CN115873958A - 一种***癌三指标数字pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种***癌三指标数字PCR检测试剂盒，包括PSA、hK2、PSMA的引物序列组，以及PSA、hK2、PSMA对应的荧光探针FAM、HEX、ROX；该试剂盒通过数字PCR方法，同时对***癌相关的基因进行检测分析，不仅检测结果准确，降低了检测的漏检率，同时实现了定量分析的效果，无论在筛查还是在后续治疗过程中都能提供数据的支持，保证了检测结果的可持续应用性，具有潜在的临床应用价值。

Description

一种***癌三指标数字PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种***癌三指标联合检测试剂盒，属于临床体外检测技术领域。

背景技术

***癌的筛查在欧美国家曾经广泛开展，然而在我国，由于未曾开始过大规模的***癌筛查，人群中应该有相当数量的高侵袭性或晚期***癌病例。因此在我国现阶段，开展***癌筛查是非常有必要的。

***癌筛查最广泛采用的是美国癌症联合委员会制订的TNM 分期***，筛查方法主要有***特异性抗原（PSA）检测、穿刺活检、核素全身骨显像、***MRI 或***CT 以及***等方法，鉴于显像、MRI、CT技术需要依赖大型医疗设备，成本高不利于分析推广，而穿刺活检技术不仅会给检测人造成伤害，同时也需要专业医师操作，不利于大范围的筛查应用，所以现阶段***癌筛查主要应用的是对***特异性抗原（PSA）检测的方式。

***特异性抗原（PSA）检测的方法有生化反应方法、酶联免疫方法、化学发光方法、荧光分析方法，但是由于***特异性抗原正常人体内的含量较低，浓度低于4ng/mL，目前的检测方法灵敏度需要进一步的提高，而且仅利用PSA一种物质来分析***癌状况特异性较差，这些缺陷制约了***癌筛查的临床发展。

参考***癌诊疗指南（2022版），国内专家对于基因检测在***癌的早期诊断以及晚期肿瘤综合治疗阶段应用达成一定共识，其具有非常重要的作用。因此临床针对于***癌筛查需要一种多指标的基因分析试剂盒。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

针对于现在临床对***癌筛查指标单一，而且现有检测指标灵敏度较差的问题，本发明提供了一种***癌三指标数字PCR检测试剂盒。

本发明的所提供的***癌三指标数字PCR检测试剂盒有如下创新之处：

（1）试剂盒中的引物和探针，针对于***特异性抗原（prostate specificantigen PSA）、人类激肽释放酶2（human kallikrein2 hK2）和***特异的膜抗原（prostate specific membrane antigen PSMA）相关基因的引物探针，能同时对三个基因指标检测，综合对***癌进行分析筛查，提高阳性样本的筛出率，保障检测结果的准确性。

（2）使用数字PCR芯片，在油孔加入微滴生成油，样本孔加入扩增试剂，盖上密封条后，利用微滴生成仪将样本的基因及扩增反应溶液分散到微滴中，形成油包水结构，再进行扩增，通过数字PCR仪对相应荧光显色微滴进行计数，无需标准曲线就可以绝对定量被测基因的数量，而且检测灵敏度高。

（3）构建微滴式数字PCR反应体系，形成试剂盒产品，主要包括微滴生成油、PCR预混液及引物探针试剂三部分，轻松实现***癌的筛查分析。

进一步的本发明所用的引物和探针为：

a）针对于***特异性抗原（prostate specific antigen PSA）基因设计的引物序列为：

正向5’- CCTTGAAGCACACCATTACA-3’，

反向5’- TACCCACTGCATCAGGAACA-3’；

探针为FAM荧光标记的如下序列：

正向5’- GTCCAGCGTCCAGCACACAG-3’，

反向5’- ACACAGGCCAGGTATTTCAG-3’。

b）针对于人类激肽释放酶2（human kallikrein2 hK2）基因设计的引物序列为：

正向5’-TGGTGTCCTTGATCCACTTCCG-3’，

反向5’- GATTGTGGGAGGCTGGGAGTG-3’；

探针为HEX荧光标记的如下序列：

正向5’- GAATCACCCCCACAAGTGTC-3’，

反向5’- ACACAGGCCAGAGGGTCCCT-3’。

c）针对于***特异的膜抗原（prostate specific membrane antigen PSMA）基因设计的引物序列为：

正向5’- AACACCATCCCTCCTCGAACC-3’，

反向5’- CAGATATGTCATTCTGGGAGGTC-3’；

探针为ROX荧光标记的如下序列：

正向5’- CTGTGATACAGTGGATAGCCGCT-3’，

反向5’- CCTAACAAAAGAGCTGAAAAGCCC-3’。

进一步的本发明的反应原理图，如图1所示。

进一步的本发明所用的微滴生成油为ABA嵌段共聚物（PFPE-PEG-PFPE）与NOVEC7500按照2：98或5：95的比例制备而成。

进一步的本发明所用PCR预混液为Taq DNA聚合酶浓度为0.02U/μL~0.1U/μL、dNTPs（0.2mmol/L~0.5 mmol/L）、PCR buffer（1×~3×）。

进一步的本发明所用探针引物的含量为：各种引物探针的浓度为1μmol/L ~2μmol/L。

进一步的本发明扩增条件如下表1所示：

表1 PCR反应程序

借助本发明的技术方案，可以获得一种同时检测***特异性抗原（prostatespecific antigen PSA）、人类激肽释放酶2（human kallikrein2 hK2）和***特异的膜抗原（prostate specific membrane antigen PSMA）相关基因的***癌三指标数字PCR检测试剂盒，该试剂盒通过数字PCR方法，同时对***癌相关的基因进行检测分析，不仅检测结果准确，降低了检测的漏检率，同时实现了定量分析的效果，无论在筛查还是在后续治疗过程中都能提供数据的支持，保证了检测结果的可持续应用性，具有潜在的临床应用价值。

附图说明

图1为本发明的反应原理图；

图2 实施例3对梯度样本检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

一种***癌三指标数字PCR检测试剂盒包括：

微滴生成油1瓶，PCR预混液1支，PSA引物探针溶液（以下简称溶液A）1支，hK2引物探针溶液（以下简称溶液B）1支，PSMA引物探针溶液（以下简称溶液C）1支。

作为耗材的数字PCR芯片不作为试剂盒组成，但是分析过程需要使用。

实施例1

1. 微滴生成油配制：

ABA嵌段共聚物（PFPE-PEG-PFPE）与NOVEC 7500按照2：98混匀。

2.PCR预混液配制：

结合采购的原料，加纯化水稀释至终浓度如表2所示：

表2 PCR预混液组成

3. 引物探针溶液制备：

(1) 将设计合成的PSA引物探针配制1μmol/L的溶液，作为溶液A；

(2) 将设计合成的hK2引物探针配制1μmol/L的溶液，作为溶液B；

(3) 将设计合成的PSMA引物探针配制1μmol/L的溶液，作为溶液C。

4.配制PCR扩增试剂

按下表3配制PCR扩增试剂，充分混匀后离心备用。

表3 PCR扩增试剂组成

5. 微滴生成及扩增

使用数字PCR芯片，在油孔加入80 μL的生成油，样本孔加入30 μL的PCR扩增试剂，盖上密封条后，放入微滴生成仪，生成好微滴约50 μL，转移至PCR反应管中准备扩增。将PCR反应管放到普通PCR仪上，按照表1设定扩增参数，运行程序进行扩增。

6. 信号检测

将扩增好的反应管转移到数字PCR分析***上，荧光检测通道设置：选择FAM检测PSA基因，选择HEX检测hK2基因，选择ROX检测PSMA基因，运行程序，根据检测结果进行分析。

实施例2

1. 微滴生成油配制：

ABA嵌段共聚物（PFPE-PEG-PFPE）与NOVEC 7500按照5：95混匀。

2.PCR预混液配制：

结合采购的原料，加纯化水稀释至终浓度如表4所示：

表4PCR预混液组成

3. 引物探针溶液制备：

(1) 将设计合成的PSA引物探针配制2μmol/L的溶液，作为溶液A；

(2) 将设计合成的hK2引物探针配制2μmol/L的溶液，作为溶液B；

(3) 将设计合成的PSMA引物探针配制2μmol/L的溶液，作为溶液C。

4.配制PCR扩增试剂

按表3配制PCR扩增试剂，充分混匀后离心备用。

5. 微滴生成及扩增

使用数字PCR芯片，在油孔加入80 μL的生成油，样本孔加入30 μL的PCR扩增试剂，盖上密封条后，放入微滴生成仪，生成好微滴约50 μL，转移至PCR反应管中准备扩增。将PCR反应管放到普通PCR仪上，按照表1设定扩增参数，运行程序进行扩增。

6. 信号检测

将扩增好的反应管转移到数字PCR分析***上，荧光检测通道设置：选择FAM检测PSA基因，选择HEX检测hK2基因，选择ROX检测PSMA基因，运行程序，根据检测结果进行分析。

实施例3

1. 微滴生成油配制：

ABA嵌段共聚物（PFPE-PEG-PFPE）与NOVEC 7500按照2：98混匀。

2.PCR预混液配制：

结合采购的原料，加纯化水稀释至终浓度如表5所示：

表5PCR预混液组成

3. 引物探针溶液制备：

(1) 将设计合成的PSA引物探针配制2μmol/L的溶液，作为溶液A；

(2) 将设计合成的hK2引物探针配制2μmol/L的溶液，作为溶液B；

(3) 将设计合成的PSMA引物探针配制2μmol/L的溶液，作为溶液C。

4.配制PCR扩增试剂

按表3配制PCR扩增试剂，充分混匀后离心备用。

5. 微滴生成及扩增

使用数字PCR芯片，在油孔加入80 μL的生成油，样本孔加入30 μL的PCR扩增试剂，盖上密封条后，放入微滴生成仪，生成好微滴约50 μL，转移至PCR反应管中准备扩增。将PCR反应管放到普通PCR仪上，按照表1设定扩增参数，运行程序进行扩增。

6. 信号检测

将扩增好的反应管转移到数字PCR分析***上，荧光检测通道设置：选择FAM检测PSA基因，选择HEX检测hK2基因，选择ROX检测PSMA基因，运行程序，根据检测结果进行分析。

实施例4

利用实施例1、实施例2、实施例3制备的试剂盒，对临床上确诊为***癌54例、非***癌随机62例的血液样本进行检测，检测结果如表6、表7、表8所示：

表6实施例1与临床结果对比表

表7实施例2与临床结果对比表

表8实施例3与临床结果对比表

通过表6、表7、表8的结果显示，实施例1、实施例2、实施例3制备的试剂盒检测样本阴阳性结果一致，与临床上确诊为***癌的结果对照，阳性检出率为88.89%，比现在文献中报道的采用PSA常规检测方法检出的52.9%要更准确，因此本实验制备的试剂盒，检测准确性更高，更能满足临床对于***癌的初筛需求。

实施例5

利用实施例3制备的试剂盒，对临床已确诊的***癌患者样本利用市售总RNA抽提纯化试剂盒提取标本总RNA，将RNA配制浓度为20000 copies/mL，并逐级稀释为2000copies/mL、200 copies/mL、20 copies/mL、2 copies/mL的浓度梯度，采用cDNA 合成试剂盒逆转录合成cDNA，进行检测，结果如图2所示：

经过对梯度稀释的结果，实施例3制备的试剂盒检测2 copies/mL~20000 copies/mL浓度的样本，检测结果显示相关系数r=0.9999，说明试剂盒在检测临床样本时，能够检测浓度范围在2 copies/mL~20000 copies/mL的样本且结果准确，灵敏度能够达到2 copies/mL的浓度下限。

通过上述实施例，本发明提供一种***癌三指标联合检测试剂盒，采用数字PCR的方法，能够同时对***癌相关的***特异性抗原（prostate specific antigenPSA）、人类激肽释放酶2（human kallikrein2 hK2）和***特异的膜抗原（prostatespecific membrane antigen PSMA）基因进行检测，检测结果准确，检测的浓度下限为2copies/mL，灵敏度极高，本发明对于临床检测***癌具有很高的潜在价值。

Claims (5)

1.一种***癌三指标数字PCR检测试剂盒，其特征在于，包括PSA、hK2、PSMA的引物序列组，以及PSA、hK2、PSMA对应的荧光探针FAM、HEX、ROX；

所述PSA的引物组序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示；

hK2的引物组序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示；

PSMA的引物组序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示；

FAM荧光探针序列如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示；

HEX荧光探针序列如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10所示；

ROX荧光探针序列如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示。

2.根据权利要求1所述的一种***癌三指标数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括微滴生成油，微滴生成油为ABA嵌段共聚物与NOVEC 7500按照2：98或5：95的比例制备而成。

3.根据权利要求1所述的一种***癌三指标数字PCR检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR预混液，PCR预混液为Taq DNA聚合酶浓度为0.02U/μL~0.1U/μL、dNTPs（0.2mmol/L~0.5 mmol/L）、PCR buffer（1×~3×）。

4.根据权利要求1所述的一种***癌三指标数字PCR检测试剂盒，其特征在于，引物探针的浓度为1μmol/L ~2μmol/L。

5.根据权利要求1所述的一种***癌三指标数字PCR检测试剂盒，其特征在于，扩增条件为：

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