CN115902052A - 一种俄色果及其制剂的hplc特征图谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物分析领域,具体公开了一种俄色果及其制剂的HPLC特征图谱检测方法,它包括如下步骤:1)对照品溶液制备;2)供试品溶液制备;3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪,记录色谱图。本发明俄色果及其制剂的HPLC特征图谱检测方法,通过特定的色谱条件建立的特征图谱能标定8个特征峰,尤其是能指认出俄色果中特有的有机酸类成分枸杞酸和L‑苹果酸的色谱峰,更具特征性的化学成分的标定实现了对俄色果及其制剂的质量控制,保障了俄色果的临床疗效,具备实际推广应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域,具体涉及一种俄色果及其制剂的HPLC特征图谱检测方法。
背景技术
俄色果来源于蔷薇科苹果属植物变叶海棠
Malus toringoides(Rehd.) Hughes或花叶海棠
Malus transitoria( Batal.) Schneid.的干燥成熟果实,为甘孜藏族自治州民间的一味习用药材,具有悠久药用及食用历史,主要功效为清肺疾,排(化) 痰、健胃、降血压等作用。为方便临床使用、提高患者依从性,目前将其制成了俄色果配方颗粒。
中药配方颗粒与饮片、传统汤剂存在形式不同,制备工艺也有差异,而在质量控制方面仅以某个成分进行质量评价不能达到质量控制的要求;同时也无法评价饮片与中药配方颗粒之间成分的相关性,因此国家局规定中药配方颗粒质量控制中需增加特征图谱,用于整体评价配方颗粒质量并与饮片进行综合分析。专利CN 109060985 A公开了一种俄色果HPLC指纹图谱,其能分离出11个特征峰,并指认出其中的6个特征成分绿原酸,金丝桃苷,异槲皮苷,槲皮苷,根皮苷和槲皮素。经试验验证发现,该方法并不能分离出俄色果中重要的特征成分L-苹果酸和枸杞酸。由于俄色果中总酸含量达到了5%以上,L-苹果酸和枸杞酸又是俄色果中特有的有机酸类成分,因此有必要开发出一种分离度好,专属性更强的俄色果配方颗粒的HPLC指纹图谱检测方法。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一种俄色果及其制剂的HPLC特征图谱检测方法,它包括如下步骤:
1)对照品溶液的制备:取枸杞酸和L-苹果酸对照品,加水溶解,即得对照品溶液;
2)供试品溶液制备:取待检样品,加水提取,提取液过滤,取滤液,即得供试品溶液;
3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪,记录色谱图;色谱条件如下:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相:以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B;梯度洗脱程序0~18 min,1%→3%A;18~18.5 min,3%→4 %A;18.5~25min,4%→7%A;25~30min,7%→15%A;30~35min,15%→31%A。
进一步地,步骤1)所述对照品溶液每1ml含枸杞酸0.1~0.5 mg、L-苹果酸0.1~1mg。
进一步地,步骤2)所述待检样品与水的质量体积比为0.5~1g:5~50ml;所述水为蒸馏水。
进一步地,所述待检样品为俄色果药材、俄色果标准汤剂或俄色果配方颗粒。
进一步地,步骤2)所述提取为超声提取,功率500W,频率40kHz,时间30~60min。
进一步地,步骤3)所述色谱条件中色谱柱为:SunFire C18柱、Inertsil ODS-3C18柱或Kromasil C18柱,柱长250mm,内径4.6mm,粒径5µm,柱温25~35℃,进样量5~25μL,流速为0.2~0.7mL∙min-1,检测波长200~220nm。
进一步地,步骤3)所述色谱条件中柱温30℃,进样量10μL,流速为0.5mL∙min-1,检测波长210nm。
进一步地,所述供试品溶液的色谱图中应呈现8个特征峰,其中2个峰应分别与相应对照品参照物峰的保留时间相对应,与枸杞酸参照物峰相应的峰为S峰,计算其余各峰与S峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内,规定值为:峰1:0.343、峰2:0.413、峰3:0.534、峰6:1.173、峰7:1.487、峰8:1.800。
本发明俄色果及其制剂的HPLC特征图谱检测方法,通过特定的色谱条件建立的特征图谱能标定8个特征峰,尤其是能指认出俄色果中特有的有机酸类成分枸杞酸和L-苹果酸的色谱峰,更具特征性的化学成分的标定实现了对俄色果及其制剂的质量控制,保障了俄色果的临床疗效,具备实际推广应用价值。
显然,根据本发明的上述内容,按照本领域的普通技术知识和惯用手段,在不脱离本发明上述基本技术思想前提下,还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1色谱柱耐用性考察色谱图(A:SunFire C18柱;B:Kromasil C18柱;C:InertsilODS-3 C18柱);
图2 3批样品特征图谱(S1:PFG001特征图谱, S2:PFG002特征图谱, S3:PFG003特征图谱, R:对照特征图谱);
图3 HPLC色谱图(A:俄色果(变叶海棠)配方颗粒的对照特征图谱;B:混合对照品溶液的HPLC色谱图;峰4:L-苹果酸;峰5:枸杞酸);
图4 俄色果饮片、标准汤剂、配方颗粒匹配色谱图。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的试剂、试药、设备均为已知产品,通过购买市售产品获得。其中俄色果(变叶海棠)配方颗粒为蔷薇科植物变叶海棠
Malus toringoides(Rehd.)Hughes的干燥成熟果实经炮制并按标准汤剂的主要质量指标加工制成的配方颗粒,性状为淡棕色至红棕色的颗粒;气微,味酸、甘。具体的制备方法为:取俄色果(变叶海棠)饮片2000g,加水煎煮,滤过,滤液浓缩成清膏(干浸膏出膏率为25%~45%),加辅料适量,干燥(或干燥,粉碎),再加辅料适量,混匀,制粒,制成1000g,即得。
实施例1 本发明俄色果配方颗粒的特征图谱检测
1)对照品溶液的制备
取枸杞酸、L-苹果酸对照品,精密称定,加蒸馏水制成每1ml分别含0.25mg、0.5mg的混合溶液,作为对照品溶液。
2)供试品溶液的制备
取俄色果配方颗粒0.5g,研细,置具塞锥形瓶中,加蒸馏水15ml,超声处理(功率500W,频率40kHz)30min,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
3)分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,记录色谱图。色谱条件如下:
色谱柱:SunFire C18柱,规格4.6 ×250 mm,5
μm;检测波长:210 nm;柱温30℃,流速为0.5mL∙min-1;流动相:以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B;梯度洗脱程序:0~18 min,1%→3%A;18~18.5 min,3%→4 %A;18.5~25min,4%→7%A;25~30min,7%→15%A;30~35min,15%→31%A。
4)分析色谱图
供试品溶液的色谱图中应呈现8个特征峰,其中2个峰应分别与相应对照品参照物峰的保留时间相对应。与枸杞酸参照物峰相应的峰为S峰,计算峰1、峰2、峰3、峰6、峰7、峰8与S峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内,规定值为:0.343(峰1)、0.413(峰2)、0.534(峰3)、1.173(峰6)、1.487(峰7)、1.800(峰8)。
实施例2 本发明俄色果的特征图谱检测
1)对照品溶液的制备
取枸杞酸、L-苹果酸对照品,精密称定,加蒸馏水制成每1ml分别含0.25mg、0.5mg的混合溶液,作为对照品溶液。
2)供试品溶液的制备
取俄色果药材粉末1g,研细,置具塞锥形瓶中,加蒸馏水20ml,超声处理(功率500W,频率40kHz)45min,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
3)分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,记录色谱图。色谱条件如下:
色谱柱:Inertsil ODS-3 C18柱,规格4.6 ×250 mm,5
μm;检测波长:210 nm;柱温30℃,流速为0.5mL∙min-1;流动相:以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B;梯度洗脱程序:0~18 min,1%→3%A;18~18.5 min,3%→4 %A;18.5~25min,4%→7%A;25~30min,7%→15%A;30~35min,15%→31%A。
4)分析色谱图
供试品溶液的色谱图中应呈现8个特征峰,其中2个峰应分别与相应对照品参照物峰的保留时间相对应。与枸杞酸参照物峰相应的峰为S峰,计算峰1、峰2、峰3、峰6、峰7、峰8与S峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内,规定值为:0.343(峰1)、0.413(峰2)、0.534(峰3)、1.173(峰6)、1.487(峰7)、1.800(峰8)。
实施例3 本发明俄色果标准汤剂的特征图谱检测
1)参照物溶液的制备
取枸杞酸、L-苹果酸对照品,精密称定,加蒸馏水制成每1ml分别含0.25mg、0.5mg的混合溶液,作为对照品溶液。
2)供试品溶液的制备
取俄色果标准汤剂的冻干粉末0.5g,研细,置具塞锥形瓶中,加蒸馏水20ml,超声处理(功率500W,频率40kHz)30min,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
3)分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,记录色谱图。色谱条件如下:
色谱柱:Inertsil ODS-3 C18柱,规格4.6 ×250 mm,5
μm;检测波长:210 nm;柱温30℃,流速为0.5mL∙min-1;流动相:以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B;梯度洗脱程序:0~18 min,1%→3%A;18~18.5 min,3%→4 %A;18.5~25min,4%→7%A;25~30min,7%→15%A;30~35min,15%→31%A。
4)分析色谱图
供试品溶液的色谱图中应呈现8个特征峰,其中2个峰应分别与相应对照品参照物峰的保留时间相对应。与枸杞酸参照物峰相应的峰为S峰,计算峰1、峰2、峰3、峰6、峰7、峰8与S峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内,规定值为:0.343(峰1)、0.413(峰2)、0.534(峰3)、1.173(峰6)、1.487(峰7)、1.800(峰8)。
以下通过实验例来说明本发明的有益效果:
实验例1 俄色果配方颗粒指纹图谱研究
1、色谱条件
本发明在前期试验的基础上确定中药配方颗粒特征图谱条件如下,并按照此条件进行检测。
色谱条件与***适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm,内径为4.6mm,粒径为5µm),以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱;检测波长为210nm;流速为每分钟0.5ml;柱温为30℃。
2、制样方法考察
本发明在前期试验的基础上确定以蒸馏水为溶剂,进行其他提取条件考察。
2.1提取时间考察
取俄色果(变叶海棠)配方颗粒0.5g,研细,置具塞锥形瓶中,加75%甲醇25ml,分别超声10min、20min、30min、40min,摇匀,滤过,取续滤液,即得。照“1”项下色谱条件进样,结果见表1。
表1提取时间考察
由表可知,随着提取时间增加,色谱峰峰面积增加,提取时间为30min和40min色谱峰峰面积差异不大,各个色谱峰峰面积趋于稳定,故确定最佳提取时间为30min。
2.2称样量考察
取俄色果(变叶海棠)配方颗粒0.1g、0.3g、0.5g、0.7g、1.0g,研细,置具塞锥形瓶中,分别加蒸馏水20ml,分别超声处理(功率250W,频率40kHz)30min,取出,放冷,摇匀,滤过,取续滤液,即得,照“1”项下色谱条件进样,结果见表2。
表2称样量考察
由表可知,随着称样量增加,各个色谱峰峰面积按比例增加,称样量为1g时枸杞酸峰峰面积过大,色谱图整体不美观;称样量为0.3g时部分峰峰面积过小;称样量为0.5g时各个峰峰面积较为适中,总色谱峰面积最大,故确定0.5g为最佳称样量。
溶剂体积考察
取俄色果(变叶海棠)配方颗粒0.5g,研细,置具塞锥形瓶中,分别加蒸馏水5ml、10ml、15ml、20ml,分别超声处理(功率250W,频率40kHz)30min,取出,放冷,摇匀,滤过,取续滤液,即得,照“1”项下色谱条件进样,结果见表3。
表3溶剂体积考察
由表可知,随着溶剂体积的增加,各色谱峰峰面积按比例减少,但色谱峰个数无变化,当溶剂为10ml时,部分峰面积过大,综合各个峰情况,最佳溶剂体积为15ml。
2.4供试品制备方法
取俄色果(变叶海棠)配方颗粒0.5g,研细,置具塞锥形瓶中,加蒸馏水15ml,超声处理(功率500W,频率40kHz)30min,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
3、方法学考察
3.1重复性考察
取俄色果(变叶海棠)配方颗粒6份,按”2.4”项下制样,照“1”色谱条件连续进样,记录色谱图,见表4~5;计算各特征峰相对保留时间及相对峰面积的RSD值,结果分别为0.08%~0.32%、0.02%~0.14%,表明方法重复性良好。
表4重复性相对保留时间
表5重复性相对保留峰面积
3.2 精密度考察
取俄色果(变叶海棠)配方颗粒样品,按”2.4”项下制样,照“1”色谱条件连续进样6次,记录色谱图,见表6~7;计算各特征峰相对保留时间及相对峰面积的RSD值,结果分别为0.05 %~0.07%、1.40 %~2.90%,表明仪器精密度良好。
表6精密度考察相对保留时间
表7精密度考察相对峰面积
3.3稳定性考察
取俄色果(变叶海棠)配方颗粒样品,按“1”项下制样,分别于(0、2、4、8、12、24 h)进样,记录色谱图,见表8~9;计算各特征峰相对保留时间及相对峰面积的RSD值,结果分别为0.16% ~0.43 %、1.21 % ~ 2.86%,表明供试品溶液在24h内稳定。
表8稳定性考察相对保留时间
表9稳定性考察相对峰面积
3.4色谱柱耐用性
取同一个供试品溶液,照“1”项下色谱条件,分别用SunFire C18柱、InertsilODS-3 C18柱、Kromasil C18柱进行检测,记录色谱图并观察色谱峰出峰情况。实验结果表明各个色谱峰在不同色谱柱上分离度良好,峰形对称,说明此方法色谱柱耐用性良好,结果见图1。
4、特征图谱的建立
将中试得到的3批俄色果配方颗粒按”2.4”项下制样,照“1”项下色谱条件进行检测,记录色谱图。根据样品色谱图结果,确定8个共有色谱峰,并指认2个特征峰,分别为L-苹果酸、枸杞酸,其中峰5(枸杞酸)的峰形稳定、分离度良好,选择此峰为参照物峰(S峰);采用中药色谱指纹图谱相似度评价***2012A版,将PFG001、PFG002、PFG003三批俄色果配方颗粒样品的色谱图与对照特征图谱中的色谱峰进行匹配,建立俄色果(变叶海棠)配方颗粒的HPLC特征图谱,见图2~图3。注:对照特征图谱是采用“中药色谱特征图谱相似度评价***”(2012A版)对3批俄色果配方颗粒特征图谱进行分析,选择重复性、分离度较好的8个色谱法作为共有峰,以保留时间适中、出峰稳定的5号峰(枸杞酸)为参照(S),再采用多点校正方式,通过平均数法生成对照特征图谱。
5、相似度分析
采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件,对3批俄色果配方颗粒样品色谱图进行相似度分析,并计算相对保留时间和相对峰面积,最终确定8个共有峰的相对保留时间。并对饮片、标准汤剂、配方颗粒三者之间进行关联分析,结果见表10~表12,图4。
表10 3批俄色果配方颗粒特征图谱相对保留时间
表11 3批俄色果配方颗粒特征图谱相对峰面积
表12不同样品相似度评价结果
由上面的结果可知,3批俄色果(变叶海棠)配方颗粒HPLC特征图谱的相似度均在0.900以上,表明配方颗粒制备工艺稳定。以枸杞酸参照物峰相对应的峰为S峰,其余各峰与S峰的相对保留时间为0.343(峰1)、0.413(峰2)、0.534(峰3)、1.173(峰6)、1.487(峰7)、1.800(峰8),各个峰的相对保留时间应在规定值的±10%范围之内。采用特征图谱对配方颗粒原料、标准汤剂以及配方颗粒样品进行相似度分析,结果表明三者具有相同的特征峰,且相似度在0.95以上,质量传递稳定、此配方颗粒制备方法合适。
Claims (8)
1.一种俄色果及其制剂的HPLC特征图谱检测方法,其特征在于:它包括如下步骤:
1)对照品溶液的制备:取枸杞酸和L-苹果酸对照品,加水溶解,即得对照品溶液;
2)供试品溶液制备:取待检样品,加水提取,提取液过滤,取滤液,即得供试品溶液;
3)分别吸取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪,记录色谱图;色谱条件如下:
色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;流动相:以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B;梯度洗脱程序0~18 min,1%→3%A;18~18.5 min,3%→4 %A;18.5~25min,4%→7%A;25~30min,7%→15%A;30~35min,15%→31%A。
2.根据权利要求1所述的HPLC特征图谱检测方法,其特征在于:步骤1)所述对照品溶液每1ml含枸杞酸0.1~0.5 mg、L-苹果酸0.1~1mg;所述水为蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的HPLC特征图谱检测方法,其特征在于:步骤2)所述待检样品与水的质量体积比为0.5~1g:5~50ml。
4.根据权利要求1或3所述的HPLC特征图谱检测方法,其特征在于:所述待检样品为俄色果药材、俄色果标准汤剂或俄色果配方颗粒。
5.根据权利要求1所述的HPLC特征图谱检测方法,其特征在于:步骤2)所述提取为超声提取,功率500W,频率40kHz,时间30~60min。
6.根据权利要求1所述的HPLC特征图谱检测方法,其特征在于:步骤3)所述色谱条件中色谱柱为:SunFire C18柱、Inertsil ODS-3 C18柱或Kromasil C18柱,柱长250mm,内径4.6mm,粒径5µm,柱温25~35℃,进样量5~25μL,流速为0.2 ~0.7mL∙min-1,检测波长200~220nm。
7.根据权利要求6所述的HPLC特征图谱检测方法,其特征在于:步骤3)所述色谱条件中柱温30℃,进样量10 μL,流速为0.5mL∙min-1,检测波长210nm。
8.根据权利要求1所述的HPLC特征图谱检测方法,其特征在于:所述供试品溶液的色谱图中应呈现8个特征峰,其中2个峰应分别与相应对照品参照物峰的保留时间相对应,与枸杞酸参照物峰相应的峰为S峰,计算其余各峰与S峰的相对保留时间,其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内,规定值为:峰1:0.343、峰2:0.413、峰3:0.534、峰6:1.173、峰7:1.487、峰8:1.800。
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