CN115896061A

CN115896061A - 一种烟酸磷酸核糖基转移酶突变体、编码基因及应用

Info

Publication number: CN115896061A
Application number: CN202211741203.7A
Authority: CN
Inventors: 邹树平; 胡博文; 薛亚平; 汤恒; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2022-12-31
Filing date: 2022-12-31
Publication date: 2023-04-04

Abstract

本发明涉及一种烟酸磷酸核糖基转移酶突变体以及编码基因，以及其多酶偶联法生物合成L‑草铵膦、D‑氨基酸、L‑叔亮氨酸或L‑氨基丁酸中的应用。本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明烟酸磷酸核糖基转移酶突变体，提高胞内NAD水平，为辅酶依赖型多酶催化反应带来高效、低成本且环境友好的生产方式，不需要额外添加辅酶；(2)本发明烟酸磷酸核糖基转移酶突变体具有更好的催化效率，以中间产物PPO为底物进行催化反应时，转化率远高于原始酶，L‑草铵膦产率也大幅提升；(3)本发明能够不外源添加辅酶直接利用PPO制备生产L‑草铵膦，无需昂贵的拆分试剂，也无需合成草铵膦衍生物，更无需对D‑草铵膦进行分离、再消旋、再拆分等步骤。

Description

一种烟酸磷酸核糖基转移酶突变体、编码基因及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种烟酸磷酸核糖基转移酶突变体以及编码基因，以及其多酶偶联法生物合成L-草铵膦、D-氨基酸、L-叔亮氨酸或L-氨基丁酸中的应用。

(二)背景技术

辅酶是非蛋白质化合物或金属离子，它们是所有生物有机体中无数酶的生物学功能和催化活性所必需的，可以有效地促进生化转化，甚至有助于许多热力学不利的反应。在众多的辅因子中，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)被称为氧化还原辅因子。它们以氧化形式(NAD⁺/NADP⁺)和还原形式(NADH/NADPH)存在，通常分别作为电子供体或受体与代谢和合成反应相关。

还原型辅酶I(NADH)和还原型辅酶II(NADPH)在细胞合成代谢中作为供氢体参与酶促反应，是细胞代谢网络中含量最丰富的两种氧化还原型辅酶。在有氧条件下，NADH参与分解代谢从而提供大量ATP；NADPH则为细胞的合成代谢提供还原力。辅酶II比辅酶I昂贵，还原型辅酶比氧化型辅酶昂贵。

氧化还原体系在工业应用中处处可见。氧化还原型催化反应通常伴随着辅酶的生成、转化和消耗。在生物工业应用中，甲酸脱氢酶(FDH)、亮氨酸脱氢酶(LeuDH)、谷氨酸脱氢酶(GluDH)等各类氨基酸脱氢酶(AADH)是最常见的辅酶依赖型的酶。在该类酶法生物合成中，常常会遇到NAD、NADP供应不足的问题，通常需要额外添加昂贵辅酶以推动反应进程。辅酶供给不足与利用不完全已成为氧化还原催化实现工业化的瓶颈。因此，如何构建辅酶自足型菌株，提高表达***中的辅酶含量，避免昂贵辅因子的外源添加，对氧化还原生物催工业化应用具有重要意义。

烟酰胺腺嘌呤类辅酶合成途径主要分为从头合成途径和补救途径。已有相关科学研究表明，对代谢途径中的关键基因进行调控，构建人工构建辅酶循环体系，可增强底盘菌株的辅酶水平。烟酸磷酸核糖基转移酶是NAD辅酶合成途径中的关键限速酶。烟酸磷酸核糖基转移酶以烟酸为底物，选择性的利用ATP，将烟酸转化为NAD关键前体物质如烟酸单核苷酸，增加的NAD合成前体可以有效的提高胞内NAD合成水平。NAD激酶催化NAD中转化为NADP，提高胞内NADP合成水平。

手性氨基酸是应用广泛的手性化合物，在多肽和单对映体等活性药物中间体中具有重要意义。利用生物酶法合成手性氨基酸具有操作简单、反应条件温和、产品收率高以及光学活性值高等优势，是目前手性氨基酸不对称合成的研究热点。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种烟酸磷酸核糖基转移酶突变体以及编码基因，以及其多酶偶联法生物合成L-草铵膦、D-氨基酸、L-叔亮氨酸或L-氨基丁酸中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种烟酸磷酸核糖基转移酶突变体，由SEQ ID NO.1所示烟酸磷酸核糖基转移酶经定点突变而得，所述点突变的位点为下列之一或其中两种以上的组合：(1)第360位，(2)第223位，(3)第372位。本发明烟酸磷酸核糖基转移酶来源于荧光假单胞菌，所述编码氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述编码核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选的，所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.6～8之一所示。

本发明还涉及编码所述烟酸磷酸核糖基转移酶突变体的基因。

具体的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3～5之一所示。

本发明还涉及含有所述编码基因的载体和基因工程菌。

本发明还涉及所述的烟酸磷酸核糖基转移酶突变体在多酶偶联法生物合成L-草铵膦中的应用，所述应用为：以PPO为底物、甲酸铵为辅底物，在谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和烟酸磷酸核糖基转移酶突变体多酶体系催化下，制备获得L-草铵膦。

所述谷氨酸脱氢酶为NADPH辅酶依赖型脱氢酶，所述甲酸脱氢酶为NADP辅酶依赖型脱氢酶。谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶构建辅酶循环途径，实现NADPH与NADP的相互转化。常见生物体中NADP均是直接从NAD转化而来，本发明所述烟酸磷酸核糖基转移酶是NAD代谢合成途径中的关键限速基因，其对胞内辅酶水平，尤其是胞内NAD水平具有显著影响；因此采用烟酸磷酸核糖基转移酶对胞内NAD进行积累，为NADPH/NADP循环提供基础。

上述酶体系可由E.coli BL21(DE3)基因工程菌同时表达获得。经条件优化，催化PPO制备L-草铵膦最适反应条件如下：表达所述谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和烟酸磷酸核糖基转移酶突变体的基因工程菌添加量为20g/L，所述PPO浓度为400mM，辅底物甲酸铵浓度为800mM，反应的温度为35℃，反应pH值为7.5。

本发明还涉及所述的烟酸磷酸核糖基转移酶突变体在多酶偶联法生物合成D-氨基酸中的应用，所述应用为：以丙酮酸为底物，在氨基酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和烟酸磷酸核糖基转移酶突变体多酶体系催化下，制备获得D-氨基酸。本发明采用NADH依赖型氨基酸脱氢酶不对称还原丙酮酸制备D-氨基酸，采用甲酸脱氢酶构建辅酶循环***，同时引入烟酸磷酸核糖基转移酶突变体将NA转变为NAMN促进胞内NAD积累，为辅酶循环体系提供辅底物。

本发明还涉及所述的烟酸磷酸核糖基转移酶突变体在多酶偶联法生物合成L-叔亮氨酸中的应用，所述应用为：以3-甲基丙酮酸为底物，在亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和烟酸磷酸核糖基转移酶突变体多酶体系催化下，制备获得L-叔亮氨酸。本发明采用NADH依赖型的亮氨酸脱氢酶催化底物3-甲基丙酮酸制备L-叔亮氨酸；甲酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶实现辅酶循环，甲酸铵为辅底物。

本发明还涉及所述的烟酸磷酸核糖基转移酶突变体在多酶偶联法生物合成L-氨基丁酸中的应用，所述应用为：以2-羰基丁酸为底物，在亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和烟酸磷酸核糖基转移酶突变体多酶体系催化下，制备获得L-氨基丁酸。本发明采用NADPH依赖型亮氨酸脱氢酶不对称还原2-羰基丁酸制备L-氨基丁酸，采用甲酸脱氢酶构建辅酶循环***，共表达烟酸磷酸核糖基转移酶突变体将NA转变为NAMN促进胞内NAD积累。

本发明所用的NADPH依赖型谷氨酸脱氢酶来源于假单胞(Pseudomonas monteiliiWP_060477601.1)，其核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

本发明所用的NADP依赖型甲酸脱氢酶来源于假单胞菌(Pseudomonas sp.101)，其核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

本发明所用的NAD依赖型甲酸脱氢酶来源于解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)，其核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。

本发明所用的NADH依赖型氨基酸脱氢酶来源于红球菌(Rhodococcuserythropolis BCRC 10909)，其核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。

本发明所用的NADH依赖型亮氨酸脱氢酶来源于嗜热硬脂双歧杆菌(Geobacillusstearothermophilus)，其核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。

本发明的有益效果主要体现在：

(1)本发明烟酸磷酸核糖基转移酶突变体，提高胞内NAD水平，为辅酶依赖型多酶催化反应带来高效、低成本且环境友好的生产方式，不需要额外添加辅酶；(2)本发明烟酸磷酸核糖基转移酶突变体具有更好的催化效率，以中间产物PPO为底物进行催化反应时，转化率远高于原始酶，L-草铵膦产率也大幅提升；(3)本发明能够不外源添加辅酶直接利用PPO制备生产L-草铵膦，无需昂贵的拆分试剂，也无需合成草铵膦衍生物，更无需对D-草铵膦进行分离、再消旋、再拆分等步骤。

(四)附图说明

图1为本发明方法采用的多酶偶联法以PPO为底物制备L-草铵膦的反应式。

图2为本发明方法采用的多酶偶联法以丙酮酸为底物制备D-氨基酸的反应式。

图3为本发明方法采用的多酶偶联法以3-甲基丙酮酸为底物制备L-叔亮氨酸的反应式。

图4为本发明方法采用的多酶偶联法以2-羰基丁酸为底物制备L-氨基丁酸的反应式。

图5为分别烟酸磷酸核糖基转移酶野生型菌株与突变体L360A菌株、突变体L360A-A223K菌株、突变体L360A-K372D菌株相对NAD辅酶含量对比图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法。

基因工程所用材料和试剂：质粒提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒采购自康宁生命科学(吴江)有限公司；基因片段扩增试剂采购自南京诺维赞有限公司的

MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase；E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)、辅酶检测试剂盒采购自碧云天、核酸提取试剂盒采购自擎科生物杭州分公司；质粒pETDuet-1、pRSFDuet-1等购自Novagen公司；相关的序列和引物由擎科生物杭州分公司合成。以上试剂使用方法参考使用说明书。其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

实施例1：烟酸磷酸核糖基转移酶基因工程菌的构建

将来源于荧光假单胞菌的烟酸磷酸核糖基转移酶(GenBank号:ABA72292.1)的氨基酸序列SEQ ID No.1经密码子优化后送擎科生物南京分公司进行全基因合成，并克隆到重组表达质粒pRSFDuet-1上酶切位点KpnI和XhoI之间。密码子优化后的烟酸磷酸核糖基转移酶基因序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2：烟酸磷酸核糖基转移酶突变体库的构建

将实施例1中获得的烟酸磷酸核糖基转移酶菌株划线于对应抗性的平板上，37℃培养12h。挑取单菌落转接于相应抗性的10mL LB液体培养基试管中，150rpm培养8h。按照擎科核酸提取试剂盒的操作说明书，提取烟酸磷酸核糖基转移酶质粒，质粒命名为pRSFDuet-1-NAPRT。

第一轮以上述提取的质粒为模板，定点突变PCR。以表1中的L360A-f和L360A-r为突变引物进行定点突变PCR。PCR产物，转化，涂平板，通过筛选获得L360A突变体，命名为L360A。

第二轮以L360A为模板，定点突变PCR。以表1中的A223K-f和A223K-r为突变引物进行定点突变PCR。PCR产物，转化，涂平板，通过筛选获得L360A突变和A223K突变的突变体，命名为L360A-A223K。

第三轮以L360A为模板，定点突变PCR。以表1中的K372D-f和K372D-r为突变引物进行定点突变PCR。将PCR产物，转化，涂平板，通过筛选获得L360A突变和K372D突变的突变体，命名为L360A-K372D。

表1：突变引物

其中，PCR反应体系如下：2×Phanta Max缓冲液：25μL；dNTPs：1μL；上游引物：2μL；下游引物：2μL；模板：1μL；Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶：1μL；ddH₂O：18μL。

PCR反应条件：预变性95℃5min；变性95℃15s，退火59℃30s，延伸72℃5min，共循环30次；后延伸72℃10min；4℃保存。

PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，结果显示扩增产物为单一条带，大小分别为5000bp左右，再将PCR产物进行DpnI酶消化模板。

实施例3：双质粒工程菌的构建

谷氨酸脱氢酶基因(SEQ ID No.9)和甲酸脱氢酶基因(SEQ ID No.10)分别位于质粒pETDuet-1上的第一个多克隆位点和第二个多克隆位点，该质粒命名为pETDuet-1-GluDH-FDH。烟酸磷酸核糖基转移酶基因位于pRSFDuet-1质粒的第一个多克隆位点，命名为pRSFDuet-1-NAPRT。利用质粒提取试剂盒将这两种质粒提取出来，导入同一个BL21(DE3)感受态细胞中，涂布在氨苄和卡那霉素抗性平板上，培养12小时。挑单菌落接种至含有相应抗性的10ml LB液体培养基中，37℃震荡培养10h。用30％甘油按照1:1的比例加入菌液，放入-80度冰箱保藏。

实施例4：双质粒工程菌的培养

利用工程菌作为催化剂进行规模化制备产物时，需要一定量的菌体。因此需要对构建的工程菌进行大规模培养制备。将保藏的谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和烟酸磷酸核糖基转移酶共表达工程菌的甘油管经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含有50μg/mL氨苄和卡那霉素抗性的10mL LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2％的接种量转接至50ml同样含有50ug/mL氨苄和卡那霉素抗性的TB液体培养基中，37℃震荡培养至OD₆₀₀达到0.8左右时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下震荡培养16h。培养结束后，将培养液8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，放到-20℃冰箱保存，待用。

实施例5：谷氨酸脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和烟酸磷酸核糖基转移酶基因重组共表达菌催化PPO反应生成L-草铵膦

按照实施例4制备收集一定量菌体。以中间产物PPO为底物，甲酸铵为辅酶再生底物，利用细胞内源性NADPH，不添加外源NADPH或NADP⁺，以pH7.5磷酸盐缓冲液为反应介质构成10mL反应体系。催化剂用量为20g/L湿菌体，PPO终浓度为300mM，甲酸铵终浓度为600mM,35℃，600转/分钟反应4h，取100ul反应液加入含有5ul 6M盐酸的1.5mL EP管中终止反应。1200rmp离心1min，取上清20uL至新的2mL EP管中，加入980ul超纯水，震荡混匀用于PPO的HPLC检测。

PPO浓度检测：月旭科技C18色谱柱(5μm，100A，4.6mm×250mm)，流动相为50mM磷酸二氢铵溶液:乙腈＝88:12(磷酸二氢铵溶液:称取5.75g磷酸二氢胺溶于800ml超纯水中，加入1.0g四丁基氢氧化铵，用磷酸调pH到3.8，定容至1L)，流速为1mL/min，柱温箱40℃，检测波长为232nm。反应8小时转化率为100％。

实施例6：烟酸磷酸核糖基转移酶及其突变体在制备L-草铵膦中的应用

谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和烟酸磷酸核糖基转移酶及其突变体共表达工程菌制备L-草铵膦：

以实施例4方法制备谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和烟酸磷酸核糖基转移酶及其突变体共表达的湿菌体。反应体系：400mM PPO，甲酸铵800mM，pH为7.5。反应4h后取样用于液相分析。结果发现，相对于原始烟酸磷酸核糖基转移酶，L360A突变体产量提高了63.98％，L360A-A223K突变体产量提高了125.04％，L360A-K372D突变体产量提高了91.51％。

实施例7：

谷氨酸脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和烟酸磷酸核糖基转移酶基因共表达的工程菌催化PPO生成L-草铵膦过程中的pH优化：

按照实施例4方法制备收集一定量菌体。以中间产物PPO为底物，甲酸铵为辅酶再生底物，利用细胞内源性NADPH，不添加外源NADPH或NADP⁺，以pH值分别为5.5、6.5、7.5、8.5的磷酸盐缓冲液为反应介质构成10mL反应体系。催化剂用量为20g/L湿菌体，PPO终浓度为400mM，甲酸铵终浓度为800mM，35℃，600转/分钟反应4h，取100ul反应液加入含有5ul 6M盐酸的1.5mL EP管中终止反应。1200rmp离心1min，取上清20ul至新的2mL EP管中，加入980ul超纯水，震荡混匀用于PPO的HPLC检测。检测方法参照实施例4。

反应6小时后，pH为5.5体系中PPO转化率为65.19％；pH为6.5体系中PPO转化率为89.47％；pH为7.5体系中PPO转化率为100％；pH为8.5体系中PPO转化率为90.98％。最优反应pH为7.5，在PPO底物浓度为400mM时，可以完全转化生成L-草铵膦。

因此，谷氨酸脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和烟酸磷酸核糖基转移酶基因共表达的工程菌催化PPO反应生成L-草铵膦过程中的pH最优条件为7.5。

实施例8：

谷氨酸脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和烟酸磷酸核糖基转移酶基因共表达的工程菌催化PPO反应生成L-草铵膦过程中的温度优化：

按照实施例4方法制备收集一定量菌体。以中间产物PPO为底物，甲酸铵为辅酶再生底物，利用细胞内源性NADPH，不添加外源NADPH或NADP⁺，反应温度分别为25、30、35、40、45℃的磷酸盐缓冲液为反应介质构成10mL反应体系。催化剂用量为20g/l湿菌体，PPO终浓度为400mM，甲酸铵终浓度为800mM，pH为7.5，600转/分钟反应4h，取100ul反应液加入含有5ul 6M盐酸的1.5mL EP管中终止反应。1200rmp离心1min，取上清20ul至新的2mL EP管中，加入980ul超纯水，震荡混匀用于PPO的HPLC检测。检测方法参照实施例4。

反应4小时后，25℃体系中PPO转化率为74.47％；30℃体系中PPO转化率为91.05％；35℃体系中PPO转化率为100％；40℃体系中PPO转化率为95.22％；45℃体系中PPO转化率为89.41％。反应最优温度为35℃。

实施例9：

比较烟酸磷酸核糖基转移酶野生型菌株pRSFDuet-1-NAPRT与突变体pRSFDuet-1-L360A菌株、突变体pRSFDuet-1-L360A-A223K菌株、突变体pRSFDuet-1-L360A-K372D菌株胞内NAD含量：

将构建完成的突变体菌株从甘油管划线，培养12h，转接相应抗性的试管，180rpm培养8h，再转接至100mL的TB培养基中。待OD₆₀₀至0.6～0.8时，加入0.1mM IPTG诱导14h，诱导温度为24℃。收集发酵液，根据实施例1中所购碧云天辅酶试剂盒检测不同突变体胞内辅酶水平。检测数据处理如图5。突变体L360A胞内NAD提高51.66％，突变体L360A-A223K胞内NAD提高78.93％，突变体L360A-K372D胞内NAD提高68.25％。

实施例10：

氨基酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和烟酸磷酸核糖基转移酶及其突变体共表达工程菌制备D-氨基酸：

参照实施例3、4方法构建并制备氨基酸脱氢酶(编码基因序列参见SEQ IDNO.12)、甲酸脱氢酶(编码基因序列参见SEQ ID NO.11)和烟酸磷酸核糖基转移酶或烟酸磷酸核糖基转移酶突变体共表达湿菌体。以20g/L共表达湿菌体为生物催化剂。反应体系：80mM甲酸铵，100mM丙酮酸。反应4h后取样用于液相分析。结果发现，相对于烟酸磷酸核糖基转移酶，L360A突变体产量提高了71.33％，L360A-A223K突变体产量提高了109.19％，L360A-K372D突变体产量提高了87.60％。

实施例11：

亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和烟酸磷酸核糖基转移酶及其突变体共表达工程菌制备L-叔亮氨酸：

参照实施例3、4方法构建并制备亮氨酸脱氢酶(编码基因序列参见SEQ IDNO.13)、甲酸脱氢酶(编码基因序列参见SEQ ID NO.11)和烟酸磷酸核糖基转移酶或烟酸磷酸核糖基转移酶突变体共表达湿菌体。反应体系：3-甲基丙酮酸100mM，甲酸铵200mM，pH为7。反应4h后取样用于液相分析。结果发现，相对于烟酸磷酸核糖基转移酶，L360A突变体产量提高了80.15％，L360A-A223K突变体产量提高了168.74％，L360A-K372D突变体产量提高了115.87％。

实施例12：

亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和烟酸磷酸核糖基转移酶及其突变体共表达工程菌制备L-氨基丁酸：

参照实施例3、4方法构建并制备亮氨酸脱氢酶(编码基因序列参见SEQ IDNO.13)、甲酸脱氢酶(编码基因序列参见SEQ ID NO.11)和烟酸磷酸核糖基转移酶或烟酸磷酸核糖基转移酶突变体共表达湿菌体。反应体系：2-羰基丁酸1M，甲酸铵500mM。反应4h后取样用于液相分析。结果发现，相对于烟酸磷酸核糖基转移酶，L360A突变体产量提高了86.98％，L360A-A223K突变体产量提高了167.01％，L360A-K372D突变体产量提高了115.96％。

Claims

1.一种烟酸磷酸核糖基转移酶突变体，由SEQ ID NO.1所示烟酸磷酸核糖基转移酶经定点突变而得，所述点突变的位点为下列之一或其中两种以上的组合：(1)第360位，(2)第223位，(3)第372位。

2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.6～8之一所示。

3.编码权利要求1或2所述烟酸磷酸核糖基转移酶突变体的基因。

4.如权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQ IDNO.3～5之一所示。

5.含有权利要求4所述编码基因的载体。

6.含有权利要求4所述编码基因的基因工程菌。

7.权利要求1或2所述的烟酸磷酸核糖基转移酶突变体在多酶偶联法生物合成L-草铵膦中的应用，所述应用为：以PPO为底物、甲酸铵为辅底物，在谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和烟酸磷酸核糖基转移酶突变体多酶体系催化下，制备获得L-草铵膦。

8.权利要求1或2所述的烟酸磷酸核糖基转移酶突变体在多酶偶联法生物合成D-氨基酸中的应用，所述应用为：以丙酮酸为底物，在氨基酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和烟酸磷酸核糖基转移酶突变体多酶体系催化下，制备获得D-氨基酸。

9.权利要求1或2所述的烟酸磷酸核糖基转移酶突变体在多酶偶联法生物合成L-叔亮氨酸中的应用，所述应用为：以3-甲基丙酮酸为底物，在亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和烟酸磷酸核糖基转移酶突变体多酶体系催化下，制备获得L-叔亮氨酸。

10.权利要求1或2所述的烟酸磷酸核糖基转移酶突变体在多酶偶联法生物合成L-氨基丁酸中的应用，所述应用为：以2-羰基丁酸为底物，在亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和烟酸磷酸核糖基转移酶突变体多酶体系催化下，制备获得L-氨基丁酸。