CN115894692A

CN115894692A - 一种靶向cd47的抗体及其应用

Info

Publication number: CN115894692A
Application number: CN202211709826.6A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 祁静瑶; 徐楼盼
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2022-12-29
Filing date: 2022-12-29
Publication date: 2023-04-04

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向CD47的抗体及其应用。本发明提供的抗人CD47抗体可以有效结合重组CD47蛋白，阻断CD47与其生物学配体SIRPa的结合，并且有效识别及结合CD47阳性肿瘤细胞。同时，该CD47抗体在高浓度下并不引起显著的人血红细胞血凝反应、血红细胞结合。

Description

一种靶向CD47的抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶向CD47的抗体及其应用。

背景技术

迄今为止，与传统的抗癌治疗策略相比，免疫治疗被认为是最有前景的全身性肿瘤治疗方法，在提高治疗效果方面发挥着不可或缺的作用。新兴的癌症免疫疗法包括癌症疫苗、CAR-T细胞治疗、细胞因子治疗、免疫检查点抑制剂和肿瘤靶向单克隆抗体。其中，单克隆抗体因其特异性靶向分子的能力，已成为癌症治疗中一种关键和有效的治疗方式。

酵母表面展示技术是一套应用于抗体发现、靶点发现及蛋白工程领域的通用技术，作为体外开发治疗性抗体技术手段之一，实现了从原核表达***到真核表达***的进步。在抗体工程中，利用酵母真核表达***的特性，将抗体文库蛋白表达于酵母细胞表面，利用磁珠和流式细胞分选技术基于抗体亲和力及展示水平进行筛选，获得高亲和力或高稳定性的抗体序列，根据设计可以获种多种骨架形式的抗体，如单链可变区scFv、抗体结合区片段Fab、全长IgG、骆驼科单域抗体可变区VHH，同时利用真核***，可对抗体进行翻译后修饰，抗体特性更接近哺乳动物细胞生产的抗体。

白细胞分化抗原CD47(cluster of differentiation 47)，也被称为整合素相关蛋白(Integrin-associated Protein,IAP)，是一种广泛表达于多种细胞表面的糖基化的跨膜蛋白。CD47分子量为45-55kDa，其结构包括与相应配体相互作用的胞外可变区、高疏水性跨膜段形成的跨膜区和亲水羧基端胞内区，属于免疫球蛋白超家族成员。CD47及其配体不仅调节免疫反应，还介导各种病理生理过程，如中性粒细胞趋化和神经***发育，并在免疫耐受和T细胞活化中发挥调节作用。信号调节蛋白α(SIRPα)是其特异性配体，主要表达与巨噬细胞和树突状细胞等吞噬性细胞表面。CD47/SIRPα的相互作用，可以传递抑制性信号，抑制巨噬细胞对相关细胞的吞噬。

大量研究表明，CD47在不同类型的肿瘤中过度表达，CD47高表达水平与癌症恶化的治疗反应和预后相关，肿瘤细胞通过CD47/SIRPα相互作用，向巨噬细胞传递“不要吃我”的信号，从而导致肿瘤细胞的固有免疫逃逸，诱导肿瘤的进一步发生和发展。因此，阻断CD47/SIRPα轴介导的抑制性信号，恢复巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用，为肿瘤免疫治疗提供了新的思路和手段。

但由于CD47的广泛表达，抗CD47抗体作为抗癌药物的潜在问题可能会产生脱靶效应，如贫血。CD47是红细胞更新的关键调节因子，CD47靶向抗体通常与红细胞有较高的靶向结合性，可能会加速红细胞清除并导致溶血性贫血，如CD47靶向制剂(即Hu5F9-G4和TTI-621)可导致人的急性贫血和血小板减少。因此，获得活性高且低毒副作用的抗CD47的单克隆抗体对于肿瘤免疫治疗具有重要意义。

发明内容

发明目的：本发明提供一种全新的抗体，该抗体不仅与CD47具有良好的亲和力，同时该抗体具有弱红细胞凝集。

本发明提供了一种全新的CD47抗体或其抗原结合片段及其制备方法，所提供的CD47抗体可识别并特异性结合CD47，可以用于制备治疗与CD47表达异常或过量的相关疾病的药物，且不引起显著的红血球凝集反应；或用于制备Western blot、ELISA、流式细胞术检测CD47表达的产品中的应用。

一种抗人CD47抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人CD47并且包含下述的重链可变区的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3和轻链可变区的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR，其中：

VH CDR1包含如SEQ ID NO：8-10所示的任一氨基酸序列；

VH CDR2包含如SEQ ID NO：11-13所示的任一氨基酸序列；

VH CDR3包含如SEQ ID NO：14-16所示的任一氨基酸序列；

VL CDR1包含如SEQ ID NO：17-19所示的任一氨基酸序列；

VL CDR2包含如SEQ ID NO：20-22所示的任一氨基酸序列；

VL CDR3包含如SEQ ID NO：23-26所示的任一氨基酸序列。

一种抗人CD47抗体或其抗原结合片段，其特征在于：

。

所述的一种抗人CD47抗体或其抗原结合片段，其特征在于：

。

一种基因工程抗体，其特征在于，它所含的重链和轻链氨基酸序列与权利要求3所述的氨基酸序列是一致的；该基因工程抗体包括：人-鼠嵌合抗体；或者是人源化抗体；或者是抗体的功能性片段Fab；或者是单链抗体；或者是重链可变区和完整轻链融合的抗体功能性片段VH-L；或者是重链和轻链的一个或多个CDR的排列、串联或组合而成的抗体功能性片段；或者是上述抗体和抗体功能片段和其他各种蛋白或多肽进行连接、拼接、融合而得到的类抗体的功能性的融合蛋白。

所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段或所述的基因工程抗体，其特征在于，所述抗体具有恒定区，重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD中的任一种；轻链恒定区为κ或λ链。编码所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段或所述的基因工程抗体的核苷酸序列。

一种表达载体，包括编码所述的核苷酸序列。

所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段或所述的基因工程抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

有益效果

本发明提供一系列全长抗体或单链抗体，该抗体具有良好的抗CD47作用，同时其具有弱的或没有红细胞聚集作用，在临床上具有良好的应用前景。

附图说明

图1为间接ELISA检测CD47抗体与重组人CD47抗原的结合。其中，A图为抗体D0604-G4和D0643-G4的EC50拟合曲线；B图为D2510-G4、D3705-G4及阳性对照抗体Hu5F9-G4的EC50拟合曲线。

图2为流式细胞术测定CD47抗体与表达CD47的肿瘤细胞结合能力。

图3为CD47抗体在不同浓度下诱导血红细胞凝集的结果。

图4为流式细胞术测定CD47抗体与血红细胞的结合活性。

具体实施方式

本发明提供了特异性结合CD47的抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合人CD47。本文中，这写抗体被统称作CD47抗体。

术语“单克隆抗体”(mAb)是指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。其只含有由独特的轻链基因产物和独特的重链基因产物组成的抗体分子中的一种分子种类。具体地，单克隆抗体的互补决定区(CDR)在该群体的所有分子中是相同的。mAb含有能够与抗原的特定表位发生免疫反应的抗原结合位点。

术语“单链抗体”(scFv)是指由抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过15-20个氨基酸的连接短肽(linker)连接而成的抗体。

术语“互补性决定区”或“CDR”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区。有三种重链CDR和三种轻链CDR。此处，取决于情况，术语“CDR”和“CDRs”用于指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或其抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。在另一具体实施方案中，CDR区或CDR是指IMGT定义的免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

以下实施方案所需试剂无特殊说明均可来自商业途径(市售可得)。

实施例1：免疫小鼠

1)选取鼠龄为6-8周的Balb/c健康雌性小鼠，使用His标签hCD47重组蛋白共进行五次免疫。首次免疫时，将100ug抗原蛋白按1:1的比例与弗氏完全佐剂混合乳化，皮下多点注射完成免疫。此后共进行四次加强免疫，每次加强免疫间隔14天，抗原用量减半，按照1:1的比例与弗氏不完全佐剂混合乳化，腹腔注射完成免疫，并在每次加强免疫后，剪去部分小鼠尾巴，收集小鼠尾静脉血液并分离血清，用ELISA测定小鼠血清滴度。

2)用抗原包被液将hFc标签hCD47重组蛋白稀释至1μg/ml，以100μl/孔的用量加至紫外活化后的酶标条中，设置复孔，并设置PBS组作为阴性对照，4℃过夜包被。吸弃包被液，加入PBST洗涤各孔，每次5min，洗涤6次；各孔加入含5％的脱脂牛奶封闭液，37℃封闭2h；吸弃封闭液，加入的PBST洗涤各孔，每次5min，洗涤6次；各孔加入用PBS以不同的比例稀释小鼠血清，37℃孵育2h；吸弃小鼠血清，加入的PBST洗涤各孔，每次5min，洗涤6次；各孔加入稀释后的HRP-山羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育1.5h；吸弃二抗，加入的PBST洗涤各孔，每次5min，洗涤6次；各孔加入新鲜配制的TMB显色液，37℃避光显色15-30min；各孔加入终止液，终止显色反应，测定各孔在450nm波长下的吸光值以测定小鼠免疫后的血清滴度。

实施例2：CD47抗体的筛选及制备

1.提取小鼠脾脏总RNA

1)根据ELISA的结果，选取加强免疫后血清滴度最高的小鼠，将其断颈处死后分离小鼠脾脏，制备脾脏组织单细胞悬液，使用红细胞裂解液去除红细胞后，加入TRizol试剂并反复吹打细胞，充***解细胞。

2)向上述裂解液中加入1/5体积氯仿,室温静置2-3min；4℃，12000g离心10-15min。小心吸取上层水相至新离心管中，加入1/2体积异丙醇，颠倒混匀后室温放置10min；4℃，12000g离心10min。弃去上清，加入等体积75％乙醇洗涤沉淀，室温放置空气干燥5-10min。加入50μl无RNase水溶解RNA。

2.RT-PCR

根据小鼠抗体可变区核酸序列，设计特异性引物，以cDNA第一链为模板，PCR扩增小鼠重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因，并通过overlap PCR获得鼠源单链抗体(scFv)的DNA片段，经1％琼脂糖凝胶电泳后胶回收对scFv片段进行纯化。

3.CD47酵母抗体文库的构建及抗体筛选

1)文库构建：使用EcoRI和XhoI限制性内切酶37℃过夜酶切酵母载体pYD1,经1％琼脂糖凝胶电泳后胶回收线性化载体，与纯化后的scFv基因片段经电转化共同转入酿酒酵母菌株EBY100，30℃，220rpm过夜培养，使酵母细胞表面展示单链抗体，构建对应的单链抗体文库，并将该文库命名为DEM139。

2)磁珠分选：测定电转后酵母菌液的OD₆₀₀，以适当的密度接种于诱导培养基中，20℃，220rpm过夜诱导培养；取诱导后酵母菌，用1％PBSA洗涤，加入经生物素标记后的hFc标签CD47抗原蛋白，室温孵育20min，用预冷的1％PBSA洗涤酵母，置于磁力架上，使用链霉亲和素磁珠分选，用扩增培养基收集酵母菌，30℃，220rpm过夜培养。

3)流式分选：测定磁珠分选后酵母菌液的OD₆₀₀，以适当的密度接种于诱导培养基中，20℃，220rpm过夜诱导培养，测定菌液OD₆₀₀，吸取适量酵母菌，用PBS洗涤，3000rpm离心5min后去除上清，用生物素标记后的hFc标签CD47抗原蛋白重悬酵母，室温孵育20min，用预冷的PBS洗涤酵母，3000rpm离心5min后去除上清，加入稀释后的APC标记链霉亲和素和Alexa

488标记的小鼠抗V5 tag抗体,4℃孵育30min，用预冷的PBS洗涤，3000rpm离心5min后去除上清，加入PBS重悬细胞，根据荧光强度圈门，分选APC和488双阳性的酵母细胞至扩增培养基中，30℃，220rpm过夜培养，再次诱导培养后进行第二轮流式分选。

4)文库测序：取二轮流式分选后酵母扩增培养，抽提酵母质粒，进行文库测序，共选取生长状态较好的50个单克隆进行测序。

4.CD47抗体的制备

1)真核表达载体的构建：根据所述文库测序结果，选取4个CDR序列不完全相同的单链抗体序列，设计引物，通过overlapPCR将抗体轻链可变区和人Igκ链恒定区进行拼接，将抗体重链可变区和人IgG4恒定区进行拼接，从而将各单链抗体转化为全长抗体，通过同源重组法将抗体轻重链基因拼接至哺乳动物表达载体中，得到对应的CD47全长抗体真核表达载体。

2)4种IgG4全长抗体的VH和VL的组合见表1；VH的C端与序列如SEQ ID NO:27的CH相连接，组成抗体的重链；VL的C端与序列如SEQ ID NO:28的CL相连接，组成抗体的轻链；抗体的重链可变区用“D”+抗体重链编号+“-VH”表示，如D06-VH；抗体的轻链可变区用“D”+抗体轻链编号+“-VL”表示，如D04-VL；IgG4全长抗体用“D”+抗体重链编号+抗体轻链编号+“-G4”表示，如D0604-G4(抗体重链由D06-VH(SEQ ID NO:1)和序列如SEQ ID NO:27的CH组成，抗体轻链由D04-VL(SEQ ID NO:4)和序列如SEQ ID NO:28的CL组成)，将所筛选到的4个全长抗体编号简写为D0604-G4、D0643-G4、D2510-G4和D3705-G4。

3)将编码CD47抗体及阳性对照抗体Hu5F9-G4(Hu5F9-G4序列已在美国专利US20150183874A1中公开)的轻、重链的重组质粒按2:1的比例转染HEK293细胞，培养5天后4℃离心收集上清，经protein A柱纯化后得到CD47抗体，通过SDS-PAGE、SEC-HPLC及Westernblot分别检测抗原分子量和纯度及抗体类型。

结果显示：抗体的分子量为150-160kd，类型为IgG。

表1：CD47抗体重链可变区与轻链可变区组合形成的全长抗体

表2：抗体的CDR区

实施例3：测定CD47抗体与hCD47分子的结合能力及亲和力

使用ELISA检测CD47抗体与重组人CD47抗原的结合情况。用抗原包被液将mFc标签hCD47重组蛋白稀释至1μg/ml，以100μl/孔的用量加至紫外活化后的酶标条中，设置复孔，并设置PBS组作为阴性对照，4℃过夜包被。用PBST洗涤3次，加入含5％脱脂牛奶，37℃封闭2h。用PBST洗涤3次，加入梯度稀释的CD47抗体及对照抗体Hu5F9(最高浓度200nM，共8个浓度梯度)并在37℃孵育2h。PBST洗涤3次，加入HRP标记的山羊抗人IgG二抗，37℃孵育1h，用PBST洗涤6次，加入TMB显色液，避光孵育15min，终止显色反应。在酶标仪上读取450nm处吸光值，计算EC50，结果如图1和表3所示，各CD47抗体在蛋白水平上可以有效结合hCD47蛋白。

表3：CD47抗体与hCD47分子的亲和力测定结果

抗体编号	EC50(nM)
		D0604-G4	0.3457
D0643-G4	0.0853
		D3705-G4	0.2218
D2510-G4	2.6910
		Hu5F9-G4	0.0570

。

实施例4：测定CD47抗体阻断CD47与SIRPα的结合作用

用抗原包被液将hFc标签hCD47重组蛋白稀释至1μg/ml，以100μl/孔的用量加至紫外活化后的酶标条中，设置复孔，并设置PBS组作为阴性对照，4℃过夜包被。用PBST洗涤3次，加入含5％脱脂牛奶，37℃封闭2h。用PBST洗涤3次，加入梯度稀释的CD47抗体及对照抗体Hu5F9(最高浓度300nM，共10个浓度梯度)与终浓度为2μg/ml的生物素标记mFc标签SIRPα重组蛋白，并在37℃孵育1h。PBST洗涤3次，加入HRP标记链霉亲和素，37℃孵育1h，用PBST洗涤6次，加入TMB显色液，避光孵育15min，终止显色反应。在酶标仪上读取450nm处吸光值，计算各抗体的IC50，结果表4所示，CD47抗体能有效阻断CD47与SIRPα相互作用。

表4：CD47抗体阻断CD47与SIRPα的结合作用的测定结果

抗体编号	IC50(nM)
		D0604-G4	8.594
D0643-G4	5.196
		D3705-G4	5.025
D2510-G4	41.090
		Hu5F9-G4	0.456

实施例5：测定CD47抗体与表达CD47的肿瘤细胞结合能力

使用含10％FBS的1640培养基在37℃，5％CO2条件下培养高表达CD47的jurkat细胞。待细胞生长状态较好时，计数，每管取2×10⁵个细胞，1500rpm，4℃离心5min，吸弃培养基；用100μl含2％BSA的PBS重悬细胞，4℃封闭20min；1500rpm，4℃离心5min，吸弃上清；用100μl浓度为100nM的CD47抗体重悬细胞，4℃孵育1h；1500rpm，4℃离心5min，吸弃一抗；用500μl的PBS重悬洗涤细胞，1500rpm，4℃离心5min，吸弃上清；用100μl已稀释的Alexa

488标记的山羊抗人IgG抗体重悬细胞，4℃孵育30min，1500rpm，4℃离心5min，吸弃二抗；用500μl的PBS重悬洗涤细胞，1500rpm，4℃离心5min，吸弃上清，重复一次；加入250ulPBS重悬细胞，经200目细胞筛网过滤后使用流式细胞仪上机检测。结果如图2所示，本发明的CD47抗体能够有效的和CD47高表达的肿瘤细胞结合，具有良好的肿瘤细胞靶向能力。

实施例6：检测CD47抗体对人红细胞(RBC)凝集的影响

采集健康人供体的新鲜血液，使用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，离心后吸取500μl红细胞，加入3ml PBS洗涤细胞，2000rpm，室温离心5min，共洗涤三次；用PBS将红细胞重悬并稀释为6％的红细胞悬液，并加至96孔型板中，进行红细胞铺板，每孔50μl细胞悬液；设置各CD47抗体最高孵育终浓度为300nM，并用PBS连续2倍稀释，共12个浓度梯度；每孔对应加入50μl各浓度梯度的CD47抗体，37℃孵育4h，取出观察各孔中红细胞的凝集情况。结果如图3所示，在所测试的CD47抗体中，抗体D3705-G4(300-9.375nM)以及HU5F9-G4在高浓度下(300-1.172nM)诱导红细胞凝集。抗体D0604-G4、D0643-G4在高浓度(300-150nM)下有轻微的红细胞凝集，而D2510-G4即使在最高浓度时也未见明显的红细胞凝集现象。

实施例7：检测CD47抗体与人红细胞(RBC)的结合能力

每管吸取20μl细胞密度为6％红细胞悬液，用含2％BSA的PBS重悬细胞，4℃封闭20min，1500rpm，4℃离心5min，吸弃上清；设置各CD47抗体最高孵育终浓度为200nM，并用PBS连续2倍稀释，共10个浓度梯度，每管100μl重悬红细胞，4℃孵育1h；用500μl的PBS重悬洗涤细胞一次；用100μl已稀释的Alexa

488标记的山羊抗人IgG抗体重悬细胞，4℃孵育30min，1500rpm，4℃离心5min，吸弃二抗；用500μl的PBS重悬洗涤细胞两次，加入1mlPBS重悬细胞，经200目细胞筛网过滤后使用流式细胞仪上机检测。结果如图4所示，所测试的CD47抗体中，抗体D0604-G4、D2510-G4和Hu5F9-G4均显示出不同程度与人血红细胞结合的能力，且这种能力是剂量依赖的。特别地，D0604-G4和D2510-G4显示出与血红细胞更低的结合，提示可能相较于Hu5F9-G4有着更低的红细胞毒副作用。

Claims

1.一种抗人CD47抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段特异性结合人CD47并且包含下述的重链可变区的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3和轻链可变区的VL CDR1、VL CDR2和VL CDR，其中：

1)VH CDR1包含如SEQ ID NO：8-10所示的任一氨基酸序列；

2)VH CDR2包含如SEQ ID NO：11-13所示的任一氨基酸序列；

3)VH CDR3包含如SEQ ID NO：14-16所示的任一氨基酸序列；

4)VL CDR1包含如SEQ ID NO：17-19所示的任一氨基酸序列；

5)VL CDR2包含如SEQ ID NO：20-22所示的任一氨基酸序列；

6)VL CDR3包含如SEQ ID NO：23-26所示的任一氨基酸序列。

2.根据权利要求1一种抗人CD47抗体或其抗原结合片段，其特征在于：

3.根据权利要求2所述的一种抗人CD47抗体或其抗原结合片段，其特征在于：

4.一种基因工程抗体，其特征在于，它所含的重链和轻链氨基酸序列与权利要求3所述的氨基酸序列是一致的；该基因工程抗体包括：人-鼠嵌合抗体；或者是人源化抗体；或者是抗体的功能性片段Fab；或者是单链抗体；或者是重链可变区和完整轻链融合的抗体功能性片段VH-L；或者是重链和轻链的一个或多个CDR的排列、串联或组合而成的抗体功能性片段；或者是上述抗体和抗体功能片段和其他各种蛋白或多肽进行连接、拼接、融合而得到的类抗体的功能性的融合蛋白。

5.根据权利要求1-3任一项权利要求所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的基因工程抗体，其特征在于，所述抗体具有恒定区，重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD中的任一种；轻链恒定区为κ或λ链。

6.编码如权利要求1～3任一项所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的基因工程抗体的核苷酸序列。

7.一种表达载体，包括编码如权利要求6所述的核苷酸序列。

8.根据权利要求1～3任一项所述的抗CD47抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的基因工程抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。