CN115902213A - 针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯elisa检测方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测方法及试剂盒，试剂盒包括：由Xaa‑Phe‑Ser‑Ile‑Ser‑Ser‑Xaa‑Arg‑Ala所示的氨基酸序列组成的9肽作为抗原；由Lys‑Asn‑Tyr‑Ser‑Ser‑Ser‑Ile‑Phe‑Phe‑Ile‑His‑Ala‑Cys所示的氨基酸序列组成的13肽作为一抗。本发明的创新在于避开了基于PCR仪的检测，不再扩增核酸序列，而是将大肠杆菌菌体作为一种检测样本，使用本发明的试剂，短时间内(根据温度的不同从4‑6个小时)可以检测出多粘菌素耐药的大肠杆菌及初步定量，为多粘菌素耐药菌治理领域提供技术支撑。

Description

针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及微生物耐药性检测领域，具体涉及一种针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测方法及试剂盒。

背景技术

近年来，由于抗生素在畜牧业、工业等领域大量无指征使用以及新的抗菌药物不断进入临床治疗感染性疾病，导致细菌的耐药性正以惊人的速度在增长，甚至已出现超级细菌和多重耐药菌。自20世纪20年代开始，大量天然抗生素相继被发现，开启了抗生素时代，但随着对抗生素使用的过度依赖，细菌抗药问题日益凸显。耐药性细菌使得抗生素药物效减弱、甚至失效。多粘菌素(Polymyxins)是多粘杆菌培养液中提得的一组多肽类抗生素，有5种成分(A,B,C,D,E)。临床常用的是多粘菌素(PolymyxinB)和多粘菌素E(colislin,抗敌素)。多粘菌素被认为是人类抗击细菌的最后防线；近几年来，质粒介导的多粘菌素耐药基因mcr的快速进化及其在全球范围内的广泛传播，给公共卫生和人类健康造成了严重威胁，由于MCR-3的广泛存在，特别是在健康人群和动物性食品中的存在，使得现用的基于MCR基因的选筛菌、菌种鉴定、药敏检测和普通PCR验证的检测程序方法变得十分繁琐且低效，需要昂贵的仪器设备等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。

目前关于多粘菌素耐药的检测技术主要涉及基于PCR法的各种耐药基因的核酸扩增法(聚合酶链式反应和Taqman探针荧光PCR,等温扩增LAMP)，但这些检测方法只能检测各种样本中是否存在耐药基因MCR，而且需要PCR仪这样的专用仪器，在普通环境及家庭环境中，并不能完全满足快检的需要(随时随地，低成本，速度快，时间短)。例如多个实验室应用的RT-qPCR是一种具有较高使用难度的单一性检测手段，且难以检测未知的抗性基因，如HT-qPCR检测前需要设计引物，无法提供宿主信息，一旦引物(复合PCR)对之间形成的二聚体有可能会干扰实验结果，降低检测的灵敏度，不同的PCR(微滴数字PCR)检测通量有限，需要设计引物。

夹芯ELISA免疫分析(Sandwich ELISA enzyme linked immunosorbent assayimmunoassay)是利用酶标记的抗抗体检测已与固相结合的抗原(产生多粘菌素耐药性的受检菌细胞壁组份脂多糖LPS的真核细胞受体的短链式多肽模拟物)—受检菌—抗体(生物素标记的较长的LPS的受体多肽模拟物)的免疫测定技术。免疫反应***，其基本原理同酶联免疫技术。间接ELISA免疫分析法的原理是免疫反应中的酶标抗抗体与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接的标记上酶，加入底物后反应的颜色深浅代表待测耐药性阳性菌的量。具有灵敏度高，操作简便、快速、易标准化的特点。目前市面上只存在检测多粘菌素耐药基因MCR的核酸检测方法的试剂，且制备样品需要较长的时间和较高的纯度，无法与本方法的对样品纯度要求低，数量要求少，仪器要求少，成本低，省时相提并论。

发明内容

本发明提供了一种针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测方法及试剂盒。

1、小肽的设计：

筛选分析大肠杆菌细胞壁中脂多糖LPS的受体复合物(先分别依次分析TRL4，CD14，LBP的氨基酸序列，然后再取三者作用力的交集)序列及空间结构获得其模体序列：XSS/FS/FISSXRAC，对其进行分析后设计出能识别LPS的肽段，送去商业化学公司根据合成的难易程度及稳定性评估与初试后，并将肽段优化为的9，13个氨基酸的小肽，其中9肽为XFSISSXRA，13肽为KNYSSSIFFIHAC，使其适用于制作成检测大肠杆菌菌体的抗原或抗体(包括同时设生物素标记的N端与C端)。

2、本发明的目的是针对现有检测多粘菌素耐药的方法及试剂盒，需要制备高纯度的样品(另外的试剂盒)及中型PCR仪等专用仪器，成本高，无法便携，需要经培训的专业人员操作，检测效率和检测速度无法满足要求的缺陷和不足，提供一种结构合理，使用方便，能够实现对多粘菌素耐药性的鉴别，敏感性和特异性好，便于实现高通量检测，检测效率和检测速度得到了极大提高的一种针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测方法及试剂盒。

为实现上述发明目的，本发明的技术解决方案是：

一种针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测试剂盒，包括：

由Xaa-Phe-Ser-Ile-Ser-Ser-Xaa-Arg-Ala(SEQ ID NO.1，为XFSISSXRA)所示的氨基酸序列组成的9肽作为抗原；

由Lys-Asn-Tyr-Ser-Ser-Ser-Ile-Phe-Phe-Ile-His-Ala-Cys(SEQ ID NO.2，KNYSSSIFFIHAC)所示的氨基酸序列组成的13肽作为一抗。

还包括：包被板、样品稀释液、酶结合物、显色液A、显色液B。

还包括：浓缩洗涤液、终止液和用于血清稀释的血清稀释板。

9肽抗原包被在所述包被板上的孔内。

所述的样品稀释液包括：磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾和水。

所述的酶结合物为链霉亲和素。

所述显色液A为pH 2.5～3.5的乙酸钠水溶液，其中包含柠檬酸、过氧化氢、乙酸钠；

所述显色液B为pH 2.5～3.5的TMB水溶液，其中包含TMB、柠檬酸、EDTA-Na2、甘油。

一种针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测方法，利用化学合成的9肽对包被板进行包被，加入待检菌，13肽进行生物素标记作为一抗加入，链霉亲和素作为二抗加入，利用13肽与链霉亲和素的高度特异性结合的特性，加入显色液A和显色液B，进行检测。

具体的本发明技术方案：

(1)根据脂多糖LPS的受体的氨基酸序列设计出一种长度不等的两种小肽(9肽，13肽)，通过生物合成的方法做成相应的抗原(9肽)，用于包被ELISA板，用生物素标记13肽用于ELISA法中的一抗；(2)一种用于检测多粘菌素耐药大肠杆菌的夹芯式间接ELISA法检测试剂盒，包括包被板、样品稀释液、酶结合物、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、浓缩洗涤液、终止液，所述包被板上包被两种小肽抗原，9肽蛋白抗原包被在所述被板上的孔内，每升样品稀释液中含有磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾1.8g、氯化钠7.9g、氯化钾0.2g，所述一抗为生物素标记的13肽，所述二抗(酶结合物)为HRP标记的链霉亲和素，所述阳性对照为经多粘菌菌素耐药性鉴定为强阳性的大肠杆菌20-2，所述阴性对照来源于不含多粘菌素耐药性的常见工程菌DH5A,ZK126等混合液，所述显色液A为所述显色液A为pH 3.0的乙酸钠溶液，其中包含柠檬酸、过氧化氢、乙酸钠，所述显色液B为pH 3.0的TMB溶液，其中包含TMB、EDTA-Na2、柠檬酸、甘油。

所述包被板为96孔板，在所述96孔板包被9肽；所述两种肽的包被浓度均为2ng/μL。

所述显色液A的制备方法为：称量柠檬酸3.2g加入适量纯水中，充分混匀，用盐酸调PH值在3.0左右，加入过氧化氢0.6ml、乙酸钠27.2g使其完全溶解，加入ProClin^TM-3000.5mL，再加入双蒸水定容至1000mL，2～8℃保存。

所述显色液B的制备方法为：称取TMB 0.3g(事先用DMSO溶解)加入纯水中，用盐酸调节PH至3.0左右，加入柠檬酸1.9g，EDTA-Na2 0.4g，甘油100ml，待其完全溶解后，加入ProClin^TM-300 0.5mL，用量筒量取双蒸水定容至1000mL，2～8℃保存。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

一、本发明应用夹芯ELISA免疫技术，基于夹芯法能增强检测的特异性的原理，来弥补及消除蛋白水平上受体模拟小肽与大肠杆菌细胞壁的主要成份脂多糖LPS(脂质A)的结合。对以检测多粘菌素耐药的大肠杆菌为基础，进一步对含多粘菌磷酸乙醇按转移酶MCR修饰过的LPS等革兰氏阴性菌的多粘耐药性进行检测，得以实现对样本或环境中的大肠杆菌/(革兰氏阴性菌)多粘菌素耐药性进行诊断与区分。其中，利用化学合成的9肽，对其进行包被，加入待检菌，另对13肽进行生物素标记作为一抗加入，利用生物素与链霉亲和素的高度特异性结合的特性，筛选出的间接ELISA试剂盒的最佳反应体系，以此为基础制备的试剂盒具有良好的敏感性和特异性，与多粘菌素耐药性有很好的反应性，并且与常见的其他菌耐药性等均不发生反应，特异性强。

二、本发明针对当前行业发展，具有以下优势：

A、目前市面上只存在检测多粘菌素耐药基因MCR的试剂盒或药敏检测法，需要专用仪器和细菌增殖法后做药敏实验的实验室条件，而本发明可以实现对各种样本(培养菌，野外菌，水，土壤，粪便，拭子等不同含量不同形式的样本)的多粘菌素的耐药性活菌的鉴别；

B、本发明利用间接ELISA免疫技术，比PCR法，药敏法对检测条件要求低，便携，成本低，易操作，检测准确，稳定性好，特异性强、灵敏度高的特点；比之PCR检测活菌，可实现高通量检测，同样能够保证其准确性、稳定性；

C、本发明利用本试剂盒检测携带多粘菌素耐药的大肠杆菌，依托试剂盒的组成作为基本框架，可同时检测96个样本，可实现高通量、快速的目的。

附图说明

图1是试剂盒的组成：

1. 96孔小肽包被的ELISA板一块(图1-K所示)；2.阻断液1瓶，用时超纯水作100倍稀释(图1-C所示)；3.一抗1瓶，用是超纯水1：1000稀释(图1-A所示)；4.二抗1瓶，用时超纯水作1：3500稀释(图1-G)；5.HRP底物显色液二瓶(A液图1-H所示，B液图1-I所示)；6.终止液1瓶(图1-E所示)；7.阴性对照一瓶(图1-B所示)；8.阳性对照一瓶(图1-D所示)；9.空白对照一瓶(图1-F所示)；10. 20倍浓缩洗液1瓶(图1-J)；

具体实施方式

以下结合附图说明和具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。

参见图1，本发明的一种多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯间接ELISA检测试剂盒，包括包被板、样品稀释液、酶结合物、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、终止液，所述96孔包被板上的孔内包被9肽抗原，每升样品稀释液中含有磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾1.8g、氯化钠7.9g、氯化钾0.2g、ProClin^TM-3000.5mL，所述酶结合物为HRP标记的链霉亲和素，所述阳性对照为经鉴定带了MCR基因的大肠杆菌，所述阴性对照来源于不带多粘菌素耐药的大肠杆菌。所述显色液A为所述显色液A为pH 3.0的乙酸钠溶液，其中包含柠檬酸、过氧化氢、乙酸钠，所述显色液B为pH 3.0的TMB溶液，其中包含TMB、EDTA-Na2、乙酸钠、甘油。

所述包被板为96孔板，即9肽和12肽溶于PBS中，包被浓度均为2ng/μL。

显色液A的制备方法为称量柠檬酸3.2g加入适量纯水中，充分混匀，用盐酸调PH值在3.0左右，加入过氧化氢0.6ml、乙酸钠27.2g使其完全溶解，加入ProClin^TM-300 0.5mL，再加入双蒸水定容至1000mL，2～8℃保存。

所述显色液B的制备方法为：取TMB 0.3g(事先用DMSO溶解)加入纯水中，用盐酸调节PH至3.0左右，加入柠檬酸1.9g，EDTA-Na2 0.4g，甘油100ml，待其完全溶解后，加入ProClin^TM-300 0.5mL，用量筒量取双蒸水定容至1000mL，2～8℃保存。

本发明的检测试剂盒包括包被板、样品稀释液、酶结合物、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、浓缩洗涤液(20倍浓缩的洗液PBST，即稀释液的基础上加洗液总体积的0.05％的吐温20)、终止液(2M硫酸)。显色液A为称量柠檬酸5.76g加入适量纯水中，充分混匀，用盐酸调PH值在3.0左右，加入过氧化氢0.5g、乙酸钠6.21g使其完全溶解，加入ProClin^TM-3000.5mL，而后使用纯化水定容，2～8℃保存；所述显色液B为称取TMB 0.2g加入纯水中，用盐酸调节PH至3.0左右，加入柠檬酸5.76g，带起完全溶解后，加入ProClin^TM-3000.5mL，而后加纯化水定容，2～8℃保存。

在检测时，同一份样本检测2次，使样本先后分别与9肽(包被浓度均为2ng/μL)，以100μl/孔的量加入包被板内，置4℃包被过夜。弃去包被液，用洗涤液洗涤96孔，洗板2次，置于室温(22℃)自然干燥4h后(眼观轻微潮湿感)，装入铝箔袋，抽真空，置于2℃～8℃保存备用。

包被液及样品稀释液均为磷酸盐溶液，其中磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾1.8g、氯化钠7.9g、氯化钾0.2g、ProClin^TM-3000.5mL的PBS溶液。

本发明9肽，生物标记的13肽的制备方法步骤如下：

步骤一：9肽，13肽的合成：根据大肠杆菌的细胞壁中脂多糖LPS的受体的氨基酸序列设计如下：9肽抗原XFSISSXRA，13肽的序列如下：Biotin-KNYSSSIFFIHAC(南京金丝瑞生物技术有限公司完成)。

阳性对照：前期自行分离纯化的野生大肠杆菌含多粘菌素耐药的20-2的指数期菌；

阴性对照：常用大肠杆菌的工程菌DH5A，ZK126的指数期菌，不含多粘菌素耐药基因；

所述的洗液PBST的配制方法如下：在稀释液的基础上加入0.05％的吐温20。

二抗为商品化生物素标记的链霉亲和素。

终止液2M硫酸。

本发明试剂盒的使用方法(说明书)，具体步骤如下：

1.准备待检菌：将菌用LB培养基增殖至指数期，超纯水250倍稀释待用；洗液稀释待用；野外待检菌用专门的方法制备，每样取100μl；

2.取出现在96孔板，室温平衡5-10分钟；

3.加入100μl每孔的250倍水稀释的待检菌，在板的合适位置分别加入阴阳性对照、空白对照各2孔，每孔100μl，37度40分钟；

4.弃去孔内液体(注意收集废液与无害化处理，下同)，将20倍浓缩洗液用超纯水稀释20倍(1：19)稀释成工作洗液，之后用洗液洗板三次(每次静置30秒，下同)，扣干，每孔加入100μl阻断(只加入待检菌及阴阳性对照孔)，空白对照孔加空白对照液各100μl，37℃40分钟；

5.弃去孔内洗液，用液体洗板三次，扣干，各孔加入一抗100μl，37℃孵40分钟；

6.弃去孔内洗液，用液体洗板三次，扣干，各孔加入二抗100μl，37℃孵40分钟；

7.弃去孔内洗液液体洗板三次，扣干，全部孔加入HRP底物显色液100μl，即显色液A液50μl，显色液B液50μl(加样量要准确均匀，吸头外侧沾附的液体不要加入)，室温(25度左右)孵育30分钟(无需要避光)，测OD及拍照；

8.每孔加入50μl终止液(加样量要准确均匀，吸头外侧沾附的液体不要加入)，立即450nm测OD值及拍照

9.加样、洗板及测OD时孔内不能出现任何气泡。

该使用方法的判定标准为：

1.颜色法：在空白对照无色或浅黄色，阳性深黄色，阴性无色或浅黄色情况下，判断本次检测对照成立，检测结果有效，如果空白对照的黄色深于阴性或阳性，则必须进一步考虑OD值法，这时OD值小于0.3为空白对照成立；

2.OD值法：在空白对照小于0.2，阳性对照大于0.4，阴性对照小于0.3的前提下，为检测结果有效，待检孔的结果大于0.4判为阳性，待检孔OD值小于0.3判为阴性，如果OD值在0.3-0.4之间，则应重复检测1-3次，然后用以下公式判断：

待检孔三次检测结果OD值均值/阴性孔的OD值均值大于2.1均判为阳性，小于2.1判为阴性。

表1是包被板上对照和待检菌样品添加模式图。

实例2、多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测方法及试剂盒的主要指标

敏感性

将8份已知多粘菌素耐药阴性与阳性的菌株从1：50起连续倍比稀释至第8孔(1：390725)，倍差为5倍，采用多粘菌素耐药的大肠杆菌夹芯ELISA抗体检测试剂盒对上述稀释后的样品进行检测，数据如下表2所示：

表2八个样品中多粘菌素耐药的大肠杆菌ELISA检测结果

检测结果OD值如表2所示，试验结果表明，从1：31250起，阳性指数菌检测结果为临界(0.3-0.4)，即指数菌检出限为1：31250，最佳稀释度为1：50-1：6250。

特异性

取9份多粘菌素耐药阴性样品(含样品1(LPS)，样品2(血清)，样品3(载体)，样品4(BSA)，样品5(B-ACTIN)，样品6(酪蛋白)，样品7(甘氨酸)，样品8(水)，样品9(TAE buf)等)的大肠杆菌菌株，用小肽包被的ELISA法进行测定计算阴性与阳性的检出率及二种方法的符合率；

表3 9个样品中多粘菌素耐药的大肠杆菌的ELISA法检测结果

稀释倍数	样品1	样品2	样品3	样品4	样品5	样品6	样品7	样品8	样品9
										1:250	0.1688	0.2666	0.0887	0.0892	0.1089	0.1204	0.1059	0.107	0.1124
1:250	0.1917	0.1957	0.0967	0.1282	0.1276	0.0738	0.1867	0.1258	0.1003
										1:250	0.2392	0.1782	0.1336	0.1608	0.1184	0.1017	0.1361	0.0781	0.1246
1:250	0.2668	0.1485	0.1318	0.1749	0.1782	0.1386	0.1444	0.1356	0.0979
										1:250	0.2448	0.2867	0.1324	0.1458	0.1800	0.1647	0.1615	0.1516	0.1518
1:250	0.2999	0.3094	0.3291	0.2269	0.3044	0.1366	0.1002	0.1143	0.2883
										1:250	0.248	0.2634	0.1586	0.2662	0.1964	0.1944	0.2288	0.1708	0.1431
1:250	0.1811	0.2401	0.2073	0.305	0.1517	0.2205	0.3336	0.1598	0.135

试验结果表明，多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA法检测试剂盒对9份非特异性样品的检测结果全部为阴性。说明其特异性良好。

重复性

进行取多粘菌素耐药阴性与阳性的菌株样品各2份，用小肽包被的板连续测定三遍(1:250稀释)，观察三次检测结果的符合率(批间重复性试验)；

检测结果表明：多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测方法及试剂盒批内重复性试验试验结果表明，批内重复性试验结果，该批次批内最大变异系数CV为小于9％，符合批内重复性要求,见表4。

表4 4个多粘菌素耐药的大肠杆菌(样品名称为2002，ATCG，DH5A，ZK126)的重复性ELISA检测

野外样品的检出限(现场测出OD值后带回实验室培养法测定最低检出量的限值)：从浙江省内5个的地点各取样品一份0.5g的野外(大田)样品，这些样品分别取自专业养殖场，城市绿地，海边滩涂，高山地区，分粪样，泥水样，土样三种形式进行制样1ml后备用。现场检测测完OD值后，拿回实验室，用经典的培养法将待检样品倍比稀释后，取稀释液2微升涂于LB固体培养基，测出cfu值，然后用本方法ELISA法测出稀释液的OD值，确定最大稀释倍数与OD值对应关系，即CFU为0时的OD值。见表5。

试验结果表明，5个样品ELISA法七次重复试验数据一致，即粪样为阳性，其余为阴性，而培养法显示，在ELISA法OD值区分为阳性(大于0.4)和阴性(OD值小于0.3)的情况下，野外土样，水样，泥水样，粪样的最小检出量可达1.5×10^3个CFU，这说明ELISA法可以成功地检测出每份样品的阴阳性。

表5

1	2	3	4	5	6
						HZ粪样	HY土样	SC泥样	LQ土样	SY土样	PBS本底
0.5gHZTY1	0.5gHZTY2	0.5gSCTY1	0.5gLQTY1	0.5gSYTY1	PBS本底
						0.5gHZTY1	0.5gHZTY2	0.5gSCTY1	0.5gLQTY1	0.5gSYTY1	PBS本底
0.5gHZTY1	0.5gHZTY2	0.5gSCTY1	0.5gLQTY1	0.5gSYTY1	PBS本底
						0.5gHZTY1	0.5gHZTY2	0.5gSCTY1	0.5gLQTY1	0.5gSYTY1	PBS空白
0.5gHZTY1	0.5gHZTY2	0.5gSCTY1	0.5gLQTY1	0.5gSYTY1	PBS空白
						0.5gHZTY1	0.5gHZTY2	0.5gSCTY1	0.5gLQTY1	0.5gSYTY1	PBS空白
0.5gHZTY1	0.5gHZTY2	0.5gSCTY1	0.5gLQTY1	0.5gSYTY1	PBS空白
						0.4459	0.2318	0.2653	0.2031	0.2038	0.2232
0.312	0.3537	0.3393	0.2214	0.2987	0.2386
						0.5139	0.3439	0.2959	0.3856	0.2158	0.3039
0.527	0.2918	0.261	0.3071	0.1721	0.2263
						0.4613	0.2927	0.3989	0.1704	0.1684	0.1195
0.5034	0.3045	0.2659	0.2009	0.1784	0.1496
						0.6968	0.1981	0.2198	0.2158	0.1305	0.1201
0.689	0.2521	0.1546	0.1398	0.1299	0.1191

以上内容是结合具体实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认为本发明的具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，所做出的简单修改和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括：

由Xaa-Phe-Ser-Ile-Ser-Ser-Xaa-Arg-Ala所示的氨基酸序列组成的9肽作为抗原；

由Lys-Asn-Tyr-Ser-Ser-Ser-Ile-Phe-Phe-Ile-His-Ala-Cys所示的氨基酸序列组成的13肽作为一抗。

2.根据权利要求1所述的针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括：包被板、样品稀释液、酶结合物、显色液A、显色液B。

3.根据权利要求2所述的针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括：浓缩洗涤液、终止液。

4.根据权利要求2所述的针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测试剂盒，其特征在于，9肽抗原包被在所述包被板上的孔内。

5.根据权利要求2所述的针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测的试剂盒，其特征在于，所述的样品稀释液包括：磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾和水。

6.根据权利要求2所述的针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的酶结合物为链霉亲和素。

7.根据权利要求2所述的针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述显色液A为pH 2.5～3.5的乙酸钠水溶液，其中包含柠檬酸、过氧化氢、乙酸钠；

所述显色液B为pH 2.5～3.5的TMB水溶液，其中包含TMB、柠檬酸、EDTA-Na2、甘油。

8.一种针对多粘菌素耐药的大肠杆菌的夹芯ELISA检测方法，其特征在于，利用化学合成的9肽对包被板进行包被，加入待检菌，13肽进行生物素标记作为一抗加入，链霉亲和素作为二抗加入，利用13肽与链霉亲和素的高度特异性结合的特性，加入显色液A和显色液B，进行检测。

Images