CN106248943A - 抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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李爽
张昭
夏福臻
钱纯亘
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Abstract

本发明公开了一种抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒包括：抗核抗体单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。这种抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成抗核抗体的检测这种抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到4AU/mL，相对于传统的抗核抗体的检测方法灵敏度至少提高了10倍，这种抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。

Description

抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及体外检测领域，尤其涉及一种抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
抗核抗体（antinuclear antibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白（DNP)、DNA、可提取的核抗原（ENA) 和RNA 等作为靶抗原的自身抗体的总称，主要存在于血清中。抗核抗体在多种自身免疫病中均呈不同程度的阳性率，如***性红斑狼疮（SLE，95％～ 100％）、类风湿性关节炎（RA，10％～ 20％）、混合性***病（MCTD，80％～ 100％）、干燥综合症（SS，10％～ 40％）、全身性硬皮病（85％～90％）、狼疮性肝炎（95％～ 100％）、原发性胆汁性肝硬化（95％～ 100％）等。
临床检测抗核抗体的常见方法包括间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、酶促化学发光法，但这些方法都存在着不足，具体如下所示。
一、间接免疫荧光法
该法的基本原理是用特异性的抗体与载玻片中的抗原结合后形成抗原抗体复合物，继用荧光抗体与抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下，根据复合物的发光情况来确定所检测的抗体。该方法评价：由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。但是其不足也是明显的：
(1) 在分析结果时无法根据分子量的大小区分非特异性识别；
(2) 操作相对复杂，需要价格较昂贵的荧光显微镜，在很多基层医院难以推广，也不太适用于标本量较多的实验室；
(3) 荧光测定中的本底较高，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难；
(4) 结果判定需要有经验的专业人员，分析结果的客观性不足；
(5) 只能进行定性检测，不能进行定量测定。
二、酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附法（ELISA） 被广泛应用，但该方法也存在着下述的不足之处：
（1）使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96孔专用微孔板作为抗原包被用具和反应容器，在使用时只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，无法进行独立的、单人份的检测；
（2） 定量测定所用的试剂种类较多，每一种检测试剂都要用试剂瓶来盛装，并且每使用一种试剂时都需要更换吸液嘴来分别加注到微孔板的微孔中，不但试剂瓶种类多，加注试剂的操作也极为繁琐；
（3） 缺少对检测信息的相应标注，只能通过查看试剂盒外包装盒的标识才能了解或知悉检测试剂的生产批号及有效期信息，而且所知悉的信息在检测过程中不受控，具有很大的随意性；
（4） 检测试剂在检测过程中处于开放的空间，容易引起各种试剂之间的交叉污染而影响检测结果的准确性；
（5） 检测过程多采用手工操作，试剂或样本的加量不很精确，操作过程极为繁琐和复杂，容易发生操作差错，检测结果的准确度和精密度较差；
（6） 在检测项目成套试剂的数量配置及使用上均为项目数×48/96人份，如果需要检测10个项目，则试剂的配置及使用数须为10×48/96人份，如果只有一份样本需要检测10个不同的项目，也需要配置10×48/96人份的试剂，存在着不够经济合理的缺点。
三、化学发光法
化学发光法按发光原理可分为直接化学发光和酶促化学发光。
酶促化学发光主要有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶两种，但都有一定的局限性，辣根过氧化物酶主要缺点为：鲁米诺在没有辣根过氧化物酶存在情况下，也会被H2O2氧化自身发光，本底相对较高，影响信噪比，反应动力学复杂，影响因素多，结果不够稳定，要得到灵敏度高且平台期长的底物不容易。碱性磷酸酶主要缺点为：底物达到平台期的时间长，底物成本高，导致检测成本高，患者负担重。
吖啶酯作为标记物的直接化学发光相比酶促化学发光具有明细优势，主要表现在：反应不需要催化剂，只要碱性环境即可进行，反应迅速，背景发光低，信噪比高，干扰因素少，试剂稳定性好，可以两点定标，体系简单，激发液成本低，吖啶酯易与蛋白质联结，且联结后光子产率不减少。
发明内容
基于此，有必要提供一种检测灵敏度较高的抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
一种抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒，包括：抗核抗体抗原包被的羧基化的磁微粒和抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。
在一个实施例中，所述抗核抗体抗原包被的羧基化的磁微粒中，所述抗核抗体单克隆抗体与所述羧基化的磁微粒的比例为1:20~100。
在一个实施例中，所述抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物中，所述抗核抗体单克隆抗体与所述化学发光标记物的比例为1:2~200。
在一个实施例中，所述羧基化的磁微粒的粒径为0.05μm~1μm。
在一个实施例中，所述化学发光标记物为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。
在一个实施例中，还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液。
在一个实施例中，所述A液为H2O2溶液，所述B液为NaOH溶液。
在一个实施例中，还包括抗核抗体定标品。
在一个实施例中，所述抗核抗体定标品为浓度分别为5AU/mL、45AU/mL、80AU/mL、160AU/mL、320AU/mL和640AU/mL的抗核抗体的溶液。
一种上述的抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入抗核抗体抗原，室温下混悬2h~10h，磁分离去除上清后用Tris缓冲液重悬，得到抗核抗体抗原包被的羧基化的磁微粒；以及
取抗核抗体单克隆抗体，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标记物后混匀，室温下避光反应1h~2h后除杂，得到抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。
这种抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成抗核抗体的检测这种抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到4AU/mL，相对于传统的抗核抗体的检测方法灵敏度至少提高了10倍，这种抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。
附图说明
图1为一实施方式的抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法的流程图；
图2为实施例3得到的抗核抗体标准曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一实施方式的抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒，包括：抗核抗体抗原包被的羧基化的磁微粒和抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。
优选的，抗核抗体抗原包被的羧基化的磁微粒中，抗核抗体单克隆抗体与羧基化的磁微粒的比例为1:20~100。
优选的，抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物中，抗核抗体单克隆抗体与化学发光标记物的比例为1:2~200。
优选的，羧基化的磁微粒的粒径为0.05μm~1μm。
化学发光标记物可以为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。其中，化学发光标记物优选为吖啶酯。
在其他的实施例中，上述抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒还包括化学发光底物液。
化学发光底物液包括A液和B液。A液可以为H2O2溶液，B液可以为NaOH溶液。
本实施例中，A液为浓度为0.1mol/L的H2O2溶液，B液为浓度为0.25mol/L的NaOH溶液。
在其他的实施例中，上述抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒还包括抗核抗体定标品。
抗核抗体定标品为浓度分别为5AU/mL、45AU/mL、80AU/mL、160AU/mL、320AU/mL和640AU/mL的抗核抗体的溶液。
具体的，抗核抗体定标品可以采用标准品缓冲液将抗核抗体配制成浓度分别为5AU/mL、45AU/mL、80AU/mL、160AU/mL、320AU/mL和640AU/mL的抗核抗体的溶液。
这种抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒用于抗核抗体检测时，利用全自动化学发光免疫分析仪对抗核抗体定标品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件；接着测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度；最后对抗核抗体全自动化学发光免疫分析***进行性能（灵敏度、线性、精密度、干扰性）的评价。
这种抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成抗核抗体的检测这种抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒，经过实验，其检测灵敏度达到4AU/mL，相对于传统的抗核抗体的检测方法灵敏度至少提高了10倍，这种抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒的检测精度较高。
此外，这种抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒还具有以下优点：
1、选择吖啶酯作为标记材料，并应用于化学发光免疫分析***，该发光体系为直接化学发光，与传统的酶促化学发光相比，该反应不需要酶的参与，更加节约成本；
2、选用吖啶酯的化学发光免疫分析***线性范围宽，能达到4AU/mL~ 500AU/mL，而传统的抗核抗体的检测方法的检线性范围为20pg/mL~ 1000pg/mL；
3、吖啶酯化学发光免疫分析***重复性高，批内及批间差均在5%以内，这是其它化学发光免疫分析***难以达到的；
4、化学发光免疫分析***已实现样本的定量，通过内置标准曲线到测试软件，只需测试样本就可直接得到样本的浓度值；
5、化学发光免疫分析***可以实现全自动化，试剂及样本的添加全有仪器完成，操作更加简便，减少了人为的误差。
如图1所示的上述抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入抗核抗体抗原，室温下混悬2h~10h，磁分离去除上清后用Tris缓冲液重悬，得到抗核抗体抗原被的羧基化的磁微粒。
MES（2-(N-***啉)乙磺酸）缓冲液的浓度为0.02M，pH为5.5。
Tris缓冲液的浓度为0.1M并且含有2%BSA，pH为8.0。
EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺）水溶液的浓度为10mg/mL~20mg/mL，EDC与羧基化的磁微粒的比例为0.05：0.1~1。
优选的，抗核抗体抗原包被的羧基化的磁微粒中，抗核抗体抗原与羧基化的磁微粒的比例为1:20~100。
优选的，羧基化的磁微粒的粒径为0.05μm~1μm。
取抗核抗体单克隆抗体，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标记物后混匀，室温下避光反应1h~2h后除杂，得到抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。
碳酸盐缓冲液浓度为0.1M，pH为9.0~9.5，
除杂的操作为离心脱盐柱脱盐，具体操作为：先分别用纯净水及TBS缓冲液（40 mMTris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）处理离心脱盐柱，最后加入得到的抗核抗体单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒的溶液，最后收集离心管中的液体。
优选的，抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物中，抗核抗体单克隆抗体与化学发光标记物的比例为1:2~200。
化学发光标记物可以为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。其中，化学发光标记物优选为吖啶酯。
得到的抗核抗体单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒和抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物组合即可得到上述抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒。
这种抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒在使用时，还需要化学发光底物液和抗核抗体定标品。
化学发光底物液和抗核抗体定标品可以自行配制得到。
化学发光底物液包括A液和B液。A液可以为H2O2溶液，B液可以为NaOH溶液。
本实施例中，A液为浓度为0.1mol/L的H2O2溶液，B液为浓度为0.25mol/L的NaOH溶液。
具体的，抗核抗体定标品可以采用标准品缓冲液将抗核抗体配制成浓度分别为5AU/mL、45AU/mL、80AU/mL、160AU/mL、320AU/mL和640AU/mL的抗核抗体的溶液。
这种抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法简单方便，制得的抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒的检测灵敏度较高，具有良好的应用前景。
以下为具体实施例。
实施例1：抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备
（1）抗核抗体单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒的制备：
取含有50mg粒径为0.05μm~1μm的羧基化的磁微粒（MagnaBind™，货号21353）悬浮液，磁分离去上清，用0.02 M，pH为5.5 MES缓冲液重悬，加入1mL新配置的10mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面羧基，加入4mg抗核抗体抗原，室温下混悬6h，磁分离，去除上清，用含2%BSA的0.1M，pH为8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到抗核抗体抗原被的羧基化的磁微粒，每瓶5mL分装保存于4℃备用。
（2）抑制素单克隆抗体标记的吖啶酯的制备：
取50μL浓度为25mg/mL的抗核抗体单克隆抗体，加入150μL浓度为0.1M、pH为9.0~9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入1.5μL浓度为5mg/mL的吖啶酯溶液混匀，室温下避光反应，1.5h后取出，用2mL的zeba离心脱盐柱脱盐处理，脱盐过程中首先分别用纯净水及TBS缓冲液进行处理，最后加入得到的抑制素单克隆抗体标记的吖啶酯溶液，收集离心管中的液体至保存管得到抑制素单克隆抗体标记的吖啶酯，每瓶5mL分装保存于4℃备用。
（3）抗核抗体定标品的制备：
用标准品缓冲液（40 mM Tris-HCl，0.5% BSA，1% NaCl，pH 8.0）将抗核抗体配置成浓度为5AU/mL、45AU/mL、80AU/mL、160AU/mL、320AU/mL和640AU/mL，每瓶0.5 mL分装冻干，4℃保存备用。
实施例2：抗核抗体化学发光免疫检测方法
以全自动化学发光免疫分析仪（YHLO，货号iFlash3000）为检测工具，方法学模式为双抗体夹心法，即仪器依次加入5μL的样品、50 μL的抗核抗体抗原被的羧基化的磁微粒以及50 μL的抗核抗体处理液，反应10min后，再加100 μL的抗核抗体包被的吖啶酯，反应10min后，进行磁分离，仪器将反应混合物送入暗室，依次加入发光底物A液（H2O2）及B液（NaOH）进行发光反应，最后记录发光值。
实施例3：抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒性能评价
采用实施例2中的方法对抗核抗体定标品进行检测，得到绘制标准曲线如图2所示。
接着对接着测试实际样本，根据样本发光值计算样本浓度。
灵敏度的检测：
参照CLSI EP17-A 文件推荐实验方案，计算抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒的灵敏度，求得的灵敏度为4AU/ mL。
线性的检测：
对浓度为10AU /mL、60AU /mL、102AU/mL、190AUpg /mL、380AU /mL 标准品做线性分析，计算线性相关系数，r=0.9922，另外，该试剂盒对抗核抗体样品检测的线性范围为0AU/ml ~400AU/mL。
精密度测定：
取浓度为160AU/mL及342AU/mL两个抗核抗体样品，每个样本每个浓度各做3个平行，用三批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明该试剂盒批内及批间差均小于5%。
干扰性实验：
取混合血清分别添加干扰物包括：结合胆红素、游离胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、甘油酯，添加比例按照 1：20进行，分别测定混合血清及添加了各种干扰物后混合血清的测值，计算二者之间的偏差，以 ±10%为可接受范围。结果表明，干扰性均达到 NCCLS 的文件标准，可用于临床实验室抗核抗体 状况的准确评估。
实施例4、抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒的对比实验
分别用化学发光检测方法和传统的酶联免疫吸附法对浓度为10AU /mL、60AU /mL、102AU/mL、190AUpg /mL、380AU /mL的抗核抗体样品做检测，两种方法检测灵敏度相比，数据如下表所示：
由上表可以看出，化学发光检测方法的灵敏度较酶联免疫吸附法提高了约20倍。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括：抗核抗体抗原包被的羧基化的磁微粒和抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。
2.根据权利要求1所述的抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述抗核抗体抗原包被的羧基化的磁微粒中，所述抗核抗体抗原与所述羧基化的磁微粒的比例为1:20~100。
3.根据权利要求1所述的抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物中，所述抗核抗体单克隆抗体与所述化学发光标记物的比例为1:2~200。
4.根据权利要求1所述的抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述羧基化的磁微粒的粒径为0.05μm~1μm。
5.根据权利要求1所述的抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物为鲁米诺、异鲁米诺、三联吡啶钌或吖啶酯。
6.根据权利要求1所述的抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液。
7.根据权利要求6所述的抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述A液为H2O2溶液，所述B液为NaOH溶液。
8.根据权利要求1所述的抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括抗核抗体定标品。
9.根据权利要求8所述的抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述抗核抗体定标品为浓度分别为5AU/mL、45AU/mL、80AU/mL、160AU/mL、320AU/mL和640AU/mL的抗核抗体的溶液。
10.一种根据权利要求1~9中任一项所述的抗核抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
取羧基化的磁微粒的悬浮液，磁分离去上清后用MES缓冲液重悬，接着加入EDC水溶液，活化羧基化的磁微粒的表面羧基，接着加入抗核抗体抗原，室温下混悬2h~10h，磁分离去除上清后用Tris缓冲液重悬，得到抗核抗体抗原包被的羧基化的磁微粒；以及取抗核抗体单克隆抗体，加入碳酸盐缓冲液后混匀，然后加入化学发光标记物后混匀，室温下避光反应1h~2h后除杂，得到抑制素单克隆抗体标记的化学发光标记物。
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