯化镁(MgCl2)或它们的混合物。
第一溶液的pH通常被调节至约6.0至约9.0，诸如约6.0至约8.0，诸如约6.0至约7.0的pH。然后可以将至少一种磷酸盐添加至第一溶液，以形成离子-多糖复合沉淀物。有用的磷酸盐包括例如磷酸氢二钠(Na2HPO4)、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、磷酸钠(Na3PO4)或二磷酸氢钠(Na2H2PO7)。
沉淀的离子-多糖复合物可以通过过滤除去以产生第二溶液，所述第二溶液可以进一步澄清以产生纯化的皂苷的提取物。任选地，可以通过现有技术中已知的任何过滤技术来浓缩提取物。优选地，纯化的皂苷的提取物的浓缩通过纳滤、超滤和渗滤，或这些技术的任何组合来进行。在一些实施方案中，皂苷提取物基本上不含蛋白质。在一些实施方案中，皂苷提取物基本上不含多糖。在一些实施方案中，皂苷提取物基本上不含酚类化合物。
可以根据本发明从草丝兰属生物质提取的皂苷的总量的范围可以是每千克绝干生物质约10至约100克，诸如约20至约80克，诸如约25至约75克。皂苷可以作为原汁液的一部分、作为干燥的水溶性固体组合物的一部分、作为部分纯化的组合物或作为包含皂苷的混合物的基本上纯的组合物提供。
在某些实施方案中，从草丝兰属生物质中提取的皂苷可以包含25(27)-脱氢岩藻抑素(图2A)、5(6),25(27)-二脱氢丝兰苷(图2B)、5(6)-二脱氢丝兰苷(图2C)、岩藻抑素和丝兰苷。
用于本发明的组合物可以通过使来自草丝兰属生物质的水性提取物与一种或多种多羟基醇共混来制备，所述多羟基醇包括甘油、丙二醇、聚亚烷基二醇诸如聚乙二醇和聚丙二醇以及聚甘油。优选的多羟基醇具有小于约八个碳原子。甘油和丙二醇是特别优选的多羟基醇。
所述组合物还可以包含糖，糖可以存在于水性提取物中或可以在配制过程中提取后添加。可用于本发明的组合物的糖包括单糖诸如葡萄糖、二糖诸如蔗糖和多糖诸如淀粉。
在另外其他实施方案中，根据本发明的实施方案的组合物可以包含本领域已知的对非人类动物的维持和健康有益的各种其他添加剂。例如，组合物还可以包含诸如维生素E、维生素A丙酸酯、维生素A棕榈酸酯、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、D-活性动物甾醇(维生素D3的来源)、酵母组分、干燥的蛋固体、干酪蛋白和干乳清的组分。
本发明的含有皂苷的组合物可以是液体或干燥形式。例如，含有皂苷的草丝兰属提取物可以被干燥成粉末形式。通过这种形式，可以将含有皂苷的组合物作为丸剂或大丸剂或者与其他组分混合成诸如饲料配给物施用于动物。例如，含有皂苷的组合物的干粉制剂可以通过微成分机器添加至饲料配给物中，或者添加至饲料混合卡车中，并充分混合以确保均匀分布在饲料中。含有皂苷草丝兰属提取物也可以是液体形式，含有一定量的载体液体，诸如水。通过这种形式，可以将含有皂苷的组合物作为液体灌施剂施用于动物。
本发明的含有皂苷的组合物可以作为喂养方案的一部分以单剂量、多剂量施用于有需要的非人类动物。例如，非人类动物可以接受初始剂量，然后接受较少量的后续维持剂量。非人类动物可以在一天内接受多剂量的含有皂苷的组合物或者可以在多天内接受多剂量。
在某些实施方案中，本发明的组合物可以用作免疫调节剂或佐剂。在某些实施方案中，可以将来源于草丝兰属的含有皂苷的组合物施用于有需要的非人类动物，以引发适应性免疫反应。在一个特别优选的实施方案中，本发明的含有皂苷的提取物的施用引起受试者中的CD4 T辅助(Th)细胞，尤其是Th1和Th17细胞的吞噬活性增加。通过这种方式，本发明的提取物可以作为药物组合物施用，而无需添加抗原以增强受试者的免疫反应。
在其他实施方案中，可以将本发明的草丝兰属提取物与抗原一起施用于非人类动物，以增强受试者的免疫反应。合适的抗原包括微生物病原体、细菌、病毒、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、肽、糖肽、脂肽、类毒素、碳水化合物和肿瘤特异性抗原。可以采用两种或更多种抗原的混合物。在某些优选的实施方案中，本发明的组合物可以与旨在预防非人类动物尤其是家禽的球虫病的疫苗一起施用，所述球虫病的特征在于选自由以下各项组成的组的球虫亚纲：艾美球虫属、等孢子球虫属(Isospora)、弓形体属(Toxoplasma)、贝诺孢子虫属(Besnoitia)和新孢子虫属(Neospora)。因此，本发明提供了一种佐剂体系，所述体系特别有利于制备和使用疫苗和其他免疫刺激性组合物来治疗或预防疾病，例如在非人类动物中诱导针对抗原的主动免疫。
在一个特别优选的实施方案中，可以将含有皂苷的提取物与艾美球虫属疫苗一起施用于有需要的家禽，以增加免疫反应、降低病变分数并且减少球虫病引起的卵囊脱落。本发明的免疫原性组合物可以以适用于增加免疫反应的剂量体积，诸如小于约50μg，诸如小于约40μg，诸如小于约30μg，诸如约1至约50μg，诸如约5至约30μg的剂量水平口服或皮下递送。
当以宽范围的剂量和宽范围的与所施用的抗原的比率施用时，本发明的组合物表现出佐剂作用。在一个实施方案中，皂苷以基于皂苷的重量计3.0或更小，优选地1.0或更小的佐剂与抗原的比率(w/w)施用。
根据本发明从草丝兰属的非木本植物中提取的皂苷可以以粗制或纯化形式用作佐剂，并且可以与其他非皂苷佐剂掺合，以实现对抗原的免疫反应的增强。可用于本发明的此类非皂苷佐剂是油佐剂(例如，弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂)、脂质体、矿物盐(例如，AlK(SO4)2、AlNa(SO4)2、AlNH4(SO4)、二氧化硅、明矾、Al(OH)3、Ca3(PO4)2、高岭土和碳)、多核苷酸(例如，多IC酸和多AU酸)和某些天然物质(例如，来自结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的蜡D，以及短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)和布鲁氏菌属(Brucella)的成员中存在的物质)。
测试方法
水溶性固体
可以使用加速溶剂提取***(ASE)诸如DionexTMASETM350(Thermo FisherScientific,Waltham,MA)来测定总生物质水溶性固体。将大约10克收获的生物质在烘箱中干燥至恒重，通常在125℃下干燥4小时。在干燥后，准确称量1.5-2.0克绝干生物质，记录重量(Wb)，精确到0.001克。使用水作为溶剂，使用下表中列出的条件提取生物质。生物质与溶剂的比率通常为21:1，并进行五个连续的水提取循环。在每个提取循环结束时，收集液相，在大约40℃的真空下干燥，记录干燥材料的重量(Wi)，精确到0.001克。水溶性固体的总重量(We)通过对从每个提取循环中回收的固体的重量求和来计算(Wi)。然后使用以下等式来确定总水溶性固体占绝干生物质的百分比：水溶性固体(重量％)＝We/Wb×100。
压力(psi) 1500
温度(℃) 40
静态时间(分钟) 10
循环(次数) 5
生物质提取物中的总水溶性固体可以通过以下步骤来测定：取出适当的等分试样，通常为约10-50ml，转移到干净、干燥的离心管中。将管以7000rpm离心20分钟。计算提取物的重量(W1)。然后将上清液的等分试样转移至干净、预先称量的烧杯(D0)中，并称量。然后对烧杯和样品进行称量，精确到0.001克，并记录重量(D2)。然后将装有样品的烧杯放置于140℃的热风烘箱中过夜干燥。将烧杯从烘箱中取出并干燥冷却至室温，然后进行称量，精确到0.001克(D1)。基于提取物的重量计，可溶性固体的重量百分比使用以下公式确定：
Figure BDA0004005467760000111
D1＝空烧杯+干燥的可溶性固体的质量，D0＝空烧杯的质量，D2＝生物质提取物和空烧杯的质量。
总皂苷
总皂苷的测量通常如Makkar,Harinder P.S.,Sidhuraju,P.,Becker,Klaus(2007)Plant Secondary Metabolites,第17章,第93-100页所述。标准皂苷溶液通过以下步骤来制备：称量10mg薯蓣皂苷元(MilliporeSigma>93％)，溶于16mL甲醇中，并添加4mL蒸馏水。将溶液充分混合，得到0.5mg/mL薯蓣皂苷元溶于80％甲醇溶剂的溶液。通过将不同量的标准(0、10、20、40、60、80和100μL)转移至13毫米玻璃管中，从而使用所述标准来生成校准曲线。添加80％甲醇水溶液至总体积为100μL。
在测试前，通过用水稀释来将生物质提取物样品调整至约0.5重量％总固体，以确保吸光度结果落在皂苷标准校准曲线范围内。将稀释的提取物样品(20μL)移入13毫米玻璃试管中，并用80μL甲醇将体积调至100μL。每个样品一式三份进行测试。
向每个样品中添加100μL香草醛试剂(通过将800mg香草醛溶解于10mL99.5％乙醇(分析级)中来制备)，然后添加1.0mL 72％(v/v)硫酸(72％(v/v)硫酸通过将72mL硫酸(分析级，95％，w/w)添加至28mL蒸馏水中来制备)。将溶液充分混合并在60℃下加热10分钟。然后将样品在冰浴中冷却，并将1mL溶液转移至相应的比色杯中，并读取544nm下的吸光度。样品中的皂苷的总质量可以根据如下标准吸光度曲线来计算：
皂苷(μg)＝[斜率]×所测吸光度-[截距]
总皂苷
总皂苷的测量通常如Makkar,Harinder P.S.,Sidhuraju,P.,Becker,Klaus(2007)Plant Secondary Metabolites,第17章,第93-100页所述。标准皂苷溶液通过以下步骤来制备：称量10mg薯蓣皂苷元(MilliporeSigma>93％)，溶于16mL甲醇中，并添加4mL蒸馏水。将溶液充分混合，得到0.5mg/mL薯蓣皂苷元溶于80％甲醇溶剂的溶液。通过将不同量的标准(0、10、20、40、60、80和100μL)转移至13毫米玻璃管中，从而使用所述标准来生成校准曲线。添加80％甲醇水溶液至总体积为100μL。
在测试前，通过用水稀释来将生物质提取物样品调整至约0.5重量％总固体，以确保吸光度结果落在皂苷标准校准曲线范围内。将稀释的提取物样品(20μL)移入13毫米玻璃试管中，并用80μL甲醇将体积调至100μL。每个样品一式三份进行测试。
向每个样品中添加100μL香草醛试剂(通过将800mg香草醛溶解于10mL99.5％乙醇(分析级)中来制备)，然后添加1.0mL 72％(v/v)硫酸(72％(v/v)硫酸通过将72mL硫酸(分析级，95％，w/w)添加至28mL蒸馏水中来制备)。将溶液充分混合并在60℃下加热10分钟。然后将样品在冰浴中冷却，并将1mL溶液转移至相应的比色杯中，并读取544nm下的吸光度。样品中的皂苷的总质量可以根据如下标准吸光度曲线来计算：
皂苷(μg)＝[斜率]×所测吸光度-[截距]
实施例
实施例1：
在28天笼养研究中，将总共150只一日龄肉鸡随机分配到六个实验组。在第14日龄时，将活球虫人工引入禽。表3中列出的处理代码包括两个对照代码：使用基础饮食(对照+)和不使用基础饮食(对照)球虫攻击。使用两种不同剂量的富含本发明的组合物的基础饮食或以商品名FOAMATIONTM(可从Ingredion,Westchester,IL商购获得)销售的丝兰提取物，对其余的所有处理代码进行球虫攻击。FOAMATIONTM占组合物水溶性固体的50重量％，其中皂苷占10重量％。每周测量每个围栏的禽体重增加(BW)和饲料消耗。饲料转化率(FCR)是消耗的饲料千克数与体重增加千克数之间的比率。较低的FCR值表示更好的饲料。
表3
Figure BDA0004005467760000131
本发明的提取物通过以下步骤来制备：收获成熟的假丝兰的冠部以上的叶，将叶切成约0.50至约8.0厘米的碎片，并使用串联压机来压榨切碎的生物质。将生物质压榨三次并收集原汁液并使其通过25毫米过滤器并加热以将提取物浓缩至29％固体。基于水溶性固体的绝干重计，水溶性固体包含21重量％的总皂苷。
在28天试验结束时，与无攻击的对照相比，受攻击对照组(对照+)组的饲料消耗减少约140克/只禽，体重增加减少约160克/只禽。然而，如下表4所示，在喂食包含本发明的组合物的饲料的鸡中未观察到这些减少。
表4
Figure BDA0004005467760000132
实施例2：
在21天研究中，将总共512只一日龄肉鸡随机分配到8个实验组，每组8个笼子，每个笼子8只禽。在第14日龄时，将活球虫人工引入幼禽。测量禽的体重增加(WG)、饲料转化率(FCR)、病变分数和卵囊计数。表5中列出的处理代码包括无球虫攻击(对照)和有攻击(对照+)的基础饮食。使用Coban(可从Elanco Animal Health,Greenfield,IN商购获得)、Micro-Aid(可从DPI Global,Porterville,CA商购获得)的基础饮食以及两种不同剂量的两种不同的本发明的样品，对其余的处理代码进行球虫攻击。基础饮食满足国家研究委员会的家禽最低要求。
表5
Figure BDA0004005467760000133
Figure BDA0004005467760000141
本发明的样品1通过以下步骤来制备：收获成熟的假丝兰的冠部以上的叶，将叶切成约0.50至约8.0厘米的碎片，并使用串联压机来压榨切碎的生物质。将生物质压榨三次并收集原汁液并使其通过25毫米过滤器并加热以将提取物浓缩至29％固体。本发明的样品2通过以下步骤来制备：收获成熟的假丝兰的冠部以上的叶，将叶切成约0.50至约8.0厘米的碎片，并使用串联压机来压榨切碎的生物质一次，然后加热收集的汁液以获得具有14％固体的提取物。所有处理材料均通过在搅拌器中以指定的装载水平使每种添加剂与基础饲料混合来制备。
喂食本发明的组合物的鸡表现出体重增加、饲料转化率提高、病变分数降低和卵囊减少，如下表6所汇总。在很多情况下，改善与在喂食Coban或Micro-Aid Green的鸡中观察到的改善相当或更好。即使在相对低剂量的皂苷下，本发明的组合物也是有效的。
表6
Figure BDA0004005467760000142
本发明的组合物特别适用于减少或预防球虫。病变分数是通过鸡肠道损伤评估球虫发育的手段，分数在0-4之间(0表示正常肠道外观，而4表示肠道严重损伤)。喂食本发明的组合物的鸡在3周内，与未受攻击的对照相比，病变分数得以改善(23％-27％)。通过减少感染病例和保护鸡的消化***，鸡能够更好地消化和吸收营养物，并且以更快的速率生长。
实施例3：
从Aviagen Hatchery,Blairsville,GA获得总共210只刚孵化的Ross x Ross雄性肉鸡。这些禽在出生时接受常规疫苗接种(HVTSB1)。在28天笼养研究中，将这些禽随机分配到六个实验组。表7中列出的处理组包括未接种疫苗或接受草丝兰属提取物的第一组，接受单独的草丝兰属提取物的组，接受新城疫病毒(Lasota毒株)和草丝兰属提取物的组，以及接受灭活的新城疫病毒(Lasota毒株)的组。
表7
Figure BDA0004005467760000151
用新城疫病毒处理的禽在第0天接受油乳剂新城疫病毒(Lasota毒株)疫苗，该疫苗在颈后部以0.10ml S.Q.施用。草丝兰属提取物的制备基本上如实施例2所述，通过使用串联压机来压榨切碎的生物质一次，然后加热收集的汁液，以获得具有14％固体的提取物。
每组35只肉鸡被饲养在13.4'x15.7'的室内。隔离室环境由独立的HEPA过滤***和热泵单元控制，其中一(1)个加热灯在孵育期间提供补充热量。禽在环境湿度下饲养，并根据首席饲养员的建议提供光照程序。在放置时，每个围栏包含大约4英寸的新鲜松木刨花。在研究过程中不更换废弃物。每个分区包含管式喂食器和钟形饮水器，达到35只禽/喂食器和饮水器的比率。
所有饮食均含有113.5克/吨安普罗铵以预防球虫病，研究期间不使用其他伴随药物疗法。对开食配给物进行称量并在DOT 0至DOT 28喂食。饲料制剂由未加药的商业型肉鸡开食和生长饮食组成，配混有代表当地制剂的常用美国饲料，计算分析达到或超过NRC标准。任何饲料中均未添加抗生素。
在DOT 28，对每个处理的十只禽实施安乐死，收集器官样本(十二指肠中的大派伊尔淋巴集结、盲肠扁桃体、二分之一的法氏囊、0.5cm空肠段)并放入单独的广口瓶中。组织样品固定在10％缓冲***中并包埋在石蜡中。石蜡包埋组织的切片(大约5微米)用Mayer苏木精和伊红(H&E)染色。
如Muniz等人,Brazilian J Poult Sci 8,217-220,2006所述测量淋巴滤泡面积和淋巴滤泡皮质。每个法氏囊测量五个具有完整解剖学特征的卵泡。使用ImageJ软件1.37中的徒手工具和线到区域功能进行测量，该软件是基于Java的图像处理软件，由美国国立卫生研究院开发，可在因特网上免费获得。使用AmScope MR400校准载玻片来将像素校准到微米。
盲肠扁桃体和派伊尔淋巴集结面积的测量与淋巴滤泡面积的测量相似，并对生发中心手动计数。处理组1至6中的每个的盲肠扁桃体生发中心计数如图3所示。
肠相关淋巴组织(GALT)扩张(增生)以0至5的尺度评分：0(不明显)、1(极少存在)、2(轻度)、3(中度)、4(显著)和5(重度)。GALT扩张表现为局灶性、局部广泛性和弥漫性，在正常范围内，但增生程度不同。处理组1至6中的每个的GALT分数如图4所示。
肠道异嗜性粒细胞在固有层中表现为异嗜性粒细胞簇。计算并记录每个空肠段的簇总数。处理组1至6中的每个的固有层中的簇总数如图5所示。
在DOT 28，对每个处理的十只禽采血，收集血清样品并使用商业化酶联免疫吸附测定法(ELISA)新城疫抗体测试(
Figure BDA0004005467760000161
可从IDEXX,Maine,USA商购获得)进行评估。每个组的ELISA效价结果如图6所示(图中从左至右显示处理组1至6)。

Claims (27)

1.一种增强非人类动物的免疫反应的方法，所述方法包括以下步骤：将免疫有效量的来自草丝兰属的非木本植物的提取物施用于非人类动物，所述提取物包含至少一种皂苷。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述提取物还包含糖、蛋白质和脂质。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述提取物基本上不含糖、蛋白质和脂质。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种皂苷包括卡姆皂苷元、门诺皂苷元、静特诺皂苷元、海柯皂苷元、提果皂苷元、萨尔萨皂苷元、克洛皂苷元和吉托皂苷元，以及至少一种选自以下的糖苷部分：葡萄糖、木糖、鼠李糖、***糖和半乳糖。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种皂苷是25(27)-脱氢岩藻抑素、5(6),25(27)-二脱氢丝兰苷、5(6)-二脱氢丝兰苷、岩藻抑素或丝兰苷。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述提取物包含25(27)-脱氢岩藻抑素、5(6),25(27)-二脱氢丝兰苷、5(6)-二脱氢丝兰苷、岩藻抑素和丝兰苷的混合物。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述草丝兰属的非木本植物是假丝兰、夜丝兰、红丝兰、江氏丝兰。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述提取物中的所述皂苷的量以所述提取物的重量计在约10％至约25％的范围内。
9.一种治疗家禽的球虫病和/或坏死性肠炎的方法，所述方法包括将包含至少一种从所述草丝兰属的非木本植物中提取的皂苷的组合物施用于家禽。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述提取物还包含糖、蛋白质和脂质。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述提取物基本上不含糖、蛋白质和脂质。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述至少一种皂苷包括卡姆皂苷元、门诺皂苷元、静特诺皂苷元、海柯皂苷元、提果皂苷元、萨尔萨皂苷元、克洛皂苷元和吉托皂苷元，以及至少一种选自以下的糖苷部分：葡萄糖、木糖、鼠李糖、***糖和半乳糖。
13.如权利要求9所述的方法，其中所述至少一种皂苷是25(27)-脱氢岩藻抑素、5(6),25(27)-二脱氢丝兰苷、5(6)-二脱氢丝兰苷、岩藻抑素或丝兰苷。
14.如权利要求9所述的方法，其中所述提取物包含25(27)-脱氢岩藻抑素、5(6),25(27)-二脱氢丝兰苷、5(6)-二脱氢丝兰苷、岩藻抑素和丝兰苷的混合物。
15.如权利要求9所述的方法，其中所述草丝兰属的非木本植物是假丝兰、夜丝兰、红丝兰或江氏丝兰。
16.如权利要求9所述的方法，其中所述提取物中的所述皂苷的量以所述提取物的重量计在约10％至约25％的范围内。
17.如权利要求9所述的方法，还包括施用免疫原性有效量的抗原。
18.一种用于增强非人类动物的适应性免疫反应的方法，所述方法包括将一定量的草丝兰属源性免疫调节剂施用于所述非人类动物，所述免疫调节剂能够有效增加所述非人类动物中的至少一种适应性免疫防御机制的活性，其中所述草丝兰属源性免疫调节剂包含至少一种皂苷。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述草丝兰属源性免疫调节剂包含两种或更多种皂苷的混合物。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述至少一种皂苷包括卡姆皂苷元、门诺皂苷元、静特诺皂苷元、海柯皂苷元、提果皂苷元、萨尔萨皂苷元、克洛皂苷元和吉托皂苷元，以及至少一种选自以下的糖苷部分：葡萄糖、木糖、鼠李糖、***糖和半乳糖。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述草丝兰属源性免疫调节剂包含两种或更多种皂苷，所述皂苷选自25(27)-脱氢岩藻抑素、5(6),25(27)-二脱氢丝兰苷、5(6)-二脱氢丝兰苷、岩藻抑素和丝兰苷。
22.如权利要求18所述的方法，其中所述草丝兰属源性免疫调节剂包含25(27)-脱氢岩藻抑素、5(6),25(27)-二脱氢丝兰苷、5(6)-二脱氢丝兰苷、岩藻抑素和丝兰苷的混合物。
23.一种针对鸡的球虫病、感染性支气管炎、感染性法氏囊病、喉气管炎、马莱克氏病或新城疫的免疫原性或疫苗组合物，所述组合物包含：至少一种寄生虫、微生物、抗原、免疫原、表位或疫苗；以及包含1至约50μg从草丝兰属中提取的总皂苷的佐剂。
24.如权利要求23所述的组合物，其中所述组合物还包含药学上有效的载体。
25.如权利要求23所述的组合物，其中至少一种寄生虫、微生物、抗原、免疫原、表位或疫苗是球虫病疫苗。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述球虫病疫苗包含堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫或柔嫩艾美球虫的一种或多种菌株。
27.如权利要求23所述的组合物，其中所述至少一种寄生虫、微生物、抗原、免疫原、表位或疫苗选自由以下各项组成的组：感染性支气管炎疫苗、感染性法氏囊病疫苗、喉气管炎疫苗、马莱克氏病疫苗和新城疫疫苗。
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