CN113278620B

CN113278620B - 一种突变的高渗诱导型启动子PproP及其应用

Info

Publication number: CN113278620B
Application number: CN202110841507.XA
Authority: CN
Inventors: 郑平; 陈久洲; 黄婧文; 孙际宾; 周文娟; 石拓; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2021-07-26
Filing date: 2021-07-26
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2041-07-26
Also published as: CN113278620A

Abstract

本发明提供了具有启动子活性的多核苷酸突变体，其在盐浓度、渗透压升高的环境下具有比野生型启动子增强的启动活性。多核苷酸与目标基因可操作地连接，可以显著提高目标基因在高盐、高渗透压的胁迫环境下的表达强度，进而稳定、高效的生产下游产物，有效解决了当前添加IPTG等高昂诱导剂、且对菌株造成毒性的问题。

Description

一种突变的高渗诱导型启动子PproP及其应用

技术领域

本发明属于基因工程与分子生物学领域，具体涉及具有启动子活性的多核苷酸的突变体，包含具有启动子的转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞，以及调控目标基因转录的方法、生产目标化合物的方法。

背景技术

启动子是调控目标基因表达的重要工具，可分为组成型启动子和诱导型启动子两大类。组成型启动子一般不受外界因素的影响，以大体上恒定的水平表达目标基因，如目前文献中已报道了一系列的组成型启动子（Rytter, J. V., et al., Synthetic promoterlibraries for Corynebacterium glutamicum. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2014,98, 2617-2623.）。然而，对于一些有毒蛋白或者代谢产物的合成而言，组成型启动子的表达往往对菌株造成较大的代谢负担，在实际的应用中存在较大的限制。

诱导型启动子是一类在某些特定的物理或化学信号的刺激下，可大幅提高目标基因转录水平的启动子。这类启动子可以控制转录起始的时间，因此更有利于菌株的代谢流调控和重新分配。目前在生物领域广泛应用的诱导型启动子包括tac、trc等，然而上述启动子需要额外添加昂贵的诱导剂，例如IPTG，这些诱导剂的添加也会对菌株造成一定的毒性，或对发酵体系造成较大的干扰。

在工业菌株的发酵过程中，高盐高渗条件几乎是所有工业菌株在发酵后期都将面临的环境诱导因素（Varela C et al., Metabolic flux redistribution inCorynebacterium glutamicum in response to osmotic stress., Appl. Microbiol.Biotechnol., 2003, 60（5）:547-555.），然而，目前在工业菌株中尤其是谷氨酸棒杆菌中几乎没有高盐高渗诱导型启动子的报告。因此，开发高活性的高盐高渗诱导型启动子，不仅可以为工业菌株的开发提供通用的自诱导型元件，也可以增加目标化合物相关基因在工业发酵后期的表达，从而增加目标化合物的合成，是当前工业菌株的遗传改造亟需解决的问题。

发明内容

鉴于现有技术中存在的技术问题，本发明首先鉴定出一种高渗诱导型启动子P_proP，并通过对其5’-UTR以及启动子核心区进行突变，获得了两个启动子活性提高的突变体多核苷酸，所述突变体多核苷酸在盐浓度、渗透压升高的环境下表现出比野生型P_proP启动子增强的启动活性。将启动子突变体多核苷酸与氨基酸合成相关的蛋白编码基因或基因表达调控蛋白的编码基因可操作的连接，可实现蛋白编码基因在高盐、高渗透压环境下的高效表达，有效解决了当前诱导型启动子需要添加高昂诱导剂、且诱导剂对菌株造成毒性的问题。

因此，本发明提供一种具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸选自如下（i）-（iv）中组成的组中的任一项：

（i）包含如SEQ ID NO：2-3任一序列所示的核苷酸序列；

（ii）包含如SEQ ID NO：2-3任一序列所示的核苷酸序列的反向互补序列；

（iii）在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，能够与（i）或（ii）所示的核苷酸序列杂交的序列的反向互补序列；

（iv）与（i）或（ii）所示的核苷酸序列具有至少80%，可选至少90%，优选至少95%，更优选至少97%，更优选至少98%，最优选至少99%的序列同一性的序列。

其中，所述的具有启动子活性的多核苷酸，在盐浓度或渗透压升高的环境中相对于野生型启动子具有提高的启动子活性。

第二方面，本发明提供一种转录表达盒，其包含所述的具有启动子活性的多核苷酸；可选地，所述转录表达盒还含有蛋白编码基因或基因表达调控蛋白的编码基因，所述蛋白编码基因或基因表达调控蛋白的编码基因与所述具有启动子活性的多核苷酸可操作地连接。

第三方面，本发明提供一种重组表达载体，其包含所述的具有启动子活性的多核苷酸，或所述的转录表达盒。

第四方面，本发明提供一种重组宿主细胞，其中，所述重组宿主细胞包含所述的转录表达盒，或所述的重组表达载体。

优选地，所述宿主细胞来源于棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属或埃希氏菌属；优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌或大肠杆菌；更优选地，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869或谷氨酸棒杆菌ATCC 14067或谷氨酸棒杆菌的衍生菌株。

第五方面，本发明提供所述启动子活性的多核苷酸在如下至少一种中的用途：

（a）调控基因的转录水平，或制备用于调控基因的转录水平的试剂或试剂盒；

（b）制备蛋白，或制备用于制备蛋白的试剂或试剂盒；

（c）生产目标化合物，或制备用于生产目标化合物的试剂或试剂盒。优选地利用所述启动子可操作连接基因表达调控蛋白编码基因、与目标化合物合成相关的蛋白的编码基因或与膜转运相关的蛋白的编码基因。在具体实施方式中，所述目标化合物是氨基酸和有机酸。优选地，所述氨基酸是如下的一种或两种以上的组合：脯氨酸、羟脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-氨基乙酰丙酸或上述任一种的氨基酸的衍生物；

优选地，所述有机酸是如下的一种或两种以上的组合：柠檬酸、琥珀酸、乳酸、醋酸、丁酸、棕榈酸、草酸、草酰乙酸、酒石酸、丙酸、己烯酸、癸酸、辛酸、戊酸、苹果酸或上述任一种的有机酸的衍生物。

第六方面，本发明提供一种调控目标基因转录的方法，其中，所述方法包括将所述的具有启动子活性的多核苷酸与目标RNA或目标基因可操作地连接的步骤；可选地，所述目标RNA是tRNA、sRNA中的至少一种，所述目标基因是与目标化合物合成相关的蛋白的编码基因、基因表达调控蛋白的编码基因、与膜转运相关的蛋白的编码基因中的至少一种；

可选地，所述目标基因是如下的至少一种：丙酮酸羧化酶基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因、γ-谷氨酰激酶基因、谷氨酸半醛脱氢酶基因、吡咯啉-5-羧酸还原酶基因、氨基酸运输蛋白基因、ptsG***相关基因、丙酮酸脱氢酶基因、高丝氨酸脱氢酶基因、草酰乙酸脱羧酶基因、葡萄糖酸阻遏蛋白基因、葡萄糖脱氢酶基因、天冬氨酸激酶基因、天冬氨酸半醛脱氢酶基因、天冬氨酸氨裂合酶基因、二氢吡啶二羧酸合成酶基因、二氢吡啶甲酸还原酶基因、琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶基因、四氢吡啶二羧酸酯琥珀酰酶基因、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶基因、二氨基庚二酸差向异构酶基因、二氨基庚二酸脱酰基酶基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因、转酮酶基因、二氨基庚二酸脱氢酶基因。

第七方面，本发明提供一种制备蛋白的方法，其特征在于，包括利用所述的转录表达盒，所述的重组表达载体，或所述的重组宿主细胞表达所述蛋白的步骤；可选地，所述蛋白为与目标化合物合成相关的蛋白、与膜转运相关的蛋白或基因表达调控蛋白；任选地，所述方法还包括分离或纯化所述蛋白的步骤。

第八方面，本发明提供一种生产目标化合物的方法，其中，包括利用所述的转录表达盒，所述的重组表达载体，或所述的重组宿主细胞表达与目标化合物合成相关的蛋白、与膜转运相关的蛋白或基因表达调控蛋白，在所述与目标化合物合成相关的蛋白、与膜转运相关的蛋白或所述基因表达调控蛋白存在的环境下生产目标化合物的步骤；可选地，所述目标化合物包括氨基酸和有机酸中的至少一种；

可选地，所述氨基酸是如下的一种或两种以上的组合：脯氨酸、羟脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-氨基乙酰丙酸或上述任一种的氨基酸的衍生物；

可选地，所述有机酸是如下的一种或两种以上的组合：柠檬酸、琥珀酸、乳酸、醋酸、丁酸、棕榈酸、草酸、草酰乙酸、酒石酸、丙酸、己烯酸、癸酸、辛酸、戊酸、苹果酸或上述任一种的有机酸的衍生物。

可选地，所述与目标化合物合成相关的蛋白为与L-氨基酸合成相关的蛋白；可选地，所与L-氨基酸合成相关的蛋白是丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、γ-谷氨酰激酶、谷氨酸半醛脱氢酶、吡咯啉-5-羧酸还原酶、氨基酸运输蛋白、ptsG***、丙酮酸脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、草酰乙酸脱羧酶、葡萄糖酸阻遏蛋白、葡萄糖脱氢酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸氨裂合酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、二氢吡啶甲酸还原酶、琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶、四氢吡啶二羧酸酯琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶、二氨基庚二酸差向异构酶、二氨基庚二酸脱酰基酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、转酮酶、二氨基庚二酸脱氢酶中的一种或两种以上的组合；

任选地，所述方法还包括分离或纯化所述目标化合物的步骤。

最后本发明还提供所述的具有启动子活性的多核苷酸，所述的转录表达盒，所述的重组表达载体，所述的重组宿主细胞在如下至少一种中的用途：

（b）制备蛋白，或制备用于制备蛋白的试剂或试剂盒；

（c）生产目标化合物，或制备用于生产目标化合物的试剂或试剂盒。

本发明提供了具有启动子活性的多核苷酸突变体，其在盐浓度、渗透压升高的环境下具有比野生型启动子增强的启动活性。多核苷酸与目标基因可操作地连接，可以显著提高目标基因在高盐、高渗透压的胁迫环境下的表达强度，进而稳定、高效的生产下游产物，有效解决了当前添加IPTG等高昂诱导剂、且对菌株造成毒性的问题。例如，利用具有启动子活性的多核苷酸生产氨基酸，能够提高与氨基酸合成相关的蛋白在胁迫环境下的表达，同时弱化其他途径蛋白的表达，使得代谢流更多地向氨基酸合成方向富集，从而稳定、高效的生产氨基酸，达到过量积累氨基酸的目的。具体例如，当以上述的方法生产L-赖氨酸时，能够在高盐、高渗透压的环境下稳定、高效的生产L-赖氨酸。

附图说明

图1 proP基因启动子及突变启动子强度及高渗诱导活性。

具体实施方式

当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。

如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。

虽然所发明的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。

当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。

本发明的“高盐环境”可以是培养基中高浓度Na₂SO₄、NaCl、K₂SO₄、KCl等无机盐离子，或是随发酵时间延长、发酵液中赖氨酸等产物或某些中间代谢物积累而增加的浓度（例如，赖氨酸硫酸盐等），或是由于底物流加而增加的浓度（例如，硫酸铵等底物），或是发酵液中可能出现的其他任意盐的浓度。在一些具体的实施方案中，“高盐环境”涉及在0.2M以上的盐浓度；在一些更为具体的实施方案中，“高盐环境”涉及在0.2-0.8M的盐浓度。例如，盐浓度为0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M。

在本发明中，“高渗透压环境”是指响应提高的盐浓度而升高的渗透压。在一些优选的实施方案中，SEQ ID NO：1-2任一序列所示的核苷酸序列的启动子在以硫酸盐所形成的“高盐环境”下表现出更高的启动子活性或更高的转化效率；在一些优选的实施方案中，硫酸盐为Na₂SO₄或K₂SO₄。

本发明中的术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法（例如，使用克隆载体）识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列（即A、T、G、C）表示时，这也包括一个RNA序列（即A、U、G、C），其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸（单独的片段或整个片段）中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。

本发明中的术语“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸***或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸***或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。

在一些具体的实施方案中，具有启动子活性的多核苷酸包含与SEQ ID NO：2-3任一序列所示的核苷酸序列的反向互补序列，且多核苷酸保持高盐、高渗透压诱导型的启动子活性。

在一些具体的实施方式中，具有启动子活性的多核苷酸包含在高严格性杂交条件或非常高严格性杂交条件下，与SEQ ID NO：2-3任一序列所示的核苷酸序列或其反向互补序列杂交的序列的反向互补序列，且多核苷酸保持高盐、高渗透压诱导型的启动子活性。

在一些具体的实施方案中，具有启动子活性的多核苷酸包含与上述任一种的核苷酸序列具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100% 的序列同一性的序列，且多核苷酸保持高盐、高渗透压诱导型的启动子活性。

如本发明所使用的，术语“高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE（saline sodium phosphate EDTA）、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

如本发明所使用的，术语“非常高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE（saline sodium phosphate EDTA）、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

本文中的术语“互补的”是指在核苷酸或核苷酸之间的杂交或碱基配对，例如双链DNA分子的两条链之间或者寡核苷酸引物与被测序或扩增的单链核苷酸上的引物结合位点之间等。

本发明中的术语“启动子”是指一种核酸分子，通常位于目标基因编码序列的上游，为RNA聚合酶提供识别位点，并位于mRNA转录起始位点的 5’方向的上游。它是不被翻译的核酸序列，RNA聚合酶与这一核酸序列结合后启动目标基因的转录。在核糖核酸（RNA）的合成中，启动子可以和调控基因转录的转录因子产生相互作用，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度，包含核心启动子区域和调控区域，就像“开关”，决定基因的活动，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。

本发明中的术语“启动子核心区”是指位于原核生物启动子区的一段核酸序列，是发挥启动子功能的核心序列区，主要包括−35 区、−10 区、−35 区和−10 区之间的区域以及转录起始位点，−35 区是RNA 聚合酶的识别位点，−10 区是RNA聚合酶的结合位点。

在一些具体的实施方案中，本发明中的具有启动子活性的多核苷酸能够用于起始蛋白编码基因的表达。在另外一些实施方案中，本发明中的具有启动子活性的多核苷酸能够用于起始非编码基因的表达。

本发明中的术语“表达”包括涉及RNA产生及蛋白产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

本发明的术语“目标RNA”包括在遗传编码、翻译、调控、基因表达等过程中发挥作用的功能性RNA。在本公开中，与具有启动子活性的多核苷酸连接的目标RNA可以是本领域任一种的功能性RNA。在一些实施方式中，目标RNA为tRNA或sRNA。在另外一些实施方式中，目标RNA还可以是sgRNA、crRNA、tracrRNA、miRNA、siRNA等其他种类的RNA。

本发明中的术语“目标基因”涉及与本发明中具有启动子活性的多核苷酸连接，以对其转录水平进行调控的任一种的基因。在一些实施方式中，目标基因为与目标化合物合成相关的蛋白的编码基因。在一些实施方式中，目标基因为基因表达调控蛋白的编码基因。在一些实施方式中，目标基因为与膜转运相关的蛋白的编码基因。示例性的，目标基因是与目标化合物的生物合成相关的酶的编码基因、与还原力相关的酶的编码基因，与糖酵解或TCA循环相关的酶的编码基因，或与目标化合物的释放相关的酶的编码基因等等。示例性的，目标基因包括如下的至少一种基因：丙酮酸羧化酶基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因、γ-谷氨酰激酶基因、谷氨酸半醛脱氢酶基因、吡咯啉-5-羧酸还原酶基因、氨基酸运输蛋白基因、ptsG***相关基因、丙酮酸脱氢酶基因、高丝氨酸脱氢酶基因、草酰乙酸脱羧酶基因、葡萄糖酸阻遏蛋白基因、葡萄糖脱氢酶基因、天冬氨酸激酶基因、天冬氨酸半醛脱氢酶基因、天冬氨酸氨裂合酶基因、二氢吡啶二羧酸合成酶基因、二氢吡啶甲酸还原酶基因、琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶基因、四氢吡啶二羧酸酯琥珀酰酶基因、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶基因、二氨基庚二酸差向异构酶基因、二氨基庚二酸脱酰基酶基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因、转酮酶基因、二氨基庚二酸脱氢酶基因。

本发明中的术语“目标化合物”可以选自氨基酸和有机酸中的至少一种，也可以选自本领域中可能通过生物合成得到的其他种类的化合物。

在一些实施方案中，目标化合物为“氨基酸”或“L-氨基酸”。“氨基酸”或“L-氨基酸”通常是指其中氨基和羧基结合至相同碳原子的蛋白质的基本构成单元。示例性的，氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸中的一种或两种以上的组合，或者是本领域中其他种类的氨基酸。

在一些实施方案中，目标化合物为有机酸。有机酸可以是具有酸性的有机化合物，例如，其中包括羧基和磺酸基的那些化合物。示例性的，有机酸包括乳酸、醋酸、琥珀酸、丁酸、棕榈酸、草酸、酒石酸、柠檬酸、丙酸、己烯酸、癸酸、辛酸、戊酸、柠檬酸中的一种或两种以上的组合，或者是本领域中其他种类的有机酸。

本发明中的术语“蛋白编码基因”是指能够通过一定的规则指导蛋白的合成DNA分子，蛋白编码基因指导蛋白合成的过程一般包括以双链DNA为模板的转录过程和以mRNA为模板的翻译过程。蛋白编码基因含有CDS序列（Coding Sequence），能够指导编码蛋白质的mRNA的产生。

示例性的，蛋白编码基因包括但不限于用于编码与目标化合物合成相关的蛋白，在一些实施方案中，蛋白编码基因涉及用于编码与合成L-赖氨酸的相关的蛋白。对于与合成L-赖氨酸的相关的蛋白，包括天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸氨裂合酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶甲酸还原酶、琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶、四氢吡啶二羧酸酯琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶、二氨基庚二酸差向异构酶、二氨基庚二酸脱酰基酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、赖氨酸运输蛋白、转酮酶、二氨基庚二酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶中的一种或两种以上的组合。在一些实施方案中，蛋白编码基因涉及用于编码与合成有机酸相关的蛋白，示例性的，蛋白编码基因用于编码与合成柠檬酸有关的蛋白，或用于编码与合成琥珀酸有关的蛋白。本发明的具有启动子活性的多核苷酸，可适于提高目标基因在高盐、高渗透压的胁迫环境下的表达，实现目标产物的高效生产。

本发明的术语“基因表达调控蛋白”包括不限于外源的基因表达调控工具蛋白，例如CRISPRi调控需要的dCas9蛋白、dCpf1蛋白，sRNA调控需要的Hfq蛋白等，以及内源或外源的转录调控因子，进而调控代谢通路中关键基因的表达。

本发明中的术语“转录表达盒”指的包含转录调控元件与目标基因，利用转录调控元件对目标基因的表达进行调控的一类表达元件。在本发明中，转录调控元件包含启动子，在此基础上，还可以包含增强子、沉默子、绝缘子等元件。在本发明中，目标基因具体为蛋白编码基因。目标基因与多核苷酸“可操作地连接”，是指将具有启动子活性的多核苷酸与目标基因功能性连接，以启动和介导目标基因的转录，所述可操作地链接的方式可以采用本领域技术人员所述的任何方式。

本发明中的术语“载体”指的是DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列，从而在合适的宿主中表达目标基因。“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括，例如包含 i）对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii）转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii）适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要，并可以使用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本发明的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体，来自如牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。

本发明中的术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的转录起始元件或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“重组宿主细胞”涵盖导入转录起始元件或重组表达载体后不同于亲本细胞的宿主细胞，重组宿主细胞具体通过转化来实现。

本发明中的术语“转化”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO₄)沉淀法、氯化钙(CaCl₂)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。

本发明的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞，只要是能够导入本发明的具有启动子活性的多核苷酸的细胞即可。在一个实施方案中，宿主细胞指原核细胞，具体地，宿主细胞来源于适合发酵生产氨基酸的微生物，例如棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属或埃希氏菌属。作为优选地，宿主细胞是来源于棒状杆菌属的谷氨酸棒杆菌。其中，谷氨酸棒杆菌可以是谷氨酸棒杆菌ATCC 13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869或谷氨酸棒杆菌ATCC14067等，以及由上述菌株制备的产生氨基酸尤其是赖氨酸的突变体菌株或谷氨酸棒杆菌的衍生菌株。在一些实施方式中，本发明的宿主细胞可以是具有氨基酸生产能力的任意类型的菌株，其包括野生型菌株和重组菌株。

示例地，宿主细胞为生产赖氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，对于生产赖氨酸的宿主细胞，可以是在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基础上表达解除反馈抑制的天冬氨酸激酶的菌株。此外，生产赖氨酸的宿主细胞也可以是具有赖氨酸生产能力的其他种类的菌株。

在一些实施方式中，所述生产赖氨酸的宿主细胞中选自以下的一个或多个基因被弱化或表达降低：

a. 编码乙醇脱氢酶的adhE基因；

b. 编码乙酸激酶的ackA基因；

c. 编码磷酸乙酰转移酶的pta基因；

d. 编码乳酸脱氢酶的ldhA基因；

e. 编码甲酸转运蛋白的focA基因；

f. 编码丙酮酸甲酸裂解酶的pflB基因；

g. 编码丙酮酸氧化酶的poxB基因；

h. 编码天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I双功能酶的thrA基因；

i. 编码高丝氨酸激酶的thrB基因；

j. 编码赖氨酸脱羧酶的ldcC基因；和

h. 编码赖氨酸脱羧酶的cadA基因。

在一些实施方式中，所述生产赖氨酸的宿主细胞中选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：

a. 编码解除赖氨酸反馈抑制的二氢二吡啶合成酶的dapA基因；

b. 编码二氢二吡啶二羧酸还原酶的dapB基因；

c. 编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因；

d.编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶的dapD和编码琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶的dapE；

e.编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的asd基因；

f.编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因；

g.编码烟酸胺腺嘌呤二核苷酸转氢酶的pntAB基因；

i.编码赖氨酸的运输蛋白lysE基因。

示例地，宿主细胞为生产苏氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，生产苏氨酸的宿主细胞为在谷氨酸棒杆菌ATCC 13032基础上表达解除反馈抑制的天冬氨酸激酶LysC的菌株。在另外一些实施方式中，生产苏氨酸的宿主细胞也可以是具有苏氨酸生产能力的其他种类的菌株。

在一些实施方式中，所述生产苏氨酸的宿主细胞中选自以下的一个或多个基因被增强或过表达：

a.编码苏氨酸操纵子的thrABC基因；

b.编码解除反馈抑制的高丝氨酸脱氢酶的hom基因；

c.编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因；

d.编码丙酮酸羧化酶的pyc基因；

e.编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因；

f.编码转酮酶的tkt基因；

g.编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶的gnd基因；

h.编码苏氨酸输出的thrE基因；

i.编码烯醇酶的eno基因。

示例地，宿主细胞为生产异亮氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，生产异亮氨酸的宿主细胞是通过用丙氨酸取代L-苏氨酸脱水酶ilvA基因第323位的氨基酸而产生L-异亮氨酸的菌株。在另外一些实施方式中，生产异亮氨酸的宿主细胞也可以是具有异亮氨酸生产能力的其他种类的菌株。

示例地，宿主细胞为生产O-乙酰高丝氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，生产O-乙酰高丝氨酸的宿主细胞是通过使O-乙酰高丝氨酸(硫醇)-裂解酶失活而产生O-乙酰高丝氨酸的菌株。在另外一些实施方式中，生产O-乙酰高丝氨酸的宿主细胞也可以是具有O-乙酰高丝氨酸生产能力的其他种类的菌株。

示例地，宿主细胞为生产蛋氨酸的宿主细胞。在一些实施方式中，生产蛋氨酸的宿主细胞是通过使甲硫氨酸和半胱氨酸的转录调节因子失活而产生蛋氨酸的菌株。在另外一些实施方式中，生产蛋氨酸的宿主细胞也可以是具有蛋氨酸生产能力的其他种类的菌株。

本发明的宿主细胞的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。

在一些具体的实施方案中，重组宿主细胞的培养条件为：将重组宿主细胞接种含有相应抗生素的TSB培养基，30℃，220 r/min过夜培养，按照初始OD 0.3分别转接添加或不添加0.6 M硫酸钠（模拟发酵后期高浓度产物积累造成的高盐高渗环境）的赖氨酸发酵培养基，培养体系为24孔板装液1 mL，30℃，800 r/min培养24 h后终止发酵，检测剩余葡萄糖含量、OD₆₀₀和赖氨酸产量。

对于赖氨酸发酵培养基，配方为：葡萄糖80 g/L、酵母粉8 g/L、尿素9 g/L、K₂HPO₄1.5 g/L、MOPS 42 g/L、FeSO₄ 0.01 g/L、MnSO₄ 0.01 g/L、MgSO₄ 0.6 g/L，氯霉素终浓度为5 µg/mL，和/或卡那霉素终浓度为25 µg/mL。

除非在本发明中另外定义或由背景清楚指示，否则在本发明中的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

实施例

本发明的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例（虽然表示本发明的具体实施方式）仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本发明的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。

本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。

表1 实施例中质粒构建所使用的引物序列如下所示：

实施例1.包含内源proP基因启动子序列的质粒构建

ProP是脯氨酸摄入蛋白，在高渗条件下诱导表达，通过提高相容性物质脯氨酸的摄入，增强菌株对高渗环境的耐受性。已有文献报道高渗条件下ProP的表达会明显上调，表明该基因的启动子可能也是一种高渗诱导型的启动子（Franzel, B., et al.,Adaptation of Corynebacterium glutamicum to salt-stress conditions,Proteomics, 2010, 10(3): 445–457.）。根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC 13032的基因组序列（NC_003450.3），设计引物proP-F（SEQ ID NO:4）和proP-R（SEQ ID NO: 5）。以ATCC 13032基因组为模板通过PCR扩增得到带有proP基因的启动子（P_proP）序列（SEQ ID NO: 1）。同时，以文献报道的pXM-gfp为模板（Sun DH et al.,Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2019, 46（2）:203-208.），利用引物pGFP-F（SEQ ID NO: 6）和pGFP-R（SEQ ID NO: 7），通过PCR扩增获得去除lacI基因和tac启动子的载体片段。上述片段回收后利用Vazyme Clon Express Multies重组试剂盒进行重组连接，并将连接产物转化到Trans T1感受态细胞，涂布氯霉素抗性平板过夜培养，挑阳性克隆进行菌落PCR验证，并将正确转化子进行测序确认，获得的重组载体命名为pXM-P_proP-gfp。同时，利用T4 PNK将载体片段磷酸化，并通过自身环化构建获得对照载体pXM-con。将上述重组载体转化谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，获得重组菌株。

实施例2. 高盐对proP基因启动子的诱导作用

将上述带有不同启动子重组载体的菌株分别接种含有5 µg/mL氯霉素的TSB培养基，30℃，220 r/min过夜培养。其中，TSB液体培养基成份为(g/L)：葡萄糖，5 g/L；酵母粉，5g/L；大豆蛋白胨，9 g/L；尿素，3 g/L；丁二酸，0.5 g/L；K₂HPO₄•3H₂O，1 g/L；MgSO₄•7H₂O，0.1g/L；生物素，0.01 mg/L；维生素B1，0.1 mg/L ；MOPS，20 g/L。按照初始OD 0.5分别转接添加或不添加0.6 M Na₂SO₄的CGXIIY培养基，培养体系为24孔板装液1 mL，30℃，800 r/min培养18 h后检测不同菌株的GFP荧光强度及OD₆₀₀，利用单位菌体的荧光强度（扣除相同条件下对照菌株的单位菌体荧光强度）表征不同条件下不同启动子的相对强度。其中CGXIIY培养基配方为：葡萄糖50 g/L、酵母粉 2 g/L、NH₄Cl 16.5 g/L、尿素5 g/L、KH₂PO₄ 1 g/L、K₂HPO₄1 g/L、MOPS 42 g/L、MgSO₄ 0.25 g/L、FeSO₄·2H₂O 0.01 g/L、MnSO₄·H₂O 0.01 g/L、ZnSO₄·7H₂O 0.001 g/L、CuSO₄ 0.2 mg/L、NiCl·6H₂O 0.02 mg/L、CaCl₂ 0.01 g/L、原儿茶酸0.03 g/L、生物素0.2 mg/L、维生素B1 0.1 mg/L，氯霉素终浓度为5 µg/mL。检测结果见图1，数据显示proP基因启动子受高盐诱导，诱导活性达到了8.9倍。

实施例3. proP启动子改造及表征质粒构建

为了进一步提高启动强度，并保留其较高的高盐诱导活性，本发明在保留可能的调控区的条件下，分别对其5’-UTR以及启动子-35区和-10区核心区和5’-UTR进行序列改造和替换，得到P_proP-1（SEQ ID NO: 2）和P_proP-2（SEQ ID NO: 3）两种突变启动子。

以pXM-P_proP-gfp为模板，利用引物proP-1-F（SEQ ID NO: 8）和proP-1-R（SEQ IDNO: 9），通过PCR扩增替换proP启动子后的5’-UTR区，将上述PCR片段回收后，利用T4 PNK将载体片段磷酸化，并通过自身环化构建获得pXM-P_proP-1-gfp。同时，以pXM-P_proP-gfp为模板，利用引物proP-2-F（SEQ ID NO: 10）和proP-2-R（SEQ ID NO: 11），通过PCR扩增获得替换proP启动子后的5’-UTR区以及-35区和-10区核心区，将上述片段回收后，利用T4 PNK将载体片段磷酸化，并通过自身环化构建获得pXM-P_proP-2-gfp。将上述重组载体转化谷氨酸棒杆菌ATCC 13032，获得重组菌株。

实施例4. 高盐对杂合启动子的诱导作用

利用实施例3类似的方法，比较高盐或正常培养基条件下突变启动子的强度和诱导活性。结果见图1，数据显示改造后的两种启动子在正常培养基及高盐条件下的强度均高于野生型proP启动子，P_proP-1诱导活性基本保持了野生型proP启动子的性能（8.7倍），但P_proP-2由于本底表达水平较高，诱导活性降为3.2倍。

实施例5. 利用突变启动子调控dCpf1表达用于促进赖氨酸

以pXM-P_proP-gfp为模板，设计引物proP-D-F（SEQ ID NO: 18）和proP-D-R（SEQ IDNO: 19），通过PCR扩增得到P_proP启动子片段。同时，以文献报道的pXM-07为模板^[5]，先利用引物pXM07-F1（SEQ ID NO: 12）和pXM07-R1（SEQ ID NO: 13），通过PCR扩增获得带有dCpf1的载体片段一；然后利用引物pXM07-F2（SEQ ID NO: 14）和pXM07-R2（SEQ ID NO: 15），通过PCR扩增获得带有复制起点的载体片段二。以文献报道的pEC-26为模板（Li MY et al.,Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2020, 8: 357.），利用引物pEC26-F（SEQ ID NO: 16）和pEC26-R（SEQ ID NO: 17），通过PCR扩增获得靶向gltA、pgi、hom和pck基因的crRNA array片段。将上述四个片段回收后，利用Vazyme Clon Express Multies一步重组试剂盒进行重组连接，获得重组载体pXM-P_proP-dCpf1。类似地，以pXM-P_proP-1-gfp为模板，设计引物proP-D-F（SEQ ID NO: 18）和proP1-D-R（SEQ ID NO: 20），通过PCR扩增得到P_proP-1启动子片段。将上述启动子片段与载体片段一、载体片段二以及crRNA array片段重组，获得重组载体pXM-P_proP-1-dCpf1。同时，以pXM-P_proP-dCpf1为模板，利用引物pXM07-F1（SEQ ID NO: 12）和pXM07-R2（SEQ ID NO: 15），通过PCR扩增获得载体片段三，将上述片段回收后分别与P_proP和P_proP-1启动子序列片段通过Vazyme Clon Express Multies一步重组试剂盒进行重组连接，获得相应的对照载体pXM-P_proP-con和pXM-P_proP-1-con。

根据文献中公开的赖氨酸菌株构建方法（Becker, J., et al., Metab. Eng.,2011, 13, 159-168.），利用基于pK18mobsacB的同源重组技术将谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组上天冬氨酸激酶（lysC基因编码）第311位的苏氨酸突变为异亮氨酸，构建获得一株具有一定赖氨酸合成能力的菌株SCgL30。将上述重组载体pXM-P_proP-dCpf1和pXM-P_proP-1-dCpf1、以及各自的对照质粒pXM-P_proP-con和pXM-P_proP-1-con分别转化SCgL30菌株，获得重组菌株和对照菌株。将上述菌株分别接种含有5 µg/mL氯霉素的TSB培养基，30℃，220 r/min过夜培养，按照初始OD 0.3分别转接添加或不添加0.6 M硫酸钠（模拟发酵后期高浓度产物积累造成的高盐高渗环境）的赖氨酸发酵培养基，培养体系为24孔板装液1 mL，30℃，800 r/min培养24 h后终止发酵，检测剩余葡萄糖含量、OD600和赖氨酸产量。其中赖氨酸发酵培养基配方为：葡萄糖80 g/L、酵母粉8 g/L、尿素9 g/L、K₂HPO₄ 1.5 g/L、MOPS 42 g/L、FeSO₄ 0.01 g/L、MnSO₄ 0.01 g/L、MgSO₄ 0.6 g/L，氯霉素终浓度为5 µg/mL。检测结果见表2，结果显示由于启动子强度较弱，野生型proP启动子调控的dCpf1弱化***对赖氨酸产量及转化率效果非常有限，而改造后的突变启动子在正常培养条件下同样没有明显效果。但在高渗诱导条件下，突变启动子调控的dCpf1***表现出良好的应用效果，赖氨酸产量及转化率均显著提高。

表2 杂合启动子调控dCpf1表达在赖氨酸合成中的应用效果

实施例6. 利用突变启动子调控LysE表达在赖氨酸合成中的应用

以pXM-P_proP-gfp为模板，利用引物proP-lysE-F（SEQ ID NO: 25）和proP-lysE-R（SEQ ID NO: 26）通过PCR扩增得到P_proP-1启动子序列片段；以pXM-P_proP-1-gfp为模板，利用引物proP-lysE-F（SEQ ID NO: 25）和proP1-lysE-R（SEQ ID NO: 27），通过PCR扩增得到P_proP启动子且序列片段。以ATCC 13032基因组为模板，利用引物lysE-F（SEQ ID NO: 21）和lysE-R（SEQ ID NO: 22）通过PCR扩增得到lysE基因片段。同时，以pXM-XK99E为模板，利用引物pEC-F（SEQ ID NO: 23）和pEC-R（SEQ ID NO: 24），通过PCR扩增获得载体片段。将上述启动子片段分别与lysE片段和载体片段进行重组连接，并将连接产物转化到Trans T1感受态细胞，涂布卡那霉素抗性平板过夜培养，挑阳性克隆进行菌落PCR验证，并将正确转化子进行测序确认，获得的重组载体命名为pEC-P_proP-lysE和pEC-P_proP-1-lysE。

将上述重组载体pEC-P_proP-lysE、pEC-P_proP-1-lysE和pEC-XK99E分别转化谷氨酸棒杆菌ScgL30，获得重组菌株和对照菌株。利用如实施例4的方法（抗生素替换为终浓度为25µg/mL的卡那霉素）验证不同启动子调控的LysE表达菌株在赖氨酸合成中的应用效果，结果见表3。数据显示，野生型proP启动子调控的LysE过表达在高渗条件下可以少量提升赖氨酸产量及转化率，而改造后的杂合启动子在高渗诱导条件下赖氨酸产量及转化率明显提高，显示出良好的应用效果。

表3 不同启动子调控LysE表达在赖氨酸合成中的应用效果

本说明书发明的所有技术特征都可以任何组合方式进行组合。本说明所发明的每个特征也可以被其它具有相同、相等或相似作用的特征所替换。因此，除非特殊说明，所发明的每一特征仅仅是一系列相等或相似特征的实例。

此外，从上述描述中，本领域技术人员可从本发明中很容易清楚本发明的关键特征，在不脱离本发明的精神及范围的情况下，可对发明进行很多修改以适应各种不同的使用目的及条件，因此这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。

序列表

<110>中国科学院天津工业生物技术研究所

<120>一种突变的高渗诱导型启动子PproP及其应用

<160>27

<170> PatentIn Version 3.1

<210>1

<211> 384

<212>DNA

<213> Corynebacterium glutamicum

<400> 1

gcaccgaaaa cagtaacttt cccaagaaaa atataagaaa acttccccac acaggccgtg 60

aagagcctga atttattgat ttttcagaca gatctggaaa tgtgaccaat ttgtaaccca 120

cccccgctca cctgcatgag tgtggggtct ttttgcattc ttccagctcc cagacttgaa 180

aacgatctga cttttcaccc cgaaccttac taaggtcgat tcatgttgaa aagagaggtg 240

gtgttttcac ttccctttta taggcaaagc tttaaggagt cttacaggaa gaagttaaca 300

ccgcccaggg gtgcgttgga tgatgatcat ctacaaacaa acattccgtt atgcactcat 360

aagatatgac gagaggtttt actc 384

<210>2

<211> 381

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 2

gcaccgaaaa cagtaacttt cccaagaaaa atataagaaa acttccccac acaggccgtg 60

aagagcctga atttattgat ttttcagaca gatctggaaa tgtgaccaat ttgtaaccca 120

cccccgctca cctgcatgag tgtggggtct ttttgcattc ttccagctcc cagacttgaa 180

aacgatctga cttttcaccc cgaaccttac taaggtcgat tcatgttgaa aagagaggtg 240

gtgttttcac ttccctttta taggcaaagc tttaaggagt cttacaggaa gaagttaaca 300

ccgcccaggg gtgcgttgga tgatgatcat ctacaaacaa acattccgtt atgcacttga 360

tacccaattc gagaaaggcc a 381

<210>3

<211> 250

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 3

gcaccgaaaa cagtaacttt cccaagaaaa atataagaaa acttccccac acaggccgtg 60

aagagcctga atttattgat ttttcagaca gatctggaaa tgtgaccaat ttgtaaccca 120

cccccgctca cctgcatgag tgtggggtct ttttgcattc ttccatatta aagatcacac 180

cgagtggtgg aatttcctca agtgatttac ccacaatgga ctttgttgat acccaattcg 240

agaaaggcca 250

<210>4

<211> 40

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 4

tttcaccagt gagacggggc accgaaaaca gtaactttcc 40

<210>5

<211> 47

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 5

ttcttctcct ttactcatga gtaaaacctc tcgtcatatc ttatgag 47

<210>6

<211> 26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

atgagtaaag gagaagaact tttcac 26

<210>7

<211> 20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

cccgtctcac tggtgaaaag 20

<210>8

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

cgagaaaggc caatgatgag taaaggagaa gaacttttca c 41

<210>9

<211> 36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

aattgggtat caagtgcata acggaatgtt tgtttg 36

<210>10

<211> 67

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

acaatggact ttgttgatac ccaattcgag aaaggccaat gatgagtaaa ggagaagaac 60

ttttcac 67

<210>11

<211>68

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 11

gggtaaatca cttgaggaaa ttccaccact cggtgtgatc tttaatatgg aagaatgcaa 60

aaagaccc 68

<210>12

<211> 30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

gtgtcaattt atcaagaatt tgttaataaa 30

<210>13

<211> 26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

gcggatacat atttgaatgt atttag 26

<210>14

<211> 46

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

acacgcgtct gagcagtatt catgagacaa taaccctgat aaatgc 46

<210>15

<211> 20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

cccgtctcac tggtgaaaag 20

<210>16

<211> 40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

cattcaaata tgtatccgcg agagtcaatt cagggtggtg 40

<210>17

<211> 21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

aatactgctc agacgcgtgt c 21

<210>18

<211> 41

<212>DNA

<213>人工序列

<400>18

ttttcaccag tgagacgggg caccgaaaac agtaactttc c 41

<210>19

<211> 49

<212>DNA

<213>人工序列

<400>19

aattcttgat aaattgacac gagtaaaacc tctcgtcata tcttatgag 49

<210>20

<211> 40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>20

attcttgata aattgacacc attggccttt ctcgaattgg 40

<210>21

<211> 26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

atggtgatca tggaaatctt cattac 26

<210>22

<211> 44

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

gtctgtttcc tgtgtgaaac taacccatca acatcagttt gatg 44

<210>23

<211> 23

<212>DNA

<213>人工序列

<400> 23

tttcacacag gaaacagacc atg 23

<210>24

<211> 21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

aacgtaaatg catgccgctt c 21

<210>25

<211> 40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>25

gcggcatgca tttacgttgc accgaaaaca gtaactttcc 40

<210>26

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<400>26

aagatttcca tgatcaccat gagtaaaacc tctcgtcata tcttatgag 49

<210>27

<211> 40

<212>DNA

<213>人工序列

<400>27

agatttccat gatcaccatc attggccttt ctcgaattgg 40

Claims

1.一种具有启动子活性的多核苷酸，其中，所述多核苷酸的序列如SEQ ID NO：2或SEQID NO：3所示。

2.一种转录表达盒，其包含如权利要求1所述的具有启动子活性的多核苷酸，并与目标基因可操作连接。

3.一种重组表达载体，其包含如权利要求1所述的具有启动子活性的多核苷酸，或如权利要求2所述的转录表达盒。

4.一种重组宿主细胞，其包含如权利要求2所述的转录表达盒，或如权利要求3所述的重组表达载体。

5.如权利要求4所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞属于棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、微杆菌属或埃希氏菌属。

6.如权利要求5所述的重组宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为谷氨酸棒杆菌ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC 13869或谷氨酸棒杆菌ATCC 14067或谷氨酸棒杆菌的衍生菌株。

7.一种调控目标基因转录的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的具有启动子活性的多核苷酸与目标RNA或目标基因可操作地连接的步骤。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述目标RNA是tRNA、sRNA中的至少一种；所述目标基因包括与目标化合物合成相关的蛋白的编码基因、基因表达调控蛋白的编码基因、与膜转运相关的蛋白的编码基因中的至少一种。

9.一种制备蛋白的方法，其特征在于，包括利用权利要求2所述的转录表达盒，权利要求3所述的重组表达载体，或权利要求4至6任一项所述的重组宿主细胞表达目标蛋白的步骤。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白为与目标化合物合成相关的蛋白、与膜转运相关的蛋白或基因表达调控蛋白。

11.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，还包括分离或纯化所述目标蛋白的步骤。

12.一种生产目标化合物的方法，其中，包括利用权利要求2所述的转录表达盒，权利要求3所述的重组表达载体，或权利要求4至6任一项所述的重组宿主细胞表达与目标化合物合成相关的蛋白、与膜转运相关的蛋白或基因表达调控蛋白，在所述与目标化合物合成相关的蛋白、与膜转运相关的蛋白或所述基因表达调控蛋白存在的环境下生产目标化合物的步骤。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述目标化合物是氨基酸、有机酸中的至少一种。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述氨基酸是如下的一种或两种以上的组合：脯氨酸、羟脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、精氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、5-氨基乙酰丙酸或上述任一种的氨基酸的衍生物。

15.如权利要求12或13所述的方法，其特征在于，所述与目标化合物合成相关的蛋白是丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、γ-谷氨酰激酶、谷氨酸半醛脱氢酶、吡咯啉-5-羧酸还原酶、氨基酸运输蛋白、ptsG***、丙酮酸脱氢酶、高丝氨酸脱氢酶、草酰乙酸脱羧酶、葡萄糖酸阻遏蛋白、葡萄糖脱氢酶、天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶、天冬氨酸氨裂合酶、二氢吡啶二羧酸合成酶、二氢吡啶二羧酸还原酶、二氢吡啶甲酸还原酶、琥珀酰二氨基庚二酸氨基转移酶、四氢吡啶二羧酸酯琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰基酶、二氨基庚二酸差向异构酶、二氨基庚二酸脱酰基酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、转酮酶、二氨基庚二酸脱氢酶中的一种或两种以上的组合。

16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述有机酸是如下的一种或两种以上的组合：柠檬酸、琥珀酸、乳酸、醋酸、丁酸、棕榈酸、草酸、草酰乙酸、酒石酸、丙酸、己烯酸、癸酸、辛酸、戊酸、苹果酸或上述任一种的有机酸的衍生物。

17.如权利要求12至16任一项所述的方法，其特征在于，还包括分离或纯化所述目标化合物的步骤。

18.权利要求1所述的具有启动子活性的多核苷酸，权利要求2所述的转录表达盒，权利要求3所述的重组表达载体，权利要求4-6任一项所述的重组宿主细胞在如下至少一种中的用途：

a.调控基因的转录水平，或制备用于调控基因的转录水平的试剂或试剂盒；

b.制备蛋白，或制备用于制备蛋白的试剂或试剂盒；

c.生产目标化合物，或制备用于生产目标化合物的试剂或试剂盒。