CN115873819A - 基于超级计算辅助获得d-氨基酸转氨酶突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于计算生物学、计算机辅助设计和酶工程技术领域，具体涉及基于超级计算辅助获得D‑氨基酸转氨酶突变体及其应用。本发明基于超级计算辅助技术成功获得一种新的D‑氨基酸转氨酶突变体并对该酶进行了应用。与野生型酶相比，上述D‑氨基酸转氨酶突变体在40℃的半衰期t _1/2>12 h，而野生型D‑氨基酸转氨酶仅为8.8 min，突变体的半失活温度T ₅₀ ¹⁵为45.3℃，比野生型D‑氨基酸转氨酶提高了约5.4℃。从而显著提高了其热稳定性及酶活性等，有效拓宽其应用领域和范围，具有广泛的工业应用前景，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

基于超级计算辅助获得D-氨基酸转氨酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于计算生物学、计算机辅助设计和酶工程技术领域，具体涉及基于超级计算辅助获得D-氨基酸转氨酶突变体及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

随着计算机技术的发展，运用计算机技术辅助蛋白质工程的策略备受关注，理性设计成为未来蛋白质改造的发展方向。特别地，运用超级计算技术的分子对接、量子/经典分子动力学模拟、量子力学及量子化学等方法可以用于预测评估突变体的结构、结合自由能、反应壁垒、稳定性等方面的性能。Aalbers等人利用FRESCO算法提高醇脱氢酶ADHA的热稳定性且突变体的活性与野生型相当。近年来，机器学习也越来越多地用于蛋白质工程，可对大量蛋白质数据进行挖掘训练，进而辅助预测蛋白质结构，提高酶的稳定性和溶解度等性能，并可预测底物特异性，指导蛋白质设计。2018年，诺贝尔化学奖获得者F.H. Arnold通过机器学习结合定向进化，成功将一氧化氮双加氧酶的立体选择性从76% (S)-ee提升至93% (S)-ee及反转至79% (R)-ee。

手性胺类化合物是指小分子化合物手性中心含有氨基的一类化合物，是一类重要的药物合成中间体。近年来，随着手性药物市场不断扩大，手性胺及其衍生物占据手性药物的份额的70%，如神经类药物、心血管药物、抗感染药物及疫苗等。市场对手性胺药物及天然氨基酸的需求巨大，使得高效制备手性胺化合物极为重要。

氨基转移酶是生物法制备手性胺的关键酶，它能够可逆催化酮类化合物与含氨基化合物之间的氨基转移反应以合成胺类化合物。来自于曲霉菌属(Aspergillus pseudonomiae)的D-氨基酸转氨酶(D-ATA)以磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate，PLP)为辅酶，催化氨基化合物上的氨基转移到受体酮类化合物上，生成手性胺和副产物酮，催化过程如下所示：

虽然转氨酶在合成手性胺方面有较好的应用前景，但野生型酶在底物特异性、稳定性、催化效率等方面还存在诸多不足，不利于将其应用到大规模生产中。热力学实验表明来源于曲霉菌属野生型D-氨基酸氨基转移酶在40℃下的半衰期仅为8.8 min，需对其进行热稳定性改造。提高酶的热稳定性将有助于加快反应速率、增加难溶性有机物的溶解性、防止反应过程中的杂菌污染等。而随着超级计算技术的不断发展，为实现高效快速的订制鲁棒性酶，通过分子动力学模拟技术获得热稳定性较好的酶已成为研究热点。

分子动力学模拟是基于牛顿力学原理模拟原子和分子的物理运动轨迹和状态的方法。对于较为复杂的生物分子体系，通常通过对相互作用粒子的牛顿运动方程进行数值解析来确定体系内粒子的轨迹，而粒子间的作用力和势能采用分子力学力场来确定。然而，由于计算数据量呈几何增长趋势，现有基于普通计算设备的分子动力学模拟方法难以满足快速高效的分析要求，简单的多台计算机并行计算方式耗费较多硬件资源且计算效率依然受限。因此，研究超级计算辅助热稳定性提升的生物酶制备方法具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明利用超级计算辅助技术成功获得一种热稳定性提高的Aspergillus pseudonomiae来源的D-氨基酸转氨酶突变体。基于上述研究成果，从而完成本发明。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种D-氨基酸转氨酶突变体，所述D-氨基酸转氨酶突变体是由野生型D-氨基酸转氨酶在其16个氨基酸位点发生如下突变后获得：N23P, E35P,Y36P, V37P, E41P, K88P, V89P, E95P, M189P, A192P, Y199P, V232P, E255P, V288P,Q292P, W301P；其中，所述野生型D-氨基酸转氨酶的NCBI登录号为XP_031942666.1。

本发明通过在野生型D-氨基酸转氨酶的基础上基于超级计算辅助技术获得上述D-氨基酸转氨酶突变体，与野生型酶相比，上述D-氨基酸转氨酶突变体在40℃的半衰期t _1/2>12 h，而野生型(WT)仅为8.8 min，突变体的半失活温度T ₅₀ ¹⁵为45.3℃，比WT（39.9℃）提高了约5.4℃。从而显著提高了其热稳定性及酶活性等，有效拓宽其应用领域和范围。

本发明的第二方面，提供一种多聚核苷酸分子，所述多聚核苷酸分子编码上述第一方面所述的D-氨基酸转氨酶突变体。

本发明的第三方面，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有本发明第二方面所述的多聚核苷酸分子。

所述重组表达载体是由上述是由上述多聚核苷酸与表达载体进行有效连接获得，所述表达载体可以选自质粒，在本发明的一个具体实施方式中，所述质粒为pET-28a(+)。

本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体、染色体整合有本发明第二方面所述的多聚核苷酸分子或者表达第一方面所述D-氨基酸转氨酶突变体。

所述宿主细胞可以为原核细胞或真核细胞。

所述宿主细胞是细菌细胞或真菌细胞中的任意一种或多种。

在本发明的一个具体实施方式中，所述宿主细胞可以为大肠杆菌及其衍生菌，具体的，所述宿主细胞为E. coli BL21(DE3)。

本发明的第五方面，提供了一种发酵产D-氨基酸转氨酶突变体的方法，所述方法包括利用培养上述宿主细胞，并分离获取所述D-氨基酸转氨酶突变体。

本发明的第六方面，提供上述第一方面所述D-氨基酸转氨酶突变体、第二方面所述多聚核苷酸分子、第三方面所述重组表达载体、第四方面所述宿主细胞、第五方面所述方法在手性胺合成领域中的应用。

具体的，所述手性胺合成具体为丙酮酸生成D-丙氨酸；更具体的，所述合成可以在40℃条件下进行。

本发明的第七方面，提供一种上述D-氨基酸转氨酶突变体的获得方法，所述获得方法包括：

利用CHARMM力场和GROMACS 5.1.2对野生型D-氨基酸转氨酶分别在40^oC和50^oC下进行20 ns的超级计算辅助的分子动力学模拟，对模拟结果中的均方根波动RMSF (RootMean Square Fluctuation)进行分析统计；通过对40^oC和50^oC下野生型D-氨基酸转氨酶的每个氨基酸的RMSF值进行差值计算(ΔRMSF=RMSF₅₀ ^o _C-RMSF₄₀ ^o _C)，选取差值>0.5 Å的氨基酸进行脯氨酸扫描，获取影响热稳定性的关键氨基酸位点，并基于突变验证及热稳定性检测获得热稳定性提高的D-氨基酸转氨酶突变体。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案基于超级计算辅助技术成功获得一种新的D-氨基酸转氨酶突变体并对该酶进行了应用。与野生型酶相比，上述D-氨基酸转氨酶突变体在40℃的半衰期t _1/2>12 h，而野生型(WT)仅为8.8 min，突变体的半失活温度T ₅₀ ¹⁵为45.3℃，比WT（39.9℃）提高了约5.4℃。从而显著提高了其热稳定性及酶活性等，有效拓宽其应用领域和范围，具有广泛的工业应用前景，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1中在40℃和50℃下进行20 ns超级计算辅助的分子动力学模拟所得到的野生型D-氨基酸转氨酶每个氨基酸的RMSF分析，矩形框所示为ΔRMSF>0.5 Å较为集中的氨基酸位点区域。

图2为本发明实施例3中野生型D-氨基酸转氨酶和D-氨基酸转氨酶突变体的SDS-PAGE电泳分析结果图，其中，各泳道分别为M：protein marker； lane 1：野生型纯化酶液；2：突变体M1纯化酶液。

图3为本发明实施例4中野生型D-氨基酸转氨酶与D-氨基酸转氨酶突变体的活力检测结果图，突变体酶包含16个突变位点（N23P, E35P, Y36P, V37P, E41P, K88P, V89P,E95P, M189P, A192P, Y199P, V232P, E255P, V288P, Q292P, W301P）。

图4为本发明实施例5中野生型D-氨基酸转氨酶与D-氨基酸转氨酶突变体在40℃下孵育10 min后的残余活性图。

图5为本发明实施例9中野生型D-氨基酸转氨酶与D-氨基酸转氨酶突变体催化20mM的丙酮酸生成D-丙氨酸的反应进程图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如 Sambrook 等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

一种D-氨基酸转氨酶突变体的获得方法，包括：利用CHARMM力场和GROMACS 5.1.2对D-ATA（NCBI登录号为XP_031942666.1）分别在40^oC和50^oC下进行20 ns的超级计算辅助的分子动力学模拟，对模拟结果中的均方根波动RMSF (Root Mean Square Fluctuation)进行分析统计。RMSF是指一段时间内，某一个原子相对于参考构象的结构变化，反应了原子的自由度(灵活性)。通过对40^oC和50^oC下每个氨基酸的RMSF值进行差值计算(ΔRMSF=RMSF₅₀ ^o _C-RMSF₄₀ ^o _C)，选取差值>0.5 Å的氨基酸进行脯氨酸扫描，获取影响热稳定性的关键位点，结果如图1所示。通过超级计算机辅助设计、突变验证及热稳定性检测获得了热稳定性提高的一个突变体M1即上述D-氨基酸转氨酶突变体。

实施例2

(1)材料与试剂

D-ATA及突变体基因由北京擎科生物科技有限公司(Tsingke BiotechnologyCo., Ltd.)合成，所使用的质粒为pET-28a(+)。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、硫酸卡那霉素(Kanamycin sulfate)、磷酸吡哆醛(pyrodoxal-5’-phosphate，PLP)、改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Ni-NTA层析介质购自北京全式金生物技术有限公司；二甲基亚砜(DMSO)、丙酮酸、(R)-α-甲基苄胺购自阿拉丁生化科技股份有限公司。

(2)酶的表达与纯化

取适量野生型及突变体菌液E. coli BL21(DE3) 接种于5 mL含有终浓度为50 μg/mL硫酸卡那霉素的Luria-Bertani (LB)液体培养基中，37℃、200 rpm条件下摇床培养12h。菌液以2%的接种量(v/v)转接至200 mL含有终浓度为50 μg/mL 硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200 rpm条件下继续培养2~3 h。当OD₆₀₀达到0.8时，加入终浓度为0.5 mM的IPTG，并在28℃、200 rpm条件下诱导蛋白表达。诱导12 h后，在8000 r/min，4 ℃条件下离心收集菌体。

菌体细胞用100 mM的PBS缓冲液(pH 7.5)洗涤2次去除残留培养基后悬浮于50 mL破胞缓冲液(50 mM磷酸二氢钠，300 mM氯化钠，20 mM咪唑，pH 8.0)中，冰浴条件下对菌体细胞进行均质机破碎细胞。细胞破碎液在8000 rpm，4℃条件下离心1 h，收集得到的上清液即为含有D-ATA的粗酶液。随后，将粗酶液用0.45 μm滤膜过滤后采用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化目的蛋白。

纯化缓冲液如下：

20 mM咪唑缓冲液：50 mM磷酸二氢钠，300 mM氯化钠，20 mM咪唑，pH 8.0；

50 mM洗脱缓冲液：50 mM磷酸二氢钠，300 mM氯化钠，50 mM咪唑，pH 8.0；

250 mM洗脱缓冲液：50 mM磷酸二氢钠，300 mM氯化钠，250 mM咪唑，pH 8.0。

具体纯化步骤：

（1）平衡Ni-NTA亲和层析柱：按顺序用20%（v/v）乙醇水溶液、去离子水和20 mM咪唑缓冲液各洗3个柱体积；

（2）上样：注射器取粗酶液经0.45 μm滤膜过滤，带有6个组氨酸标签的目的蛋白能与填料结合。

（3）清洗：20 mM咪唑缓冲液和50 mM洗脱缓冲液各洗3柱体积，Bradford溶液检测是否洗干净杂蛋白；

（4）洗脱：250 mM洗脱缓冲液冲洗，收集5 mL穿流液。

实施例3

蛋白含量的测定

采用改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒建立蛋白含量标准曲线，测定纯酶的浓度，蛋白标准曲线的制备步骤参照说明书进行。采用SDS-PAGE方法鉴定纯化后蛋白的分子量和纯度。

蛋白含量测定：将目的蛋白稀释到BSA标准曲线的线性范围内，通过酶标仪测定A595值，代入线性方程求得稀释后的蛋白浓度。

野生型和突变体的SDS-PAGE电泳图谱如图2所示。野生型和突变体的电泳条带位于同一位置，且与理论分子量35.8 kDa一致。

实施例4

酶活力的测定

20 μL纯酶与180 μL底物溶液(10 mM PLP，2.5 mM (R)-α-甲基苄胺，2.5 mM丙酮酸，30% DMSO，100 mM PBS，pH 7.5)于40℃条件下反应3 min，测定OD₂₄₅苯乙酮的生成量。酶活力(U)定义为在一定条件下，每分钟酶催化底物丙酮酸和(R)-α-甲基苄胺发生转氨反应生成1 μmoL苯乙酮所需酶量。

野生型和突变体的酶活力如图3所示，与野生型的酶活力相比，突变体的酶活力显著提高，为野生型酶活力的4.0倍。

实施例5

酶残余活力的测定

将纯化的野生型和突变体在40℃下孵育10 min，孵育结束后，立即放冰上冷却10min。随后，20 μL经热处理的酶液与180 μL底物溶液(10 mM PLP，2.5 mM (R)-α-甲基苄胺，2.5 mM丙酮酸，30% DMSO，100 mM PBS，pH 7.5)于40℃条件下反应3 min，测定野生型和突变体的残余活力。以未在40℃下孵育处理得到的酶活力为100%，测定相对酶活力比野生型高的突变体。40°C下热处理10 min后，野生型和突变体的残余活力如图4所示。突变体的活力下降30%，而野生型的活力下降了约90%。

实施例6

酶动力学参数的测定

用含10 mM PLP的PBS缓冲液(100 mM，pH 7.5)分别配制0、0.1、0.2、0.3、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mM不同浓度的丙酮酸底物溶液。采用酶活力测定的方法测定在不同浓度下D-ATA野生型和突变体的酶活力。将不同底物以及不同底物浓度[S]下对应的反应速率V带入米氏方程V=V _max ×[S]/(K _m+[S])，在计算机中利用Origin 8.0软件进行非线性拟合，并计算野生型和突变体对应的酶动力学参数K _m 和V _max；由公式k _cat=V _max/[E]计算野生型和突变体对应的转化数k _cat和催化效率k _cat/K _m，其中[E]为酶的摩尔浓度。结果如表1所示，突变酶M1对丙酮酸的转化数均提升，米氏常数K _m值较WT均降低，亲和力提升。

表1 野生型和突变体的动力学参数

实施例7

T ₅₀ ¹⁵的测定

T ₅₀ ¹⁵是指纯酶在4~60℃下孵育15 min后，酶残余活力降低到50%时所对应的温度。将纯化后的野生酶及其突变体分别在4℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、47℃、49℃、50℃、55 ℃下孵育10 min，孵育结束后迅速放置冰上冷却5 min，测定野生型及其突变体的残余活力。以温度为横坐标，以热处理后与未经热处理的酶活力比值为纵坐标，运用Origin 8.0软件作图，计算野生型和突变体的T ₅₀ ¹⁵。

实施例8

t _1/2的测定

t _1/2是指纯酶在40℃下孵育不同时间后，酶残余活力降低到50%时所对应的时间。将纯化后的野生型及其突变体分别在40℃下孵育0~24 h，孵育结束后立即放冰上冷却5min，测定野生型及其突变体的残余活力。以时间为横坐标，以热处理后与未经热处理的酶活力比值为纵坐标，运用Origin 8.0软件作图，计算野生型和突变体在40℃下的t _1/2。

WT及M1的超级计算辅助稳定性测定结果表2所示。野生型的T ₅₀ ¹⁵为39.9°C，突变体的T ₅₀ ¹⁵为45.3°C，比野生型提高了5.4°C。突变体的t _1/2均大于12 h (780.3 min)，而野生型t _1/2仅8.8 min，突变体较野生酶的半衰期提升了87.7倍。

表2 野生型和突变体的稳定性参数

实施例9

WT和M1催化20 mM的丙酮酸生成D-丙氨酸的反应进程

在20 mL反应体系中，将1.0 g/L纯酶液，20 mM丙酮酸，20 mM的(R)-α-甲基苄胺，20 mM的PLP，30% (v/v) DMSO和100 mM pH 7.5的PBS缓冲液进行混合，在40℃，600 rpm下搅拌，每隔一段时间取样，测定其转化率。结果如图5所示，突变体M1催化效率远高于WT。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种D-氨基酸转氨酶突变体，其特征在于，所述D-氨基酸转氨酶突变体是由野生型D-氨基酸转氨酶在其16个氨基酸位点发生如下突变后获得：N23P, E35P, Y36P, V37P,E41P, K88P, V89P, E95P, M189P, A192P, Y199P, V232P, E255P, V288P, Q292P,W301P；其中，所述野生型D-氨基酸转氨酶的NCBI登录号为XP_031942666.1。

2.一种多聚核苷酸分子，其特征在于，所述多聚核苷酸分子编码权利要求1所述D-氨基酸转氨酶突变体。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求2所述多聚核苷酸分子。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的重组表达载体、染色体整合有权利要求2所述多聚核苷酸分子或者表达权利要求1所述D-氨基酸转氨酶突变体。

5.如权利要求4所述宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

6.一种发酵产权利要求1所述D-氨基酸转氨酶突变体的方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求4或5所述宿主细胞，并分离获取所述D-氨基酸转氨酶突变体。

7.权利要求1所述D-氨基酸转氨酶突变体、权利要求2所述多聚核苷酸分子、权利要求3所述重组表达载体、权利要求4或5所述宿主细胞、权利要求6所述方法在手性胺合成领域中的应用。

8.如权利要求7所述应用，其特征在于，所述手性胺合成具体为丙酮酸生成D-丙氨酸。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于，所述合成在40℃条件下进行。

10.一种权利要求1所述D-氨基酸转氨酶突变体的获得方法，其特征在于，所述获得方法包括：

利用CHARMM力场和GROMACS 5.1.2对野生型D-氨基酸转氨酶分别在40^oC和50^oC下进行20 ns的超级计算辅助的分子动力学模拟，对模拟结果中的均方根波动RMSF进行分析统计；通过对40^oC和50^oC下野生型D-氨基酸转氨酶的每个氨基酸的RMSF值进行差值计算，选取差值>0.5 Å的氨基酸进行脯氨酸扫描，获取影响热稳定性的关键氨基酸位点，并基于突变验证及热稳定性检测获得热稳定性提高的D-氨基酸转氨酶突变体。

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