CN113913403B - 一种nadh激酶突变体、编码基因及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种NADH激酶突变体及其编码基因，以及其在多酶偶联法生物合成L‑草铵膦、D‑氨基酸和L‑氨基丁酸中的应用。所述突变体为SEQ ID No.1所示的NADH激酶经下列之一的突变所得：(1)第175位苏氨酸T突变为组氨酸H；(2)第175位苏氨酸T突变为组氨酸H、第252位精氨酸R突变为丙氨酸A；(3)第175位苏氨酸T突变为组氨酸H、第252位精氨酸R突变为丙氨酸A、第332位异亮氨酸I突变为赖氨酸K。本发明NADH激酶突变体具有更好的催化效率，以中间产物PPO为底物进行催化反应时，转化率远高于原始酶，L‑草铵膦产率也大幅提升，克服了化学法合成L‑PPT所具有的工艺步骤多、反应条件苛刻、手性原料昂贵等缺点，是一种高效、低成本且环境友好的生产方式。

Description

一种NADH激酶突变体、编码基因及其应用
技术领域
本发明涉及一种NADH激酶突变体及其编码基因，以及其在多酶偶联法生物合成L-草铵膦、D-氨基酸和L-氨基丁酸中的应用。
背景技术
手性氨基酸是应用广泛的手性化合物，在多肽和单对映体等活性药物中间体中具有重要意义。 利用生物酶法合成手性氨基酸具有操作简单、反应条件温和、产品收率高以及光学活性值高等优势，是目前手性氨基酸不对称合成的研究热点。利用氨基酸脱氢酶不对称还原前手性酮是最常见的方法，但氨基酸脱氢酶在不对称还原中需要消耗NADPH，由于NADPH价格昂贵，限制了其在工业水平的应用。采用酶偶联构建NADPH再生循环***可以有效的解决NADPH限制，其中甲酸脱氢酶（FDH）、醇脱氢酶（ADH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）是最常用于NADPH再生的酶。甲酸脱氢酶构建的辅酶循环***中，甲酸铵可同时作为甲酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶的胺供体，并且副产物 CO2可由气体形式离开体系，简化了反应体系以及后续的分离纯化工艺。尽管构建了NADPH再生体系，但在实际的催化中需要加入一定量的NADP或NADPH驱动反应的进行。NADH激酶是一种催化NADH和ATP反应生成NADPH的磷酸化酶，由于NADH相对于NADPH更为便宜，使得NADH激酶在工厂实际应用中具有重要意义。
草铵膦 （D，L-PPT） 是一种有机磷除草剂，具有低毒，安全性高、广谱等优点。在市场方面所销售的草铵膦主要是外消旋草铵膦，但只有L-PPT能发挥除草作用，且能在土壤微生物的作用下迅速降解。D构型草铵膦不具有除草活性，且对土壤有一定的损害。若能将D-PPT转化为L-PPT，使销售的草铵膦产品能以仅含L-PPT的形式使用，可降低草铵膦产品的使用量和使用成本，同时减轻环境压力。
L-PPT可由化学法和生物法合成，目前工业法生产主要采用化学法。
化学法合成L-PPT具有工艺步骤多、反应条件苛刻、手性原料昂贵等缺点，从而导致产品收率低，生产成本高，并且不是一种绿色环保的制备方法。而生物法可以克服上述化学法的局限性，是一种高效、低成本且环境友好的生产方式。生物法主要有三种：
（1）酶直接水解L-草铵膦的衍生物，其优点在于转化率高，产物ee值较高，但所用原料为昂贵且不易获得的手性前体。
（2）酶的选择性拆分外消旋草铵膦，其优点在于原料相对易得，催化效率高，但是理论收率只能达到50％，极大地降低了原料利用率。
（3）以D，L-草铵膦为原料，先由D-氨基酸氧化酶催化D-草铵膦合成L-草铵膦前体2-羰基-4-[羟基（甲基）膦酰基]丁酸（简称PPO），再由氨基酸脱氢酶催化PPO得到L-草铵膦。该法的最大理论产率为100%，原料得到充分利用，因此相比于上述两种方法，该法在工业化生产中具有更广阔的应用前景。
利用生物酶法合成D-丙氨酸具有高效催化、绿色环保等特点。以丙酮酸为底物，在D-氨基酸脱氢酶的作用下生成D-丙氨酸，同时NADPH氧化为NADP，加入甲酸脱氢酶（FDH）又将NADP转化为NADPH构成循环体系，因此反应过程不需要源源不断地加入昂贵的NADPH。该方法成本较低、产品光学纯度高，适用于工业化大生产。
通过生物多酶偶联法以L-苏氨酸为原料经过苏氨酸脱氨酶生成2-羰基丁酸，2-羰基丁酸在亮氨酸脱氢酶作用下不对称还原生成L-氨基丁酸，同时利用甲酸脱氢酶建立高效NADPH再生循环***。该方法具有价格低廉，转化效率高等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种NADH激酶突变体及其编码基因，以及其在多酶偶联法生物合成L-草铵膦、D-氨基酸和L-氨基丁酸中的应用。
本发明采用的技术方案是：
一种NADH激酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的NADH激酶经下列之一的突变所得：（1）第175位苏氨酸T突变为组氨酸H（突变体T175H）；（2）第175位苏氨酸T突变为组氨酸H、第252位精氨酸R突变为丙氨酸A（突变体T175H-R252A）；（3）第175位苏氨酸T突变为组氨酸H、第252位精氨酸R突变为丙氨酸A、第332位异亮氨酸I突变为赖氨酸K（突变体T175H-R252A-I332K）。
本发明NADH激酶来源于酿酒酵母，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，编码基因如SEQ ID No.2所示。
本发明还涉及所述NADH激酶突变体的编码基因。
具体的，所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.3或4所示。
本发明还涉及所述NADH激酶突变体在多酶偶联法生物合成L-草铵膦中的应用。
具体的，所述应用为：以外消旋D，L-草铵膦为底物，先利用D-氨基酸氧化酶催化D-草铵膦生成PPO，使得L-草铵膦得以保留，同时，加入过氧化氢酶去除过氧化氢副产物，然后，再以PPO为底物、甲酸铵为辅底物，经谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶与NADH激酶多酶体系催化制备L-草铵膦。
本发明采用NADPH依赖型谷氨酸脱氢酶不对称还原PPO制备L-PPT，采用甲酸脱氢酶构建辅酶循环***，但由于胞内NADPH含量较低，不能满足反应的需求，因此采用NADH激酶突变体将胞内含量较多的NADH磷酸化生成更多的NADPH以促进反应的进行。上述酶体系可由E .coli BL21（DE3）基因工程菌同时表达获得。经条件优化，催化PPO制备L-草铵膦最适反应条件如下：表达所述谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和NADH激酶突变体的基因工程菌添加量为20 g/L，所述PPO浓度为200 mM，辅底物甲酸铵浓度为700mM，反应的温度为35℃，反应pH值为7.5。
本发明还涉及所述NADH激酶突变体在多酶偶联法生物合成D-氨基酸中的应用。本发明采用NADPH依赖型D-氨基酸脱氢酶不对称还原丙酮酸制备D-氨基酸，采用甲酸脱氢酶构建辅酶循环***，同时引入NADH激酶突变体将NADH转变为NADPH促进反应的进行。
具体的，所述应用为：以丙酮酸为底物，以D-氨基酸脱氢酶和甲酸脱氢酶、NADH激酶突变体为催化体系，催化制得D-丙氨酸。
本发明还涉及所述NADH激酶突变体在多酶偶联法生物合成L-氨基丁酸中的应用。本发明采用NADPH依赖型亮氨酸脱氢酶不对称还原2-羰基丁酸制备L-氨基丁酸，采用甲酸脱氢酶构建辅酶循环***，共表达NADH激酶突变体将NADH转变为NADPH促进反应的进行。
具体的，所述应用为：以2-羰基丁酸为底物，以亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶、NADH激酶突变体为催化体系，催化制得L-氨基丁酸。
本发明所用谷氨酸脱氢酶来源于蒙氏假单胞（Pseudomonas monteilii WP_ 060477601.1）。
本发明所用的甲酸脱氢酶来源于布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri），其基因序列来自Gen Bank：No.WP_013726924.1。
本发明所用的亮氨酸脱氢酶来自于蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。
本发明所用的苏氨酸转氨酶来自于E.coli。
本发明的有益效果主要体现在：
（1）本发明以外消旋D，L-草铵膦为底物，利用D-氨基酸氧化酶将D-草铵膦氧化为PPO，L-草铵膦因不参与反应而被完全保留；PPO又经谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和NADH激酶全部还原为L-草铵膦，进而实现D，L-草铵膦的原位去消旋化，不会造成原料的浪费。
（2）本发明能够直接以D，L-草铵膦为底物进行拆分，无需昂贵的拆分试剂，也无需合成草铵膦衍生物，更无需对D-草铵膦进行分离、再消旋、再拆分等步骤。
（3）本发明在NADPH依赖型谷氨酸脱氢酶催化PPO制备L-草铵膦、NADPH氧化为NADP时，利用甲酸脱氢酶将NADP还原为NADPH，构成NADPH循环***，从而减少反应中NADPH的使用量。
（4）本发明在NADPH依赖型谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶催化PPO制备L-草铵膦时，偶联NADH激酶，将胞内的NADH磷酸化生成NADPH，从而不需要外源加入NADPH来促进反应的进行。
（5）本发明NADH激酶突变体具有更好的催化效率，以中间产物PPO为底物进行催化反应时，转化率远高于原始酶，L-草铵膦产率也大幅提升。
（6）本发明方法克服了化学法合成L-PPT所具有的工艺步骤多、反应条件苛刻、手性原料昂贵等缺点，是一种高效、低成本且环境友好的生产方式。
附图说明
图1为发明方法采用的多酶偶联法以PPO为底物生产L-草铵膦的反应式。
图2为本发明方法采用的多酶偶联法以丙酮酸为底物生产D-丙氨酸的反应式。
图3为本发明方法采用的多酶偶联法以苏氨酸为底物生产L-氨基丁的反应式。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
上游基因工程所用试剂：Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 购自南京诺唯赞生物有限公司；Dpn I 购自 Thermo Scientific 公司。质粒提取试剂盒PlasmidMiniprep Kit、PCR 清洁试剂盒 PCR Clean-up Kit 购于AxyPrep 公司；一步克隆试剂盒ClonExpressII One Step Cloning Kit购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司。E.coli BL21（DE3）购自上海旭冠生物科技发展有限公司；DNA marker、低分子量标准蛋白、蛋白胶等购自北京Gen Star有限公司；重组质粒构建、引物合成，序列测序工作由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。D-氨基酸脱氢酶由湖南福来格生物技术有限公司生产，其他常用试剂购自国药集团化学试剂有限公司。以上试剂使用方法参考商品说明书。
实施例1：NADH激酶基因工程菌的构建
将来源于酿酒酵母的NADH激酶（Gen Bank号:NC_001148.4）的基因序列经密码子优化后送生工生物工程（上海）股份有限公司进行全基因合成，并克隆到重组表达质粒pET-28a（+）上。密码子优化后的NADH激酶基因序列如SEQ ID No.2所示。
由于谷氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶所用表达载体为pETDuet-1质粒，该质粒不能与pET-28a（+）质粒共存，因此将NADH激酶的重组表达载体换为pCDFDuet质粒。以空pCDFDuet质粒为模板，表一中的pCDFDuet-Pf和pCDFDuet-Pr为引物进行PCR，将这一过程称为质粒线性化。以合成的重组质粒为模板，以表1中NADHK-Pf和NADHK-Pr为引物进行扩增，将这一步称为NADH激酶扩增。将上述两种PCR产物经PCR Clean-up Kit纯化，纯化产物用NanoDropTMOne/OneC 超微量紫外分光光度计测其核酸浓度，再经ClonExpress IIOne Step CloningKit一步克隆得到重组质粒。上述重组质粒进行转化，涂板，挑单菌落送测序。
其中， PCR体系如下：2×Phanta Max缓冲液：25μL；dNTPs：1μL；上游引物：2μL；下游引物：2μL；模板：1μL；Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶：1μL；ddH2O：18μL。一步克隆体系为：质粒线性化纯化产物：1uL; NADK激酶扩增纯化产物：1uL。质粒线性化PCR反应条件如下：预变性95℃ 5min；变性95℃ 15s，退火59℃ 30s，延伸72℃ 3 min，共循环30次；后延伸72℃ 10min；4℃保存。NADH激酶扩增PCR反应条件如下：预变性95℃ 5min；变性95℃ 15s，退火59℃ 30s，延伸72℃ 1min 30s，共循环30次；后延伸72℃ 10min；4℃保存。一步克隆反应条件如下：37℃ 30min， 4℃保存。PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，结果显示扩增产物为单一条带，线性化质粒条带为3500bp左右，NADH激酶扩增条带为1500bp左右。
表1：引物序列
实施例2：NADH激酶突变体库的构建
第一轮将上述保存的菌液接试管培养，提取质粒作为NADH激酶突变定点突变PCR的模板，以表二中的T175H-Pf和T175H-Pr为突变引物进行定点突变PCR。PCR产物，转化，涂平板，通过筛选获得T175H突变体，命名为T175H。
第二轮以T175H为模板以表二中的R252A-Pf、R252A-Pr为引物进行定点突变PCR。PCR产物，转化，涂平板，通过筛选获得T175H突变和R252A的突变体，命名为T175H-R252A。
第三轮以T175H-R252A为模板，以表2中的I332K-Pf、I332K-Pr为引物进行定点突变PCR。PCR产物，转化，涂平板，通过筛选获得T175H突变和R252A的突变体，命名为T175H-R252A-I332K。
其中，PCR反应体系如下：2×Phanta Max缓冲液：25μL；dNTPs：1μL；上游引物：2μL；下游引物：2μL；模板：1μL；Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶：1μL；ddH2O：18μL。
PCR反应条件：预变性95℃ 5min；变性95℃ 15s，退火59℃ 30s，延伸72℃ 5 min，共循环30次；后延伸72℃ 10min；4℃保存。
PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，结果显示扩增产物为单一条带，大小分别为5000bp左右，再将PCR产物进行DpnI酶消化模板。
表2：引物序列
实施例3：双质粒工程菌的构建
谷氨酸脱氢酶基因和甲酸脱氢酶基因分别位于质粒PetduetI上的第一个多克隆位点和第二个多克隆位点，该质粒命名为PetduetI-GluDH-FDH。NADH激酶基因位于PcdfduetI质粒的一个多克隆位点，命名为PcdfduetI-NADHK。利用质粒提取试剂盒将这两种质粒提取出来，导入同一个BL21感受态细胞中，涂布在同时含有链霉素和氨苄抗性的平板上，培养12小时。挑单菌落接种至含有50ul/ml链霉素和50ul/ml氨苄抗性的10ml LB液体培养基中，37℃震荡培养10h。用30%甘油按照1:1的比例加入菌液，放入-80度冰箱保藏。
实施例4：菌体的大规模制备
因转化PPO生产L-草铵膦的过程中，需要大量的生物催化剂，因此需要菌体大规模制备。将保藏的谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和NADH激酶共表达工程菌的甘油管经平皿划线活化后，挑单菌落接种至含有50μg/m L链霉素和氨苄抗性的10m L LB液体培养基中，37℃震荡培养12h。按2%的接种量转接至50ml同样含有50ug/ml链霉素和50ul/ml氨苄抗性的TB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600达到0.8左右时，加入终浓度为0.1mM的IPTG，24℃下震荡培养15h。培养结束后，将培养液8000rmp离心10min，弃上清，收集菌体，放到-20℃冰箱保存，待用。
各谷氨酸脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和NADH激酶突变基因共表达的工程菌体也按上述方法制得。
实施例5：谷氨酸脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和NADH激酶基因共表达的工程菌体催化PPO反应生成L-草铵膦过程
实施例4方法制备的谷氨酸脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和NADH激酶基因基因共表达湿菌体为催化剂，以中间产物PPO为底物，甲酸铵为辅酶再生底物，利用细胞内源性NADPH，不添加外源NADPH或NADP+，以、pH5.5磷酸盐缓冲液为反应介质构成10mL反应体系。催化剂用量为20g/l湿菌体，ppo终浓度为200mM，甲酸铵终浓度为600mM，30℃，600转/分钟反应4h，取100ul反应液加入含有5ul 6M盐酸的1.5mL EP管中终止反应。1200rmp离心1min，取上清20ul至新的2mL EP管中，加入980ul超纯水，震荡混匀用于PPO的HPLC检测。PPO 浓度检测：Unitary C18 色谱柱 （5 μm， 100 A， 4.6 mm × 250 mm），流动相 为 50 mM 磷酸二氢铵溶液：乙腈=88:12（磷酸二氢铵溶液：称取 5.75g 磷酸二氢胺溶于 800 ml 超纯水中，加入 1.0 g 四丁基氢氧化铵，用磷酸调 pH 到 3.8，定容至 1 L。），流速为 1 mL/min，柱温箱 40 ˚C，检测波长为 232 nm。
反应4小时后，ppo还剩137.23mM，转化了62.77mM，转化率为31.38%。
实施例6：谷氨酸脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和NADH激酶基因共表达的工程菌体催化PPO反应生成L-草铵膦过程中pH的优化
以实施例4方法制备的谷氨酸脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和NADH激酶基因基因共表达湿菌体为催化剂，以中间产物PPO为底物，甲酸铵为辅酶再生底物，利用细胞内源性NADPH，不添加外源NADPH或NADP+，分别以pH3.5、pH5.5、pH7.5、pH9.5磷酸盐缓冲液为反应介质构成10mL反应体系。催化剂用量为20g/l湿菌体，ppo终浓度为200mM，甲酸铵终浓度为600mM，30℃，600转/分钟反应4h，取100ul反应液加入含有5ul 6M盐酸的1.5mL EP管中终止反应。1200rmp离心1min，取上清20ul至新的2mL EP管中，加入980ul超纯水，震荡混匀用于PPO的HPLC检测。PPO 浓度检测：Unitary C18 色谱柱 （5 μm， 100 A， 4.6 mm × 250mm），流动相 为 50 mM 磷酸二氢铵溶液：乙腈=88:12（磷酸二氢铵溶液：称取 5.75g 磷酸二氢胺溶于 800 ml 超纯水中，加入 1.0 g 四丁基氢氧化铵，用磷酸调 pH 到 3.8，定容至 1 L。），流速为 1 mL/min，柱温箱 40 ˚C，检测波长为 232 nm。
反应4小时后，pH3.5体系中ppo还剩189.77mM，转化了10.23mM，转化率为5.12%；pH5.5体系中ppo还剩137.23mM，转化了62.77mM，转化率为31.38%；pH7.5体系中ppo还剩109.77mM，转化了89.23mM，转化率为44.6%；pH9.5体系中ppo还剩158.78mM，转化了41.22mM，转化率为20.6%。
谷氨酸脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和NADH激酶基因共表达的工程菌体催化PPO反应生成L-草铵膦过程中最适pH为7.5。
实施例7：谷氨酸脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和NADH激酶基因共表达的工程菌体催化PPO反应生成L-草铵膦过程中温度的优化
以实施例4方法制备的谷氨酸脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和NADH激酶基因基因共表达湿菌体为催化剂，以中间产物PPO为底物，甲酸铵为辅酶再生底物，利用细胞内源性NADPH，不添加外源NADPH或NADP+，以、pH7.5磷酸盐缓冲液为反应介质构成10mL反应体系。催化剂用量为20g/l湿菌体，ppo终浓度为200mM，甲酸铵终浓度为600mM，反应温度分别为30℃、35℃、40℃、45℃，600转/分钟反应4h，取100ul反应液加入含有5ul 6M盐酸的1.5mL EP管中终止反应。1200rmp离心1min，取上清20ul至新的2mL EP管中，加入980ul超纯水，震荡混匀用于PPO的HPLC检测。PPO 浓度检测：Unitary C18 色谱柱 （5 μm， 100 A， 4.6 mm ×250 mm），流动相 为 50 mM 磷酸二氢铵溶液：乙腈=88:12（磷酸二氢铵溶液：称取 5.75g磷酸二氢胺溶于 800 ml 超纯水中，加入 1.0 g 四丁基氢氧化铵，用磷酸调 pH 到 3.8，定容至 1 L。），流速为 1 mL/min，柱温箱 40 ˚C，检测波长为 232 nm。
反应4小时后，30℃的反应体系中，ppo还剩110.72mM，转化了89.28mM，转化率为44.64%；35℃的反应体系中，ppo还剩108.28mM，转化了91.72mM，转化率为45.86%；40℃的反应体系中，ppo还剩112.62mM，转化了87.38mM，转化率为43.69%；45℃的反应体系中，ppo还剩154.29mM，转化了45.71mM，转化率为22.86%。
谷氨酸脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和NADH激酶基因共表达的工程菌体催化PPO反应生成L-草铵膦过程中最适反应温度为35℃。
实施例8：
谷氨酸脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和NADH激酶基因共表达的工程菌体催化PPO反应生成L-草铵膦过程甲酸铵添加量的优化。
以实施例4方法制备的谷氨酸脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和NADH激酶基因基因共表达湿菌体为催化剂，以中间产物PPO为底物，甲酸铵为辅酶再生底物，利用细胞内源性NADPH，不添加外源NADPH或NADP+，以、pH7.5磷酸盐缓冲液为反应介质构成10mL反应体系。催化剂用量为20g/l湿菌体，ppo终浓度为200mM，甲酸铵终浓度分别为500mM、600、700、800，反应温度分别为30℃，600转/分钟反应4h，取100ul反应液加入含有5ul 6M盐酸的1.5mL EP管中终止反应。1200rmp离心1min，取上清20ul至新的2mL EP管中，加入980ul超纯水，震荡混匀用于PPO的HPLC检测。PPO 浓度检测：Unitary C18 色谱柱 （5 μm， 100 A， 4.6 mm ×250 mm），流动相 为 50 mM 磷酸二氢铵溶液：乙腈=88:12（磷酸二氢铵溶液：称取 5.75g磷酸二氢胺溶于 800 ml 超纯水中，加入 1.0 g 四丁基氢氧化铵，用磷酸调 pH 到 3.8，定容至 1 L。），流速为 1 mL/min，柱温箱 40 ˚C，检测波长为 232 nm。
反应4小时后，甲酸铵终浓度为500mM的反应体系中，ppo还剩130.31mM，转化了69.69mM，转化率为34.85%；甲酸铵终浓度分为600mM的反应体系中，ppo还剩110.23mM，转化了89.77mM，转化率为44.89%；甲酸铵终浓度为700mM的反应体系中，ppo还剩101.34mM，转化了98.43mM，转化率为49.17%；甲酸铵终浓度为800mM的反应体系中，ppo还剩105.25mM，转化了94.75mM，转化率为47.375%。
谷氨酸脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和NADH激酶基因共表达的工程菌体催化PPO反应生成L-草铵膦过程中最适甲酸铵添加量为700mM。
实施例9：
以实施例4方法制备的谷氨酸脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和T175H基因共表达湿菌体为催化剂。以pH7.5磷酸盐缓冲液为反应介质构成10mL反应体系。催化剂用量为20g/l湿菌体，ppo终浓度为200mM，甲酸铵终浓度为700mM，35℃，600转/分钟反应4h，取100ul反应液加入含有5ul 6M盐酸的1.5mL EP管中终止反应。1200rmp离心1min，取上清20ul至新的2mL EP管中，加入980ul超纯水，震荡混匀用于PPO的HPLC检测。
反应4小时后，ppo还剩69.77mM，转化了130.23mM，转化率为65.12%。
实施例10：
以实施例4方法制备的谷氨酸脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和T175H-R252A基因共表达湿菌体为催化剂。以pH7.5磷酸盐缓冲液为反应介质构成10mL反应体系。催化剂用量为20g/l湿菌体，ppo终浓度为200mM，甲酸铵终浓度为700mM，35℃，600转/分钟反应4h，取100ul反应液加入含有5ul 6M盐酸的1.5mL EP管中终止反应。1200rmp离心1min，取上清20ul至新的2mL EP管中，加入980ul超纯水，震荡混匀用于PPO的HPLC检测。
反应4小时后，ppo还剩48.17mM，转化了151.83mM，转化率为75.92%。
实施例11：
以实施例4方法制备的谷氨酸脱氢酶基因、甲酸脱氢酶基因和T175H-R252A-I332K基因共表达湿菌体为催化剂。以pH7.5磷酸盐缓冲液为反应介质构成10mL反应体系。催化剂用量为20g/l湿菌体，ppo终浓度为200mM，甲酸铵终浓度为700mM，35℃，600转/分钟反应4h，取100ul反应液加入含有5ul 6M盐酸的1.5mL EP管中终止反应。1200rmp离心1min，取上清20ul至新的2mL EP管中，加入980ul超纯水，震荡混匀用于PPO的HPLC检测。
反应4小时后，ppo完全转化，转化率达到为100%。
实施例12：
苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和NADH激酶或NADH激酶突变体四酶共表达工程菌株交由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以实施例4方法制备苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和NADH激酶或NADH激酶突变体四酶共表达湿菌体。以20g/l苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶和NADH激酶或NADH激酶突变体湿菌体为生物催化剂催化20M L-苏氨酸，30M甲酸铵，反应4h后取样用于液相分析。结果发现，相对于NADH激酶，T175H突变体产量提高了47.66%，T175H-R252A突变体产量提高了90.65%，T175H-R252A-I332K突变体产量提高了159.65%。
实施例13：
D-氨基酸脱氢酶由湖南福来格生物技术有限公司生产，甲酸脱氢酶和NADH激酶或NADH激酶共表达菌株由杭州擎科梓熙生物技术有限公司完成。以实施例4方法制备的甲酸脱氢酶和NADH激酶或NADH激酶突变体共表达湿菌体为催化剂。14 U/mL D氨基酸脱氢酶、20g/l甲酸脱氢酶和NADH激酶或NADH激酶突变体湿菌体催化10M丙酮酸，20M甲酸铵，反应4h后取样用于液相分析。结果发现，相对于NADH激酶，T175H突变体产量提高了39.98%，T175H-R252A突变体产量提高了88.76%，T175H-R252A-I332K突变体产量提高了135.76%。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种NADH激酶突变体、编码基因及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 414
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 1
Met Phe Val Arg Val Lys Leu Asn Lys Pro Val Lys Trp Tyr Arg Phe
1 5 10 15
Tyr Ser Thr Leu Asp Ser His Ser Leu Lys Leu Gln Ser Gly Ser Lys
20 25 30
Phe Val Lys Ile Lys Pro Val Asn Asn Leu Arg Ser Ser Ser Ser Ala
35 40 45
Asp Phe Val Ser Pro Pro Asn Ser Lys Leu Gln Ser Leu Ile Trp Gln
50 55 60
Asn Pro Leu Gln Asn Val Tyr Ile Thr Lys Lys Pro Trp Thr Pro Ser
65 70 75 80
Thr Arg Glu Ala Met Val Glu Phe Ile Thr His Leu His Glu Ser Tyr
85 90 95
Pro Glu Val Asn Val Ile Val Gln Pro Asp Val Ala Glu Glu Ile Ser
100 105 110
Gln Asp Phe Lys Ser Pro Leu Glu Asn Asp Pro Asn Arg Pro His Ile
115 120 125
Leu Tyr Thr Gly Pro Glu Gln Asp Ile Val Asn Arg Thr Asp Leu Leu
130 135 140
Val Thr Leu Gly Gly Asp Gly Thr Ile Leu His Gly Val Ser Met Phe
145 150 155 160
Gly Asn Thr Gln Val Pro Pro Val Leu Ala Phe Ala Leu Gly Thr Leu
165 170 175
Gly Phe Leu Ser Pro Phe Asp Phe Lys Glu His Lys Lys Val Phe Gln
180 185 190
Glu Val Ile Ser Ser Arg Ala Lys Cys Leu His Arg Thr Arg Leu Glu
195 200 205
Cys His Leu Lys Lys Lys Asp Ser Asn Ser Ser Ile Val Thr His Ala
210 215 220
Met Asn Asp Ile Phe Leu His Arg Gly Asn Ser Pro His Leu Thr Asn
225 230 235 240
Leu Asp Ile Phe Ile Asp Gly Glu Phe Leu Thr Arg Thr Thr Ala Asp
245 250 255
Gly Val Ala Leu Ala Thr Pro Thr Gly Ser Thr Ala Tyr Ser Leu Ser
260 265 270
Ala Gly Gly Ser Ile Val Ser Pro Leu Val Pro Ala Ile Leu Met Thr
275 280 285
Pro Ile Cys Pro Arg Ser Leu Ser Phe Arg Pro Leu Ile Leu Pro His
290 295 300
Ser Ser His Ile Arg Ile Lys Ile Gly Ser Lys Leu Asn Gln Lys Pro
305 310 315 320
Val Asn Ser Val Val Lys Leu Ser Val Asp Gly Ile Pro Gln Gln Asp
325 330 335
Leu Asp Val Gly Asp Glu Ile Tyr Val Ile Asn Glu Val Gly Thr Ile
340 345 350
Tyr Ile Asp Gly Thr Gln Leu Pro Thr Thr Arg Lys Thr Glu Asn Asp
355 360 365
Phe Asn Asn Ser Lys Lys Pro Lys Arg Ser Gly Ile Tyr Cys Val Ala
370 375 380
Lys Thr Glu Asn Asp Trp Ile Arg Gly Ile Asn Glu Leu Leu Gly Phe
385 390 395 400
Asn Ser Ser Phe Arg Leu Thr Lys Arg Gln Thr Asp Asn Asp
405 410
<210> 2
<211> 1242
<212> DNA
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 2
atgttcgtcc gtgtaaaact taataagcca gttaaatggt atcgctttta ttccacgctt 60
gattcacatt cgctgaaatt acagagtggg tctaaattcg ttaagattaa acctgtcaac 120
aacctgcgct ctagtagttc agcggatttc gtcagtcctc ccaactccaa attacagtcc 180
ttgatctggc agaatccttt acagaatgtg tatattacca agaagccgtg gactccatca 240
actcgcgagg ctatggtgga gttcattact caccttcacg agtcctaccc cgaggtaaac 300
gttattgtcc agcctgacgt tgccgaagaa atcagtcaag actttaaatc tcctctggag 360
aacgacccta atcgcccgca tattctgtat acgggtcccg aacaggacat cgtcaatcgc 420
actgacttgt tggtgacgtt agggggtgac gggactatcc tgcacggggt ctccatgttt 480
ggtaatacgc aagtgcctcc cgttcttgca ttcgcgcttg gaacccttgg gttcttgtcc 540
ccctttgatt ttaaagagca taagaaagtt tttcaagagg ttatctcttc gcgtgcaaag 600
tgtctgcatc gtacccgttt ggaatgtcat cttaagaaaa aagattcgaa ttccagtatt 660
gtaacccacg ccatgaatga tattttctta caccgcggca attcacccca tttaaccaat 720
ctggacatct ttattgatgg agagtttttg actcgcacca cggctgacgg tgtcgcttta 780
gcaacgccca ctggatctac agcgtactca ttatctgctg gcggcagcat tgttagccca 840
ctggtccctg ctatcctgat gactccgatc tgccctagga gtctgtcttt tcgccccttg 900
attttgcccc actcaagcca tatccgcatc aaaatcggat caaaacttaa ccagaaacct 960
gtcaactccg tagtaaagtt atcggtggat gggattccac agcaggacct tgacgttgga 1020
gacgaaattt atgtcatcaa tgaggtgggc acaatttata ttgatgggac tcaattgcca 1080
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tattgtgtgg ctaagacaga gaacgattgg atccgcggga tcaatgagtt gttaggattt 1200
aactcatcct ttcgcttaac gaagcgtcaa accgataatg at 1242
<210> 3
<211> 1242
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
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ctggtccctg ctatcctgat gactccgatc tgccctagga gtctgtcttt tcgccccttg 900
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gacgaaattt atgtcatcaa tgaggtgggc acaatttata ttgatgggac tcaattgcca 1080
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aactcatcct ttcgcttaac gaagcgtcaa accgataatg at 1242
<210> 4
<211> 1242
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 4
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Claims (9)

1.一种NADH激酶突变体，由氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的NADH激酶经下列之一的突变所得：（1）第175位苏氨酸T突变为组氨酸H；（2）第175位苏氨酸T突变为组氨酸H、第252位精氨酸R突变为丙氨酸A；（3）第175位苏氨酸T突变为组氨酸H、第252位精氨酸R突变为丙氨酸A、第332位异亮氨酸I突变为赖氨酸K。
2.权利要求1所述NADH激酶突变体的编码基因。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因核苷酸序列如SEQ ID No.3或4所示。
4.权利要求1所述NADH激酶突变体在多酶偶联法生物合成L-草铵膦中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：以外消旋D,L-草铵膦为底物，先利用D-氨基酸氧化酶催化D-草铵膦生成L-草铵膦前体2-羰基-4-[羟基（甲基）膦酰基]丁酸，使得L-草铵膦得以保留，同时，加入过氧化氢酶去除过氧化氢副产物，然后，再以L-草铵膦前体2-羰基-4-[羟基（甲基）膦酰基]丁酸为底物、甲酸铵为辅底物，经谷氨酸脱氢酶、甲酸脱氢酶与NADH激酶突变体多酶体系催化制备L-草铵膦。
6.权利要求1所述NADH激酶突变体在多酶偶联法生物合成D-氨基酸中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用为：以丙酮酸为底物，以D-氨基酸脱氢酶和甲酸脱氢酶、NADH激酶突变体为催化体系，催化制得D-丙氨酸。
8.权利要求1所述NADH激酶突变体在多酶偶联法生物合成L-氨基丁酸中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述应用为：以2-羰基丁酸为底物，以亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶、NADH激酶突变体为催化体系，催化制得L-氨基丁酸。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113088501A (zh) * 2019-12-23 2021-07-09 浙江大学 一种用于生产l-草铵膦的谷氨酸脱氢酶突变体及l-草铵膦生产方法

Patent Citations (1)

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Molecular Conversion of NAD Kinase to NADH Kinase through Single Amino Acid Residue Substitution;Shigetarou Mori等;The Journal of Biological Chemistry;第280卷(第25期);第24104-24112页 *

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