CN101116750A

CN101116750A - 一种犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop

Info

Publication number: CN101116750A
Application number: CN 200710061856
Authority: CN
Inventors: 王俊霞
Original assignee: Hebei Medical University
Current assignee: Hebei Medical University
Priority date: 2007-05-10
Filing date: 2007-05-10
Publication date: 2008-02-06

Abstract

本发明涉及医药生物工程技术领域，是一种用于预防犬传染性肝炎的犬腺病毒DNA疫苗pVAX1－CpG－Loop。它由犬腺病毒六邻体蛋白改造后编码基因***真核表达载体所构成。该重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α就成pVAX1－CpG－Loop工程菌，可用于制备疫苗pVAX1－CpG－Loop。由于抗原基因Loop编码中和抗体决定簇基因，体内表达的抗原蛋白水平更高，从而增强了体液免疫，起到更好的预防犬肝炎感染的作用。本发明DNA疫苗制备工艺简单，成本低廉，可在真核细胞中表达Loop抗原并可激活淋巴细胞。

Description

一种犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop

技术领域：

本发明涉及医药生物工程技术领域，是一种用于预防犬传染性肝炎的DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop

背景技术：

犬传染性肝炎是由犬腺病毒一型(Canine adenovirus-1，CAV-1)引起的急性败血性疾病，目前预防以灭活苗和减毒苗为主。DNA疫苗，是近年兴起的新型疫苗，具有抗体效价维持时间长和交叉保护效果好等优点。此外DNA疫苗还具有以下突出优点：(1)能诱发体液及细胞全方位免疫应答，起到预防作用；(2)免疫保护时间长；(3)生产工艺简单、成本低廉、稳定性好且贮运方便。

发明内容：

本发明提供一种预防犬传染性肝炎的DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop，可用于预防犬传染性肝炎的感染。其作用机理为：将犬腺病毒一型抗原基因Loop***真核表达载体，将其注射于肌肉组织，使其在肌细胞中表达病毒抗原，经过抗原提呈过程，可激活体内的体液免疫***和细胞免疫***。激活的体液免疫***可产生特异的抗体，消除游离在血液中的病毒，预防犬肝炎病毒的入侵；

犬腺病毒(Canine adenovirus，CAV)，属于腺病毒科哺乳动物腺病毒属成员，各类腺病毒具有相同的结构，外形是无包膜的球形结构，衣壳为二十面体立体对称，由252个壳粒组成，其中240个非顶角壳粒为六邻体(hexon)，为主要的包膜蛋白；12个顶角的壳粒称为五邻体(penton)；还有三聚体蛋白的纤维。其中五邻体基底一端通过非共价键与三聚体纤维相连，另一端吸附到细胞膜上。目前，已对六邻体蛋白的结构和功能进行了广泛的研究。每个六邻体是六邻体蛋白的同源三聚体，是大于900个残基的复杂蛋白。三聚体的六邻体分子有一个五面体的基底和三角形的塔尖，基底包含两个区域P1、P2区，塔区由4个环构成即Loop1、Loop2、Loop3、Loop4。Loop1是最长、最复杂的环，自身折叠许多倍，与周围环境相互作用。通过一组单克隆抗体来检测不同型的纯化的六邻体蛋白表明，在六邻体表面有许多的抗原决定簇在这几个环上。对15个不同型的腺病毒的六邻体蛋白的序列研究表明，基底区P1、P2是保守的，变化区主要集中在Loop1、Loop2上。Loop1、Loop2存在有7个独特的超变区(Hypervariable Region，HVR)，在这7个HVRs中，HVR1-HVR6出现在Loop1中，HVR7出现在Loop2的塔尖。其中HVR1、HVR2、HVR4、HVR5、HVR7中都含有中和抗原决定簇，而且抗原决定簇至少包括两个或两个以上的HVRs。目前证实六邻体蛋白可以引发极强的中和反应，中和抗原决定簇主要存在六邻体上，而六邻体中主要抗原决定簇集中在Loop1区和Loop2区。本发明根据GeneBank中犬腺病毒I型和人腺病毒2型的六邻体蛋白基因序列及氨基酸序列，设计并合成了Loop1和Loop2基因，连接两个基因命名为Loop，将Loop克隆到质粒载体pVAX1-CpG，构建疫苗pVAX1-CpG-Loop；

合成的Loop蛋白核苷酸序列为：

Loop1

AACTGCCTATTTAATGGATCAGGTGCCAACATTAACACTTTAGCCCAAGTGCCATTTGCGGGCGCCATT

ACCGTTAATGGTCAAGCCGCAGTCACAGACAACACCTACCAGCCAGAGCCCCAGCTGGGCCCTGAAAGT

TGGGTGGATGGCACCTTGGCAGACCTAGGAGATGCGTCTGGCCGCGCCCTGAAAGCATCGACCCCACGC

ATGCCTTGCTACGGTTCTTATGCTCCCCCCACCAATGAAAACGGAGGTCAAGCAACTGGGGCCGTGGAA

CGAAGATTCTATAAAGTGACCACCAACAATAATAATGAAGCTGATGCCCTACTATATACAGAAGATGTG

AACCTCCAAACCCCAGACACCCACTTGGTGCATCAGGTGTCAGACGATCAGGTTACAGGTGTACAGGGA

CTGGGGCAACAA

Loop2

AACTATTGCTTCCCACTGAGCGGCATGGGACCATTAACTAACATGACAGCTATGAAGGTCAATAATCAA

AACTTTCAAACGGACAACACTAACGTGGGTCCCATTCAAAAGATTGGTTTCGGAAATGTTGAGGCCATG

GAGATAAATCTCAATGCTAACCTCTTTAAAGGTTTTCTCTACTCCAATGTGGCCCTATACCTACCTGAT

GCCTATAAATACACACCTGATAACATTGTAGCTCCTGCTAATGCAAATACCTATGCTTACATGAATGTG

AGATTGCCCGCTGCTAACCTTATAGACACATTTGTAAATATTGGCGCCAGATGGTCACCTGATGTAATG

GACTCTGTTAATCCTTTTAACCACCACAGAAATGCAGGACTCCGCTACCGATCACAGCTGCTTGGCAAT

GGCCGC

本发明犬肝炎病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop的制备方法如下：

1.人工合成犬肝炎病毒Loop(Loop1+Loop2)蛋白编码基因：

长度：860bp

类型：核酸

链数：双链

几何结构：线性

b)分子类型：DNA

c)来源：人工合成

d)序列描述：Loop蛋白编码基因：

5’-CGGGATCCATGAACTGCCTATTTAATGGATCAGGTGCCAACATTAACACTTTAGCCCAAGTGCCAT

TTGCGGGCGCCATTACCGTTAATGGTCAAGCCGCAGTCACAGACAACACCTACCAGCCAGAGCCCCAGC

TGGGCCCTGAAAGTTGGGTGGATGGCACCTTGGCAGACCTAGGAGATGCGTCTGGCCGCGCCCTGAAAG

CATCGACCCCACGCATGCCTTGCTACGGTTCTTATGCTCCCCCCACCAATGAAAACGGAGGTCAAGCAA

CTGGGGCCGTGGAACGAAGATTCTATAAAGTGACCACCAACAATAATAATGAAGCTGATGCCCTACTAT

ATACAGAAGATGTGAACCTCCAAACCCCAGACACCCACTTGGTGCATCAGGTGTCAGACGATCAGGTTA

CAGGTGTACAGGGACTGGGGCAACAACCCGGGTCCCCCGGGAACTATTGCTTCCCACTGAGCGGCATGG

GACCATTAACTAACATGACAGCTATGAAGGTCAATAATCAAAACTTTCAAACGGACAACACTAACGTGG

GTCCCATTCAAAAGATTGGTTTCGGAAATGTTGAGGCCATGGAGATAAATCTCAATGCTAACCTCTTTA

AAGGTTTTCTCTACTCCAATGTGGCCCTATACCTACCTGATGCCTATAAATACACACCTGATAACATTG

TAGCTCCTGCTAATGCAAATACCTATGCTTACATGAATGTGAGATTGCCCGCTGCTAACCTTATAGACA

CATTTGTAAATATTGGCGCCAGATGGTCACCTGATGTAATGGACTCTGTTAATCCTTTTAACCACCACA

GAAATGCAGGACTCCGCTACCGATCACAGCTGCTTGGCAATGGCCGCCTCGAG-3’

其中，5’末端的GGATCC为BamH I酶切位点；CCCGGG为Sma I酶切位点；3’末端CTCGAG是Xho I酶切位点；

2.制备DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop：

分别用限制性内切酶BamH I和Sma I，Sma I和Xho I先合成Loop1和Loop2片段，再用BamH I和Xho I连接Loop1和Loop2合成Loop蛋白编码基因。Loop蛋白编码基因和真核表达载体pVAX1-CpG(pVAX1购自Invitrogen公司，序列和物理图谱见该公司的产品目录，加CpG基序修饰)进行双酶切，酶切片段分别经琼脂糖凝胶电泳纯化回收。然后将上述pVAX1-CpG载体酶切片段与Loop基因酶切片段按一定比例混合，通过连接酶进行连接。然后以CaCl₂法转化至感受态大肠杆菌DH5α(购自GIBLCO公司)中，在卡那霉素平板上得到转化子，进行筛选。筛选到的阳性转化子为重组pVAX1-CpG-Loop的工程菌，该工程菌可用于制备DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop；

本发明DNA疫苗是真核表达载体pVAX1-CpG与Loop蛋白编码基因的重组质粒。该重组质粒含有pUC ori质粒复制起始位点、卡那霉素抗性基因Kanamycin、一个完整的真核转录翻译单元的巨细胞病毒启动子PCMV、犬腺病毒Loop基因。本发明DNA疫苗制备工艺简单，成本低廉，其可在真核细胞中表达Loop抗原并可激活淋巴细胞；

附图说明

图1：为本发明犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop的结构示意图

图2：为本发明犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop的构建流程图

具体实施方式：下面结合实施例，对本发明的制备方法作详细描述。

实施例1：犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop的制备

DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop结构见图1，构建流程见图2

1.合成Loop基因DNA(结构如前所述)，5’末端的GGATCC为BamH I酶切位点；3’末端CTCGAG是Xho I酶切位点；

3.构建pVAX1-CpG-Loop的重组质粒：

用限制性内切酶BamH I和Xho I对Loop基因DNA进行双酶切。反应体系为：200ng/μl的Loop基因DNA 5μl；10×M Buffer是由pH7.5 100mM-150mMTris-HCl；100mM MgCl₂；1mM-10mM二硫苏糖醇；100mM NaCl组成；BamH I酶(10U/μl)1μl；Xho I酶(12U/μl)1μl；补H₂O至总体积20μl。37℃温浴消化2小时。之后将消化样品进行1-2％低溶点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收Loop酶切片段。同时，用BamH I和Xho I双酶切pVAX1-CpG载体。反应体系为：pVAX1-CpG载体2μl(200ng/μl)；10×M Buffer 2μl；BamH I酶(10U/μl)1μl；XhoI酶(12U/μl)1μl；补H₂0至总体积20μl。37℃温育消化2小时。之后将消化样品进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收pVAX1-CpG酶切片段；

将上述pVAX1-CpG酶切片段与Loop酶切片段混合，以连接酶进行连接。连接反应体系为：200ng/μl的pVAX1-CpG酶切片段0.5μl；50ng/μl的Loop酶切片段1μl；由600mM-660mM Tris-HCl pH7.6；60mM-66mM MgCl₂；100mM二硫苏糖醇；1mM ATP组成的连接Buffe 1μl；补H₂O至总体积10μl。连接反应的条件定为12℃10小时；

4.构建pVAX1-CpG-Loop工程菌：

将上述连接反应产物以CaCl₂法转化至感受态大肠杆菌DH5α中(购于大连宝生物公司)：连接产物10μl与DH5α(1～2×10⁹细菌/ml)感受态细胞200μl混合，冰浴放置30分钟，42℃2分钟，冰浴10分钟，加入0.6ml 2YT液体培养基是由18g蛋白胨/L；10g酵母抽提物/L；5g NaCl/L组成，37℃培养45分钟后铺于含卡那霉素的琼脂平板。37℃培养12小时后在琼脂平板上出现转化子。挑选转化子接种在含100μg/ml卡那霉素的3ml 2YT培养基中37℃培养过夜，6,000rpm/分钟离心收集菌体，以质粒小量抽提试剂盒(Qiagen)提取质粒DNA。然后用Hind III和Xho I双酶切鉴定。反应体系为：200ng/μl的重组质粒1μl；10×M Buffer 2μl；10U/μl Hind III酶1μl；12U/μl Xho I酶1μl；补H₂O至总体积20μl。37℃温育消化2小时。之后将消化样品进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果可见860bp的Loop片段和2.99kb的pVAX1-CpG载体片段。说明筛选到的该阳性转化子为重组pVAX1-CpG-Loop的工程菌；

5.犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop的制备

本发明的DNA疫苗是用上述重组工程菌株制备的。培养方式为液体培养。采用细菌培养。选用2×YT培养基含1.6-2％胰蛋白胨、1％酵母提取物和0.5-1％氯化钠，pH7.0。培养温度为37℃，培养时间为24小时；

从扩增后的工程菌中分离纯化质粒DNA，采用常规方法(分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002)。具体步骤如下：

100g湿菌中加入800mL溶液I含50-60mM葡萄糖，25-30mM Tris-ClpH8.0，10mM EDTA强烈振荡混匀。加入新鲜配制的1L溶液II含0.2N NaOH，1％SDS)垂直轻柔混匀，室温5分钟。再加入冰预冷的0.75L溶液III含1M醋酸钾，7M醋酸铵pH4.8垂直轻柔混匀，冰浴5分钟。连续流12000转/分钟4℃离心取上清。在上清中加入1.53L异丙醇室温10分钟，连续流12000转/分钟室温离心留沉淀。加70％7醇450ml漂洗过夜。10000转/分钟4℃离心10分钟留沉淀。加1L pH7.4的PBS溶解，加终浓度0.1％RNaseA(华美生物工程有限公司生产)65℃消化30分钟。再加入等体积的PEG溶液含PEG8000 13％，氯化钠1.6M，沉淀；12000转/分钟4℃离心10分钟，留沉淀。200ml PBS溶解沉淀，加1％体积曲拉通X114混匀，冰浴5-10分钟，37℃30分钟，37℃12000转/分钟离心10分钟，取上层水相。最后用0.45μm和0.22μm双层滤膜加压过滤，用PBS缓冲液稀释至1mg/ml，即犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop，用于肌肉注射。

Claims

1.一种犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop，其特征在于由犬腺病毒六邻体蛋白中和抗原决定簇改造后的编码基因和真核表达载体构成，改造后的Loop蛋白编码基因的核苷酸序列如下：

CGGGATCCATGAACTGCCTATTTAATGGATCAGGTGCCAACATTAACACTTTAGCCCAAGTGCCATTTGC

GGGCGCCATTACCGTTAATGGTCAAGCCGCAGTCACAGACAACACCTACCAGCCAGAGCCCCAGCTGGGC

CCTGAAAGTTGGGTGGATGGCACCTTGGCAGACCTAGGAGATGCGTCTGGCCGCGCCCTGAAAGCATCGA

CCCCACGCATGCCTTGCTACGGTTCTTATGCTCCCCCCACCAATGAAAACGGAGGTCAAGCAACTGGGGC

CGTGGAACGAAGATTCTATAAAGTGACCACCAACAATAATAATGAAGCTGATGCCCTACTATATACAGAA

GATGTGAACCTCCAAACCCCAGACACCCACTTGGTGCATCAGGTGTCAGACGATCAGGTTACAGGTGTAC

AGGGACTGGGGCAACAACCCGGGTCCCCCGGGAACTATTGCTTCCCACTGAGCGGCATGGGACCATTAAC

TAACATGACAGCTATGAAGGTCAATAATCAAAACTTTCAAACGGACAACACTAACGTGGGTCCCATTCAA

AAGATTGGTTTCGGAAATGTTGAGGCCATGGAGATAAATCTCAATGCTAACCTCTTTAAAGGTTTTCTCT

ACTCCAATGTGGCCCTATACCTACCTGATGCCTATAAATACACACCTGATAACATTGTAGCTCCTGCTAA

TGCAAATACCTATGCTTACATGAATGTGAGATTGCCCGCTGCTAACCTTATAGACACATTTGTAAATATT

GGCGCCAGATGGTCACCTGATGTAATGGACTCTGTTAATCCTTTTAACCACCACAGAAATGCAGGACTCC

GCTACCGATCACAGCTGCTTGGCAATGGCCGCCTCGAG。

2.按权利要求1所述的犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop，其特征在于所说的真核表达载体为pVAX1-CpG。

3.按权利要求1所述的犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop，其特征在于所说的疫苗制备方法

①构建pVAX1-CpG-Loop重组质粒：

用限制性内切酶BamHI和Xho I对Loop基因DNA进行双酶切。反应体系为：Loop基因DNA 5μl(200ng/μl)；10×M Buffer是由pH7.5 100mM-150mM Tris-HCl；100mM MgCl₂；1mM-10mM二硫苏糖醇；100mM NaCl组成；BamHI酶(10U/μl)1μl；Xho I酶(12U/μl)1μl；补H₂O至总体积20μl。37℃温浴消化2小时。之后将消化样品进行1-2％低溶点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收Loop酶切片段。同时，用BamHI和Xho I双酶切pVAX1-CpG载体。反应体系为：pVAX1-CpG载体2μl(200ng/μl)；10×M Buffer 2μl；10U/μl的BamH I酶1μl；12U/μl的Xho I酶1μl；补H₂O至总体积20μl。37℃温育消化2小时。之后将消化样品进行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，切胶回收pVAX1-CpG酶切片段；

将上述pVAX1-CpG酶切片段与Loop酶切片段混合，以连接酶进行连接。连接反应体系为：pVAX1-CpG酶切片段0.5μl(200ng/μl)；Loop酶切片段1μl(50ng/μl)；由600mM-660mM Tris-HCl pH7.6；60mM-66mM MgCl₂；100mM二硫苏糖醇；1mM ATP组成的连接Buffe 1μl；补H₂O至总体积10μl。连接反应的条件定为12℃10小时；连接反应得到连接产物；

②构建pVAX1-CpG-Loop工程菌：

将上述连接产物以CaCl₂法转化至感受态大肠杆菌DH5α中，操作如下：连接产物10μl与1～2×10⁹细菌/ml的DH5α和感受态细胞200μl混合，冰浴放置30分钟，42℃2分钟，冰浴10分钟，加入0.6ml由18g蛋白胨/L；10g酵母抽提物/L；5g NaCl/L组成的2YT液体培养基，37℃培养45分钟后铺于含卡那霉素的琼脂平板。37℃培养12小时后在琼脂平板上出现转化子。挑选转化子接种在含100μg/ml卡那霉素的3ml 2YT培养基中37℃培养过夜，6，000rpm/分钟离心收集菌体，以质粒小量抽提试剂盒(Qiagen)提取重组质粒DNA。然后用HindIII和Xho I双酶切鉴定。反应体系为：重组质粒1μl(200ng/μl)；10×M Buffer 2μl；HindIII酶(10U/μl)1μl；XhoI酶(12U/μl)1μl；补H₂O至总体积20μl。37℃温育消化2小时。之后将消化样品进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果可见860bp的Loop片段和2.99kb的pVAX1-CpG载体片段。说明筛选到的该阳性转化子为重组pVAX1-CpG-Loop的工程菌；

③犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop的制备

从扩增后的工程菌中分离纯化质粒DNA，采用常规方法具体步骤如下：

100g湿菌中加入800mL溶液I含50-60mM葡萄糖，25-30mM Tris-Cl pH8.0，10mM EDTA强烈振荡混匀。加入新鲜配制的1L溶液II含0.2N NaOH，1％SDS垂直轻柔混匀，室温5分钟。再加入冰预冷的0.75L溶液III含1M醋酸钾，7M醋酸铵pH4.8垂直轻柔混匀，冰浴5分钟。连续流12000转/分钟4℃离心取上清。在上清中加入1.53L异丙醇室温10分钟，连续流12000转/分钟室温离心留沉淀。加70％乙醇450ml漂洗过夜。10000转/分钟4℃离心10分钟留沉淀。加1LpH7.4的PBS溶解，加终浓度0.1％RnaseA 65℃消化30分钟。再加入等体积的PEG溶液：含PEG8000 13％，氯化钠1.6M，沉淀；12 000转/分钟4℃离心10分钟，留沉淀。200ml PBS溶解沉淀，加1％体积曲拉通X114混匀，冰浴5-10分钟，37℃30分钟，37℃12 000转/分钟离心10分钟，取上层水相。最后用0.45μm和0.22μm双层滤膜加压过滤，用PBS缓冲液稀释至1mg/ml，即得犬腺病毒DNA疫苗pVAX1-CpG-Loop。