CN115873958A - 一种***癌三指标数字pcr检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种***癌三指标数字PCR检测试剂盒,包括PSA、hK2、PSMA的引物序列组,以及PSA、hK2、PSMA对应的荧光探针FAM、HEX、ROX;该试剂盒通过数字PCR方法,同时对***癌相关的基因进行检测分析,不仅检测结果准确,降低了检测的漏检率,同时实现了定量分析的效果,无论在筛查还是在后续治疗过程中都能提供数据的支持,保证了检测结果的可持续应用性,具有潜在的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种***癌三指标联合检测试剂盒,属于临床体外检测技术领域。
背景技术
***癌的筛查在欧美国家曾经广泛开展,然而在我国,由于未曾开始过大规模的***癌筛查,人群中应该有相当数量的高侵袭性或晚期***癌病例。因此在我国现阶段,开展***癌筛查是非常有必要的。
***癌筛查最广泛采用的是美国癌症联合委员会制订的TNM 分期***,筛查方法主要有***特异性抗原(PSA)检测、穿刺活检、核素全身骨显像、***MRI 或***CT 以及***等方法,鉴于显像、MRI、CT技术需要依赖大型医疗设备,成本高不利于分析推广,而穿刺活检技术不仅会给检测人造成伤害,同时也需要专业医师操作,不利于大范围的筛查应用,所以现阶段***癌筛查主要应用的是对***特异性抗原(PSA)检测的方式。
***特异性抗原(PSA)检测的方法有生化反应方法、酶联免疫方法、化学发光方法、荧光分析方法,但是由于***特异性抗原正常人体内的含量较低,浓度低于4ng/mL,目前的检测方法灵敏度需要进一步的提高,而且仅利用PSA一种物质来分析***癌状况特异性较差,这些缺陷制约了***癌筛查的临床发展。
参考***癌诊疗指南(2022版),国内专家对于基因检测在***癌的早期诊断以及晚期肿瘤综合治疗阶段应用达成一定共识,其具有非常重要的作用。因此临床针对于***癌筛查需要一种多指标的基因分析试剂盒。
有鉴于此,特提出本发明。
发明内容
针对于现在临床对***癌筛查指标单一,而且现有检测指标灵敏度较差的问题,本发明提供了一种***癌三指标数字PCR检测试剂盒。
本发明的所提供的***癌三指标数字PCR检测试剂盒有如下创新之处:
(1)试剂盒中的引物和探针,针对于***特异性抗原(prostate specificantigen PSA)、人类激肽释放酶2(human kallikrein2 hK2)和***特异的膜抗原(prostate specific membrane antigen PSMA)相关基因的引物探针,能同时对三个基因指标检测,综合对***癌进行分析筛查,提高阳性样本的筛出率,保障检测结果的准确性。
(2)使用数字PCR芯片,在油孔加入微滴生成油,样本孔加入扩增试剂,盖上密封条后,利用微滴生成仪将样本的基因及扩增反应溶液分散到微滴中,形成油包水结构,再进行扩增,通过数字PCR仪对相应荧光显色微滴进行计数,无需标准曲线就可以绝对定量被测基因的数量,而且检测灵敏度高。
(3)构建微滴式数字PCR反应体系,形成试剂盒产品,主要包括微滴生成油、PCR预混液及引物探针试剂三部分,轻松实现***癌的筛查分析。
进一步的本发明所用的引物和探针为:
a)针对于***特异性抗原(prostate specific antigen PSA)基因设计的引物序列为:
正向5’- CCTTGAAGCACACCATTACA-3’,
反向5’- TACCCACTGCATCAGGAACA-3’;
探针为FAM荧光标记的如下序列:
正向5’- GTCCAGCGTCCAGCACACAG-3’,
反向5’- ACACAGGCCAGGTATTTCAG-3’。
b)针对于人类激肽释放酶2(human kallikrein2 hK2)基因设计的引物序列为:
正向5’-TGGTGTCCTTGATCCACTTCCG-3’,
反向5’- GATTGTGGGAGGCTGGGAGTG-3’;
探针为HEX荧光标记的如下序列:
正向5’- GAATCACCCCCACAAGTGTC-3’,
反向5’- ACACAGGCCAGAGGGTCCCT-3’。
c)针对于***特异的膜抗原(prostate specific membrane antigen PSMA)基因设计的引物序列为:
正向5’- AACACCATCCCTCCTCGAACC-3’,
反向5’- CAGATATGTCATTCTGGGAGGTC-3’;
探针为ROX荧光标记的如下序列:
正向5’- CTGTGATACAGTGGATAGCCGCT-3’,
反向5’- CCTAACAAAAGAGCTGAAAAGCCC-3’。
进一步的本发明的反应原理图,如图1所示。
进一步的本发明所用的微滴生成油为ABA嵌段共聚物(PFPE-PEG-PFPE)与NOVEC7500按照2:98或5:95的比例制备而成。
进一步的本发明所用PCR预混液为Taq DNA聚合酶浓度为0.02U/μL~0.1U/μL、dNTPs(0.2mmol/L~0.5 mmol/L)、PCR buffer(1×~3×)。
进一步的本发明所用探针引物的含量为:各种引物探针的浓度为1μmol/L ~2μmol/L。
进一步的本发明扩增条件如下表1所示:
表1 PCR反应程序
借助本发明的技术方案,可以获得一种同时检测***特异性抗原(prostatespecific antigen PSA)、人类激肽释放酶2(human kallikrein2 hK2)和***特异的膜抗原(prostate specific membrane antigen PSMA)相关基因的***癌三指标数字PCR检测试剂盒,该试剂盒通过数字PCR方法,同时对***癌相关的基因进行检测分析,不仅检测结果准确,降低了检测的漏检率,同时实现了定量分析的效果,无论在筛查还是在后续治疗过程中都能提供数据的支持,保证了检测结果的可持续应用性,具有潜在的临床应用价值。
附图说明
图1为本发明的反应原理图;
图2 实施例3对梯度样本检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
一种***癌三指标数字PCR检测试剂盒包括:
微滴生成油1瓶,PCR预混液1支,PSA引物探针溶液(以下简称溶液A)1支,hK2引物探针溶液(以下简称溶液B)1支,PSMA引物探针溶液(以下简称溶液C)1支。
作为耗材的数字PCR芯片不作为试剂盒组成,但是分析过程需要使用。
实施例1
1. 微滴生成油配制:
ABA嵌段共聚物(PFPE-PEG-PFPE)与NOVEC 7500按照2:98混匀。
2.PCR预混液配制:
结合采购的原料,加纯化水稀释至终浓度如表2所示:
表2 PCR预混液组成
3. 引物探针溶液制备:
(1) 将设计合成的PSA引物探针配制1μmol/L的溶液,作为溶液A;
(2) 将设计合成的hK2引物探针配制1μmol/L的溶液,作为溶液B;
(3) 将设计合成的PSMA引物探针配制1μmol/L的溶液,作为溶液C。
4.配制PCR扩增试剂
按下表3配制PCR扩增试剂,充分混匀后离心备用。
表3 PCR扩增试剂组成
5. 微滴生成及扩增
使用数字PCR芯片,在油孔加入80 μL的生成油,样本孔加入30 μL的PCR扩增试剂,盖上密封条后,放入微滴生成仪,生成好微滴约50 μL,转移至PCR反应管中准备扩增。将PCR反应管放到普通PCR仪上,按照表1设定扩增参数,运行程序进行扩增。
6. 信号检测
将扩增好的反应管转移到数字PCR分析***上,荧光检测通道设置:选择FAM检测PSA基因,选择HEX检测hK2基因,选择ROX检测PSMA基因,运行程序,根据检测结果进行分析。
实施例2
1. 微滴生成油配制:
ABA嵌段共聚物(PFPE-PEG-PFPE)与NOVEC 7500按照5:95混匀。
2.PCR预混液配制:
结合采购的原料,加纯化水稀释至终浓度如表4所示:
表4PCR预混液组成
3. 引物探针溶液制备:
(1) 将设计合成的PSA引物探针配制2μmol/L的溶液,作为溶液A;
(2) 将设计合成的hK2引物探针配制2μmol/L的溶液,作为溶液B;
(3) 将设计合成的PSMA引物探针配制2μmol/L的溶液,作为溶液C。
4.配制PCR扩增试剂
按表3配制PCR扩增试剂,充分混匀后离心备用。
5. 微滴生成及扩增
使用数字PCR芯片,在油孔加入80 μL的生成油,样本孔加入30 μL的PCR扩增试剂,盖上密封条后,放入微滴生成仪,生成好微滴约50 μL,转移至PCR反应管中准备扩增。将PCR反应管放到普通PCR仪上,按照表1设定扩增参数,运行程序进行扩增。
6. 信号检测
将扩增好的反应管转移到数字PCR分析***上,荧光检测通道设置:选择FAM检测PSA基因,选择HEX检测hK2基因,选择ROX检测PSMA基因,运行程序,根据检测结果进行分析。
实施例3
1. 微滴生成油配制:
ABA嵌段共聚物(PFPE-PEG-PFPE)与NOVEC 7500按照2:98混匀。
2.PCR预混液配制:
结合采购的原料,加纯化水稀释至终浓度如表5所示:
表5PCR预混液组成
3. 引物探针溶液制备:
(1) 将设计合成的PSA引物探针配制2μmol/L的溶液,作为溶液A;
(2) 将设计合成的hK2引物探针配制2μmol/L的溶液,作为溶液B;
(3) 将设计合成的PSMA引物探针配制2μmol/L的溶液,作为溶液C。
4.配制PCR扩增试剂
按表3配制PCR扩增试剂,充分混匀后离心备用。
5. 微滴生成及扩增
使用数字PCR芯片,在油孔加入80 μL的生成油,样本孔加入30 μL的PCR扩增试剂,盖上密封条后,放入微滴生成仪,生成好微滴约50 μL,转移至PCR反应管中准备扩增。将PCR反应管放到普通PCR仪上,按照表1设定扩增参数,运行程序进行扩增。
6. 信号检测
将扩增好的反应管转移到数字PCR分析***上,荧光检测通道设置:选择FAM检测PSA基因,选择HEX检测hK2基因,选择ROX检测PSMA基因,运行程序,根据检测结果进行分析。
实施例4
利用实施例1、实施例2、实施例3制备的试剂盒,对临床上确诊为***癌54例、非***癌随机62例的血液样本进行检测,检测结果如表6、表7、表8所示:
表6实施例1与临床结果对比表
表7实施例2与临床结果对比表
表8实施例3与临床结果对比表
通过表6、表7、表8的结果显示,实施例1、实施例2、实施例3制备的试剂盒检测样本阴阳性结果一致,与临床上确诊为***癌的结果对照,阳性检出率为88.89%,比现在文献中报道的采用PSA常规检测方法检出的52.9%要更准确,因此本实验制备的试剂盒,检测准确性更高,更能满足临床对于***癌的初筛需求。
实施例5
利用实施例3制备的试剂盒,对临床已确诊的***癌患者样本利用市售总RNA抽提纯化试剂盒提取标本总RNA,将RNA配制浓度为20000 copies/mL,并逐级稀释为2000copies/mL、200 copies/mL、20 copies/mL、2 copies/mL的浓度梯度,采用cDNA 合成试剂盒逆转录合成cDNA,进行检测,结果如图2所示:
经过对梯度稀释的结果,实施例3制备的试剂盒检测2 copies/mL~20000 copies/mL浓度的样本,检测结果显示相关系数r=0.9999,说明试剂盒在检测临床样本时,能够检测浓度范围在2 copies/mL~20000 copies/mL的样本且结果准确,灵敏度能够达到2 copies/mL的浓度下限。
通过上述实施例,本发明提供一种***癌三指标联合检测试剂盒,采用数字PCR的方法,能够同时对***癌相关的***特异性抗原(prostate specific antigenPSA)、人类激肽释放酶2(human kallikrein2 hK2)和***特异的膜抗原(prostatespecific membrane antigen PSMA)基因进行检测,检测结果准确,检测的浓度下限为2copies/mL,灵敏度极高,本发明对于临床检测***癌具有很高的潜在价值。
Claims (5)
1.一种***癌三指标数字PCR检测试剂盒,其特征在于,包括PSA、hK2、PSMA的引物序列组,以及PSA、hK2、PSMA对应的荧光探针FAM、HEX、ROX;
所述PSA的引物组序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示;
hK2的引物组序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示;
PSMA的引物组序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示;
FAM荧光探针序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示;
HEX荧光探针序列如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10所示;
ROX荧光探针序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示。
2.根据权利要求1所述的一种***癌三指标数字PCR检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括微滴生成油,微滴生成油为ABA嵌段共聚物与NOVEC 7500按照2:98或5:95的比例制备而成。
3.根据权利要求1所述的一种***癌三指标数字PCR检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括PCR预混液,PCR预混液为Taq DNA聚合酶浓度为0.02U/μL~0.1U/μL、dNTPs(0.2mmol/L~0.5 mmol/L)、PCR buffer(1×~3×)。
4.根据权利要求1所述的一种***癌三指标数字PCR检测试剂盒,其特征在于,引物探针的浓度为1μmol/L ~2μmol/L。
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CN202310092879.6A CN115873958A (zh) | 2023-02-10 | 2023-02-10 | 一种***癌三指标数字pcr检测试剂盒 |
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