CN113759011B - 一种银柴胡及其制剂特征图谱的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种银柴胡及其制剂特征图谱的建立方法。该方法采用高效液相色谱法建立的银柴胡及其制剂的特征图谱，适用于银柴胡药材、银柴胡饮片、银柴胡标准汤剂冻干粉及银柴胡配方颗粒。本发明通过控制洗脱梯度程序，尤其是在9.0‑10.5min和10.5‑13.5min，可以保证特征图谱上的特征峰的峰形和分离度均较好，有助于对银柴胡配方颗粒的质量进行控制。本发明通过控制洗脱梯度程序，在保证特征图谱质量的同时，还能大幅降低洗脱时间，提高了分析的速度，节约了试剂。

Description

一种银柴胡及其制剂特征图谱的建立方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种银柴胡及其制剂特征图谱的建立方法。
背景技术
银柴胡为石竹科植物银柴胡Stellaria dichotoma L.var.lanceolata Bge.的干燥根，味甘、微寒，归肝、胃经，具有清虚热、除疳热之功效，用于阴虚发热，骨蒸痨热，小儿疳热等症，是著名中成药乌鸡白凤丸等的主药之一。
目前，银柴胡应用的形式主要有银柴胡药材、银柴胡饮片、银柴胡标准汤剂冻干粉、银柴胡配方颗粒以及部分含有银柴胡的复方药。银柴胡标准汤剂冻干粉是由银柴胡饮片按照传统汤剂煎煮要求制备的汤液，减压浓缩后进行冷冻干燥得到的冻干粉，其成分与标准汤剂保持一致；中药配方颗粒是以传统中药饮片为原料，经过提取、浓缩、干燥、制粒等生产工艺，制成一定规格，供医疗机构临床配方使用的一种新型用药。它是以中药标准汤剂为基础，需在中医理论指导下使用。与传统中药汤剂相比，具有免煎易服、易储存、携带方便、质量可控等优点。
2015版《中国药典》收载了银柴胡药材及饮片的质量标准，但无指标成分及特征图谱检测项。市面上也没有标准的银柴胡对照药材，这增加了银柴胡的质量控制难度。而银柴胡配方颗粒更是缺乏统一的质量标准，且研究报导较少。
现有技术中公开了银柴胡配方颗粒的紫外分光光度法和薄层色谱法两种鉴别方法，但是不足以全面控制银柴胡配方颗粒的质量。而特征图谱是近年来广泛用于中药质量评价的有效方法之一，采用综合的、可量化的鉴别模式，可以对中药材及其制剂的真实性和质量的一致性及稳定性进行有效控制。刘训红等人公开的《银柴胡高效液相色谱特征图谱的初步研究》中公开了采用高效液相色谱法建立银柴胡的特征图谱，但是该研究中供试品溶液的制备步骤繁琐，加入甲醇索氏提取时间为24h，并用***萃取10次，提取时间较长，又采用有毒试剂，且该方法提取的成分极性较小，该研究中的供试品溶液制备方法和色谱检测条件不适合检测经水煎煮提取后的银柴胡制剂。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中没有银柴胡配方颗粒等银柴胡水提制剂的液相特征图谱的建立方法等缺陷，从而提供了一种银柴胡及其制剂特征图谱的建立方法。
为此，本发明提供了以下技术方案。
本发明提供了一种银柴胡及其制剂特征图谱的建立方法，包括获得银柴胡及其制剂的特征图谱，所述特征图谱包括4个共有特征峰，分别是：1号峰，2号峰，3号峰，4号峰；以1号共有特征峰银柴胡胺B为参照峰，其余特征峰的相对保留时间在规定值的±10％内，所述特征峰的相对保留时间的规定值分别为：
2号峰的相对保留时间为1.24；
3号峰的相对保留时间为1.28；
4号峰的相对保留时间为2.02。
所述建立方法，包括以下步骤，
供试品溶液的制备：取银柴胡待测样品制成供试品溶液；
色谱条件：照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以乙酸为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱的程序包括：0-1.5min，流动相A：流动相B为0.7-1.5％：99.3-98.5％；1.5-3.5min，流动相A：流动相B为1.5-5.0％：98.5-95.0％；3.5-4.0min，流动相A：流动相B为5.0-10.0％：95.0-90.0％；4.0-9.0min，流动相A：流动相B为10.0-13.5％：90.0-86.5％；9.0-10.5min，流动相A：流动相B为13.5-12.0％：86.5-88.0％；10.5-13.5min，流动相A：流动相B为12.0-26.0％：88.0-74.0％；13.5-18.5min，流动相A：流动相B为26.0-43.0％：74.0-57.0％；检测波长为250-290nm；流速0.2-0.7ml/min；
测定：吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，测定，即得。
所述色谱条件：照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，检测波长为260-280nm；流速0.3-0.5ml/min；柱温29-31℃；以乙腈为流动相A，以体积分数0.01-0.1％乙酸为流动相B，梯度洗脱。
所述供试品溶液的制备具体步骤包括，
取银柴胡待测样品，研细，精密称定，加水提取10-30min，滤过，取续滤液，即得。
所述供试品溶液的浓度为40-75mg/ml。
所述提取的方法为超声提取法或回流提取法。
所述银柴胡待测样品为银柴胡药材、银柴胡饮片、银柴胡标准汤剂冻干粉或银柴胡配方颗粒。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明提供的银柴胡及其制剂特征图谱的建立方法，该方法采用高效液相色谱法建立的银柴胡及其制剂的特征图谱适用于配方颗粒等银柴胡水提制剂特征图谱的建立；该方法该特征图谱以银柴胡胺B为参照峰，得到的特征图谱可以对银柴胡药材、银柴胡饮片、银柴胡标准汤剂冻干粉及银柴胡配方颗粒进行多成分、整体的质量控制，且该方法经方法学实验验证，准确度高、重复性好。
本发明通过控制洗脱梯度程序，尤其是在9.0-10.5min和10.5-13.5min，可以保证特征图谱上的特征峰的峰形和分离度均较好，有助于对银柴胡及其制剂的质量进行控制。本发明通过控制洗脱梯度程序，在保证特征图谱质量的同时，还能大幅降低洗脱时间，提高了分析的速度，节约了试剂。
该方法是以标准汤剂物质基础为衡量标准建立的，保证了银柴胡水提制剂与标准汤剂的一致性，质量控制更加客观、准确。
2.本发明提供的银柴胡及其制剂特征图谱的建立方法，该方法中供试品溶液的制备方法简单、快速，以水为溶剂，避免了有毒试剂的使用，提高了特征图谱建立过程中安全性和环保性。该方法整体分析时间控制在1h内，大幅度缩短了分析时间，提高了工作效率，节约了人力、物力成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1中18个批次银柴胡标准汤剂冻干粉的特征图谱；
图2是本发明实施例1中18个批次银柴胡标准汤剂冻干粉生成的对照特征图谱；
图3是本发明实验例5中的供试品溶液的3D全扫描图；
图4是本发明实验例6中实验组1供试品溶液的特征图谱；
图5是本发明实验例6中对照组1供试品溶液的特征图谱；
图6是本发明实验例7中实验组1供试品溶液的特征图谱；
图7是本发明实验例7中对照组1供试品溶液的特征图谱；
图8是本发明实验例7中对照组2供试品溶液的特征图谱；
图9是本发明实验例8中对照组1供试品溶液的特征图谱；
图10是本发明实验例8中对照组2供试品溶液的特征图谱；
图11是本发明实验例9中供试品溶液的特征图谱；
图12是本发明实验例10中银柴胡待测样品的特征图谱。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
本发明试药及仪器：
试药：
银柴胡标准汤剂冻干粉的制备方法包括：银柴胡饮片置于砂锅中，浸泡30min，煎煮两次，一煎加入饮片量9倍水，武火煮沸后，文火煎煮20min，趁热过滤，迅速冷却，备用；二煎加饮片量7倍水，武火煮沸后，文火煎煮15min，趁热过滤，合并滤液，浓缩，冷冻干燥后，即得；本发明用到了18批的银柴胡标准汤剂冻干粉，分别记为S1-S1，18批冻干粉的区别仅在于银柴胡饮片的产地不同，18批银柴胡饮标准汤剂冻干粉对应的饮片的产地如下：
170122-748411-01 产地：甘肃省岷县十里镇；
170122-748103-02 产地：甘肃陇西县马河镇；
170122-748106-03 产地：甘肃省陇西县双泉乡礼羊口村；
170327-743000-04 产地：甘肃省定西市；
170327-748100-05 产地：甘肃省定西市陇西县；
170327-756000-06 产地：宁夏回族自治区固原市；
170327-741000-07 产地：甘肃省天水市；
170406-756300-08 产地：宁夏回族自治区固原市隆德县神林乡；
170406-756500-09 产地：宁夏回族自治区固原市彭阳县城阳乡时沟圈村；
170406-756500-10 产地：宁夏回族自治区固原市彭阳县城阳乡时家沟村；
170421-751300-11 产地：宁夏回族自治区吴忠市同心县；
170421-751300-12 产地：宁夏回族自治区吴忠市同心县；
170421-751300-13 产地：宁夏回族自治区吴忠市同心县；
170525-753204-14 产地：宁夏石嘴山市西永固乡；
170525-753400-15 产地：宁夏平罗县六中乡；
170525-750200-16 产地：宁夏贺兰县通贵乡；
170525-750200-17 产地：宁夏贺兰县金贵镇；
170525-753400-18 产地：宁夏平罗县渠口乡。
银柴胡配方颗粒的制备方法包括：取银柴胡饮片(产地为甘肃省岷县十里镇)，加水12倍，煎煮1.5h，滤过，滤液备用；二煎加水10倍，煎煮1h，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩成浸膏，干燥，加糊精，制成颗粒，包装即得。本发明用于制备银柴胡配方颗粒的饮片的批号为170122-748411-01，由北京康仁堂药业生产得到。
试剂：
甲酸(国药集团化学试剂有限公司)，色谱纯；
磷酸(国药集团化学试剂有限公司)，色谱纯；
乙腈(默克公司)，色谱纯；
甲醇(国药集团化学试剂有限公司)，分析纯；
乙醇(国药集团化学试剂有限公司)，分析纯；
乙酸(国药集团化学试剂有限公司)，分析纯；
水为蒸馏水(屈臣氏)。
仪器：
ACQUITY
Figure BDA0002651707860000071
H-Class超高效液相色谱仪，PDA Detector检测器，TUVDetector检测器，Empower 3色谱工作站；
ME104E电子天平(梅特勒-托利多)；
KQ-300DB超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
实施例1
本实施例提供了一种银柴胡及其制剂特征图谱的建立方法，包括以下步骤，
供试品溶液的制备：取银柴胡待测样品，研细，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20ml，密塞，超声处理20min，超声功率为250W，频率40kHz，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得，供试品溶液的浓度为50mg/ml。
色谱条件：照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，ACQUITY UPLCHSS T3(柱长为7.5cm，柱内径为2.1mm，粒径为1.8μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积分数0.05％乙酸为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱的程序包括：0-1.5min，流动相A：流动相B为0.7-1.5％：99.3-98.5％；1.5-3.5min，流动相A：流动相B为1.5-5.0％：98.5-95％；3.5-4.0min，流动相A：流动相B为5.0-10.0％：95.0-90.0％；4.0-9.0min，流动相A：流动相B为10.0-13.5％：90.0-86.5％；9.0-10.5min，流动相A：流动相B为13.5-12.0％：86.5-88.0％；10.5-13.5min，流动相A：流动相B为12.0-26.0％：88.0-74.0％；13.5-18.5min，流动相A：流动相B为26.0-43.0％：74.0-57.0％；检测波长为270nm；流速0.4ml/min；柱温为30℃。
测定：吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，注入量为2μL，测定，即得。
特征峰的确认
分别取18批银柴胡标准汤剂冻干粉，按照上述“供试品溶液的制备”项下制备得到18批银柴胡标准汤剂冻干粉的供试品溶液，然后按照上述“色谱条件”和“测定”项下得到各个批次供试品溶液的特征图谱，见图1；选择4个重复性较好的峰作为共有峰，分别是1号共有特征峰，2号共有特征峰，3号共有特征峰，4号共有特征峰，以1号峰为参照峰(S峰)，计算其它特征峰的相对保留时间和相对峰面积，见表1和表2。从表1、表2可知，各个特征峰相对保留时间差异较小，均在±10％范围内，符合质量控制要求，选择相对保留时间的平均值作为测定值；测定值为：1(峰1S)、1.24(峰2)、1.28(峰3)、2.02(峰4)，允许误差：±10％。而相对峰面积的差异较大，其RSD值为8.8％-26.0％，不符合质量控制要求，因此对相对峰面积不做规定。
银柴胡及其制剂的特征图谱包括4个共有特征峰，以1号峰为参照物峰(S峰)，其它特征峰的相对保留时间在规定值的±10％内，分别为：
2号峰的相对保留时间为1.24；
3号峰的相对保留时间为1.28；
4号峰的相对保留时间为2.02。
表1 18批银柴胡标准汤剂冻干粉特征峰保留时间及相对保留时间
Figure BDA0002651707860000091
表2 18批银柴胡标准汤剂冻干粉特征峰的峰面积及相对峰面积
Figure BDA0002651707860000101
使用《中药色谱指纹图谱相似度评价***》(2012.1版本)生成银柴胡标准汤剂冻干粉对照特征图谱，对照特征图谱见图2，相似度结果见表3，图1中的R为对照特征图谱，便于与18批次银柴胡标准汤剂冻干粉的图谱进行比较。
表3相似度计算结果
编号 批号 与对照图谱相似度
1 170122-748411-01 1.000
2 170122-748103-02 1.000
3 170122-748106-03 1.000
4 170327-743000-04 0.996
5 170327-748100-05 0.989
6 170327-756000-06 0.998
7 170327-741000-07 1.000
8 170406-756300-08 0.966
9 170406-756500-09 0.961
10 170406-756500-10 1.000
11 170421-751300-11 1.000
12 170421-751300-12 0.998
13 170421-751300-13 1.000
14 170525-753204-14 1.000
15 170525-753400-15 0.984
16 170525-750200-16 1.000
17 170525-750200-17 0.991
18 170525-753400-18 0.989
- R 1.000
表3可以看出，18批银柴胡标准汤剂冻干粉特征图谱与对照特征图谱的相似度为0.961-1，均高于0.95，表明各个批次银柴胡标准汤剂冻干粉特征图谱的差异较小。
特征峰的指认
取银柴胡标准汤剂冻干粉(批号为S1)，按照上述“供试品溶液的制备”项下制备得到供试品溶液，然后按照上述“色谱条件”，利用高效液相串联高分辨飞行时间质谱仪获得其质谱图，对4个特征峰进行结构测定，各个特征峰的分子式见表4。
表4质谱成分推测结果
Figure BDA0002651707860000111
Figure BDA0002651707860000121
实验例1供试品溶液的制备中提取溶剂的考察
取同一批次的银柴胡标准汤剂冻干粉(批号为S1)，共3份。
实验组1中供试品溶液的制备方法包括，取银柴胡标准汤剂冻干粉，研细，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20ml，密塞，超声处理20min，超声功率为250W，频率40kHz，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；然后按照实施例1“色谱条件”和“测定”项下得到供试品溶液的特征图谱。
对照组1与实验组1的区别仅在于，用甲醇作为提取溶剂，代替实验组1中的水。
对照组2与实验组1的区别仅在于，用乙醇作为提取溶剂，代替实验组1中的水。
实验组1、对照组1和对照组2得到的特征图谱中特征峰的峰面积见表5。
表5实验组和对照组特征图谱的特征峰的峰面积
示例 1号峰峰面积 2号峰峰面积 3号峰峰面积 4号峰峰面积
对照组1 1523707 123707 106908 214198
对照组2 457239 36286 9464 48767
实验组1 2878412 212192 199248 346088
RSD(％) 74.9 70.9 90.2 73.4
表5，不同提取溶剂获得的特征图谱所呈现的物质信息基本相同，由各个特征峰峰面积的RSD可知，特征峰受溶剂的影响差异较大，其中，水作为溶剂得到的特征峰的峰面积较高，且水无毒，按照样品制备毒性最低的原则，选用水作为供试品溶液的制备提取溶剂。
实验例2供试品溶液的制备中提取方法的考察
取同一批次的银柴胡标准汤剂冻干粉(批号为S1)，共2份。
实验组1中供试品溶液的制备方法包括，取银柴胡标准汤剂冻干粉，研细，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20ml，密塞，超声处理30min，超声功率为250W，频率40kHz，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；然后按照实施例1“色谱条件”和“测定”项下得到供试品溶液的特征图谱。
对照组1中供试品溶液的制备方法包括，取银柴胡标准汤剂冻干粉，研细，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20ml，密塞，加热回流提取30min，，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得；然后按照实施例1“色谱条件”和“测定”项下得到供试品溶液的特征图谱。
实验组1和对照组1的特征图谱的峰面积见表6。
表6实验组1和对照组1特征图谱的特征峰的峰面积
示例 1号峰峰面积 2号峰峰面积 3号峰峰面积 4号峰峰面积
对照组1 2841589 187760 187708 349746
实验组1 2891265 193657 200348 346474
RSD(％) 1.2 2.2 4.6 0.7
表6，说明两种提取方法得到的特征图谱中的3号峰的峰面积RSD差异较大，超声提取得到的特征图谱的3号峰的峰面积高于回流方法，其它特征峰的峰面积RSD差异较小，考虑实验操作的方便性，选择超声作为提取方法。
实验例3供试品溶液的浓度的考察
取同一批次的银柴胡标准汤剂冻干粉(批号为S1)，共6份。实验组1按照实施例1中“供试品溶液的制备”项下的方法制备得到供试品溶液，然后按照实施例1中的“色谱条件”项的条件和“测定”项的方法建立特征图谱。
对照组1与实验组1的区别仅在于供试品溶液的浓度不同，对照组1的供试品溶液的浓度为10mg/ml。
对照组2与实验组1的区别仅在于供试品溶液的浓度不同，对照组2的供试品溶液的浓度为25mg/ml。
对照组3与实验组1的区别仅在于供试品溶液的浓度不同，对照组3的供试品溶液的浓度为35mg/ml。
对照组4与实验组的区别仅在于供试品溶液的浓度不同，对照组4的供试品溶液的浓度为75mg/ml。
对照组5与实验组的区别仅在于供试品溶液的浓度不同，对照组5的供试品溶液的浓度为100mg/ml。
实验组1、对照组1-5得到的特征图谱的峰面积见表7，由于特征峰中的1号峰的峰面积较高，对各个浓度的供试品溶液的1号峰的高度进行比较，结果见表8。
表7供试品溶液浓度的考察
Figure BDA0002651707860000141
表8特征图谱中的1号峰高度的比较表
Figure BDA0002651707860000142
Figure BDA0002651707860000151
根据超高效液相谱图峰高范围应在0.5-1.0AU的原则，最佳高度为0.5AU，因此供试品溶液浓度为50mg/ml为最佳浓度。
实验例4提取时间的考察
取同一批次的银柴胡标准汤剂冻干粉(批号为S1)，共3份，实验组1按照实施例中“供试品溶液的制备”项下的方法制备得到供试品溶液，然后按照实施例1中的“色谱条件”项的条件和“测定”项的方法建立特征图谱。
对照组1与实验组1的区别仅在于超声提取时间不同，对照组1在制备供试品溶液时，超声提取时间为30min。
对照组2与实验组1的区别仅在于超声提取时间不同，对照组2在制备供试品溶液时，超声提取时间为50min。
实验组1、对照组1和对照组2的特征图谱的峰面积见表9。
表9提取时间考察表
Figure BDA0002651707860000152
表9结果显示，提取时间对峰面积的影响较小，以节省时间为原则，本发明的提取时间确定为20min。
实验例5检测波长的考察
取银柴胡标准汤剂冻干粉(批号S1)，按照实施例1“供试品溶液的制备”项下制备得到供试品溶液，然后对供试品溶液进行3D全扫描，见图3，结果显示，270nm左右的峰较丰富，且峰形较好，优于其他波长，故选用270nm作为检测波长。
实验例6色谱柱的考察
取同一批次的银柴胡标准汤剂冻干粉(批号为S1)，共2份，按照实施例1“供试品溶液的制备”项下制备得到供试品溶液。
实验组1的色谱条件：照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，ACQUITY UPLC HSS T3(柱长为7.5cm，柱内径为2.1mm，粒径为1.8μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积分数0.05％乙酸为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱的程序包括：0-4min，流动相A：流动相B为2％：98％；4-19min，流动相A：流动相B为2-19％：98-81％；19-21min，流动相A：流动相B为19-30％：81-70％；21-25min，流动相A：流动相B为30-46％：70-54％；25-30min，流动相A：流动相B为46-75％：54-25％；检测波长为270nm；流速0.4ml/min；柱温为30℃，然后吸取供试品溶液注入超高效色相色谱仪，注入量为2μL，测定，得到特征图谱。
对照组1与实验组1的区别仅在于，对照组1采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(柱长为10cm，柱内径为2.1mm，粒径为1.7μm)。
实验组1和对照组1的特征图谱分别见图4和图5，结果表明，ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱可耐受100％水相，利于洗脱梯度的梯度调整，因此选用该色谱柱。
实验例7流动相的考察
取同一批次的银柴胡标准汤剂冻干粉(批号为S1)，按照实施例1“供试品溶液的制备”项下制备得到供试品溶液，共3份。
实验组1按照实施例1“色谱条件”和“测定”项下得到供试品溶液的特征图谱。
对照组1与实验组1的区别仅在于，对照组1以体积分数0.05％甲酸作为流动相B。
对照组2与实验组1的区别仅在于，对照组2以体积分数0.05％磷酸作为流动相B。
实验组1、对照组1和对照组2的特征图谱见图6-8，结果表明，0.05％乙酸作为流动相B，得到的特征图谱的色谱峰峰形最为对称，分离度最好，明显优于0.05％甲酸和0.05％磷酸，因此，选择0.05％乙酸作为流动相B。
实验例8洗脱梯度的考察
取同一批次的银柴胡标准汤剂冻干粉(批号为S1)，共3份，按照实施例1“供试品溶液的制备”项下制备得到供试品溶液。
实验组1按照实施例1“色谱条件”和“测定”项下得到供试品溶液的特征图谱。
对照组1的色谱条件：照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，ACQUITY UPLCHSS T3(柱长为7.5cm，柱内径为2.1mm，粒径为1.8μm)色谱柱；以乙腈为流动相A，以体积分数0.01-0.1％乙酸为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱的程序包括：0-4min，流动相A：流动相B为0％：100％；4-22min，流动相A：流动相B为0-15％：100-85％；22-24min，流动相A：流动相B为15-30％：85-70％；24-28min，流动相A：流动相B为30-43％：70-57％；28-35min，流动相A：流动相B为43-75％：57-25％；检测波长为270nm；流速0.4ml/min；柱温为30℃；然后按照“测定”项下得到供试品溶液的特征图谱。
对照组2的色谱条件：照高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以乙酸为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱的程序包括：0-4min，流动相A：流动相B为0％：100％；4-6.5min，流动相A：流动相B为0-1.5％：100-98.5％；6.5-7.0min，流动相A：流动相B为1.5-4.0％：98.5-96％；7.0-8.0min，流动相A：流动相B为4.0-5.0％：96.0-95.0％；8.0-8.5min，流动相A：流动相B为5.0-10.0％：95.0-90.0％；8.5-14.0min，流动相A：流动相B为10.0-14.0％：90.0-86.0％；14.0-16.0min，流动相A：流动相B为14.0-30.0％：86.0-70.0％；16.0-20.0min，流动相A：流动相B为30.0-43.0％：70.0-57.0％；检测波长为270nm；流速0.4ml/min；柱温为30℃；然后按照“测定”项下得到供试品溶液的特征图谱。
实验组1的特征图谱同图6，对照组1的特征图谱见图9，对照组2的特征图谱见图10。
结果表明，对照组1中洗脱梯度得到的特征图谱在20-28min间的峰形分离度较差，且基线的波动较大。对照组2在0-9min的峰较少，且14.5-19min间的峰形分离度较差，实验组1得到的特征图谱的峰形和分离度均较好，因此，选用实验组1中的梯度洗脱程序。
实验例9延迟性的考察
取柴胡标准汤剂冻干粉(批号为S1)供试品溶液，按照实施例1“供试品溶液的制备”项下制备得到供试品溶液，然后按照实施例1“色谱条件”进样，记录2倍梯度洗脱时间的特征图谱，见图11。
结果表明：在18.5min后无明显的滞后峰出现，此色谱方法符合分析要求。
实验例10银柴胡待测样品的考察
实验组1：取银柴胡药材待测样品，研细，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20ml，密塞，超声处理20min，超声功率为250W，频率40kHz，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得，供试品溶液的浓度为50mg/ml。
实验组2：取银柴胡饮片待测样品，研细，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20ml，密塞，超声处理20min，超声功率为250W，频率40kHz，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得，供试品溶液的浓度为50mg/ml。
实验组3：取银柴胡配方颗粒待测样品，研细，取1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水20ml，密塞，超声处理20min，超声功率为250W，频率40kHz，取出，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得，供试品溶液的浓度为50mg/ml。
实验组1-3制得的供试品溶液按照实施例1“色谱条件”进样，注入量为2μL，测定，得到特征图谱，见图12，相对保留时间见表10。
表10银柴胡药材、饮片、颗粒相对保留时间表
名称 峰1(S峰) 峰2 峰3 峰4
银柴胡药材170122-748411-01 1 1.245 1.278 2.020
银柴胡饮片170122-748411-01 1 1.245 1.276 2.020
银柴胡颗粒170122-748411-01 1 1.245 1.276 2.022
标准 1 1.24 1.28 2.02
从图12和表10中可知，银柴胡药材、银柴胡饮片和银柴胡配方颗粒的相对保留时间在规定值的±10％内，符合要求，说明本发明提供的银柴胡及其制剂特征图谱的建立方法适用于银柴胡药材、银柴胡饮片、银柴胡标准汤剂冻干粉和银柴胡配方颗粒。
实施例2
本实施例提供了实施例1中的银柴胡及其制剂特征图谱的建立方法的方法学考察。
(1)精密度考察
重复性考察
取同一批次的银柴胡标准汤剂冻干粉(批号：S1)，共6份，按照实施例1“供试品溶液的制备”项下制备得到供试品溶液，然后按照实施例1“色谱条件”和“测定”项下得到供试品溶液的特征图谱，以1号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD，结果见表11和表12。
表11特征峰的相对保留时间
Figure BDA0002651707860000201
表12特征峰的相对峰面积
Figure BDA0002651707860000202
从表11和表12的结果来看，各个特征峰的相对保留时间RSD在0.1％-0.2％范围内，相对峰面积RSD在0.7％-1.9％范围内，表明该特征图谱的重复性较好。
中间精密度考察
取同一批次的银柴胡标准汤剂冻干粉(批号为S1)，共6份，按照实施例1“供试品溶液的制备”项下制备得到供试品溶液，然后按照实施例1“色谱条件”，采用Waters UPLC H-Class，TUV检测器下得到供试品溶液的特征图谱，以1号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD，结果见表13和表14。
表13特征峰的相对保留时间
Figure BDA0002651707860000211
表14特征峰的相对峰面积
Figure BDA0002651707860000212
Figure BDA0002651707860000221
采用Waters UPLC H-Class，TUV检测器获得的特征图谱中，4个特征峰的相对保留时间RSD在0.1％-0.2％范围内，相对峰面积RSD在0.8％-3.4％范围内。不同仪器间相对保留时间RSD范围0.6-2.4％，相对峰面积范围3.2-4.2％，说明不同仪器间只考察相对保留时间，符合分析要求。
(2)稳定性考察
取同一批次的银柴胡标准汤剂冻干粉(批号为S1)，共8份，按照实施例1“供试品溶液的制备”项下制备得到供试品溶液，分别于室温条件下放置0、2、4、6、8、10、12、24h，然后按照实施例1“色谱条件”和“测定”项下得到供试品溶液的特征图谱，以1号峰为参照峰，计算其相对峰面积和相对保留时间，并计算RSD，结果见表15和表16。
表15特征峰的相对保留时间
Figure BDA0002651707860000222
表16特征峰的相对峰面积
Figure BDA0002651707860000223
Figure BDA0002651707860000231
表15和表16中的稳定性实验结果表可知，经过考察24小时溶液稳定性，4个特征峰的相对保留时间RSD在0.2％-0.5％范围内，相对峰面积的RSD在0.3％-1.6％范围内。本发明所采用的特征图谱分析方法稳定、可靠、重现性好。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (6)

1.一种银柴胡及其制剂特征图谱的建立方法，其特征在于，包括获得银柴胡及其制剂的特征图谱，所述特征图谱包括4个共有特征峰，分别是：1号峰，2号峰，3号峰，4号峰；以1号峰银柴胡胺B为参照峰，其余特征峰的相对保留时间在规定值的±10%内，所述特征峰的相对保留时间的规定值分别为：
2号峰的相对保留时间为1.24；
3号峰的相对保留时间为1.28；
4号峰的相对保留时间为2.02；
所述建立方法包括以下步骤，
供试品溶液的制备：取银柴胡待测样品制成供试品溶液，提取所述供试品溶液的溶剂为水；
色谱条件：照超高效液相色谱法，色谱柱ACQUITY UPLC HSS T3，柱长为7.5cm，柱内径为2.1mm，粒径为1.8μm；以乙腈为流动相A，以乙酸溶液为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱的程序包括：0-1.5min，流动相A：流动相B为0.7-1.5%：99.3-98.5%；1.5-3.5min，流动相A：流动相B为1.5-5.0%：98.5-95.0%；3.5-4.0min，流动相A：流动相B为5.0-10.0%：95.0-90.0%；4.0-9.0min，流动相A：流动相B为10.0-13.5%：90.0-86.5%；9.0-10.5min，流动相A：流动相B为13.5-12.0%：86.5-88.0%；10.5-13.5min，流动相A：流动相B为12.0-26.0%：88.0-74.0%；13.5-18.5min，流动相A：流动相B为26.0-43.0%：74.0-57.0%；检测波长为250-290nm；流速0.2-0.7ml/min；
测定：吸取供试品溶液，注入超高效液相色谱仪，测定，即得。
2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，所述色谱条件：照超高效液相色谱法，检测波长为260-280nm；流速0.3-0.5ml/min；柱温29-31℃；以乙腈为流动相A，以体积分数0.01-0.1%乙酸为流动相B，梯度洗脱。
3.根据权利要求1或2所述的建立方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备具体步骤包括，
取银柴胡待测样品，研细，精密称定，加水提取10-30min，滤过，取续滤液，即得。
4.根据权利要求1或2所述的建立方法，其特征在于，所述供试品溶液的浓度为40-75mg/ml。
5.根据权利要求3所述的建立方法，其特征在于，所述提取的方法为超声提取法或回流提取法。
6.根据权利要求1或2所述的建立方法，其特征在于，所述银柴胡待测样品为银柴胡药材、银柴胡饮片、银柴胡标准汤剂冻干粉或银柴胡配方颗粒。
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