CN115873808A - 一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种噬菌体及其用途。一种弗氏柠檬酸杆菌噬菌体，该噬菌体为RDP‑CF‑21001，分类命名为弗氏柠檬酸杆菌噬菌体，于2022年4月20日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45088。本发明提供的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体为烈性噬菌体，其对水体中弗氏柠檬酸杆菌有较强的裂解能力，并且具有很短的潜伏期，能够在短时间内大量增殖，快速杀菌，对水产养殖病害的预防和治疗具有积极的意义。为工业化生产噬菌体及治疗弗氏柠檬酸杆菌引起的水产动物细菌病提供了噬菌体来源。

Description

一株弗氏柠檬酸杆菌噬菌体及其用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种噬菌体及其用途。

背景技术

近年来，我国的水产养殖业获得迅猛发展。随着海水养殖规模的日益扩大和集约化养殖方式的不断推广，鱼虾疾病的频繁发生对水产品的规模化养殖的健康发展造成了严重的威胁。水产动物的病原菌主要有细菌、病毒，寄生虫等，其中细菌引起的疾病对水产动物危害程度较为严重。

弗氏柠檬酸杆菌是一种重要的人畜共患病原，不仅引起严重的海水动物弧菌病，而且造成人类的感染，甚至死亡。每年夏秋季节是该疾病的爆发期，容易感染鱼类、虾类、贝类以及蟹类等。目前，预防和控制弗氏柠檬酸杆菌感染的主要方法是使用抗生素，虽然抗生素具有使用方便，广谱抑菌，见效快等优点，但是，抗生素的滥用也导致了严重的细菌耐药性，在防治弗氏柠檬酸杆菌所造成的疾病时效果越来越差，急需开发新型抗弗氏柠檬酸杆菌的药物。

噬菌体是一种细菌病毒，在自然界中具有较高的丰度，具有宿主专一性强，不会破坏微生态环境。噬菌体侵染宿主菌后，裂解时会释放出新的噬菌体，而少量的噬菌体就能起到防治的效果。弗氏柠檬酸杆菌噬菌体的作用靶点在原核微生物细胞壁，对动植物细胞没有相应的作用位点，增加了噬菌体使用的安全性。噬菌体和病原菌可以共同进化，防止细菌耐药性的出现。因此利用细菌的天敌噬菌体来防治细菌感染，具有广阔前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种弗氏柠檬酸杆菌噬菌体RDP-CF-21001，该噬菌体能够专一裂解弗氏柠檬酸杆菌，利用该噬菌体应用到弗氏柠檬酸杆菌感染的防治中，安全无毒，防治效果好，不会产生耐药性。

为实现上述目的，本发明采用的技术手段是：一种弗氏柠檬酸杆菌噬菌体，该噬菌体为RDP-CF-21001，分类命名为弗氏柠檬酸杆菌噬菌体，于2022年4月20日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45088。

进一步地，该噬菌体的潜伏期为10 min，最高效价为3.83×10¹⁰ PFU/mL 。

进一步地，该噬菌对弗氏柠檬酸杆菌的最佳感染复数为1:1。

进一步地，本发明提供所述噬菌体的用途，该噬菌体用于制备裂解弗氏柠檬酸杆菌的生物制剂、治疗或/和预防弗氏柠檬酸杆菌引起的疾病的药物、预防弗氏柠檬酸杆菌引起的疾病的饲料、添加剂或保健品。

进一步地，本发明提供一种裂解弗氏柠檬酸杆菌的生物制剂，该生物制剂包含所述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体。

进一步地，本发明提供一种用于预防或/和治疗弗氏柠檬酸杆菌引起的疾病的药物，包含有效剂量的所述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体。

进一步地，本发明提供一种预防弗氏柠檬酸杆菌引起的疾病的饲料、添加剂或保健品，包含所述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体。

进一步地，本发明提供一种水产养殖环境清洁剂或消毒剂，包含所述的所述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体。

本发明提供的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体为烈性噬菌体，其对水体中弗氏柠檬酸杆菌有较强的裂解能力，并且具有很短的潜伏期，能够在短时间内大量增殖，快速杀菌，对水产养殖病害的预防和治疗具有积极的意义。为工业化生产噬菌体及治疗弗氏柠檬酸杆菌引起的水产动物细菌病提供了噬菌体来源。

附图说明

图1为本发明实施例中噬菌体RDP-CF-21001的噬菌斑；

图2为本发明实施例中噬菌体RDP-CF-21001在透射电镜下的形态；

图3为本发明实施例中噬菌体RDP-CF-21001对弗氏柠檬酸杆菌生长曲线的作用图；

图4为本发明实施例中噬菌体RDP-CF-21001的热稳定性测定；

图5为本发明实施例中噬菌体RDP-CF-21001的一步生长曲线。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

本发明的发明人从患病鹦鹉鱼的病灶处分离得到弗氏柠檬酸杆菌，并通过实验确定了该菌的致病性，以该弗氏柠檬酸杆菌为宿主，从环境中分离得到一株裂解性弗氏柠檬酸杆菌噬菌体，并通过全基因组序列确定了弗氏柠檬酸杆菌噬菌体RDP-CF-21001的基因型。

本发明所提供的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体RDP-CF-21001在治疗弗氏柠檬酸杆菌感染疾病中具有很好的优势，而且不会对益生菌造成伤害，效价较高，防治效果好。

实施例一：弗氏柠檬酸杆菌BCF-21001及其噬菌体的分离纯化

1、弗氏柠檬酸杆菌BCF-21001的分离鉴定

从发病鹦鹉鱼的病变部位取样，采用无菌操作的方法，在RS培养基上划线，27℃培养18-24h后，在RS琼脂平板上呈现边缘整齐的圆形边缘绿色，中央黑色的菌落，直径约2~4mm；然后继续划线纯化3次，再挑取单菌落接种于5mL的LB肉汤培养基中，27℃，200rpm振荡培养6h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液。再通过16sRNA分子鉴定，确定为弗氏柠檬酸杆菌BCF-21001。该弗氏柠檬酸杆菌BCF-21001为后续实验中噬菌体的宿主。

2、噬菌体RDP-CF-21001的分离鉴定

本发明试验用污水样品为2021年从青岛即墨海参养殖户周边污水中采集，作为噬菌体分离的水样。

取污水10毫升，10000rpm离心5分钟，出去较大杂质及大部分细菌后，再用0.22微米微孔滤膜过滤除菌。取3毫升滤液和3毫升宿主菌菌悬液，一起加入20毫升高压灭菌后的LB肉汤中，然后置27℃培养箱中，过夜培养。培养后取5毫升，10000rpm离心5分钟，再用0.22微米微孔滤器过滤除菌，滤液即为拟含有噬菌体的原液。然后，采用双平板法鉴定是否有噬菌体，若有噬菌斑则有噬菌体，反之则表明未分离出噬菌体，需从新筛选。

3、噬菌体RDP-CF-21001的纯化

初次分离的噬菌斑大小、形态常常不一致，因此需要进一步的纯化。在有噬菌斑的双层平板上挑取单个独立、形态均匀、清晰透明的噬菌斑，置1毫升生理盐水中，浸泡10分钟后，取清液，用0.22微米微孔过滤器过滤，然后将滤液适当稀释（铺双平板时有单个噬菌斑）后，与宿主菌悬液铺双层平板，此步骤重复3~4次，待双平板上各噬菌斑大小、形态和清晰度一致时即得到纯化的噬菌体。

4、噬菌体RDP-CF-21001效价的测定

将纯化好的噬菌体铺双层平板，然后取单个噬菌斑，加入LB肉汤中，同时加入宿主菌悬液，将噬菌体增殖后，再将增殖液10000rpm离心5分钟后再用0.22微米微孔过滤器过滤，将滤液做10倍梯度稀释至10⁸倍，取最后3个稀释度的噬菌体稀释液0.1毫升和宿主菌悬液0.1毫升，铺双层平板，测定噬菌体效价。

噬菌体效价（pfu/mL）=噬菌斑数*稀释倍数÷0.1

结果如图1所示，其噬菌斑形态、大小和清晰度一致，有典型的裂解性噬菌体特征。该噬菌体的效价可达10¹⁰pfu/mL以上。

实施例2：噬菌体RDP-CF-21001的形态观察

运用磷钨酸负染法：在石蜡片上滴噬菌体液（效价 10⁸pfu/m L）100 μL，将铜网有膜的一面置于噬菌体液滴上，10 min后取下，在空气中自然干燥2-3 min。然后在铜网上滴一滴2%的磷钨酸（PTA）水溶液进行染色，10 min后取下，在空气中干燥10~15 min，用电子显微镜观察，选取清晰的噬菌体图像进行拍照。由图2所示的电镜照片可看出，该噬菌体有尾部，头部长约100nm，直径约为55nm。

实施例3：噬菌体RDP-CF-21001基因组测序

通过对单株噬菌体的富集培养后，在4℃条件下8000g离心15分钟，加入10%PEG8000和0.5M NaCl静置过夜，再加入等量氯仿混匀，静置分层后5000g下离心10min，去处氯仿层和PEG层后，加入限制性核酸内切酶消化处理，并采用梯度密度氯化铯条件下悬浮噬菌体，后期采用TM缓冲液透析3次，每次30min，最后将透析好的噬菌体一部分预留做电镜观察，一部分送华大基因生物测序公司进行全基因组测序，测序结果如序列表SEQ ID NO.1所示，其基因组全长170756bp，将其命名为弗氏柠檬酸杆菌噬菌体，并于2022年4月20日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45088。保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例4：噬菌体RDP-CF-21001最佳感染复数实验

按照感染复数为1：1、1：10、10：1、100：1、1000：1的比例将噬菌体增殖液和宿主加入LB肉汤中，并且确保培养体系的总体积相同。于37℃200rpm振荡培养4-6h后，常温下12000r/min离心5min，取上清液铺双平板测定其效价。由表1可知，噬菌体RDP-CF-21001对宿主菌的最佳感染复数为1:1。

表1 本发明提供的噬菌体RDP-CF-21001对宿主菌的感染复数结果

实施例5：噬菌体RDP-CF-21001对弗氏柠檬酸杆菌BCF-21001生长曲线的作用

在细菌悬液中加入噬菌体，由于噬菌体对宿主的裂解作用，导致OD600的值产生变化，由此得到噬菌体对宿主的裂解曲线。将培养6h的宿主菌悬液以2%的比例接种到5mL LB培养基中，以最佳感染复数，加入噬菌体增殖液，同时以不加噬菌体的作为对照，做3组平行对照，结果取其平均值。

结果如图3所示，未加入噬菌体的宿主，随着宿主的增殖，其OD600逐渐增加，在8h达到平衡，而加入噬菌体的宿主，在前100min，噬菌体处于对宿主的吸附、侵染阶段，OD600有所增加，随着噬菌体的数量的指数增加，在120min后，噬菌体裂解宿主，其OD600开始下降，在170min时OD600降到最低，此阶段宿主菌含量最低，噬菌体对宿主菌的压制持续了455min。

弗氏柠檬酸杆菌噬菌体RDP-CF-21001加入到宿主菌菌悬液中，作用120min后出现持续的裂解效果，与未加入噬菌体的宿主OD600增加明显，说明该噬菌体对宿主有较强的裂解能力，能够持续的对宿主菌进行裂解。由于前100min，噬菌体处于对宿主菌的吸附、侵染阶段，只有少部分噬菌体开始裂解宿主，因此，其裂解宿主的量远远小于宿主的增长量，因此，OD600在在前100min内，依旧保持一定的上升趋势，伴随着噬菌体数量的指数增加，在100min后，其裂解宿主数量大于宿主的增殖速度，所以OD600值开始逐渐降低，混合菌液达最澄清。持续作用455min后，混合菌液出现返浊，原敏感菌被噬菌体裂解，被突变的耐受菌所取代的一种菌***替。因此，为获得高效价的噬菌体，应控制混合菌液在达到最高清晰度至返浊现象开始之前这一时间范围内，从而避免对噬菌体效价的影响。

实施例6：噬菌体RDP-CF-21001热稳定性的测定

将噬菌体RDP-CF-21001原液分装到EP管中，分别在40℃、50℃、60℃、70℃的条件下孵育30min，然后用生理盐水10倍倍比稀释后，铺双平板计数。由图4可知，噬菌体RDP-CF-21001在50℃的条件下存放30min后，效价可保持在7.92*10⁹pfu/mL，但是温度超过60℃，噬菌体均已失活，因此该噬菌体对高温不具有耐受性。

实施例7：噬菌体RDP-CF-21001一步生长曲线测定

按照最佳MOI=1，将 1 mL噬菌体裂解液和1 mL宿主菌液混合，37 ℃恒温培养箱中静置孵育15 min后，10 000 r/min离心10 min，弃上清液，此时沉淀已有噬菌体吸附，再用LB液体培养基洗涤1～2 次，洗去未吸附的游离噬菌体，加入15 mL LB液体培养基，在0～120 min内每隔10 min取样，120~240min内每60min取一次样，双层平板法计算噬菌体效价。

由图5所示，噬菌体和宿主菌混合后侵染0～10 min内，噬菌体增殖不明显，可判断噬菌体RDP-CF-21001的潜伏期为10 min；在10 min后噬菌体开始大量增殖，80 min后开始趋于平缓，90 min时达到最大值，此时噬菌体效价为3.83×10¹⁰ PFU/mL。因此，噬菌体RDP-CF-21001的爆发期为80 min。由此可见，该噬菌体有较短的潜伏期，可快速杀死细菌。

Claims (7)

1.一种弗氏柠檬酸杆菌噬菌体，其特征在于：该噬菌体为RDP-CF-21001，分类命名为弗氏柠檬酸杆菌噬菌体，于2022年4月20日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45088。

2.根据权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体，其特征在于：该噬菌体的潜伏期为10min，最高效价为3.83×10¹⁰ PFU/mL 。

3.根据权利要求1所述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体，其特征在于：该噬菌对弗氏柠檬酸杆菌的最佳感染复数为1:1。

4.一种如权利要求1-3任一项所述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体的用途，其特征在于：该噬菌体用于制备裂解弗氏柠檬酸杆菌的生物制剂、治疗或/和预防弗氏柠檬酸杆菌引起的疾病的药物、预防弗氏柠檬酸杆菌引起的疾病的饲料、添加剂或保健品。

5.一种裂解弗氏柠檬酸杆菌的生物制剂，其特征在于：包含如权利要求1-3任一项所述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体。

6.一种用于预防或/和治疗弗氏柠檬酸杆菌引起的疾病的药物，其特征在于：包含有效剂量的如权利要求1-3任一项所述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体。

7.预防弗氏柠檬酸杆菌引起的疾病的饲料、添加剂或保健品，其特征在于：包含有效剂量的如权利要求1-3任一项所述的弗氏柠檬酸杆菌噬菌体。

Images