CN115887535A - 一种防治禽大肠杆菌病的复方中药渣发酵液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种防治禽大肠杆菌病的复方中药渣发酵液及其制备方法，属于中药渣发酵液技术领域。该复方中药渣发酵液是利用鼠李糖乳杆菌PC30‑2‑1发酵而成的，其能够降低人工感染禽致病性大肠杆菌炎症细胞因子水平，提高法氏囊指数，提高畜禽的食欲和抗病力，促进增重，提高生产效益，减少或替代常规抗菌药物的使用，降低药物残留，降低抗菌药物选择压力，抑制或减缓临床致病菌耐药性产生。

Description

一种防治禽大肠杆菌病的复方中药渣发酵液及其制备方法

技术领域

本发明属于中药渣发酵液技术领域，具体涉及一种防治禽大肠杆菌病的复方中药渣发酵液及其制备方法。

背景技术

大肠杆菌病是各种畜禽的一种常见传染病，其病原致病性大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)是一种重要的人畜共患病原菌。不仅给家禽养殖业造成了巨大经济损失，阻碍其持续健康发展，还极易引发动物性食品安全问题，给人类的健康及生存环境带来潜在威胁。目前，临床上主要依靠抗菌药物预防和治疗该病，但由于抗菌药物的不合理使用导致了多重耐药、交叉耐药甚至超级耐药菌株不断出现，给防治该病带来巨大困难。为此，降低或消除致病性大肠杆菌的耐药性是有效防治该病的关键。中药具有抗菌、抗病毒、免疫调节等多种生物学活性，因其成分多样，不易产生耐药性，对于有效防治致病性大肠杆菌造成的畜禽细菌性疾病、保障人类健康和生态环境都具有重要意义。随着我国农业农村部《全国兽用抗菌药使用减量化行动方案(2021-2025年)》等相关规定的发布，使用兽用中药，减少或替代常规兽用抗菌药物已成为行业研究热点、畜牧业绿色健康发展的新方向。鼠李糖乳杆菌是一种安全、应用广泛的益生菌，能够耐受动物消化道环境，并能够在人和动物肠道内定植，起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素、预防龋齿和提高机体免疫力等作用。其具有耐酸、耐氧、定植力强的特性，目前接受度较高。

综上，在中药炮制基础上，利用乳酸菌发酵技术，不仅能提高中药活性成分含量、改变或产生一些中药中原不具有的活性成分，还能使中药大分子物质转变为能够被机体直接吸收利用的小分子，进而提高动物机体的抗病能力和经济效益。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种防治禽大肠杆菌病的复方中药渣发酵液及其制备方法，本发明的复方中药渣发酵液能够降低人工感染禽致病性大肠杆菌炎症细胞因子水平，减少或替代常规抗菌药物的使用，降低药物残留。

本发明首先提供一种防治禽大肠杆菌病的复方中药渣发酵液的制备方法，包括：

步骤一：从市售泡菜中分离获得鼠李糖乳杆菌PC30-2-1，通过16S rDNA进行菌种鉴定，获得采用保藏号为CCTCC NO:M 2022083的鼠李糖乳杆菌PC30-2-1(Lactobacillusrhamnosus PC30-2-1)，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉大学，保藏日期为：2022年1月17日，将鼠李糖乳杆菌PC30-2-1接种于培养基中，于37℃，150r/min,振荡培养12-18h，获得种子培养液；

步骤二：将细辛、甘草、肉桂、当归、赤芍、大枣、木通切片后，加水煎煮，合并滤液；

步骤三：将步骤二得到的药渣进行烘干，得到的干药渣加入蒸馏水，进行灭菌后冷却至室温，得到药渣培养液；

步骤四：将步骤二的种子培养液接种于步骤三的药渣培养液中，于37℃，150r/min,振荡培养12-18h，离心收集发酵上清，得到复方中药渣发酵液。

优选的是，所述的步骤一的培养基为MRS液体培养基。

优选的是，所述的步骤二中中药原料配比为：细辛12-15份、甘草12-15份、肉桂12-15份、当归12-15份、赤芍12-15份、大枣12-15份、木通8-10份。

优选的是，所述的步骤二中中药原料配比为：细辛12份、甘草12份、肉桂12份、当归12份、赤芍12份、大枣12份、木通8份。优选的是，所述的步骤二中煎煮次数为2次，第一次煎煮时间为1h，第二次煎煮时间为40-45min。

优选的是，所述的步骤三的烘干温度为室温，烘干时间为48h。

优选的是，所述的步骤三中药渣和蒸馏水的料液比为1:10。

优选的是，所述的步骤三中灭菌温度为121℃，压力为103.4kPa。

优选的是，所述的步骤四离心收集包括：将药渣发酵液于4℃，8000r/min，离心10min，将离心后所得上清液通过0.45μm滤膜进行真空抽滤，后将滤液于旋转蒸发仪(45℃，75r/min)，旋蒸浓缩至体积比为1:3。

本发明还提供上述制备方法得到的防治禽大肠杆菌病的复方中药渣发酵液。

本发明药渣中各原料药的药理和药性如下：

细辛：性温，味辛，有小毒。归心、肺、肾经。祛风、散寒、通窍止痛、温肺祛痰。属解表药下属分类的辛温解表药。1.局部麻醉作用；2.抑制关节炎；3.抑菌作用；4.有增强脂质代谢及升高血糖的作用，调节机体平滑肌功能。挥发油能使麻醉动物血压下降，而煎剂则使血压上升；5.消炎和抗惊厥作用；6.镇痛、镇静、抑制发热、解热；7.抗组胺和抗***反应；8.兴奋呼吸作用。

甘草：味甘、性平，归心、肺、脾、胃经，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、缓和药性的功效。主治脾胃虚弱，倦怠乏力，心悸气短，咳嗽痰多，脘腹、四肢挛急疼痛，痈肿疮毒。药理作用包括：1.肾上腺皮质激素样作用(盐皮质激素样作用、糖皮质激素样作用)；2.增强非特异性免疫和细胞免疫，但对体液免疫有抑制作用；3.对消化***作用(抗溃疡、保肝、解痉)；4.解毒作用；5.抗炎；6.镇咳祛痰；7.抗病原微生物；8.抗心律失常；9.抗肿瘤；10.降血脂、抗动脉粥样硬化。

肉桂：味辛、甘，性大热，归脾、肾、心、肝经，具有补火助阳、引火归源、散寒止痛、活血通经的功效。主治阳痿宫冷、腰膝冷痛、肾虚作喘、目赤咽痛、心腹冷痛、虚寒吐泻、寒疝、经闭痛经等。药理作用包括：1.对心血管***作用(强心、扩张血管、降低血压)；2.对消化***作用(水煎液抑制鼠小肠蠕动，桂皮油促进肠蠕动，使消化液分泌增加，缓解胃肠痉挛性疼痛)；3.抗溃疡；4.抗血小板聚集、抗凝血；5.兴奋垂体-肾上腺皮质***；6.调节机体免疫。

当归：味甘、辛，性温，归肝、心、脾经，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效。主治血虚萎黄，晕眩心悸，***，经闭痛经，虚寒腹痛，肠燥便秘，风湿痹痛，跌打损伤，痈疽疮疡等。药理作用包括：1.对血液***作用(促进骨髓造血功能、抑制血小板聚集、抗血栓、降血脂、抗动脉粥样硬化)；2.对心血管***作用(抗心肌缺血、抗心肌梗死后纤维化、抗心律失常、扩张血管、降血压)；3.兴奋或抑制子宫平滑肌；4.增强机体免疫功能；5.抗辐射；6.抗损伤；7.保肝；8.抗肿瘤。

赤芍：味苦，性微寒。归肝经。具有清热凉血；活血祛瘀。主温毒发斑；吐血衄血；肠风下血；目赤肿痛；痈肿疮疡；闭经痛经；崩带淋浊；瘀滞胁痛；疝瘕积聚；跌扑损伤。用于温毒发斑，吐血衄血，目赤肿痛，肝郁胁痛，经闭痛经，症瘕腹痛，跌扑损伤，痈肿疮疡。多用于温病热入血分的身热出血，目赤肿痛，痈肿疮毒。药理作用包括：1.抗血栓形成作用；2.抗血小板聚集作用；3.降血脂和抗动脉硬化作用；4.对心血管***的影响；5.抗肿瘤作用；6.保肝作用。

大枣：味甘、性温。归脾、胃经。补中益气，养血安神。用于脾虚食少，乏力便溏，妇人脏躁。药理作用包括：1.中枢抑制作用；2.护肝；3.增强肌力、抗疲劳；4.抗***反应；5.抗肿瘤；6.镇静安神；7.增加白细胞cAMP、增强免疫等功能。

木通：味苦，性寒。归心、小肠、膀胱经。清热利尿，活血通脉。主小便赤赤、淋浊，水肿，胸中烦热，喉喉疼痛，口舌生疮，风湿痹痛，乳汁不通，经闭痛经。药理作用包括：1.利尿；2.抗细菌和抗真菌。

本发明的有益效果

本发明提供一种防治禽大肠杆菌病的复方中药渣发酵液及其制备方法，该复方中药渣发酵液是利用鼠李糖乳杆菌PC30-2-1发酵而成的，其能够降低人工感染禽致病性大肠杆菌炎症细胞因子水平，提高法氏囊指数，提高畜禽的食欲和抗病力，促进增重，提高生产效益，减少或替代常规抗菌药物的使用，降低药物残留，降低抗菌药物选择压力，抑制或减缓临床致病菌耐药性产生。

本发明中药渣处方中的七味中药均为常见中药，价格低廉，对发病畜禽机体无任何毒副作用，在畜禽体内无残留，不产生耐药性。体外试验表明，该药对大肠杆菌具有良好的抑制作用；体内试验表明，该复方中药渣发酵液对人工感染的禽致病性大肠杆菌具有较好的保护和治疗作用，有望替代常用抗菌药物用于预防和治疗畜禽大肠杆菌病。

附图说明

图1为灌服实施例2的制备药渣发酵液的小鼠的生长柱状图；

图2为灌服实施例2的制备药渣发酵液的试验鸡的周增重柱状图；

图3为剖检器官病变图；

图4为IL-6含量的细胞因子柱状图；

图5为IL-8含量的细胞因子柱状图；

图6为血清IFN-γ含量的细胞因子柱状图。

具体实施方式

实施例1鼠李糖乳杆菌PC30-2-1的分离鉴定

(1)分离纯化

将市售泡菜汁置于无菌超净工作台中，使用生理盐水将样品10倍梯度稀释，取100μL适宜梯度的稀释液均匀涂布在含有2％碳酸钙的MRS培养基上，将涂布好的培养基置于厌氧罐中，37℃培养48h。挑取有明显溶钙环的不同形态菌落接种在相应的液体培养基中增菌培养24h后，再次划线接种在MRS固体培养基上，经分离纯化3次后，挑取单个菌落，进行革兰氏染色。将革兰氏染色为阳性的菌落进行增菌培养，在MRS液体培养基(含20％甘油)中-80℃保存。所有菌株在使用前需经过3次传代培养。经MRS分离培养基纯化后，得到圆形，乳白色，边缘整齐，表面光滑，直径1-1.5mm，成对或成链排列菌落，革兰氏染色镜检可见分散、成链排列短杆状菌体。

(2)16S rDNA测序鉴定

将纯化后的菌株，挑取单个菌落至5mL液体培养基中增菌培养过夜，使用生工生物工程(上海)股份有限公司细菌DNA基因组抽提试剂盒提取分离菌株的基因组DNA。

以上述基因组DNA为模板，由生工生物公司合成细菌16S rDNA通用引物(正向序列：27F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，反向序列：1492R：5’-TACGGYTACCTTG TTACGACTT-3’)对分离菌株16S rDNA特异性片段进行PCR扩增，50μL PCR反应体系如表1-2所示。PCR扩增程序设置如下，预变性：94℃、5min；变性：94℃、30s；退火：55℃、30s；延伸：72℃、90s；30个循环；末端延伸：72℃、10min。

表1 PCR反应体系

Tab.1 Reaction system of PCR

取5μL PCR扩增产物，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，在1600bp处有清晰条带的样品进行切胶回收，将胶回收产物连接pMD18-T克隆载体，转化至DH5α感受态细胞，将阳性克隆质粒送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析。将得到的测序结果采用BLAST与NCBI中的数据进行比对确定其种属。16S rDNA序列比对结果显示，该菌与L.rhamnosus序列一致性达99％。

实施例2复方中药发酵液的制备

步骤一：将实验室保存的鼠李糖乳杆菌PC30-2-1按1％接菌量接种于5mL灭菌MRS液体培养基，于37℃，150r/min,振荡培养12h，获得种子培养液；

步骤二：称取细辛12g、甘草12g、肉桂12g、当归12g、赤芍12g、大枣12g、木通8g，将上述中药切片后，加水5L煎煮60min至2L，纱布过滤滤液；再次加水3L，水沸转至文火煎煮45min至1L，合并滤液；

步骤三：将上述所得药渣烘干，称取一定量干燥药渣于锥形瓶中，按照料液比1:10加入蒸馏水，于121℃高压灭菌后冷却至室温；

步骤四：将步骤一的种子培养液按0.5％体积比无菌接入步骤三的锥形瓶中，于37℃，150r/min,振荡培养18h，将上述药渣发酵液于4℃，8000r/min，离心10min，将离心后所得上清液通过0.45μm滤膜进行真空抽滤，后将滤液于旋转蒸发仪(45℃，75r/min)，旋蒸浓缩至体积比为1:3；得到复方中药发酵液。

实施例3牛津杯法测试复方中药发酵液对大肠杆菌标准株ATCC25922抑菌活性

将实验室保存的ATCC25922株按1％接菌量接于灭菌LB液体培养基，于37℃，150r/min,振荡培养至OD₆₀₀＝0.5(约10⁸CFU/mL)，利用LB液体培养基连续稀释100倍用于药敏试验；

取100μL上述培养好的ATCC25922株均匀涂布于LB固体培养基平板，并均匀放置灭菌牛津杯，向牛津杯中分别加入实施例2制备的200μL上述浓缩发酵液，于37℃恒温培养箱静置培养12h；

观察平板有无抑菌圈，并用直尺测量抑菌圈直径；牛津杯实验结果显示，本发明的中药渣浓缩发酵上清液对大肠杆菌ATCC25922株抑菌圈直径约为12mm，具有一定抑菌效果。

实施例4

选取健康昆明小鼠(体重20±2克)，雌雄各半，10只/组，连续15天灌服实施例2的制备药渣发酵液，200ul/只/天，观察小鼠采食、饮水、体重变化及健康状况；

如图1，图1为灌服实施例2的制备药渣发酵液的小鼠的生长柱状图，从图1可以看出，试验小鼠灌服复方中药渣发酵液后采食饮水较好，被毛平顺光亮，精神活泼无异常。在试验前10天，灌服1％复方中药渣发酵液组小鼠体重相较于对照组呈明显上升趋势。

实施例5

选取7日龄健康洛克鸡雏鸡30只(已完成基础免疫)，适应环境5天，设为试验组和对照组，10只/组，雌雄各半。将本发明实施例2的复方中药发酵液按1％和5％添加量连续饮水饲喂21天，2次/日，通过计算饮水量保证各组试验鸡每次2h内饮尽。于试验第22天，停止添加发酵液，滴鼻感染禽致病性大肠杆菌CC1株0.5mL/只(约10⁹CFU/mL)。攻菌后48h，观察试验鸡状态、临床症状等，翅下采集静脉血，检测血清IL-2、IL-6、IL-8、IFN-γ等细胞因子水平，每组剖检6只试验鸡，观察器官病变、计算脾脏、法氏囊等器官指数。

如图2，图2为灌服实施例2的制备药渣发酵液的试验鸡的周增重柱状图，从图2可以看出，1％和5％中药渣发酵液均一定程度促进试验鸡增重。其中，5％添加组在第2周时增重效果最佳，1％添加组在第3周时增重效果最佳，但与对照组差异均不显著。以上结果表明，复方中药渣发酵液对试验动物安全、无毒副作用，能够一定程度提高动物食欲，促进增重，降低料肉比。

图3为剖检器官病变图，其中a代表对照组(未给药)，b代表发酵液添加组剖检心包、肝脏，图3说明，攻菌后，各组试验鸡采食饮水量较平时均有不同程度下降，对照组个别鸡只表现精神沉郁，眼鼻分泌物增多，翅松弛，复方中药渣发酵液添加组整体采食和精神状况略好于对照组。个别鸡只剖检可见心包增厚、浑浊、纤维素性心包炎，肝脏肿大，出血瘀血，肝表面有纤维素性渗出物等病理变化。复方中药渣发酵液添加组(图3b)出现上述症状鸡较少，且整体症状较对照组轻(图3a,)。

图4为IL-6含量的细胞因子柱状图，图5为IL-8含量的细胞因子柱状图，图6为血清IFN-γ含量的细胞因子柱状图，图4-6说明，与对照组相比，1％和5％中药渣发酵液均能够显著降低血清IL-6水平；此外，1％中药渣发酵液还能够显著降低血清IL-8、IFN-γ等细胞因子的分泌，表明其具有一定抗炎效果。

表2为本发明的复方中药渣发酵液对试验鸡免疫器官指数，如表2所示，1％和5％中药渣发酵液对试验鸡法氏囊发育具有促进作用，法氏囊指数均高于对照组，但差异不显著；而1％和5％中药渣发酵液降低了试验鸡的脾指数，与对照组相比同样不显著。

表2复方中药渣发酵液对试验鸡免疫器官指数％

Claims (10)

1.一种防治禽大肠杆菌病的复方中药渣发酵液的制备方法，其特征在于，包括：

步骤一：从市售泡菜中分离获得鼠李糖乳杆菌PC30-2-1，通过16S rDNA进行菌种鉴定，获得采用保藏号为CCTCC NO:M 2022083的鼠李糖乳杆菌PC30-2-1(Lactobacillusrhamnosus PC30-2-1)，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉大学，保藏日期为：2022年1月17日，将鼠李糖乳杆菌PC30-2-1接种于培养基中，于37℃，150r/min,振荡培养12-18h，获得种子培养液；

步骤二：将细辛、甘草、肉桂、当归、赤芍、大枣、木通切片后，加水煎煮，合并滤液；

步骤三：将步骤二得到的药渣进行烘干，得到的干药渣加入蒸馏水，进行灭菌后冷却至室温，得到药渣培养液；

步骤四：将步骤二的种子培养液接种于步骤三的药渣培养液中，于37℃，150r/min,振荡培养12-18h，离心收集发酵上清，得到复方中药渣发酵液。

2.根据权利要求1所述的一种防治禽大肠杆菌病的复方中药渣发酵液的制备方法，其特征在于，所述的步骤一的培养基为MRS液体培养基。

3.根据权利要求1所述的一种防治禽大肠杆菌病的复方中药渣发酵液的制备方法，其特征在于，所述的步骤二中中药原料配比为：细辛12-15份、甘草12-15份、肉桂12-15份、当归12-15份、赤芍12-15份、大枣12-15份、木通8-10份。

4.根据权利要求3所述的一种防治禽大肠杆菌病的复方中药渣发酵液的制备方法，其特征在于，所述的步骤二中中药原料配比为：细辛12份、甘草12份、肉桂12份、当归12份、赤芍12份、大枣12份、木通8份。

5.根据权利要求1所述的一种防治禽大肠杆菌病的复方中药渣发酵液的制备方法，其特征在于，所述的步骤二中煎煮次数为2次，第一次煎煮时间为1h，第二次煎煮时间为40-45min。

6.根据权利要求1所述的一种防治禽大肠杆菌病的复方中药渣发酵液的制备方法，其特征在于，所述的步骤三的烘干温度为室温，烘干时间为48h。

7.根据权利要求1所述的一种防治禽大肠杆菌病的复方中药渣发酵液的制备方法，其特征在于，所述的步骤三中药渣和蒸馏水的料液比为1:10。

8.根据权利要求1所述的一种防治禽大肠杆菌病的复方中药渣发酵液的制备方法，其特征在于，所述的步骤三中灭菌温度为121℃，压力为103.4kPa。

9.根据权利要求1所述的一种防治禽大肠杆菌病的复方中药渣发酵液的制备方法，其特征在于，所述的步骤四离心收集包括：将药渣发酵液于4℃，8000r/min，离心10min，将离心后所得上清液通过0.45μm滤膜进行真空抽滤，后将滤液于旋转蒸发仪(45℃，75r/min)，旋蒸浓缩至体积比为1:3。

10.权利要求1所述的制备方法得到的防治禽大肠杆菌病的复方中药渣发酵液。

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