CN115896133B - 一种谷氨酰激酶的表达调控序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供的具有表达调控活性的多核苷酸，核苷酸序列如序列SEQ ID NO：3‑5任一项所示，是表达调控活性显著提高的谷氨酸棒杆菌来源的表达调控元件的突变体。与野生型表达调控元件相比，突变体的表达调控活性显著提高，将其与目标基因可操作地连接，可以显著提高目标基因的表达强度，且不会破坏基因组的稳定性，使目标基因能够稳定高效表达，进而稳定、高效的生产下游产物。

Description

一种谷氨酰激酶的表达调控序列及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种具有表达调控活性的多核苷酸，包含具有表达调控活性的多核苷酸的转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞，以及增强目标基因表达的方法、制备氨基酸尤其是脯氨酸的方法。

背景技术

L-脯氨酸，是天然存在的一种人体的非必需氨基酸，在临床、生物材料和工业等方面有广泛的应用。目前，主要以微生物发酵法生产L-脯氨酸，由于谷氨酸棒杆菌的生理优越性，已成为工业中最重要的生产菌株。

在谷氨酸棒杆菌中，主要以谷氨酸为底物经过γ-谷氨酰激酶（Glutamate-5-kinase，ProB）、谷氨酸半醛脱氢酶（Glutamate-semialdehyde dehydrogenase，ProA）、吡咯啉-5-羧酸还原酶（Pyrroline-5-carboxylic acid reductase，ProC）催化后生产 L-脯氨酸。现有技术表明，ProB是提高L-脯氨酸产量的关键，如 CN101084312A 报道了谷氨酸棒杆菌来源的ProB蛋白的 149位突变可以解除 L-脯氨酸的反馈抑制，提高工程菌株 L-脯氨酸的产量。同时，发明人前期的工作也表明采用强启动子表达ProB也有助于L-脯氨酸产量的提高（Nat Commun. 2022 Feb 16;13(1):891.），然而，现有技术中，仍缺乏在谷氨酸棒杆菌中可以更加高效表达ProB的表达调控元件。

发明内容

针对现有技术中缺乏在谷氨酸棒杆菌中可以更加高效表达ProB的表达调控元件的问题，本发明通过对已知的表达调控元件进行改造，获得了能够在谷氨酸棒杆菌中更高效稳定表达ProB的表达元件，在此基础上完成本发明。本发明的发明内容如下：

第一方面，提供一种具有表达调控活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自如下（i）-（iv）中的任一项：

（i）包含如SEQ ID NO.3-5任一项所示的核苷酸序列；

（ii）包含如SEQ ID NO.3-5所示的核苷酸序列的反向互补序列；

（iii）在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与（i）或（ii）所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；

（iv）与（i）或（ii）所示的核苷酸序列具有至少90％，可选至少95％，优选至少97％，更优选至少98％，最优选至少99％的序列同一性；且最后五个核苷酸残基保持不变。

第二方面，提供一种转录表达盒，其中，包含第一方面所述的具有表达调控活性的多核苷酸；可选地，所述转录表达盒还含有蛋白编码基因，所述蛋白编码基因与所述具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接。

第三方面，提供一种重组表达载体，其中，包含第一方面所述的具有表达调控活性的多核苷酸，或第二方面所述的转录表达盒。所谓的表达盒就是包括启动子和下游基因的序列，启动子和基因之前可以是直接链接，也可以在增加一些间隔区序列，如SD序列等等，都是为了增强表达强度的。

第四方面，提供一种重组微生物宿主细胞，其中，包含第二方面所述的转录表达盒，或者第三方面所述的重组表达载体。

在本发明一个优选的实施方案中，所述的重组微生物宿主细胞来源于棒状杆菌属；优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌。

第五方面，提供第一方面所述的具有表达调控活性的多核苷酸、第二方面所述的转录表达盒、第三方面所述的重组表达载体，或者第四方面所述的重组宿主细胞在如下至少一种中的用途:

（i）制备用于增强基因转录水平的试剂或试剂盒；

（ii）制备蛋白，或制备用于制备蛋白的试剂或试剂盒；优选地，所述蛋白为氨基酸合成的相关酶；进一步优选地，所述蛋白为谷氨酰激酶ProB；更优选地，所述谷氨酰激酶ProB为解除了L-脯氨酸反馈抑制的谷氨酰激酶。

（iii）生产氨基酸；优选地，所述氨基酸为脯氨酸、羟脯氨酸。

第六方面，提供一种增强目标基因表达的方法，其中，所述方法包括将第一方面所述的具有表达调控活性的多核苷酸与目标基因可操作地连接的步骤。

第七方面，提供一种制备蛋白的方法，其中，选择第二方面所述的转录表达盒，第三方面所述的重组表达载体，或第四方面所述的重组宿主细胞表达所述蛋白；可选地，所述蛋白为谷氨酰激酶ProB。

第八方面，提供一种生产氨基酸的方法，其中，选择第一方面所述的多核苷酸，第二方面所述的转录表达盒，第三方面所述的重组表达载体，或第四方面所述的重组宿主细胞表达氨基酸合成的相关酶，在所述氨基酸合成的相关酶存在下生产所述氨基酸，任选地，该方法还包括分离或纯化氨基酸的步骤；

优选地，所述氨基酸为脯氨酸、羟脯氨酸，所述氨基酸合成的相关酶为谷氨酰激酶ProB。进一步优选地，所述谷氨酰激酶ProB为解除了L-脯氨酸反馈抑制的谷氨酰激酶。

本发明的有益效果：

本发明提供的具有表达调控活性的多核苷酸，核苷酸序列如序列SEQ ID NO：3-5任一项所示，是表达调控活性显著提高的谷氨酸棒杆菌来源的表达调控元件的突变体。与野生型表达调控元件相比，突变体的表达调控活性显著提高，将其与目标基因可操作地连接，可以显著提高目标基因的表达强度，且不会破坏基因组的稳定性，使目标基因能够稳定高效表达，进而稳定、高效的生产下游产物。

由此，本发明提供的生产氨基酸的方法，利用上述具有表达调控活性的多核苷酸，能够提高氨基酸合成的相关酶的表达，进而稳定、高效的生产氨基酸。当用于脯氨酸或反式-4-羟基-L-脯氨酸生产时，能够获得稳定高产的脯氨酸或反式-4-羟基-L-脯氨酸。

附图说明

图1.pEC-rfp-1质粒的质粒图谱。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

定义与说明：

本发明中的术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法（例如，使用克隆载体）识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列（即A、T、G、C）表示时，这也包括一个RNA序列（即A、U、G、C），其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸（单独的片段或整个片段）中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。

本发明中的术语“突变”是指在多核苷酸的一个或多个（例如，若干个）位置处包含突变的核苷酸，并且保持多核苷酸的启动子活性。其中，本发明中的突变（包含，取代、***和/或缺失）特指其中的取代，取代是指用不同的核苷酸置换占用一个位置的核苷酸。缺失是指去除占据某一位置的核苷酸。***是指在邻接并且紧随占据位置的核苷酸之后添加核苷酸。

本发明中的术语“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸***或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸***或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。

本发明的术语“互补的”是指在核苷酸或核苷酸之间的杂交或碱基配对，例如双链DNA分子的两条链之间或者寡核苷酸引物与被测序或扩增的单链核苷酸上的引物结合位点之间等。

本发明的术语“高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE（saline sodium phosphate EDTA）、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

本发明的术语“非常高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE（saline sodium phosphate EDTA）、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

本发明中的术语“启动子”是指一种核酸分子，通常位于目的基因编码序列的上游，为RNA聚合酶提供识别位点，并位于mRNA转录起始位点的 5’方向的上游。它是不被翻译的核酸序列，RNA聚合酶与这一核酸序列结合后启动目的基因的转录。在核糖核酸（RNA）的合成中，启动子可以和调控基因转录的转录因子产生相互作用，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，包含核心启动子区域和调控区域，就像“开关”，决定基因的活动，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。

本发明中的术语“RBS”是指核糖体结合位点（ribosomebinding site，简称RBS），是指mRNA的起始AUG上游约8~13核苷酸处，存在一段由4~9个核苷酸组成的共有序列-AGGAGG-，可被16SrRNA通过碱基互补精确识别的序列。

本发明中的术语“RBS间隔区”是指位于原核生物启动子区的一段核酸序列，是RBS与起始密码子之间的一段核苷酸序列。

本发明的术语“表达调控元件”具有本领域技术人员公知的定义，是指位于基因起始密码子上游的非编码区DNA序列，包括启动子、RBS以及起始密码子与RBS的间隔区等序列，能够启动下游基因的转录和表达。

本发明中的术语“表达”包括涉及RNA产生及蛋白产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

本发明中的术语“蛋白编码基因”是指能够通过一定的规则指导蛋白的合成DNA分子，蛋白编码基因指导蛋白合成的过程一般包括以双链DNA为模板的转录过程和以mRNA为模板的翻译过程。蛋白编码基因含有CDS序列（Coding Sequence），能够指导编码蛋白质的mRNA的产生。蛋白编码基因包括但不限于用于编码参与合成氨基酸的酶，在一些实施方案中，蛋白编码基因涉及用于编码参与合成L-脯氨酸、羟脯氨酸的酶。在一些实施方案中，蛋白编码基因涉及用于编码参与合成L-脯氨酸、羟脯氨酸及其衍生物的酶，如γ-谷氨酰激酶、谷氨酸半醛脱氢酶、吡咯啉-5-羧酸还原酶、脯氨酸4-羟化酶、脯氨酸3-羟化酶、脯氨酸转运蛋白等等。本发明的具有启动子活性的多核苷酸，可适于调控目标基因的表达，实现目标产物的高效生产。

本发明中的术语“转录表达盒”指的包含转录调控元件与目标基因，利用转录调控元件对目标基因的表达进行调控的一类表达元件。在本发明中，转录调控元件包含启动子，在此基础上，还可以包含增强子、沉默子、绝缘子等元件。在本发明中，目标基因具体为蛋白编码基因。目标基因与多核苷酸“可操作地连接”，是指将具有表达调控活性的多核苷酸与目标基因功能性连接，以启动和介导目标基因的转录，所述可操作地链接的方式可以采用本领域技术人员所述的任何方式。

本发明中的术语“目标基因”涉及与本发明中具有表达调控活性的多核苷酸连接，以对其转录水平进行调控的任一种的基因。

在一些实施方式中，目标基因是指编码微生物中目标蛋白质的基因。可选地，目标基因是编码与氨基酸的生物合成相关的酶的基因、编码与还原力相关的酶的基因，编码与糖酵解或TCA循环相关的酶的基因，或编码与目标化合物的释放相关的酶的基因等等。在一些具体的实施方式中，目标基因可以是γ-谷氨酰激酶的编码基因、谷氨酸半醛脱氢酶的编码基因、吡咯啉-5-羧酸还原酶的编码基因、脯氨酸4-羟化酶的编码基因、脯氨酸3-羟化酶的编码基因、脯氨酸转运蛋白的编码基因等等。

本发明中的术语“载体”指的是DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列，从而在合适的宿主中表达目的基因。“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括，例如包含i）对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii）转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii）适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要，并可以使用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本发明的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体，来自如牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。

本发明中的术语“氨基酸”或“L-氨基酸”通常是指其中氨基和羧基结合至相同碳原子的蛋白质的基本构成单元。例如，氨基酸选自如下的一种或多种：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、5-氨基乙酰丙酸或上述任一种的氨基酸的衍生物。此外，氨基酸也可以是本领域中其他种类的氨基酸。

本发明中的术语“微生物宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的转录起始元件或表达载体转化、转染、转导等的任何微生物细胞类型。术语“重组微生物宿主细胞”涵盖导入转录起始元件或重组表达载体后不同于亲本细胞的宿主细胞，重组宿主细胞具体通过转化来实现。

本发明中的术语“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO₄)沉淀法、氯化钙(CaCl₂)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。

在一个实施方案中，宿主细胞指适合发酵生产氨基酸的微生物，例如棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属或埃希氏菌属。作为优选地，宿主细胞是来源于埃希氏菌属的大肠杆菌或来源于棒状杆菌属的谷氨酸棒杆菌。

本发明的宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。

除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明所用的培养基如下：

TSB液体培养基成份为(g/L)：葡萄糖，5 g/L；酵母粉，5 g/L；大豆蛋白胨，9 g/L；尿素，3 g/L；丁二酸，0.5 g/L；K₂HPO₄·3H₂O，1 g/L；MgSO₄·7H₂O，0.1 g/L；生物素，0.01mg/L；维生素B1，0.1 mg/L ；MOPS，20 g/L。

TSB固体培养基为TSB液体培养基中补充15 g/L琼脂粉。

L-脯氨酸发酵培养基成份为：葡萄糖，80 g/L；酵母粉，1 g/L；大豆蛋白胨，1 g/L；NaCl，1 g/L；硫酸铵，1 g/L；尿素，10 g/L； K₂HPO₄·3H₂O，1 g/L；MgSO₄·7H₂O，0.45 g/L；FeSO₄·7H₂O，0.05 g/L；生物素，0.4 mg/L；维生素B1，0.1 mg/L ；MOPS，40 g/L，余量为水；pH7.2。

实施例1. 改造谷氨酸棒杆菌来源的谷氨酰激酶ProB的表达调控元件提高表达强度

首先，沿用发明人前期发表论文（Jiao Liu, et al. CRISPR-assisted rationalflux-tuning and arrayed CRISPRi screening of an L-proline exporter for L-proline hyperproduction. Nat Commun. 2022 Feb 16;13(1):891.）中的表征方法，采用基因的表达调控元件、基因N端的部分编码区、一个柔性linker和一个红色荧光蛋白基因rfp顺序连接的方法，基于荧光强度对ProB的表达调控序列进行表达强度表征。P _pyc -20启动子表达ProB的表征质粒pEC-rfp-1的图谱如图1所示，P _pyc -20启动子序列如SEQ ID NO.1所示，proB基因的起始密码子是ATG，pEC-rfp-1质粒序列如SEQ ID NO.2所示。

起始密码子与RBS间隔区碱基序列的改造可用于进一步增强表达强度。本发明对pEC-rfp-1质粒中的TTACTCTA（为SEQ ID NO：1的第366位至373位序列，是起始密码子与RBS间隔区的部分序列）进行改造，改造为序列“GT”、“TA”、“TT”，起始密码子仍为ATG，改造后获得的携带起始密码子的具有表达调控活性的多核苷酸序列分别如序列SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、和SEQ ID NO：5所示。具体构建如下：以pEC-rfp-1质粒为模板，以RBS1/ pEC-5、RBS2/ pEC-5、RBS3/ pEC-5为引物，分别扩增包括3种改造区的3个片段。以pEC-rfp-1质粒为模板，以pEC-6/7为引物，扩增质粒骨架。以上3个包括改造区的片段分别与质粒骨架片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，分别获得pEC-rfp-2、pEC-rfp-3和pEC-rfp-4表征载体。本实施例所用引物序列如表1所示。

表1

引物	核苷酸序列	SEQ ID NO：
			RBS-1	CGGTCTCTTGTTGAAAGGAATAAGTATGCGTGAGCGCATCTCCAAC	SEQ ID NO：7
RBS-2	CGGTCTCTTGTTGAAAGGAATAATAATGCGTGAGCGCATCTCCAAC	SEQ ID NO：8
			RBS-3	CGGTCTCTTGTTGAAAGGAATAATTATGCGTGAGCGCATCTCCAAC	SEQ ID NO：9
pEC-5	AACCTTCCATACGAACTTTGAAACG	SEQ ID NO：10
			pEC-6	CAAAGTTCGTATGGAAGGTTCCG	SEQ ID NO：11
pEC-7	TTCCTTTCAACAAGAGACCGCC	SEQ ID NO：12

为表征SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、和SEQ ID NO：5增强表达的强度，将对照质粒pEC-rfp-1和本实施例构建的pEC-rfp-2、pEC-rfp-3和pEC-rfp-4质粒分别转化至谷氨酸棒杆菌ATCC13032，获得ATCC13032（pEC-rfp-1）、ATCC13032（pEC-rfp-2）、ATCC13032（pEC-rfp-3）和ATCC13032（pEC-rfp-4）菌株，涂布TSB固体培养平板。将TSB平板获得的菌株用牙签接种至每孔含有200 μl TSB液体培养基的96孔板中，每个菌株3个平行，孔板摇床转速为800 rpm，30℃培养24 h后采用酶标仪检测菌株的荧光强度(激发波长：560 nm，发射波长：607 nm)。结果如表2所示，ATCC13032（pEC-rfp-2）、ATCC13032（pEC-rfp-3）和ATCC13032（pEC-rfp-4）菌株的荧光强度分别比对照提高了0.9倍、1.1倍、1.3倍，表明本发明的人工表达调控序列可以进一步增强ProB的表达。

表2

菌株	荧光强度（RFU/OD600）
		ATCC13032（pEC- rfp-1）	5653±276
ATCC13032（pEC- rfp-2）	10755±71
		ATCC13032（pEC- rfp-3）	11758±313
ATCC13032（pEC- rfp-4）	12875±592

实施例2. 改造后的表达调控序列应用于L-脯氨酸生产

（1）L-脯氨酸生产菌中整合改造后表达调控元件表达proB基因表达盒的重组菌株构建

在L-脯氨酸生产菌PRO-19菌株（CN114107141B）基础上，基因组水平整合SEQ IDNO：5所示人工表达调控元件表达proB ^V150N，同时基因下游添加rrnB转录终止子，以上表达盒所示序列如SEQ ID NO：6所示，采用pK18mobsacB编辑方法。

首先构建重组质粒。根据已报道的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列设计引物，以ATCC13032基因组为模板，以TY-UF /TY-UR为引物，PCR扩增整合位置的上游同源臂；以包含SEQ ID NO：6的质粒为模板，以proB-A/proB-B为引物，扩增SEQ ID NO：5表达调控元件、proB ^V150N和rrnB转录终止子的表达盒序列；以TY-DF /TY-DR为引物，以ATCC13032基因组为模板，PCR扩增另一部分下游同源臂；以pK18-1/2为引物扩增pK18mobsacB(GenBank:FJ437239.1)的骨架。上述4种PCR片段通过诺唯赞的一步重组试剂盒克隆连接，获得proB基因表达盒整合的重组质粒pK18-1。

将上述构建的重组质粒pK18-1转化谷氨酸棒杆菌L-脯氨酸生产菌PRO-19菌株，涂布含有25 μg/mL卡那霉素的TSB固体培养基上，30℃培养获得第一次重组的转化子。正确的一次重组转化子接种TSB液体培养基，培养3-6 h，分别稀释涂布添加100 g/L蔗糖的TSB固体培养基平板，通过抗性平板和无抗性平板同时点板培养对获得的克隆进行卡那霉素敏感性筛选。对卡那霉素敏感的克隆分别采用引物proB-C1和proB-C2进行PCR扩增及测序验证，测序正确的克隆即为整合SEQ ID NO：5所示的表达调控元件表达proB基因表达盒的重组菌株PRO-20。

以上所用引物序列如表3所示。

表3

引物	核苷酸序列	序列号
			TY-UF	CAGGAAACAGCTATGACATGCCAACCAGTTGGGATGTGTTCC	SEQ ID NO：13
TY-UR	CACAAAGCAATCCTGGGTTTTCAAGAAGCGACCTCTCAGAATCG	SEQ ID NO：14
			TY-DF	TAGATGACGTGCGGCTTCGACCCCGAGGTAGATTCCTGACTG	SEQ ID NO：15
TY-DR	GTAAAACGACGGCCAGTGCGACGCTGGTGGCAATTCAAC	SEQ ID NO：16
			proB-A	ATTCTGAGAGGTCGCTTCTTGAAAACCCAGGATTGCTTTGTGC	SEQ ID NO：17
proB-B	TCGAAGCCGCACGTCATCTAG	SEQ ID NO：18
			pK18-1	GCACTGGCCGTCGTTTTAC	SEQ ID NO：19
pK18-2	CATGTCATAGCTGTTTCCTGTGTG	SEQ ID NO：20
			proB-C1	GACGGGCATTGAGATCAATAGAAC	SEQ ID NO：21
proB-C2	AACGATGCTTCTCGACGACC	SEQ ID NO：22

（2）改造菌株的L-脯氨酸生产能力评价

采用24孔板评价菌株的L-脯氨酸产量：首先将PRO-20菌株和PRO-19对照菌株分别接种到TSB液体培养基中培养8 h，培养物作为种子接种到每孔含有800 μl发酵培养基的24孔板中，初始OD₆₀₀控制约为0.1，30℃培养18 h，孔板摇床转速为800 rpm，每个菌株3个平行，发酵结束后检测OD₆₀₀（酶标仪检测）和L-脯氨酸产量。

L-脯氨酸的检测方法：水配制的1 g/L的L-脯氨酸标准品（Sigma-Aldrich，P0380）或发酵液上清，用3%(W/V)磺基水杨酸稀释到合适浓度；取1 mL稀释液，加入1 mL酸合茚三酮(1.25 g茚三酮溶于30 mL冰醋酸和20 mL 6 M H₃PO₄中，70℃加热溶解)和1 mL冰醋酸，100℃沸水浴反应45 min；冷却后测定OD₅₂₀。采用0-100 mg/L浓度的L-脯氨酸标准品绘制标准曲线，根据标准曲线及稀释倍数计算样品的L-脯氨酸浓度。

结果如表4所示，整合SEQ ID NO：5所示的表达调控元件表达proB基因表达盒可以导致L-脯氨酸产量提高22%。由此可见，本发明获得的人工表达调控元件可显著提高ProB的表达强度，从而进一步提高L-脯氨酸的产量。

表4 PRO-20的L-脯氨酸产量评价

菌株	OD600	L-脯氨酸产量（g/L）
			PRO-19	10.83±0.47	15.89±0.05
PRO-20	11.18±0.37	19.35±0.36

由于L-脯氨酸下游产物的合成均依赖于谷氨酸激酶ProB催化的反应步骤，通过本发明公开的proB基因表达增强的方法也可以用于提高依赖ProB催化反应的下游产物的产量。因此，本发明提供的技术方案也可用于羟脯氨酸等的生产。

Claims (20)

1.一种具有表达调控活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自如下SEQ ID NO.3-5任一项所示的核苷酸序列。

2.一种转录表达盒，其特征在于，包含如权利要求1所述的具有表达调控活性的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的转录表达盒，其特征在于，所述转录表达盒还含有与所述具有表达调控活性的多核苷酸可操作地连接的蛋白编码基因。

4.一种重组表达载体，其特征在于，包含如权利要求1所述的具有表达调控活性的多核苷酸，或如权利要求2所述的转录表达盒。

5.一种重组微生物宿主细胞，其包含如权利要求2所述的转录表达盒，或者如权利要求4所述的重组表达载体。

6.如权利要求5所述的重组微生物宿主细胞，其特征在于，所述的重组微生物宿主细胞为棒状杆菌属。

7.如权利要求6所述的重组微生物宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌。

8.如权利要求1所述的具有表达调控活性的多核苷酸、如权利要求2或3所述的转录表达盒、如权利要求4所述的重组表达载体或者如权利要求5至7任一项所述的重组微生物宿主细胞在如下至少一种中的用途:

（i）制备用于调控基因转录的试剂或试剂盒；

（ii）制备蛋白，或制备用于制备蛋白的试剂或试剂盒；

（iii）生产氨基酸。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述蛋白为氨基酸合成的相关酶。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述蛋白为谷氨酰激酶ProB。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述谷氨酰激酶ProB为解除了L-脯氨酸反馈抑制的谷氨酰激酶。

12.如权利要求8所述的用途，其特征在于，第（ii）项中的所述蛋白为氨基酸合成的相关酶；第（iii）项中的所述氨基酸为脯氨酸、羟脯氨酸。

13.一种目标基因表达的方法，其中，所述方法包括将如权利要求1所述的具有表达调控活性的多核苷酸与目标基因可操作地连接的步骤。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述目标基因为谷氨酸酰激酶ProB的编码基因。

15.一种制备蛋白的方法，其特征在于，将含有如权利要求3所述的转录表达盒的重组微生物宿主细胞表达所述蛋白。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述蛋白为谷氨酰激酶ProB。

17.一种生产氨基酸的方法，其特征在于，将含有如权利要求3所述的转录表达盒重组微生物宿主细胞用于生产相关的氨基酸。

18.如权利要求17所述的生产氨基酸的方法，其特征在于，还包括分离或纯化氨基酸的步骤。

19.如权利要求17所述的生产氨基酸的方法，其特征在于，所述氨基酸为脯氨酸、羟脯氨酸，所述氨基酸合成的相关酶为谷氨酰激酶ProB。

20.如权利要求19所述的生产氨基酸的方法，其特征在于，所述谷氨酰激酶ProB为解除了L-脯氨酸反馈抑制的谷氨酰激酶。