CN115867657A - 用于治疗疾患和疾病的opa1反义寡聚物 - Google Patents

用于治疗疾患和疾病的opa1反义寡聚物 Download PDF

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Abstract

基因中选择性剪接事件可导致非生产性mRNA转录物，其因此可导致蛋白质表达异常，而可靶向基因中所述选择性剪接事件的治疗剂可调节患者中功能性蛋白的表达水平和/或抑制异常蛋白质表达。此类治疗剂可用于治疗由蛋白质缺乏和/或线粒体功能缺陷所引起的疾患或疾病。

Description

用于治疗疾患和疾病的OPA1反义寡聚物
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年5月11日提交的美国临时申请号63/023,013和2020年11月11日提交的美国临时申请号63/112,458的权益，其各自以引用的方式整体并入本文。
背景技术
基因中的选择性剪接事件可导致非生产性mRNA转录物，其因此可导致蛋白质表达异常或降低，并且可靶向基因中的选择性剪接事件的治疗剂可调节患者中功能性蛋白的表达水平和/或抑制异常蛋白质表达。此类治疗剂可用于治疗由蛋白质缺乏所引起的疾患或疾病。
常染色体显性视神经萎缩(ADOA)是最常诊断的视神经病变之一。这种视神经疾病与结构性和功能性线粒体缺陷相关，导致视网膜神经节细胞变性和进行性、不可逆的视力丧失。大部分ADOA患者携带OPA1的突变并且大部分突变导致单倍剂量不足(Lenaers G.等人Orphanet J Rare Dis 2012)。OPA1编码线粒体GTP酶，在线粒体融合、ATP合成和细胞凋亡中起关键作用。当前，无批准用于ADOA患者的疾病修正治疗并且需要此类治疗。
发明内容
在一些方面中，本文描述了调节具有前mRNA的细胞中的OPA1蛋白表达的方法，所述前mRNA从OPA1基因转录并包含无义介导的RNA衰变诱导外显子(NMD外显子)，所述方法包括使剂或编码剂的载体与细胞接触，由此剂调节NMD外显子从前mRNA的剪接，从而调节从前mRNA加工的经加工mRNA的水平，以及调节细胞中的OPA1蛋白表达，其中剂包含与选自由SEQID NO:6-275和280-299组成的组的序列具有至少80％序列同一性的反义寡聚物。
在一些实施方案中，剂：(a)结合至前mRNA的目标部分；(b)调节涉及NMD外显子剪接的因子的结合；或(c)(a)与(b)的组合。在一些实施方案中，剂干扰涉及NMD外显子剪接的因子与目标部分的区域的结合。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分接近NMD外显子。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在NMD外显子的5'端上游至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在NMD外显子的5'端上游至少约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸、约40个核苷酸、约30个核苷酸、约20个核苷酸、约10个核苷酸、约5个核苷酸、约4个核苷酸、约2个核苷酸、约1个核苷酸处。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在NMD外显子的3'端下游至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在NMD外显子的3'端下游至少约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸、约40个核苷酸、约30个核苷酸、约20个核苷酸、约10个核苷酸、约5个核苷酸、约4个核苷酸、约2个核苷酸、约1个核苷酸处。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193628509上游至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193628509上游约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193628616下游至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193628616下游约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分位于前mRNA的两个典型外显子区域之间的内含子区域中，并且其中内含子区域含有NMD外显子。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分与NMD外显子至少部分重叠。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分与在NMD外显子上游或下游的内含子至少部分重叠。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分包含5'NMD外显子-内含子连接处或3'NMD外显子-内含子连接处。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在NMD外显子内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分包含NMD外显子的约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续核苷酸。
在一些实施方案中，NMD外显子包含与SEQ ID NO:279具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，NMD外显子包含SEQ ID NO:279的序列。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在无义介导的RNA衰变诱导外显子GRCh38/hg38:chr3193628509至193628616内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在无义介导的RNA衰变诱导外显子GRCh38/hg38:chr3193628509至193628616上游或下游。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分包含外显子GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616的外显子-内含子连接处。在一些实施方案中，由经加工mRNA表达的OPA1蛋白是全长OPA1蛋白或野生型OPA1蛋白。在一些实施方案中，由经加工mRNA表达的OPA1蛋白是功能性OPA1蛋白。在一些实施方案中，相比于野生型OPA1蛋白，由经加工mRNA表达的OPA1蛋白是至少部分功能性的。在一些实施方案中，相比于全长野生型OPA1蛋白，由经加工mRNA表达的OPA1蛋白是至少部分功能性的。在一些实施方案中，由经加工mRNA表达的OPA1蛋白是缺乏由与SEQ ID NO:277具有至少80％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列的OPA1蛋白。
在一些实施方案中，所述方法促进NMD外显子从前mRNA排除。在一些实施方案中，相比于不存在剂的情况下，在与剂接触的细胞中从前mRNA排除NMD外显子增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。在一些实施方案中，所述方法使得细胞中的经加工mRNA的水平增加。在一些实施方案中，相比于不存在剂的情况下，与剂接触的细胞中的经加工mRNA的水平增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。在一些实施方案中，所述方法使得细胞中的OPA1蛋白的表达增加。在一些实施方案中，相比于不存在剂的情况下，在与剂接触的细胞中由经加工mRNA表达的OPA1蛋白的水平增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
在一些实施方案中，剂包含与选自由以下组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物：SEQ ID NO:36、236、242、250、280-283、288和290-292。在一些实施方案中，剂还包含基因编辑分子。在一些实施方案中，基因编辑分子包含CRISPR-Cas9。
在一些方面中，本文描述了一种调节OPA1蛋白于具有从OPA1基因转录的前mRNA的细胞中的表达的方法，其中所述前mRNA包含编码外显子，所述方法包括使剂或编码剂的载体与细胞接触，由此所述剂促进从前mRNA排除编码外显子，从而增加细胞中从前mRNA加工并缺乏编码外显子的经加工mRNA的水平。在一些实施方案中，剂：(a)结合至前mRNA的目标部分；(b)调节涉及编码外显子剪接的因子的结合；或(c)(a)与(b)的组合。在一些实施方案中，剂干扰涉及编码外显子剪接的因子与目标部分的区域的结合。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分接近编码外显子。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分位于紧邻编码外显子上游的内含子区域中。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在跨越编码外显子的5'端上游的100至50、90至50、80至50、70至50、60至50、60至40、60至30、60至20、60至10、49至1、39至1、29至1或19至1个核苷酸的区域内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在跨越编码外显子的5'端上游的49至1、39至1、29至1或19至1个核苷酸的区域内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分位于紧邻编码外显子下游的内含子区域中。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在跨越编码外显子的3'端下游的1至49、1至39、1至29、1至19、10至60、20至60、30至60、40至60、50至60、50至70、50至80、50至90或50至100个核苷酸的区域内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在跨越编码外显子的3'端下游的1至49、1至39、1至29或1至19个核苷酸的区域内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分与编码外显子至少部分重叠。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分与紧邻编码外显子上游或紧邻编码外显子下游的内含子至少部分重叠。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分包含5'编码外显子-内含子连接处或3'编码外显子-内含子连接处。在一些实施方案中，目标部分在前mRNA的编码外显子内。在一些实施方案中，编码外显子是选择性剪接外显子。
在一些实施方案中，编码外显子包含与SEQ ID NO:277具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，编码外显子包含SEQ ID NO:277。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分紧邻编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202上游。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在跨越基因组位点GRCh38/hg38:chr3193626092上游的49至1、39至1、29至1或19至1个核苷酸的区域内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分紧邻编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202下游。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在跨越基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193626202下游的1至49、1至39、1至29或1至19个核苷酸的区域内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分包含外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202的外显子-内含子连接处。在一些实施方案中，目标部分包含编码外显子的约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续核苷酸。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分包含与包含SEQ ID NO:277的至少8个邻接核酸的区域具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，相比于不存在剂的情况下，在与剂接触的细胞中从前mRNA排除编码外显子增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。在一些实施方案中，所述方法使得细胞中的OPA1蛋白的表达增加。在一些实施方案中，相比于不存在剂的情况下，在与剂接触的细胞中由经加工mRNA表达的OPA1蛋白的水平增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。在一些实施方案中，相比于不存在剂的情况下，在与剂接触的细胞中由经加工mRNA表达的OPA1蛋白的水平增加至少约1.5倍。
在一些实施方案中，由经加工mRNA表达的OPA1蛋白是功能性OPA1蛋白。在一些实施方案中，相比于野生型OPA1蛋白，由经加工mRNA表达的OPA1蛋白是至少部分功能性的。在一些实施方案中，相比于全长野生型OPA1蛋白，由经加工mRNA表达的OPA1蛋白是至少部分功能性的。在一些实施方案中，剂促进从前mRNA排除无义介导的RNA衰变诱导外显子(NMD外显子)。在一些实施方案中，NMD外显子包含与SEQ ID NO:279具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，NMD外显子包含SEQ ID NO:279的序列。在一些实施方案中，与由含有编码外显子的对应mRNA编码的OPA1蛋白相比，由经加工mRNA表达的OPA1蛋白包含较少蛋白质裂解位点。
在一些实施方案中，剂包含与选自由SEQ ID NO:227-242、250、280-283、288和290-292组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。在一些实施方案中，剂包含基因编辑分子。在一些实施方案中，基因编辑分子包含CRISPR-Cas9。
在一些方面中，本文描述了在具有从OPA1基因转录的前mRNA的细胞中调节OPA1蛋白的表达的方法，其中前mRNA包含编码外显子，所述方法包括使剂或编码剂的载体与细胞接触，其中剂包含反义寡聚物，其结合至：(a)紧邻前mRNA的编码外显子的5'端上游的内含子区域内的前mRNA的目标部分；或(b)紧邻前mRNA的编码外显子的3'端下游的内含子区域内的前mRNA的目标部分；由此剂增加细胞中从前mRNA加工并含有编码外显子的经加工mRNA的水平。
在一些实施方案中，编码外显子是选择性剪接外显子。在一些实施方案中，所述方法促进在细胞中的前mRNA的剪接期间，在经加工mRNA中包含编码外显子。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在跨越编码外显子的5'端上游的100至50、100至60、100至70、100至80或100至90个核苷酸的区域内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在跨越编码外显子的3'端下游的40至100、50至100、60至100、70至100、80至100或90至100个核苷酸的区域内。在一些实施方案中，编码外显子包含与SEQ ID NO:277具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，编码外显子包含SEQ ID NO:277。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在跨越基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193626092上游的100至50、100至60、100至70、100至80或100至90个核苷酸的区域内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在跨越基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193626202下游的40至100、50至100、60至100、70至100、80至100或90至100个核苷酸的区域内。在一些实施方案中，相比于不存在剂的情况下，在与剂接触的细胞中在经加工mRNA中包含编码外显子增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。在一些实施方案中，剂包含与SEQ ID NO:267具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。
在一些方面中，本文描述了调节目标蛋白在具有从编码所述目标蛋白的基因转录的前mRNA的细胞中的表达的方法，其中前mRNA包含编码外显子和无义介导的RNA衰变诱导外显子(NMD外显子)，所述方法包括使剂或编码剂的载体与细胞接触，其中剂促进从前mRNA排除编码外显子和NMD外显子两者，从而增加细胞中从前mRNA加工并缺乏NMD外显子和编码外显子两者的经加工mRNA的水平。
在一些实施方案中，剂：(a)结合至前mRNA的目标部分；(b)调节涉及编码外显子、NMD外显子或两者的剪接的因子的结合；或(c)(a)与(b)的组合。在一些实施方案中，剂干扰涉及编码外显子、NMD外显子或两者的剪接的因子与目标部分的区域的结合。在一些实施方案中，NMD外显子在邻近于编码外显子的内含子区域内。在一些实施方案中，NMD外显子在紧邻编码外显子上游的内含子区域内。在一些实施方案中，NMD外显子在紧邻编码外显子下游的内含子区域内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分接近编码外显子。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分位于紧邻编码外显子上游的内含子区域中。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分位于紧邻编码外显子下游的内含子区域中。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分位于编码外显子内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在跨越编码外显子的5'端上游的49至1、39至1、29至1或19至1个核苷酸的区域内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在跨越编码外显子上游的100个核苷酸至编码外显子下游的100个核苷酸的区域内。在一些实施方案中，编码外显子是选择性剪接外显子。在一些实施方案中，编码外显子包含与SEQ ID NO:277具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，编码外显子包含SEQ ID NO:277。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分紧邻编码外显子GRCh38/hg38:chr3193626092至193626202上游。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分紧邻编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202下游。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在跨越GRCh38/hg38:chr3 193626092上游的49至1、39至1、29至1或19至1个核苷酸的区域内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在跨越基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193626092上游的100个核苷酸至基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193626202下游的100个核苷酸的区域内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分包含编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202的外显子-内含子连接处。在一些实施方案中，目标部分包含编码外显子的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续核苷酸。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分接近NMD外显子。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分位于紧邻NMD外显子上游的内含子区域中。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分位于紧邻NMD外显子下游的内含子区域中。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分位于NMD外显子内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在跨越NMD外显子上游的100个核苷酸至NMD外显子下游的100个核苷酸的区域内。在一些实施方案中，NMD外显子包含与SEQ ID NO:279具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，NMD外显子包含SEQ ID NO:279。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分紧邻NMD外显子GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616上游。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分紧邻NMD外显子GRCh38/hg38:chr3193628509至193628616下游。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193628509上游的100个核苷酸至基因组位点GRCh38/hg38:chr3193628616下游的100个核苷酸的区域内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分在NMD外显子GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616内。在一些实施方案中，前mRNA的目标部分包含NMD外显子GRCh38/hg38:chr3193628509至193628616的外显子-内含子连接处。在一些实施方案中，目标部分包含NMD外显子的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续核苷酸。
在一些实施方案中，相比于不存在剂的情况下，在与剂接触的细胞中从前mRNA排除编码外显子增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。在一些实施方案中，相比于不存在剂的情况下，在与剂接触的细胞中从前mRNA排除NMD外显子增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。在一些实施方案中，剂使得细胞中的经加工mRNA的水平增加。在一些实施方案中，相比于不存在剂的情况下，与剂接触的细胞中的经加工mRNA的水平增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。在一些实施方案中，所述方法使得细胞中的目标蛋白的表达增加。在一些实施方案中，相比于不存在剂的情况下，在与剂接触的细胞中由经加工mRNA表达的目标蛋白的水平增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。在一些实施方案中，目标蛋白是OPA1蛋白。在一些实施方案中，相比于不存在剂的情况下，在与剂接触的细胞中由经加工mRNA表达的OPA1蛋白的水平增加至少约1.5倍。在一些实施方案中，由经加工mRNA表达的OPA1蛋白是功能性OPA1蛋白。
在一些实施方案中，相比于野生型OPA1蛋白，由经加工mRNA表达的OPA1蛋白是至少部分功能性的。在一些实施方案中，相比于全长野生型OPA1蛋白，由经加工mRNA表达的OPA1蛋白是至少部分功能性的。
在一些实施方案中，剂包含与选自由SEQ ID NO:236、242、250、280-283、288和290-292组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。在一些实施方案中，剂包含基因编辑分子。在一些实施方案中，基因编辑分子包含CRISPR-Cas9。
在一些实施方案中，剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中反义寡聚物包含含有硫代磷酸酯键联或二氨基磷酸酯键联的主链修饰。在一些实施方案中，剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中反义寡聚物包含二氨基磷酸酯吗啉代、锁核酸、肽核酸、2'-O-甲基部分、2'-氟基部分或2'-O-甲氧基乙基部分。在一些实施方案中，治疗剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中反义寡聚物包含至少一个修饰的糖部分。在一些实施方案中，每个糖部分是修饰的糖部分。在一些实施方案中，剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中反义寡聚物由8至50个核碱基、8至40个核碱基、8至35个核碱基、8至30个核碱基、8至25个核碱基、8至20个核碱基、8至15个核碱基、9至50个核碱基、9至40个核碱基、9至35个核碱基、9至30个核碱基、9至25个核碱基、9至20个核碱基、9至15个核碱基、10至50个核碱基、10至40个核碱基、10至35个核碱基、10至30个核碱基、10至25个核碱基、10至20个核碱基、10至15个核碱基、11至50个核碱基、11至40个核碱基、11至35个核碱基、11至30个核碱基、11至25个核碱基、11至20个核碱基、11至15个核碱基、12至50个核碱基、12至40个核碱基、12至35个核碱基、12至30个核碱基、12至25个核碱基、12至20个核碱基，或12至15个核碱基组成。在一些实施方案中，载体包括编码剂的病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)病毒载体或逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，方法还包括评估OPA1蛋白的mRNA水平或表达水平。在一些实施方案中，剂是治疗剂。
在一些方面中，本文描述了一种药物组合物，其包含如本文所公开的治疗剂或编码如本文所公开的治疗剂的载体，和药学上可接受的赋形剂。
在一些方面中，本文描述了一种药物组合物，其包含治疗剂或编码治疗剂的载体，和药学上可接受的赋形剂，其中治疗剂包含与选自由SEQ ID NO:6-275和280-299组成的组的序列具有至少80％序列同一性的反义寡聚物。在一些实施方案中，治疗剂包含与选自由SEQ IDNO:36、236、242、250、280-283、288和290-292组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。在一些实施方案中，治疗剂包含与选自由SEQ IDNO:227-242、250、280-283、288和290-292组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。在一些实施方案中，治疗剂包含与SEQ ID NO:267具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。在一些实施方案中，治疗剂包含与选自由SEQ ID NO:236、242、250、280-283、288和290-292组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。
在一些方面中，本文描述了一种组合物，其包含与选自由SEQ IDNO:6-275和280-299组成的组的序列具有至少80％序列同一性的反义寡聚物，其中所述反义寡聚物包含主链修饰、糖部分修饰或它们的组合。在一些实施方案中，反义寡聚物与选自由SEQ ID NO:36、236、242、250、280-283、288和290-292组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性。在一些实施方案中，反义寡聚物与选自由SEQ ID NO:227-242、250、280-283、288和290-292组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性。在一些实施方案中，反义寡聚物与SEQ ID NO:267具有至少80％、至少90％或100％序列同一性。在一些实施方案中，反义寡聚物与选自由SEQ ID NO:236、242、250、280-283、288和290-292组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性。
在一些方面中，本文描述了一种药物组合物，其包含治疗剂或编码治疗剂的载体和药学上可接受的赋形剂，其中治疗剂促进从前mRNA排除编码外显子，从而增加细胞中从前mRNA加工并缺乏编码外显子的经加工mRNA的水平，其中前mRNA从OPA1基因转录并包含编码外显子。
在一些方面中，本文描述了一种药物组合物，其包含治疗剂或编码治疗剂的载体和药学上可接受的赋形剂，其中治疗剂包含结合至前mRNA的反义寡聚物，所述前mRNA从细胞中的OPA1基因转录，其中反义寡聚物结合至：(a)紧邻前mRNA的编码外显子的5'端上游的内含子区域内的前mRNA的目标部分；或(b)紧邻前mRNA的编码外显子的3'端下游的内含子区域内的前mRNA的目标部分；由此治疗剂增加细胞中从前mRNA加工并含有编码外显子的经加工mRNA的水平。
在一些方面中，本文描述了一种药物组合物，其包含治疗剂或编码治疗剂的载体和药学上可接受的赋形剂，其中治疗剂促进从前mRNA排除编码外显子和无义介导的RNA衰变诱导外显子(NMD外显子)两者，从而增加细胞中从前mRNA加工并缺乏编码外显子和NMD外显子的经加工mRNA的水平，其中前mRNA从细胞中的OPA1基因转录并包含编码外显子和NMD外显子。
在一些实施方案中，药物组合物被配制用于脑室内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、鞘内注射、皮下注射、经口施用、滑膜注射、玻璃体内施用、视网膜下注射、局部应用、植入或静脉内注射。在一些实施方案中，药物组合物被配制用于玻璃体内注射。在一些实施方案中，药物组合物还包含第二治疗剂。在一些实施方案中，第二治疗剂包含小分子。在一些实施方案中，第二治疗剂包含反义寡聚物。在一些实施方案中，第二治疗剂纠正内含子保留。在一些实施方案中，反义寡聚物选自由化合物ID NO:1-303组成的组。
在一些方面中，本文描述了一种通过调节OPA1蛋白在有需要的受试者的细胞中的表达来治疗所述受试者的疾病或疾患或降低发展出所述疾病或疾患的可能性的方法，其包括使所述受试者的细胞与如本文所公开的治疗剂接触。在一些实施方案中，疾病或疾患与OPA1基因中的功能丧失型突变相关。在一些实施方案中，疾病或疾患与OPA1基因的单倍剂量不足相关，并且其中受试者具有编码功能性OP A1蛋白的第一等位基因，和不产生或产生低水平OPA1蛋白的第二等位基因，或编码非功能性OPA1蛋白或部分功能性OPA1蛋白的第二等位基因。在一些实施方案中，疾病或疾患包括眼部疾病或疾患。在一些实施方案中，疾病或疾患包括ADOA叠加综合征；线粒体病症；青光眼；正常眼压青光眼；夏-马-图三氏病(Charcot-Marie-Tooth disease)；线粒体功能失调；糖尿病性视网膜病变；年龄相关性黄斑变性；视网膜神经节细胞死亡；线粒体裂变介导的线粒体功能失调；进行性眼外肌麻痹；耳聋；共济失调；运动神经病；感觉神经病；肌病；贝尔综合征(Behr syndrome)；脑部功能失调；脑病；周围神经病变；致死性婴儿线粒体脑肌病；肥厚性心肌病；痉挛性共济失调综合征；感觉运动周围神经病变；张力减退；胃肠道蠕动异常和吞咽困难；视神经萎缩；视神经萎缩叠加综合征；线粒体DNA耗竭综合征14；晚发型心肌病；糖尿病性心肌病；阿尔茨海默氏病(Alzheimer's Disea se)；局灶节段性肾小球硬化；肾病；亨廷顿氏病(Huntington'sDiseas e)；健康老化中的认知功能下降；朊病毒疾病；晚发型痴呆和帕金森氏症(parkinsonism)；线粒体肌病；利氏综合征(Leigh syndrome)；弗里德希氏共济失调(Friedreich's ataxia)；帕金森氏病(Parkinson's disea se)；MELAS(线粒体脑肌病、乳酸中毒和中风样发作)；丙酮酸脱氢酶复合物缺乏症；慢性肾病；莱伯遗传性视神经病变(Leber's heredit ary optic neuropathy)；肥胖；年龄相关的全身性神经变性；骨胳肌萎缩；心脏和大脑缺血性损伤；或大量肝细胞凋亡。在一些实施方案中，疾病或疾患包括1型视神经萎缩。在一些实施方案中，疾病或疾患包括常染色体显性视神经萎缩(ADOA)。在一些实施方案中，疾病或疾患与OPA1基因的常染色体隐性突变相关，其中受试者具有第一等位基因，由所述第一等位基因：(i)不产生或产生比野生型等位基因低水平的OPA1蛋白；或(ii)产生的OPA1蛋白相比于野生型等位基因是非功能性或部分功能性的，和第二等位基因，由所述第二等位基因：(iii)产生比野生型等位基因低水平的OPA1蛋白，并且产生的OPA1蛋白相比于野生型等位基因是至少部分功能性的；或(iv)产生的OPA1蛋白相比于野生型等位基因是部分功能性的。
在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是非人动物。在一些实施方案中，受试者是胎儿、胚胎或儿童。在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物所适用的细胞是离体的。在一些实施方案中，治疗剂通过脑室内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、鞘内注射、皮下注射、经口施用、滑膜注射、玻璃体内施用、视网膜下注射、局部应用、植入或静脉内注射来施用。在一些实施方案中，治疗剂通过玻璃体内注射来施用。在一些实施方案中，本文所公开的方法治疗疾病或疾患。
参考文献并入
本说明书中所提及的所有公布、专利和专利申请均以引用的方式并入本文，其程度犹如每个单独公布、专利或专利申请均具体地且单独地被指示为以引用的方式并入一样。
附图说明
本公开的新颖特征细致阐述于所附加权利要求中。将参考阐述利用本公开原理的说明性实施方案及其附图的以下详细描述来获得对本公开的特征和优点的更好理解：
图1A-图1C描绘了目标mRNA的示意图，所述目标mRNA含有无义介导的mRNA衰变诱导外显子(NMD外显子mRNA)和治疗剂介导的无义介导的mRNA衰变诱导外显子排除，以增加全长目标蛋白或功能性RNA的表达。图1A示出了分为细胞核和细胞质隔室的细胞。在细胞核中，目标基因的前mRNA转录物经历剪接以产生mRNA，并且将此mRNA输出至细胞质中并翻译成目标蛋白。对于此目标基因，一部分mRNA含有无义介导的mRNA衰变诱导外显子(NMD外显子mRNA)，其在细胞质中降解，因此不会导致产生目标蛋白。图1B示出了分为细胞核和细胞质隔室的相同细胞的实例。用诸如反义寡聚物(ASO)的治疗剂治疗促进无义介导的mRNA衰变诱导外显子的排除并使得mRNA增加，其因此翻译成较高水平的目标蛋白。图1C示出了OPA1基因中鉴定的新型NMD外显子包含事件(外显子X)的实例示意图，所述事件导致引入提前终止密码子(PTC)，从而导致非生产性mRNA转录物被无义介导的衰变(NMD)降解。
图2描绘了OPA1基因中的示例性无义介导的mRNA衰变(NMD)诱导外显子的鉴定。示出了在UCSC基因组浏览器中可视化的使用RNA测序在OPA1基因中鉴定NMD诱导外显子。上图示出了OPA1基因按比例的图形表示。在内含子GRCh38/hg38:chr3 193626204至193631611中鉴定对应于RNA测序读段的峰，示出在中图中。生物信息学分析鉴定了被3'和5'剪接位点侧接的外显子样序列(下图，以大写字母突出显示的序列；GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616)。包含此外显子导致引入提前终止密码子，使转录物成为NMD的目标。
图3描绘了OPA1基因中的示例性无义介导的mRNA衰变(NMD)诱导外显子的鉴定。示出了在UCSC基因组浏览器中可视化的使用RNA测序在OPA1基因中鉴定NMD诱导外显子。上图示出了OPA1基因按比例的图形表示。在内含子GRCh38/hg38:chr3 193593374至193614710中鉴定对应于RNA测序读段的峰，示出在中图中。生物信息学分析鉴定了被3'和5'剪接位点侧接的外显子样序列(下图，以大写字母突出显示的序列；GRCh38/hg38:chr3 193603500至193603557)。包含此外显子导致引入提前终止密码子，使转录物成为NMD的目标。
图4描绘了在各种细胞系中经由嘌呤霉素或环己酰亚胺处理确认NMD诱导外显子，以及在大脑和视网膜样品中确认NMD诱导外显子。RT-PCR分析使用来自水处理、DMSO处理、嘌呤霉素处理或环己酰亚胺处理的细胞的总RNA确认了对应于OPA1基因的NMD诱导外显子7x(GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616)的条带的存在。
图5描绘了OPA1外显子7x(GRCh38/hg38:chr3 193628509193628616)区域周围的示例性ASO步移。示出了对OPA1外显子7x(GRCh38/hg38:chr3 193628509 193628616)区域周围进行的ASO步移的图形表示，所述区域靶向3'剪接位点上游、跨3'剪接位点、外显子7x、跨5'剪接位点和5'剪接位点下游的序列。ASO被设计以通过每次移动5个核苷酸或跨剪接位点区域移动3个核苷酸来覆盖这些区域。
图6描绘了通过Taqman RT-qPCR评价的OPA1外显子7x(GRCh38/hg38:chr3193628509 193628616)区域ASO步移。绘制了OPA1生产性mRNA产物相对于Sham的倍数变化的图。
图7描绘了通过Taqman RT-qPCR评价的OPA1外显子7x(GRCh38/hg38:chr3193628509 193628616)区域ASO步移。绘制了OPA1生产性mRNA产物相对于Sham的倍数变化的图。
图8说明了含有NMD外显子的OPA1转录物在用增加量的环己酰亚胺处理的HEK293细胞中的表达。
图9A说明了在产后第P93天(3个月)和产后第P942天(2.6年)时，来自西非绿猴(绿猴)的眼后段的RT-PCR数据。图9A确认了含有NMD外显子的OPA1转录物在这些细胞中的表达。
图9B说明了来自图9A的NMD外显子丰度的量化。
图10A说明了在用各种ASO和环酰亚胺处理HEK293细胞之后，生产性和非生产性OPA1 mRNA的RT-PCR。
图10B说明了图10A中的数据的量化。
图11说明了在用各种ASO处理且未用环己酰亚胺处理的HEK293细胞中，生产性OPA1 mRNA根据定量PCR的表达。
图12A说明了在用ASO-14和环己酰亚胺处理之后，HEK293细胞中非生产性OPA1mRNA的RT-PCR。
图12B说明了在不存在环己酰亚胺的情况下用ASO-14处理之后，HEK293细胞中的生产性OPA1 mRNA的量化。
图12C说明了在不存在环己酰亚胺的情况下用ASO-14处理之后，HEK293细胞中的OPA1的蛋白质表达。
图13A说明了OPA1单倍剂量不足(OPA1+/-)HEK293细胞中OPA1基因的mRNA和蛋白质水平。
图13B说明了在用ASO-14处理之后，OPA1单倍剂量不足(OPA1+/-)HEK293细胞中的OPA1蛋白表达。
图13C说明了在用ASO-14处理之后，OPA1单倍剂量不足(OPA1+/-)HEK293细胞中的OPA1蛋白表达的量化。
图14A说明了实施例14的体内兔实验的研究设计。
图14B说明了生产性和非生产性OPA1 mRNA和蛋白的水平。
图14C说明了来自图14B的数据的量化。
图15说明了本公开的示例性OPA1 ASO。图表中的右两列说明了示例性ASO的化学修饰。除非另外指出，否则所有ASO的每个核苷酸都具有2'-O-甲氧基乙基(2'MOE)修饰(“MOE”)，例如较大字体大小的字母(例如G)是锁核酸(“LNA”)，加下划线的字母(例如C)是具有2'-MOE部分的5'甲基-胞嘧啶(“5MeC-MOE”)，并且一些ASO标记为二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(“PMO”)。
图16A说明了在用ASO-14和环己酰亚胺处理之后，HEK293细胞中使用跨越外显子7和外显子8的探针对OPA1 mRNA的RT-PCR结果。
图16B说明了基于使用跨越外显子6和8的探针、跨越外显子7和8的探针或跨越外显子23和24的探针的qPCR，在不存在环己酰亚胺的情况下用ASO-14处理之后，HEK293细胞中OPA1 mRNA的量化。
图16C说明了用ASO-14转染的HEK293细胞中各种OPA1mRNA转录物的相对量的测序数据。
图17A说明了在用各种示例性OPA1 ASO处理之后，HEK293细胞中使用跨越外显子6和外显子8的探针对OPA1 mRNA的RT-PCR结果。
图17B说明了在用各种示例性OPA1 ASO处理之后，HEK293细胞中具有串联的外显子6、7和8的OPA1 mRNA转录物(“6-7-8”)相对于“6-7-8”转录物和具有串联的外显子6和8的转录物(“6-8”)的总量的相对比。
图17C和图17D分别说明了在用各种示例性OPA1 ASO处理之后，HEK293细胞中使用跨越外显子6和8的探针和跨越外显子7和8的探针的OPA1 mRNA的量化。
图18A说明了在用各种示例性OPA1 ASO处理且用环己酰亚胺处理之后，HEK293细胞中使用跨越外显子6和外显子8的探针(“外显子6-8PCR”)或跨越外显子7x和外显子8的探针(“外显子7x-8PCR”)的OPA1 mRNA的RT-PCR结果。
图18B说明了在用各种示例性OPA1 ASO处理之后，HEK293细胞中的OPA1蛋白的表达水平。
图18C说明了在用各种示例性OPA1 ASO处理之后，HEK293细胞中使用跨越外显子6和外显子8的探针的OPA1 mRNA中的剂量反应。
图18D和图18E分别说明了在用各种示例性OPA1 ASO处理之后，HEK293细胞中使用跨越外显子6和8的探针、跨越外显子7和8的探针、跨越外显子23和24的探针的OPA1 mRNA中的剂量反应的量化。图18D总结了qPCR反应的Ct值，并且图18E总结了相对量。
图18F说明了在用各种示例性OPA1 ASO处理之后，HEK293细胞中的OPA1蛋白的表达水平的剂量反应。
图19A-图19D说明了在用各种示例性OPA1 ASO 18聚体处理且用或不用环己酰亚胺处理之后，HEK293细胞中使用跨越外显子6和外显子8的探针(“外显子6-8”)或跨越外显子7和外显子8的探针(“外显子7-8”)的OPA1 mRNA的RT-PCR结果。图19A-图19B分别示出了具有外显子6和8的OPA1转录物(“Ex6-8”)和具有外显子7和8的OPA1转录物(“Ex7-8”)的qPCR反应的Ct值(上图)，以及相对量的量化(下图；归一化为RPL32 qPCR产物的Ct的值)。图19C示出了具有外显子23和24的OPA1转录物(“Ex23-24”)的qPCR反应的Ct值(上图)和相对量的量化(下图；归一化为RPL32 qPCR产物的Ct值)，并且图19D示出了作为上样对照的RPL32转录物的Ct值。
图20A-图20B说明了在用各种示例性OPA1 ASO 18聚体处理且用或不用环己酰亚胺处理之后，HEK293细胞中使用跨越外显子6和外显子8的探针(“外显子6-8”)或跨越外显子7x和外显子8的探针(“外显子7x-8”)的OPA1 mRNA的RT-PCR结果。
图21A-图21D说明了在用各种示例性OPA1 ASO 16聚体处理且用或不用环己酰亚胺处理之后，HEK293细胞中使用跨越外显子6和外显子8的探针(“外显子6-8”)或跨越外显子7和外显子8的探针(“外显子7-8”)的OPA1 mRNA的RT-PCR结果。图21A-图21B分别示出了具有外显子6和8的OPA1转录物(“Ex6-8”)和具有外显子7和8的OPA1转录物(“Ex7-8”)的qPCR反应的Ct值(上图)，以及相对量的量化(下图；归一化为RPL32 qPCR产物的Ct的值)。图21C示出了具有外显子23和24的OPA1转录物(“Ex23-24”)的qPCR反应的Ct值(上图)和相对量的量化(下图；归一化为RPL32 qPCR产物的Ct值)，并且图21D示出了RPL32转录物的Ct值。这些数据展示用ASO-49至ASO-60处理的细胞均显示出“Ex6-8”转录物的量增加和“Ex7-8”转录物的量减少，表明这些ASO促进从OPA1转录物排除外显子7。未将环己酰亚胺应用于经历这些外显子7包含分析的细胞。
图22A-图22C说明了在用各种示例性OPA1 ASO 15聚体处理且用或不用环己酰亚胺处理之后，HEK293细胞中使用跨越外显子6和外显子8的探针(“外显子6-8”)或跨越外显子7x和外显子8的探针(“外显子7x-8”)的OPA1 mRNA的RT-PCR结果。图22A示出了具有外显子7x和8的OPA1转录物(“Ex7x-8”)的qPCR反应的Ct值(上图)和相对量的量化(下图；归一化为RPL32 qPCR产物的Ct值)，并且图22C示出了作为上样对照的RPL32转录物的Ct值。这些数据展示用ASO-49至ASO-56处理的细胞均显示出“Ex7x-8”转录物的量减少，表明这些ASO促进从OPA1转录物排除外显子7x。将环己酰亚胺应用于细胞以进行这些外显子7x包含分析。
图23A-图23B说明了在用不同浓度的各种示例性OPA1 ASO处理之后，HEK293细胞中具有外显子6和外显子8(“6-8”)、具有外显子7和外显子8(“7-8”)或具有外显子7x和外显子8(“7x-8”)的OPA1mRNA中的剂量反应。
图24A是直方图，其展示相比于OPA1+/+HEK293细胞，模拟处理的OPA1+/-HEK293细胞中的ATP水平降低，并且OPA1+/-HEK293细胞的ASO-14处理增加细胞中的ATP水平。
图24B-图24C展示了在OPA1+/+HEK293细胞中通过ASO-14增加了OPA1蛋白。图24B示出了OPA1蛋白和β-肌动蛋白的免疫印迹凝胶图像，并且图24C是总结免疫印迹结果量化的直方图。
图25A-图25B示出了直方图，其展示相比于野生型(WT)成纤维细胞，来自具有OPA1基因的单倍剂量不足突变的诊断患者的成纤维细胞中OPA1基因的mRNA(图25A)和蛋白质表达(图25B)减少。图25C示出了患病成纤维细胞中的OPA蛋白表达水平的代表性免疫印迹图像。
图26A、图26B和图26D示出了直方图，其展示在野生型(WT)成纤维细胞和来自具有OPA1基因的单倍剂量不足突变的诊断患者的成纤维细胞中，示例性反义寡聚物ASO-14减少OPA1 NMD外显子包含(图26A)、增加OPA1总mRNA水平(图26B)和蛋白质水平(图26D)。图26C示出了OPA1蛋白和上样对照β-微管蛋白在所有类型的条件下的代表性免疫印迹图像。
图27A-图27E展示了患者成纤维细胞(细胞系F35和F36)显示出线粒体生物能量学的缺陷。图27A示出了WT细胞、F35细胞和F36细胞在基线水平下和依序用寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素A激发时的耗氧率的代表性时程。图27B-图27E示出了直方图，其展示相比于WT成纤维细胞，患者成纤维细胞F35和F36细胞具有降低的基础耗氧率(图27B)、ATP相关呼吸(图27C)、最大呼吸(图27D)和备用呼吸容量(图27E)。
图28A-图28D示出了直方图，其展示用20nM、40nM和60nM的ASO-14处理以剂量依赖性方式增加了F35患者细胞的基础耗氧率(图28A)、ATP相关呼吸(图28B)、最大呼吸(图28C)和备用呼吸容量(图28D)。
图29A-图29D示出了直方图，其展示用20nM、40nM和60nM的ASO-14处理以剂量依赖性方式增加了F36患者细胞的基础耗氧率(图29A)、ATP相关呼吸(图29B)、最大呼吸(图29C)和备用呼吸容量(图29D)。
具体实施方式
OPA1基因中的选择性剪接事件可导致非生产性mRNA转录物，其因此可导致蛋白质表达异常，并且可靶向OPA1基因中的选择性剪接事件的治疗剂可调节DS患者中功能性蛋白的表达水平和/或抑制异常蛋白质表达。此类治疗剂可用于治疗由OPA1蛋白缺乏所引起的疾患。
可导致非生产性mRNA转录物的选择性剪接事件之一是将额外外显子包含在可诱导无义介导的mRNA衰变的mRNA转录物中。本公开提供了用于调节OPA1的选择性剪接以增加蛋白质编码成熟mRNA的产生，并且因此增加经翻译功能性OPA1蛋白的产生的组合物和方法。这些组合物和方法包括可引起外显子跳读(例如假外显子跳读)并促进OPA1前mRNA的组成型剪接的反义寡聚物(ASO)。在多个实施方案中，可使用本公开的方法增加功能性OPA1蛋白以治疗由OPA1蛋白缺乏所引起的疾患。
mRNA剪接
RNA序列或内含子中的间插序列由被称为剪接体的较大且高度动态的RNA-蛋白质复合物去除，所述RNA-蛋白质复合物协调初级转录物、小核RNA(snRNA)与大量蛋白质之间的复杂相互作用。剪接体按有序方式针对每个内含子专门组装，从通过U1 snRNA识别5'剪接位点(5'ss)或通过U2途径识别3'剪接位点(3'ss)开始，所述U2途径涉及将U2辅助因子(U2AF)结合至3'ss区以促进U2结合至分支点序列(branch point sequence；BPS)。U2AF是由以下构成的稳定杂二聚体：U2AF2编码的65-kD亚基(U2AF65)，其结合多嘧啶束(polypyrimidine tract；PPT)；和U2AF1编码的35-kD亚基(U2AF35)，其与3'ss处高度保守的AG二核苷酸相互作用并使U2AF65结合稳定。除BPS/PPT单元和3'ss/5'ss以外，精确剪接还需要激活或抑制剪接位点识别的辅助序列或结构，其被称为内含子或外显子剪接增强子或沉默子。这些元件允许在高等真核生物的基因组中的大量多余隐蔽位点或假位点中识别出真正的剪接位点，所述隐蔽位点或假位点具有相同序列但数目上比真实位点多出一个数量级。尽管所述隐蔽位点或假位点通常具有调节功能，但其激活或阻遏的确切机制还不清楚。
是否进行剪接的决定可通常建模为随机过程而非确定性过程，使得甚至在最大程度上定义的剪接信号有时也可不正确地剪接。然而，在正常条件下，前mRNA剪接出人意料地以高保真度进行。这部分归因于邻近的顺式作用辅助外显子和内含子剪接调节元件(ESR或ISR)的活性。通常，这些功能元件分别基于其刺激或抑制剪接的能力而分类为外显子或内含子剪接增强子(ESE或ISE)或沉默子(ESS或ISS)。尽管目前有证据表明一些辅助顺式作用元件可通过影响剪接体组装的动力学，诸如通过影响U1 snRNP与5'ss之间的复合物的布置而起作用，但似乎很有可能多种元件与反式作用RNA结合蛋白(RBP)共同作用。例如，富含丝氨酸和精氨酸的RBP(SR蛋白)家族是在定义外显子方面具有关键作用的保守蛋白质家族。SR蛋白通过将剪接体前体的组件募集至邻近剪接位点或通过拮抗附近ESS的作用而促进外显子识别。ESS的阻遏作用可通过核不均一蛋白(hnRNP)家族的成员介导，并且可改变核心剪接因子至邻近剪接位点的募集。沉默子元件除了在剪接调节方面具有作用以外，还表明在假外显子(具有外显子的典型间距但不具有功能性开放阅读框的诱饵内含子剪接位点集合)的阻遏方面发挥作用。与其同源反式作用RBP合作的ESE和ESS表示剪接控制件集合中的重要组件，所述剪接控制件集合指定从mRNA的前体组装mRNA的方式、位置和时间。
选择性剪接是基因表达期间的调节过程，其可导致成熟mRNA转录物的多种同工型，所述成熟mRNA转录物由转录自单一基因的单一初级mRNA转录物加工，和由多个成熟mRNA同工型中的至少一些翻译的所得多种蛋白质。在这个过程中，基因的特定外显子可包括在由所述基因产生的最终经加工mRNA内或从所述mRNA排除。因此，由选择性剪接mRNA翻译的蛋白质将在其氨基酸序列中，并且在一些情况下在其生物功能中含有差异。
如本文所述，“选择性剪接外显子”可指基因的外显子，其可由成熟mRNA转录物天然地包括或排除，因此产生由不同成熟mRNA转录物翻译的不同蛋白质产物。选择性剪接外显子的包含或跳读可在细胞中自然发生，随机或以调节方式，例如受外部生理或病理刺激或细胞内信号传导调节。在一些情况下，选择性剪接mRNA的产生，例如选择性剪接外显子的剪接通过结合至初级转录物本身上的顺式作用位点的反式作用蛋白质的***来调节。在一些情况下，选择性剪接的外显子是编码外显子，例如当包括在成熟mRNA转录物中时，翻译为氨基酸序列作为由成熟mRNA转录物翻译的蛋白质产物的一部分的外显子。在一些情况下，与无选择性剪接外显子的成熟mRNA转录物相比，成熟mRNA转录物中包含选择性剪接外显子将保持典型开放阅读框，例如，选择性剪接外显子中的核苷酸数目可被3整除。
标记外显子-内含子边界的序列是具有变化强度的简并信号，其可在人基因内以高频率出现。在多外显子基因中，不同剪接位点对可按许多不同组合连接在一起，从而从单一基因产生一系列不同的转录物。这通常被称为选择性前mRNA剪接。尽管由选择性剪接产生的大部分mRNA同工型可从细胞核输出并翻译成功能性多肽，但来自单一基因的不同mRNA同工型的翻译效率可变化极大。在外显子连接复合物上游至少50bp处具有提前终止密码子(PTC)的那些mRNA同工型可能由无义介导的mRNA衰变(NMD)途径靶向而降解。传统剪接基序(BPS/PPT/3'ss/5'ss)和辅助剪接基序中的突变可导致异常剪接，诸如外显子跳读或隐蔽(或假)外显子包含或剪接位点激活，并且显著提高人发病率和死亡率。异常剪接模式和选择性剪接模式两者均可受外显子和内含子中的天然DNA变体影响。
鉴于外显子-内含子边界可出现在密码子的三个位置中的任一个位置处，显而易见的是仅选择性剪接事件的子集可保持典型开放阅读框。例如，仅可被3整除的外显子可在阅读框无任何改变的情况下跳读或包括在mRNA中。不具有相容相位的剪接事件将诱导读框移位。除非由下游事件逆转，否则读框移位当然可导致一个或多个PTC，可能导致随后NMD降解。NMD是一种翻译偶联机制，其消除含有PTC的mRNA。NMD可充当所有真核生物中存在的监视途径。NMD可通过消除含有提前终止密码子的mRNA转录物来减少基因表达误差。在一些情况下，这些异常mRNA的翻译可导致所得蛋白质的有害功能获得或显性负活性。NMD不仅靶向PTC的转录物，并且还靶向由许多内源基因表达的多种mRNA同工型，表明NMD是驱动细胞中的稳态RNA水平的精细和粗略调整的主调节因子。
NMD诱导外显子(“NIE”或“NMD外显子”)是外显子或假外显子，其是内含子内的区域并且如果包括在成熟RNA转录物中，则可激活NMD途径。在组成型剪接事件中，含有NMD外显子的内含子通常被剪接掉，但内含子或其一部分(例如NMD外显子)可在选择性或异常剪接事件期间保留。含有此类NMD外显子的成熟mRNA转录物可由于诱导NMD途径的读框移位而是非生产性的。成熟RNA转录物中包含NMD外显子可下调基因表达。含有NMD外显子的mRNA转录物可在本公开中称为“含NIE的mRNA”或“NMD外显子mRNA”。
隐蔽(或假剪接位点)具有与真剪接位点相同的剪接识别序列但不用于剪接反应中。所述隐蔽(或假)剪接位点在数目上比人类基因组中的真正剪接位点多出一个数量级，并且通常由迄今尚不清楚的分子机制阻遏。隐蔽5'剪接位点具有共有序列NNN/GUNNNN或NNN/GCNNNN，其中N是任何核苷酸，并且/是外显子-内含子边界。隐蔽3'剪接位点具有共有序列NAG/N。所述隐蔽剪接位点的激活受周围核苷酸正面影响，所述周围核苷酸使得所述隐蔽剪接位点分别更类似于真实剪接位点的最佳共有序列，即MAG/GURAGU和YAG/G，其中M是C或A，R是G或A，并且Y是C或U。
剪接位点及其调节序列可由技术人员使用公开可用的合适算法容易地鉴定，所述算法列举于例如Kralovicova,J.和Vorechovsky,I.(2007)Global control of aberrantsplice site activation by auxiliary splicing sequences:evidence for agradient in exon and intron defin ition.Nucleic Acids Res.,35,6399-6413(www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2095810/pdf/gkm680.pdf)中。
隐蔽剪接位点或剪接调节序列可与NMD外显子的剪接位点竞争诸如U2AF的RNA结合蛋白。在一些实施方案中，剂可结合至隐蔽剪接位点或剪接调节序列以防止RNA结合蛋白的结合，并且从而促进RNA结合蛋白结合至NMD外显子剪接位点。
在一些实施方案中，隐蔽剪接位点可不包含NMD外显子的5'或3'剪接位点。在一些实施方案中，隐蔽剪接位点可在NMD外显子5'剪接位点上游至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少50个核苷酸、至少100个核苷酸或至少200个核苷酸处。在一些实施方案中，隐蔽剪接位点可在NMD外显子3'剪接位点下游至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少200个核苷酸处。
目标转录物
在一些实施方案中，本公开的方法和组合物利用从OPA1基因转录的前mRNA中NMD外显子的存在。剪接鉴定的OPA1 NMD外显子前mRNA物种以产生功能性成熟OPA1 mRNA可使用刺激NMD外显子的外显子跳读的剂，诸如ASO来诱导。外显子跳跃的诱导可导致NMD途径的抑制。所得成熟OPA1 mRNA可通常在不激活NMD途径的情况下翻译，从而增加患者细胞中的OPA1蛋白的量，并且缓解与OPA1缺乏相关的疾患或疾病的症状，所述疾患或疾病诸如眼部疾病或疾患、1型视神经萎缩、常染色体显性视神经萎缩(ADOA)、ADOA叠加综合征；线粒体病症；青光眼；正常眼压青光眼；夏-马-图三氏病；线粒体功能失调；糖尿病性视网膜病变；年龄相关性黄斑变性；视网膜神经节细胞死亡；线粒体裂变介导的线粒体功能失调；进行性眼外肌麻痹；耳聋；共济失调；运动神经病；感觉神经病；肌病；贝尔综合征；脑部功能失调；脑病；周围神经病变；致死性婴儿线粒体脑肌病；肥厚性心肌病；痉挛性共济失调综合征；感觉运动周围神经病变；张力减退；胃肠道蠕动异常和吞咽困难；视神经萎缩；视神经萎缩叠加综合征；线粒体DNA耗竭综合征14；晚发型心肌病；糖尿病性心肌病；阿尔茨海默氏病；局灶节段性肾小球硬化；肾病；亨廷顿氏病；健康老化中的认知功能下降；朊病毒疾病；晚发型痴呆和帕金森氏症；线粒体肌病；利氏综合征；弗里德希氏共济失调；帕金森氏病；MELAS(线粒体脑肌病、乳酸中毒和中风样发作)；丙酮酸脱氢酶复合物缺乏症；慢性肾病；莱伯遗传性视神经病变；肥胖；年龄相关的全身性神经变性；骨胳肌萎缩；心脏和大脑缺血性损伤；或大量肝细胞凋亡。
在一些实施方案中，本公开的方法和组合物利用从OPA1基因转录的前mRNA的选择性剪接。在一些情况下，编码外显子，例如选择性剪接外显子，例如OPA1外显子7(或由跨越GRCh38/hg38:chr3193626092至193626202的基因组区域编码的外显子)的剪接可调节由OPA1基因表达的OPA1蛋白的水平。如本文所述，术语“OPA1外显子7”或其语法等效物可与术语“外显子(GRCh38/hg38:chr3193626092至193626202)”或“由跨越GRCh38/hg38:chr3193626092至193626202的基因组区域编码的外显子”互换使用。不希望受某一理论约束，由外显子7或外显子(GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202)编码的氨基酸序列的存在或不存在可调节OPA1蛋白的稳定性。例如，在一些情况下，相比于由含有外显子7的对应成熟mRNA转录物编码的OPA1蛋白，由缺乏外显子7的成熟mRNA转录物编码的OPA1蛋白可具有较少蛋白质裂解位点。在一些情况下，由缺乏外显子7的成熟mRNA转录物编码的OPA1蛋白是功能性蛋白。相比于由含有外显子7的对应成熟mRNA转录物编码的OPA1蛋白，由缺乏外显子7的成熟mRNA转录物编码的OPA1蛋白可以是至少部分功能性的。在一些情况下，相比于全长野生型OPA1蛋白，由缺乏外显子7的成熟mRNA转录物编码的OPA1蛋白是至少部分功能性的。在一些情况下，由于缺少外显子7的OPA1蛋白的较高稳定性及其至少部分功能等效，细胞中由缺乏外显子7的成熟mRNA转录物编码的OPA1蛋白的增加可在细胞中产生更具功能性的OPA1蛋白。
在其他实施方案中，除外显子7以外的OPA1前mRNA的编码外显子被本文所公开的剂靶向，其促进除外显子7以外的编码外显子的排除。在这些其他实施方案中，促进除外显子7以外的编码外显子的排除的剂增加由缺乏所排除外显子的成熟mRNA转录物编码的OPA1蛋白的表达。
可使用刺激外显子跳读的剂，诸如ASO来诱导OPA1前mRNA物种的选择性剪接，例如编码外显子，例如选择性剪接外显子，例如外显子7的跳读以产生功能性成熟OPA1蛋白。外显子跳读的诱导可引起不同选择性剪接mRNA转录物的水平的调节。所得成熟OPA1mRNA可翻译为不同OPA1蛋白，从而调节患者细胞中的OPA1蛋白的量，并且缓解与OPA1缺乏相关的疾患或疾病的症状，所述疾患或疾病诸如眼部疾病或疾患、1型视神经萎缩、常染色体显性视神经萎缩(ADOA)、ADOA叠加综合征；线粒体病症；青光眼；正常眼压青光眼；夏-马-图三氏病；线粒体功能失调；糖尿病性视网膜病变；年龄相关性黄斑变性；视网膜神经节细胞死亡；线粒体裂变介导的线粒体功能失调；进行性眼外肌麻痹；耳聋；共济失调；运动神经病；感觉神经病；肌病；贝尔综合征；脑部功能失调；脑病；周围神经病变；致死性婴儿线粒体脑肌病；肥厚性心肌病；痉挛性共济失调综合征；感觉运动周围神经病变；张力减退；胃肠道蠕动异常和吞咽困难；视神经萎缩；视神经萎缩叠加综合征；线粒体DNA耗竭综合征14；晚发型心肌病；糖尿病性心肌病；阿尔茨海默氏病；局灶节段性肾小球硬化；肾病；亨廷顿氏病；健康老化中的认知功能下降；朊病毒疾病；晚发型痴呆和帕金森氏症；线粒体肌病；利氏综合征；弗里德希氏共济失调；帕金森氏病；MELAS(线粒体脑肌病、乳酸中毒和中风样发作)；丙酮酸脱氢酶复合物缺乏症；慢性肾病；莱伯遗传性视神经病变；肥胖；年龄相关的全身性神经变性；骨胳肌萎缩；心脏和大脑缺血性损伤；或大量肝细胞凋亡。
在一些实施方案中，可使用本文所公开的方法或组合物治疗或改善的疾病或疾患不与治疗剂所靶向的目标蛋白(基因)直接相关。在一些实施方案中，本文所提供的治疗剂可靶向不与疾病或疾患直接相关的蛋白质(基因)，但调节目标蛋白(基因)的表达可治疗或改善疾病或疾患。
在多个实施方案中，本公开提供了一种治疗剂，其可靶向OPA1mRNA转录物以调节剪接或蛋白质表达水平。治疗剂可以是小分子、多核苷酸或多肽。在一些实施方案中，治疗剂是ASO。OPA1前mRNA上的各种区域或序列可被治疗剂，诸如ASO靶向。在一些实施方案中，ASO靶向含有NMD外显子的OPA1前mRNA转录物。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1前mRNA转录物的NMD外显子内的序列。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1前mRNA转录物的NMD外显子的5'端(3'ss)上游(或5')的序列。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1前mRNA转录物的NMD外显子的3'端(5'ss)下游(或3')的序列。在一些实施方案中，ASO靶向在侧接于OPA1前mRNA转录物的NMD外显子的5'端上的内含子内的序列。在一些实施方案中，ASO靶向在侧接于OPA1前mRNA转录物的NMD外显子的3'端上的内含子内的序列。在一些实施方案中，ASO靶向包含OPA1前mRNA转录物的NMD外显子-内含子边界的序列。NMD外显子-内含子边界可指内含子序列与NMD外显子区域的连接处。内含子序列可侧接NMD外显子的5'端，或NMD外显子的3'端。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1前mRNA转录物的外显子内的序列。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1前mRNA转录物的内含子内的序列。在一些实施方案中，ASO靶向包含OPA1前mRNA转录物的内含子的一部分和外显子的一部分两者的序列。
在一些实施方案中，ASO靶向NMD外显子的5'端上游(或5')约4至约300个核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO靶向NMD外显子区域的5'端上游(或5')约1至约20个核苷酸、约20至约50个核苷酸、约50至约100个核苷酸、约100至约150个核苷酸、约150至约200个核苷酸、约200至约250核苷酸或约250至约300个核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO可靶向NMD外显子的5'端上游超过300个核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO靶向NMD外显子的3'端下游(或3')约4至约300个核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO靶向NMD外显子的3'端下游约1至约20个核苷酸、约20至约50个核苷酸、约50至约100个核苷酸、约100至约150个核苷酸、约150至约200个核苷酸、约200至约250核苷酸或约250至约300个核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO靶向NMD外显子的3'端下游超过300个核苷酸的序列。
在一些实施方案中，含OPA1 NMD外显子的前mRNA转录物通过与SEQ ID NO:1具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的基因序列编码。在一些实施方案中，OPA1 NMD外显子前mRNA转录物包含与SEQ ID NO:2-5中的任一个具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，含OPA1 NMD外显子的前mRNA转录物(或NMD外显子mRNA)包含与SEQ ID NO:2-5中的任一个具有至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，含OPA1 NMD外显子的前mRNA转录物(或NMD外显子mRNA)通过与SEQ ID NO:2-5中的任一个具有至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，NMD外显子mRNA的目标部分包含与包含SEQ ID NO:2-5中的任一个的至少8个邻接核酸的区域具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，ASO靶向包含NIE外显子6的含OPA1 NMD外显子的前mRNA的外显子6x、包含NIE外显子7的含OPA1 NMD外显子的前mRNA的外显子7x或包含NIE外显子28的含OPA1NMD外显子的前mRNA的外显子28x。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1前mRNA的外显子(GRCh38/hg38:chr3 193628509193628616)；或OPA1的外显子(GRCh38/hg38:chr3193603500193603557)。在一些实施方案中，ASO靶向除NMD外显子以外的OPA1前mRNA的NMD外显子(GRCh38/hg38:chr3 193628509193628616)。
在一些实施方案中，ASO靶向OPA1的外显子6x、OPA1的外显子7x或OPA1的外显子28x的5'端上游(或5')约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1的GRCh38/hg38:chr3 193628509；或OPA1的GRCh38/hg38:chr3193603500上游(或5')约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸的序列。
在一些实施方案中，ASO靶向OPA1的外显子6x、OPA1的外显子7x或OPA1的外显子28x的5'端上游(或5')至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1的GRCh38/hg38:chr3 193628509；或OPA1的GRCh38/hg38:chr3193603500上游(或5')至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸的序列。
在一些实施方案中，ASO靶向OPA1的外显子6x、OPA1的外显子7x或OPA1的外显子28x的3'端下游(或3')约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1的GRCh38/hg38:chr3 193628616；或OPA1的GRCh38/hg38:chr3193603557下游(或3')约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸的序列。
在一些实施方案中，ASO靶向OPA1的外显子6x、OPA1的外显子7x或OPA1的外显子28x的3'端下游(或3')至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1的GRCh38/hg38:chr3 193628616；或OPA1的GRCh38/hg38:chr3193603557下游(或3')至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸的序列。
在一些实施方案中，ASO具有与根据SEQ ID NO:2-5或279中的任一个的NMD外显子mRNA的目标部分互补的序列。
在一些实施方案中，ASO靶向NMD外显子的5'端上游的序列。例如，靶向NMD外显子(OPA1的外显子6x、OPA1的外显子7x或OPA1的外显子28x)的5'端上游的序列的ASO包含与SEQ ID NO:2或3的至少8个邻接核酸至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％互补的序列。例如，靶向NMD外显子(例如OPA1的外显子(GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616)；或OPA1的外显子(GRCh38/hg38:chr3 193603500 193603557))的5'端上游的序列的ASO可包含与SEQ ID NO:4或5具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，ASO靶向含有外显子-内含子边界(或连接处)的序列。例如，靶向含有外显子-内含子边界的序列的ASO可包含与SEQ ID NO:2-5中的任一个的至少8个邻接核酸至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％互补的序列。在一些实施方案中，ASO靶向NMD外显子的3'端下游的序列。例如，靶向NMD外显子(例如OPA1的外显子6x、OPA1的外显子7x或OPA1的外显子28x)的3'端下游的序列的ASO包含与SEQ ID NO:2或3，或SEQ ID NO:2或3的至少8个邻接核酸具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。例如，靶向NMD外显子(例如OPA1的外显子(GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616)；或OPA1的外显子(GRCh38/hg38:chr3 193603500至193603557))的3'端下游的序列的ASO可包含与SEQ ID NO:4或5，或SEQ ID NO:4或5的至少8个邻接核酸具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，ASO靶向NMD外显子内的序列。
在一些实施方案中，ASO靶向包含NIE外显子6的含OPA1 NMD外显子的前mRNA的外显子6x、包含NIE外显子7的含OPA1 NMD外显子的前mRNA的外显子7x或包含NIE外显子28的含OPA1NMD外显子的前mRNA的外显子28x。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1前mRNA的外显子6x、外显子7x或外显子28x的5'端下游(或3')的序列。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1前mRNA的外显子6x、外显子7x或外显子28x的3'端上游(或5')的序列。
在一些实施方案中，含OPA1 NMD外显子的前mRNA的目标部分在内含子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50中。在一些实施方案中，ASO与NMD外显子前mRNA的目标部分的杂交导致内含子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50内的NMD外显子中的至少一个的外显子跳读，并且随后增加OPA1蛋白产生。在一些实施方案中，含OPA1 NMD外显子的前mRNA的目标部分在OPA1的内含子6或OPA1的内含子28中。在一些实施方案中，含OPA1NMD外显子的前mRNA的目标部分是OPA1的内含子(GRCh38/hg38:chr3 193626203至193631611)；或OPA1的内含子(GRCh38/hg38:chr3 193593374至193614710)。
在一些实施方案中，本公开的方法和组合物用于通过诱导含OPA1 NMD外显子的前mRNA的假外显子的外显子跳读来增加OPA1的表达。在一些实施方案中，假外显子是内含子1-50中的任一个内的序列。在一些实施方案中，假外显子是内含子1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50中的任一个内的序列。在一些实施方案中，假外显子可以是OPA1内含子或其一部分。在一些实施方案中，假外显子在OPA1的内含子6或OPA1的内含子28内。在一些实施方案中，假外显子在OPA1的内含子(GRCh38/hg38:chr3 193626203至193631611)；或OPA1的内含子(GRCh38/hg38:chr3 193593374至193614710)内。
在一些实施方案中，ASO靶向OPA1前mRNA转录物以诱导编码外显子，例如选择性剪接外显子的外显子跳读。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1前mRNA转录物的编码外显子，例如选择性剪接外显子内的序列。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1前mRNA转录物的编码外显子的5'端(3'ss)上游(或5')的序列。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1前mRNA转录物的编码外显子的3'端(5'ss)下游(或3')的序列。在一些实施方案中，ASO靶向在侧接于OPA1前mRNA转录物的编码外显子的5'端上的内含子内的序列。在一些实施方案中，ASO靶向在侧接于OPA1前mRNA转录物的编码外显子的3'端上的内含子内的序列。在一些实施方案中，ASO靶向包含OPA1前mRNA转录物的外显子-内含子边界的序列。外显子-内含子边界可指内含子序列与外显子序列的连接处。内含子序列可侧接编码外显子的5'端，或编码外显子的3'端。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1前mRNA转录物的外显子内的序列。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1前mRNA转录物的内含子内的序列。在一些实施方案中，ASO靶向包含OPA1前mRNA转录物的内含子的一部分和外显子的一部分两者的序列。
在一些实施方案中，ASO靶向编码外显子，例如选择性剪接外显子的5'端上游(或5')约4至约300个核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO靶向编码外显子区域的5'端上游(或5')约1至约20个核苷酸、约20至约50个核苷酸、约50至约100个核苷酸、约100至约150个核苷酸、约150至约200个核苷酸、约200至约250核苷酸或约250至约300个核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO可靶向编码外显子的5'端上游超过300个核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO靶向编码外显子的3'端下游(或3')约4至约300个核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO靶向编码外显子的3'端下游约1至约20个核苷酸、约20至约50个核苷酸、约50至约100个核苷酸、约100至约150个核苷酸、约150至约200个核苷酸、约200至约250核苷酸或约250至约300个核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO靶向编码外显子的3'端下游超过300个核苷酸的序列。
在一些实施方案中，OPA1前mRNA转录物通过与SEQ ID NO.1具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的基因序列编码。在一些实施方案中，OPA1前mRNA转录物包含与SEQ ID NO.2-5中的任一个具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，OPA1前mRNA转录物(或NMD外显子mRNA)包含与SEQ ID NO:2-5中的任一个具有至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，OPA1前mRNA转录物(或NMD外显子mRNA)通过与SEQ ID NO:2-5中的任一个具有至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，OPA1前mRNA的目标部分包含与包含SEQ ID NO:2-5中的任一个的至少8个邻接核酸的区域具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，ASO靶向OPA1前mRNA的外显子7，即，ASO靶向OPA1前mRNA的外显子(GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202)。
在一些实施方案中，ASO靶向除外显子7以外的OPA1前mRNA的编码外显子，即，ASO靶向除由(GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202)定义的外显子以外的OPA1前mRNA的外显子。
在一些实施方案中，ASO靶向OPA1的外显子7的5'端上游(或5')约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1的GRCh38/hg38:chr3 193626092上游(或5')约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸的序列。
在一些实施方案中，ASO靶向OPA1的外显子7的5'端上游(或5')至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1的GRCh38/hg38:193626092上游(或5')至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸的序列。
在一些实施方案中，ASO靶向OPA1的外显子7的3'端下游(或3')约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1的GRCh38/hg38:chr3 193626202下游(或3')约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸的序列。
在一些实施方案中，ASO靶向OPA1的外显子7的3'端下游(或3')至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸的序列。在一些实施方案中，ASO靶向OPA1的GRCh38/hg38:chr3 193626202下游(或3')至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸的序列。
在一些实施方案中，ASO具有与根据SEQ ID NO:2-5或277中的任一个的NMD外显子mRNA的目标部分互补的序列。
在一些实施方案中，ASO靶向编码外显子，例如选择性剪接外显子的5'端上游的序列。例如，靶向编码外显子(例如OPA1的外显子7)的5'端上游的序列的ASO包含与SEQ IDNO:2或3的至少8个邻接核酸至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％互补的序列。例如，靶向编码外显子(例如OPA1的外显子(GRCh38/hg38:193626092至193626202))的5'端上游的序列的ASO可包含与SEQ IDNO:4或5具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，ASO靶向含有外显子-内含子边界(或连接处)的序列。例如，靶向含有外显子-内含子边界的序列的ASO可包含与SEQ ID NO:2-5中的任一个的至少8个邻接核酸至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％互补的序列。在一些实施方案中，ASO靶向编码外显子，例如选择性剪接外显子的3'端下游的序列。例如，靶向编码外显子(例如OPA1的外显子7)的3'端下游的序列的ASO包含与SEQ ID NO:2或3，或SEQ ID NO:2或3的至少8个邻接核酸具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。例如，靶向编码外显子(例如OPA1的外显子7)的3'端下游的序列的ASO可包含与SEQ ID NO:4或5，或SEQ ID NO:4或5的至少8个邻接核酸具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。在一些实施方案中，ASO靶向编码外显子，例如选择性剪接外显子内的序列。
蛋白质表达
在一些实施方案中，本文所述的方法用于增加功能性OPA1蛋白或RNA的产生。如本文所用，术语“功能性”是指消除所治疗疾患或疾病(例如1型视神经萎缩)的任何一种或多种症状所需的OPA1蛋白或RNA的活性或功能的量。在一些实施方案中，所述方法用于增加部分功能性OPA1蛋白或RNA的产生。如本文所用，术语“部分功能性”是指消除或预防疾病或疾患的任何一种或多种症状所需的活性或功能的量的OPA1蛋白或RNA的活性或功能的任何量。在一些实施方案中，部分功能性蛋白或RNA将具有比完全功能性蛋白或RNA低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的活性。
在一些实施方案中，所述方法是一种通过具有OPA1前mRNA的受试者的细胞增加OPA1蛋白的表达的方法，其中受试者患有由OPA1蛋白的活性量不足引起的疾病或疾患，例如1型视神经萎缩，并且其中OPA1蛋白的量不足是由OPA1蛋白的单倍剂量不足引起的。在此类实施方案中，受试者具有编码功能性OPA1蛋白的第一等位基因和不产生OPA1蛋白的第二等位基因。在另一此类实施方案中，受试者具有编码功能性OPA1蛋白的第一等位基因，和编码非功能性OPA1蛋白的第二等位基因。在另一此类实施方案中，受试者具有编码功能性OPA1蛋白的第一等位基因，和编码部分功能性OPA1蛋白的第二等位基因。在这些实施方案中的任一个中，反义寡聚物结合至从第二等位基因转录的OPA1前mRNA的目标部分，从而诱导假外显子从前mRNA的外显子跳读，并且使得编码功能性OPA1蛋白的成熟mRNA的水平增加，和OPA1蛋白在受试者的细胞中的表达增加。
在一些实施方案中，所述方法是一种通过具有OPA1前mRNA的受试者的细胞增加OPA1蛋白的表达的方法，其中受试者患有由OPA1蛋白的活性量不足引起的疾病或疾患，并且其中OPA1蛋白的量不足是由常染色体隐性遗传引起的。
在一些实施方案中，所述方法是一种通过具有OPA1前mRNA的受试者的细胞增加OPA1蛋白的表达的方法，其中受试者患有由OPA1蛋白的活性量不足引起的疾病或疾患，例如1型视神经萎缩，并且其中OPA1蛋白的量不足是由常染色体显性遗传引起。
在相关实施方案中，所述方法是使用ASO增加蛋白质或功能性RNA的表达的方法。在一些实施方案中，ASO可用于增加具有OPA1前mRNA的受试者的细胞中的OPA1蛋白的表达，其中受试者的OPA1蛋白的量或功能不足，例如1型视神经萎缩。
在一些实施方案中，本文所述的剂，例如寡核苷酸靶向编码导致疾病或疾患的蛋白质的前mRNA转录物。在一些情况下，其是通过本文所述的剂，例如寡核苷酸靶向的含NMD外显子的前mRNA转录物。在一些情况下，本文所述的剂，例如寡核苷酸被设计以靶向前mRNA的编码外显子。在一些情况下，本文所述的剂，例如寡核苷酸可诱导跳读NMD外显子、编码外显子或两者。在一些实施方案中，ASO靶向编码不导致所述疾病的蛋白质的含NMD外显子的前mRNA转录物。例如，由特定途径中第一蛋白质的突变或缺乏引起的疾病可通过靶向编码第二蛋白质的前mRNA，从而增加第二蛋白质的产生来改善。在一些实施方案中，第二蛋白质的功能能够补偿第一蛋白质的突变或缺乏(所述突变或缺乏导致所述疾病或疾患)。
在一些实施方案中，受试者具有：
(a)第一突变等位基因，由所述第一突变等位基因
(i)产生的OPA1蛋白比来自野生型等位基因的产量低，
(ii)产生的OPA1蛋白是以呈相比于等效野生型蛋白具有降低功能的形式，或
(iii)未产生OPA1蛋白或功能性RNA；和
(b)第二突变等位基因，由所述第二突变等位基因
(i)产生的OPA1蛋白比来自野生型等位基因的产量低，
(ii)产生的OPA1蛋白是以呈相比于等效野生型蛋白具有降低功能的形式，或
(iii)未产生OPA1蛋白，并且
其中含NMD外显子的前mRNA从第一等位基因和/或第二等位基因转录。在这些实施方案中，ASO结合至从第一等位基因或第二等位基因转录的含NMD外显子的前mRNA的目标部分，从而诱导假外显子从含NMD外显子的前mRNA的外显子跳读，并且使得编码OPA1蛋白的mRNA的水平增加，和目标蛋白或功能性RNA在受试者的细胞中的表达增加。在这些实施方案中，具有由假外显子从含NMD外显子的前mRNA的外显子跳读产生的表达水平增加的目标蛋白或功能性RNA可呈相比于等效野生型蛋白具有降低的功能(部分功能性)或相比于等效野生型蛋白具有完全功能(完全功能性)的形式。
在一些实施方案中，受试者具有：
(a)第一突变等位基因，由所述第一突变等位基因
(i)产生的OPA1比来自野生型等位基因的产量低，
(ii)产生的OPA1是以呈相比于等效野生型蛋白具有降低功能的形式，或
(iii)未产生OPA1蛋白或功能性RNA；和
(b)第二突变等位基因，由所述第二突变等位基因
(i)产生的OPA1比来自野生型等位基因的产量低，
(ii)产生的OPA1是以呈相比于等效野生型蛋白具有降低功能的形式，或
(iii)未产生OPA1蛋白，并且
其中OPA1前mRNA从第一等位基因和/或第二等位基因专利。在这些实施方案中，ASO结合至从第一等位基因或第二等位基因转录的OPA1前mRNA的目标部分，从而诱导编码外显子从OPA1前mRNA的外显子跳读，并且使得受试者的细胞中的目标OPA1蛋白的表达增加。在这些实施方案中，具有由编码外显子从OPA1前mRNA的外显子跳读产生的表达水平增加的目标OPA1蛋白可呈相比于等效野生型蛋白具有降低的功能(部分功能性)或相比于等效野生型蛋白具有完全功能(完全功能性)的形式。
在一些实施方案中，当与对照细胞(例如未用反义寡聚物处理的细胞或用不结合至OPA1前mRNA的目标部分的反义寡聚物处理的细胞)中产生的编码OPA1蛋白的mRNA的量相比时，编码OPA1蛋白的mRNA的水平增加1.1至10倍。
在一些实施方案中，使用本公开的方法治疗的受试者表达来自一个等位基因的部分功能性OPA1蛋白，其中部分功能性OPA1蛋白可由读框移位突变、无义突变、错义突变或部分基因缺失引起。在一些实施方案中，使用本公开的方法治疗的受试者表达来自一个等位基因的非功能性OPA1蛋白，其中非功能性OPA1蛋白可由一个等位基因中的读框移位突变、无义突变、错义突变、部分基因缺失引起。在一些实施方案中，使用本公开方法治疗的受试者在一个等位基因中具有OPA1全基因缺失。
外显子包含
如本文所用，“含NMD外显子的前mRNA”是含有至少一个假外显子的前mRNA转录物。选择性或异常剪接可使得成熟mRNA转录物中包含至少一个假外显子。术语“成熟mRNA”和“完全剪接mRNA”在本文中可互换使用以描述经完全加工的mRNA。至少一个假外显子的包含可以是非生产性mRNA并产生成熟mRNA的NMD。含NMD外显子的成熟mRNA有时可导致异常蛋白质表达。
在一些实施方案中，包括的假外显子是从细胞中编码目标蛋白的基因转录的含NMD外显子的前mRNA的群体中的最丰富的假外显子。在一些实施方案中，包括的假外显子是从细胞中编码目标蛋白的基因转录的含NMD外显子的前mRNA的群体中的最丰富的假外显子，其中含NMD外显子的前mRNA群体包含两个或更多个包括的假外显子。在一些实施方案中，靶向编码目标蛋白的含NMD外显子的前mRNA的群体中的最丰富的假外显子的反义寡聚物诱导所述群体中一个或两个或更多个假外显子，包括反义寡聚物所靶向或结合的假外显子的外显子跳读。在一些实施方案中，靶向区域在假外显子中，所述假外显子是编码OPA1蛋白的含NMD外显子的前mRNA中的最丰富的假外显子。
外显子包含的程度可表示为外显子包含百分比，例如包括给定假外显子在内的转录物的百分比。简言之，外显子包含百分比可计算为具有外显子包含的RNA转录物的量相对于具有外显子包含的RNA转录物的量的平均值加上具有外显子排除的RNA转录物的量的平均值之和的百分比。
在一些实施方案中，包括的假外显子是基于至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％或至少约50％包含的测定而鉴定为包括的假外显子的外显子。在实施方案中，包括的假外显子是基于约5％至约100％、约5％至约95％、约5％至约90％、约5％至约85％、约5％至约80％、约5％至约75％、约5％至约70％、约5％至约65％、约5％至约60％、约5％至约55％、约5％至约50％、约5％至约45％、约5％至约40％、约5％至约35％、约5％至约30％、约5％至约25％、约5％至约20％、约5％至约15％、约10％至约100％、约10％至约95％、约10％至约90％、约10％至约85％、约10％至约80％、约10％至约75％、约10％至约70％、约10％至约65％、约10％至约60％、约10％至约55％、约10％至约50％、约10％至约45％、约10％至约40％、约10％至约35％、约10％至约30％、约10％至约25％、约10％至约20％、约15％至约100％、约15％至约95％、约15％至约90％、约15％至约85％、约15％至约80％、约15％至约75％、约15％至约70％、约15％至约65％、约15％至约60％、约15％至约55％、约15％至约50％、约15％至约45％、约15％至约40％、约15％至约35％、约15％至约30％、约15％至约25％、约20％至约100％、约20％至约95％、约20％至约90％、约20％至约85％、约20％至约80％、约20％至约75％、约20％至约70％、约20％至约65％、约20％至约60％、约20％至约55％、约20％至约50％、约20％至约45％、约20％至约40％、约20％至约35％、约20％至约30％、约25％至约100％、约25％至约95％、约25％至约90％、约25％至约85％、约25％至约80％、约25％至约75％、约25％至约70％、约25％至约65％、约25％至约60％、约25％至约55％、约25％至约50％、约25％至约45％、约25％至约40％或约25％至约35％包含的测定而鉴定为包括的假外显子的外显子。ENCODE数据(由例如Tilgner等人,2012,“Deep sequencin g ofsubcellular RNA fractions shows splicing to be predominantly co-transcriptional in the human genome but inefficient for lncRNAs”,GenomeResearch 22(9):1616-25描述)可用于帮助鉴定外显子包含。
在一些实施方案中，相比于由不存在ASO/不存在处理的细胞产生的蛋白质的量，使细胞与与OPA1前mRNA转录物的目标部分互补的ASO接触使得产生的OPA1蛋白的量增加至少10、20、30、40、50、60、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500或1000％。在一些实施方案中，相比于由对照化合物产生的目标蛋白的量，由反义寡聚物所接触的细胞产生的OPA1蛋白的总量增加约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％。在一些实施方案中，相比于由对照化合物产生的目标蛋白的量，由反义寡聚物所接触的细胞产生的OPA1蛋白的总量增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。对照化合物可以是例如与前mRNA的目标部分不互补的寡核苷酸。
在一些实施方案中，使细胞与与OPA1前mRNA转录物的目标部分互补的ASO接触使得编码OPA1的mRNA，包括编码目标蛋白的成熟mRNA的量增加。在一些实施方案中，相比于由不存在ASO/不存在处理的细胞产生的蛋白质的量，编码OPA1蛋白的mRNA，或编码OPA1蛋白的成熟mRNA的量增加至少10、20、30、40、50、60、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500或1000％。在一些实施方案中，相比于未处理细胞，例如未处理细胞或用对照化合物处理的细胞中产生的成熟RNA的量，反义寡聚物所接触的细胞中产生的编码OPA1蛋白的mRNA，或编码OPA1蛋白的成熟mRNA的总量增加约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％。在一些实施方案中，相比于未处理细胞，例如未处理细胞或用对照化合物处理的细胞中产生的成熟RNA的量，反义寡聚物所接触的细胞中产生的编码OPA1蛋白的mRNA，或编码OPA1蛋白的成熟mRNA的总量增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。对照化合物可以是例如与含OPA1 NMD外显子的前mRNA的目标部分不互补的寡核苷酸。
NMD外显子可以是任何长度。在一些实施方案中，NMD外显子包含内含子的全序列，在这种情况下，其可称为内含子保留。在一些实施方案中，NMD外显子可以是内含子的一部分。在一些实施方案中，NMD外显子可以是包括5'ss序列的内含子的5'端部分。在一些实施方案中，NMD外显子可以是包括3'ss序列的内含子的3'端部分。在一些实施方案中，NMD外显子可以是不包含5'ss序列的内含子内的部分。在一些实施方案中，NMD外显子可以是不包含3'ss序列的内含子内的部分。在一些实施方案中，NMD外显子可以是不包含5'ss或3'ss序列的内含子内的部分。在一些实施方案中，NMD外显子的长度可以是5个核苷酸至10个核苷酸、长度可以是10个核苷酸至15个核苷酸、长度可以是15个核苷酸至20个核苷酸、长度可以是20个核苷酸至25个核苷酸、长度可以是25个核苷酸至30个核苷酸、长度可以是30个核苷酸至35个核苷酸、长度可以是35个核苷酸至40个核苷酸、长度可以是40个核苷酸至45个核苷酸、长度可以是45个核苷酸至50个核苷酸、长度可以是50个核苷酸至55个核苷酸、长度可以是55个核苷酸至60个核苷酸、长度可以是60个核苷酸至65个核苷酸、长度可以是65个核苷酸至70个核苷酸、长度可以是70个核苷酸至75个核苷酸、长度可以是75个核苷酸至80个核苷酸、长度可以是80个核苷酸至85个核苷酸、长度可以是85个核苷酸至90个核苷酸、长度可以是90个核苷酸至95个核苷酸，或长度可以是95个核苷酸至100个核苷酸。在一些实施方案中，NMD外显子的长度可以是至少10个核苷酸、至少20个核苷酸、至少30个核苷酸、至少40个核苷酸、至少50个核苷酸、至少60个核苷酸、至少70个核苷酸、至少80个核苷酸、至少90个核苷酸或长度可以是至少100个核苷酸。在一些实施方案中，NMD外显子的长度可以是100至200个核苷酸、长度可以是200至300个核苷酸、长度可以是300至400个核苷酸、长度可以是400至500个核苷酸、长度可以是500至600个核苷酸、长度可以是600至700个核苷酸、长度可以是700至800个核苷酸、长度可以是800至900个核苷酸、长度可以是900至1,000个核苷酸。在一些实施方案中，NMD外显子的长度可长于1,000个核苷酸。
假外显子的包含可导致读框移位和在成熟mRNA转录物中引入提前终止密码子(PIC)，使转录物成为NMD的目标。含有NMD外显子的成熟mRNA转录物可以是非生产性mRNA转录物，其不会导致蛋白质表达。PIC可存在于NMD外显子下游的任何位置。在一些实施方案中，PIC可存在于NMD外显子下游的任何外显子中。在一些实施方案中，PIC可存在于NMD外显子内。例如，在由OPA1基因编码的mRNA转录物中包含OPA1的外显子6x、OPA1的外显子7x或OPA1的外显子28x可在mRNA转录物中诱导PIC。例如，在由OPA1编码的mRNA转录物中包含OPA1的外显子(GRCh38/hg38:chr3 193628509 193628616)；或OPA1的外显子(GRCh38/hg38:chr3193603500 193603557)。
在一些方面中，本文提供了一种通过促进包含编码外显子来调节OPA1蛋白的表达的方法。所述方法可包括使剂与具有OPA1前mRNA的细胞接触，其中所述剂包含结合至以下各项的寡核苷酸：(a)内含子区域内紧邻前mRNA的编码外显子的5'端上游的前mRNA的目标部分；或(b)内含子区域内紧邻前mRNA的编码外显子的3'端下游的前mRNA的目标部分；由此所述剂增加细胞中从前mRNA加工并含有编码外显子的经加工mRNA的水平。在一些情况下，要包括的编码外显子是选择性剪接外显子。在一些情况下，所述方法促进在细胞中的前mRNA的剪接期间，在经加工mRNA中包含编码外显子。
在包含编码外显子的一些这些实施方案中，前mRNA的目标部分在跨越编码外显子的5'端上游的100至50、100至60、100至70、100至80或100至90个核苷酸的区域内。在一些情况下，前mRNA的目标部分在跨越编码外显子的3'端下游的40至100、50至100、60至100、70至100、80至100或90至100个核苷酸的区域内。在一些情况下，编码外显子是OPA1的外显子7。在一些情况下，编码外显子包含与SEQ ID NO:277具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，编码外显子包含SEQ ID NO:277。前mRNA的目标部分可在跨越基因组位点GRCh38/hg38:chr3193626092上游的100至50、100至60、100至70、100至80或100至90个核苷酸的区域内。在一些情况下，前mRNA的目标部分在跨越基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193626202下游的40至100、50至100、60至100、70至100、80至100或90至100个核苷酸的区域内。
在一些情况下，相比于不存在剂的情况下，在与剂接触的细胞中在经加工mRNA中包含编码外显子增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
NMD外显子和编码外显子两者的排除
在一些实施方案中，本文提供了一种通过靶向前mRNA和调节编码外显子和无义介导的RNA衰变诱导外显子(NMD外显子)两者从前mRNA的排除来调节目标蛋白的表达的方法。在一些情况下，所述方法包括使剂与细胞接触，并且剂促进从前mRNA排除编码外显子和NMD外显子两者，从而增加从前mRNA加工并缺乏编码外显子和NMD外显子两者的经加工mRNA的水平。在一些情况下，剂结合至前mRNA的目标部分，或调节涉及编码外显子、NMD外显子或两者的剪接的因子的结合。在一些情况下，剂干扰涉及编码外显子、NMD外显子或两者的剪接的因子与目标部分的区域的结合。在一些情况下，NMD外显子在邻近于编码外显子的内含子区域内。在一些情况下，NMD外显子在紧邻编码外显子上游的内含子区域内。在一些情况下，NMD外显子在紧邻编码外显子下游的内含子区域内。在一些情况下，编码外显子是选择性剪接外显子。
在一些情况下，前mRNA的目标部分接近编码外显子。前mRNA的目标部分可位于紧邻编码外显子上游的内含子区域中。前mRNA的目标部分可位于紧邻编码外显子下游的内含子区域中。在一些情况下，前mRNA的目标部分可位于编码外显子内。在一些情况下，前mRNA的目标部分在跨越编码外显子的5'端上游的49至1、39至1、29至1或19至1个核苷酸的区域内。在一些情况下，前mRNA的目标部分在跨越编码外显子上游的100个核苷酸至编码外显子下游的100个核苷酸的区域内。在一些情况下，目标部分包含编码外显子的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续核苷酸。
在一些情况下，前mRNA的目标部分接近NMD外显子。在一些情况下，前mRNA的目标部分位于紧邻NMD外显子上游的内含子区域中。在一些情况下，前mRNA的目标部分位于紧邻NMD外显子下游的内含子区域中。在一些情况下，前mRNA的目标部分位于NMD外显子内。在一些情况下，前mRNA的目标部分在跨越NMD外显子上游的100个核苷酸至NMD外显子下游的100个核苷酸的区域内。
在一些实施方案中，本文所述的方法适用于通过调节含有外显子7和外显子7x两者的OPA1前mRNA的外显子7和NMD外显子(例如外显子7x)的排除来调节OPA1蛋白的表达。在一些情况下，编码外显子包含与SEQ ID NO:277具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，编码外显子包含SEQ ID NO:277。在一些情况下，前mRNA的目标部分紧邻编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202上游。在一些情况下，前mRNA的目标部分紧邻编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202下游。在一些情况下，前mRNA的目标部分在跨越GRCh38/hg38:chr3193626092上游的49至1、39至1、29至1或19至1个核苷酸的区域内。在一些情况下，前mRNA的目标部分在基因组位点GRCh38/hg38:chr3193626092上游的100个核苷酸至基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193626202下游的100个核苷酸的区域内。在一些情况下，前mRNA的目标部分在编码外显子GRCh38/hg38:chr3193626092至193626202内。在一些情况下，前mRNA的目标部分包含编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202的外显子-内含子连接处。在一些情况下，NMD外显子包含与SEQ ID NO:279具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。在一些情况下，NMD外显子包含SEQ ID NO:279。在一些情况下，前mRNA的目标部分紧邻NMD外显子GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616上游。在一些情况下，前mRNA的目标部分紧邻NMD外显子GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616下游。在一些情况下，前mRNA的目标部分在基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193628509上游的100个核苷酸至基因组位点GRCh38/hg38:chr3193628616下游的100个核苷酸的区域内。
在一些情况下，前mRNA的目标部分在NMD外显子GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616内。在一些情况下，前mRNA的目标部分包含NMD外显子GRCh38/hg38:chr3193628509至193628616的外显子-内含子连接处。在一些情况下，目标部分包含NMD外显子的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续核苷酸。
在一些情况下，相比于不存在与剂接触的情况下，在与剂接触的细胞中从前mRNA排除编码外显子增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。在一些情况下，相比于不存在与剂接触的情况下，在与剂接触的细胞中从前mRNA排除NMD外显子增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。在一些情况下，所述方法使得细胞中的经加工mRNA的水平增加。相比于不存在与剂接触的情况下，与剂接触的细胞中的经加工mRNA的水平可增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
在一些情况下，所述方法使得细胞中的OPA1蛋白的表达增加。相比于不存在与剂接触的情况下，在与剂接触的细胞中由经加工mRNA表达的OPA1蛋白的水平可增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
在一些情况下，相比于不存在与剂接触的情况下，在与剂接触的细胞中由经加工mRNA表达的OPA1蛋白的水平增加至少约1.5倍。
在一些情况下，由缺乏外显子7和外显子7x的经加工mRNA表达的OPA1蛋白是功能性OPA1蛋白。相比于野生型OPA1蛋白，由缺乏外显子7和外显子7x的经加工mRNA表达的OPA1蛋白可以是至少部分功能性的。相比于全长野生型OPA1蛋白，由缺乏外显子7和外显子7x的经加工mRNA表达的OPA1蛋白可以是至少部分功能性的。
治疗剂
在本公开的多个实施方案中，提供包括治疗剂的组合物和方法以调节OPA1的蛋白质表达水平。在一些实施方案中，本文提供了调节OPA1前mRNA的选择性剪接的组合物和方法。在一些实施方案中，本文提供了在OPA1前mRNA剪接中诱导外显子跳读，例如在OPA1前mRNA剪接期间诱导假外显子跳读的组合物和方法。在其他实施方案中，治疗剂可用于诱导包含外显子以降低蛋白质表达水平。
本文所公开的治疗剂可以是NIE抑制剂。治疗剂可包含多核酸聚合物。
根据本公开的一个方面，本文提供了一种治疗或预防与功能性OPA1蛋白缺乏相关的疾患或疾病的方法，其包括向受试者施用NIE阻遏剂以增加功能性OPA1蛋白的水平，其中所述剂结合至前mRNA转录物的区域以减少在成熟转录物中包含NMD外显子。例如，本文提供了一种治疗或预防与功能性OPA1蛋白缺乏相关的疾患的方法，其包括向受试者施用NIE阻遏剂以增加功能性OPA1蛋白的水平，其中所述剂结合至含有前mRNA转录物的NMD外显子(例如OPA1的外显子6x、OPA1的外显子7x或OPA1的外显子28x)的内含子的区域或结合至相同内含子中的NMD外显子激活调节序列。例如，本文提供了一种治疗或预防与功能性OPA1蛋白缺乏相关的疾患的方法，其包括向受试者施用NIE阻遏剂以增加功能性OPA1蛋白的水平，其中所述剂结合至含有前mRNA转录物的NMD外显子(例如OPA1的外显子(GRCh38/hg38:chr3193628509 193628616)；或OPA1的外显子(GRCh38/hg38:chr3 193603500 193603557))的内含子的区域或结合至相同内含子中的NMD外显子激活调节序列。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用NIE阻遏剂以增加功能性OPA1蛋白的水平，其中所述剂结合至含有前mRNA转录物的NMD外显子(例如除了由(GRCh38/hg38:chr3 193628509 193628616)定义的外显子7x或由(GRCh38/hg38:chr3 193603500 193603557)定义的外显子以外的OPA1的外显子)的内含子的区域或结合至相同内含子中的NMD外显子激活调节序列。在一些实施方案中，治疗剂促进除了由(GRCh38/hg38:chr3 193628509 193628616)定义的外显子7x或由(GRCh38/hg38:chr3 193603500 193603557)定义的外显子以外的OPA1前mRNA的NMD外显子的排除。在一些实施方案中，本文所公开的组合物包括一种剂，其促进除了由(GRCh38/hg38:chr3 193628509193628616)定义的外显子7x或由(GRCh38/hg38:chr3193603500193603557)定义的外显子以外的OPA1前mRNA的NMD外显子的排除。
当提及减少成熟mRNA中的NMD外显子包含时，所述减少可以是完全的，例如100％，或可以是部分的。减少可以是临床上显著的。减少/纠正可相对于未治疗的受试者中的NMD外显子包含的水平，或相对于类似受试者群体中的NMD外显子包含的量。减少/纠正可以是相对于普通受试者或治疗之前的受试者，NMD外显子包含少至少10％。减少可以是相对于普通受试者或治疗之前的受试者，NMD外显子包含少至少20％。减少可以是相对于普通受试者或治疗之前的受试者，NMD外显子包含少至少40％。减少可以是相对于普通受试者或治疗之前的受试者，NMD外显子包含少至少50％。减少可以是相对于普通受试者或治疗之前的受试者，NMD外显子包含少至少60％。减少可以是相对于普通受试者或治疗之前的受试者，NMD外显子包含少至少80％。减少可以是相对于普通受试者或治疗之前的受试者，NMD外显子包含少至少90％。
根据本公开的一个方面，本文提供了一种治疗或预防与功能性OPA1蛋白缺乏相关的疾患或疾病的方法，其包括向受试者施用剂以增加功能性OPA1蛋白的水平，其中所述剂结合至前mRNA转录物的区域以减少在成熟转录物中包含编码外显子(例如外显子7)。例如，本文提供了一种治疗或预防与功能性OPA1蛋白缺乏相关的疾患的方法，其包括向受试者施用剂以增加功能性OPA1蛋白的水平，其中所述剂结合至含有前mRNA转录物的编码外显子(例如OPA1的外显子7)的区域。例如，本文提供了一种治疗或预防与功能性OPA1蛋白缺乏相关的疾患的方法，其包括向受试者施用剂以增加功能性OPA1蛋白的水平，其中所述剂结合至含有前mRNA转录物的编码外显子(例如OPA1的外显子(GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202))的区域。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用剂以增加功能性OPA1蛋白的水平，其中所述剂结合至含有前mRNA转录物的编码外显子(例如除了由(GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202)定义的外显子7以外的OPA1的外显子)的区域。在一些实施方案中，治疗剂促进除了由(GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202)定义的外显子7以外的OPA1前mRNA的编码外显子的排除。在一些实施方案中，本文所公开的组合物包括一种剂，其促进除了由(GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202)定义的外显子7以外的OPA1前mRNA的编码外显子的排除。
当提及增加活性OPA1蛋白水平时，增加可以是临床上显著的。增加可相对于未治疗的受试者的活性OPA1蛋白的水平，或相对于类似受试者群体中的活性OPA1蛋白的量。增加可以是相对于普通受试者或治疗之前的受试者，活性OPA1蛋白多至少10％。增加可以是相对于普通受试者或治疗之前的受试者，活性OPA1蛋白多至少20％。增加可以是相对于普通受试者或治疗之前的受试者，活性OPA1蛋白多至少40％。增加可以是相对于普通受试者或治疗之前的受试者，活性OPA1蛋白多至少50％。增加可以是相对于普通受试者或治疗之前的受试者，活性OPA1蛋白多至少80％。增加可以是相对于普通受试者或治疗之前的受试者，活性OPA1蛋白多至少100％。增加可以是相对于普通受试者或治疗之前的受试者，活性OPA1蛋白多至少200％。增加可以是相对于普通受试者或治疗之前的受试者，活性OPA1蛋白多至少500％。
在其中NIE阻遏剂包含多核酸聚合物的实施方案中，多核酸聚合物的长度可以是约50个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约45个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约40个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约35个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约30个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约24个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约25个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约20个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约19个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约18个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约17个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约16个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约15个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约14个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约13个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约12个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约11个核苷酸。多核酸聚合物的长度可以是约10个核苷酸。多核酸聚合物的长度可在约10与约50个核苷酸之间。多核酸聚合物的长度可在约10与约45个核苷酸之间。多核酸聚合物的长度可在约10与约40个核苷酸之间。多核酸聚合物的长度可在约10与约35个核苷酸之间。多核酸聚合物的长度可在约10与约30个核苷酸之间。多核酸聚合物的长度可在约10与约25个核苷酸之间。多核酸聚合物的长度可在约10与约20个核苷酸之间。多核酸聚合物的长度可在约15与约25个核苷酸之间。多核酸聚合物的长度可在约15与约30个核苷酸之间。多核酸聚合物的长度可在约12与约30个核苷酸之间。
多核酸聚合物的序列可与mRNA转录物(例如，部分经加工mRNA转录物)的目标序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％互补。多核酸聚合物的序列可与前mRNA转录物的目标序列100％互补。
多核酸聚合物的序列可与前mRNA转录物的目标序列具有4个或更少错配。多核酸聚合物的序列可与前mRNA转录物的目标序列具有3个或更少错配。多核酸聚合物的序列可与前mRNA转录物的目标序列具有2个或更少错配。多核酸聚合物的序列可与前mRNA转录物的目标序列具有1个或更少错配。多核酸聚合物的序列可与前mRNA转录物的目标序列不具有错配。
多核酸聚合物可与前mRNA转录物的目标序列特异性杂交。例如，多核酸聚合物可与前mRNA转录物的目标序列具有91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％序列互补性。杂交可在高严格杂交条件下进行。
多核酸聚合物包含与选自由SEQ ID NO:2-5组成的组的序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性的序列。多核酸聚合物可包含与选自由SEQ ID NO:2-5组成的组的序列具有100％序列同一性的序列。
当提及多核酸聚合物序列时，技术人员应理解，所述序列中可允许一个或多个取代，任选地可允许两个取代，使得所述序列保持与目标序列杂交的能力；或当取代在目标序列中时，保持被识别为目标序列的能力。对序列同一性的引用可使用标准/默认参数，通过BLAST序列比对来确定。例如，序列可具有99％同一性并且根据仍本公开起作用。在其他实施方案中，序列可具有98％同一性并且仍根据本公开起作用。在另一实施方案中，序列可具有95％同一性并且仍根据本公开起作用。在另一实施方案中，序列可具有90％同一性并且仍根据本公开起作用。
反义寡聚物
本文提供了一种组合物，其包含通过结合至OPA1前mRNA(例如，含OPA1 NMD外显子的前mRNA)的目标部分来诱导外显子跳读的反义寡聚物。如本文所使用，术语“ASO”与“反义寡聚物”可互换使用并且是指诸如多核苷酸的寡聚物，其包含通过沃森-克里克(Wats on-Crick)碱基配对或摆动碱基配对(G-U)与目标核酸(例如OPA1前mRNA，例如含OPA1 NMD外显子的前mRNA)序列杂交的核碱基。ASO可具有与目标序列互补的准确序列或具有接近互补性(例如，足以结合目标序列并增强剪接位点处的剪接的互补性)。ASO被设计成使得其结合(杂交)至目标核酸(例如，前mRNA转录物的目标部分)并在生理条件下保持杂交。通常，如果ASO杂交至除预期(目标)核酸序列以外的位点，则所述ASO杂交至并非目标核酸的有限数目的序列(杂交至除目标核酸以外的若干位点)。ASO的设计可考虑前mRNA转录物的目标部分的核酸序列的存在或者基因组或细胞前mRNA或转录组中的其他位置中充分类似核酸序列的存在，使得ASO将结合其他位点并导致“脱靶”效应的可能性受到限制。本领域已知的任何反义寡聚物(例如，PCT申请号PCT/US2014/054151，公布为WO 2015/035091，标题为“Reducing Nonsense-Mediated mRNA Decay”，以引用的方式并入本文)可用于实践本文所述的方法。
在一些实施方案中，ASO与OPA1前mRNA(例如，含NMD外显子的前mRNA)的目标核酸或目标部分“特异性杂交”或对其“特异”。通常，此杂交在基本上大于37℃、优选至少50℃、并且通常在60℃至大约90℃之间的Tm下发生。此类杂交优选对应于严格杂交条件。在给定离子强度和pH下，Tm是50％目标序列与互补寡核苷酸杂交的温度。
当两个单链多核苷酸之间发生反平行构型的杂交时，寡聚物(诸如寡核苷酸)彼此“互补”。如果第一多核苷酸的链中的一个与第二多核苷酸的链中的一个之间可发生杂交，则双链多核苷酸可与另一多核苷酸“互补”。互补性(一个多核苷酸与另一多核苷酸互补的程度)可依据相对链中根据普遍接受的碱基配对规则预期彼此形成氢键的碱基的比例(例如，百分比)来量化。反义寡聚物(ASO)的序列不必与同其所杂交的目标核酸的序列100％互补。在某些实施方案中，ASO可与其所靶向的目标核酸序列内的目标区域具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列互补性。例如，寡聚化合物的20个核碱基中的18个与目标区域互补，并且将因此特异性杂交的ASO将呈现90％互补性。在这个实例中，其余非互补核碱基可集中在一起或穿插有互补核碱基，并且不必彼此邻接或与互补核碱基邻接。可使用本领域已知的BLAST程序(基础局部比对搜索工具)或PowerBLAST程序来测定ASO与目标核酸的区域的互补性百分比(Altschul,等人,J.Mol.Biol.,1990,215,403-410；Zhang和Madden,Genome Res.,1997,7,649-656)。
ASO不必与目标序列中的所有核碱基杂交，并且不与ASO杂交的核碱基可以是邻接或非邻接的。ASO可在前mRNA转录物的一个或多个区段上杂交，使得间插或相邻区段不参与杂交事件(例如，可形成环结构或发夹结构)。在某些实施方案中，ASO与目标前mRNA转录物中的非邻接核碱基杂交。例如，ASO可与前mRNA转录物中通过不与所述ASO杂交的一个或多个核碱基间隔开的核碱基杂交。
本文所述的ASO包含与OPA1前mRNA(例如，含NMD外显子的前mRNA)的目标部分中存在的核碱基互补的核碱基。术语ASO体现寡核苷酸和包含能够与目标mRNA上的互补核碱基杂交的核碱基但不包含糖部分的任何其他寡聚分子，诸如肽核酸(PNA)。ASO可包含天然存在的核苷酸、核苷酸类似物、修饰的核苷酸或前述两者或三者的任何组合。术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。术语“修饰的核苷酸”包括具有修饰或取代的糖基团和/或具有修饰主链的核苷酸。在一些实施方案中，ASO的所有核苷酸都是修饰的核苷酸。与本文所述的方法和组合物相容的ASO或ASO的组分的化学修饰对于本领域技术人员将显而易见，并且可在例如以下文献中找到：美国专利号8,258,109B2；美国专利号5,656,612；美国专利公布号2012/0190728；以及Dias和Stein,Mol.Cancer Ther.2002,347-355，所述文献以引用的方式整体并入本文。
ASO的一个或多个核碱基可以是任何天然存在的未修饰的核碱基，诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，或者是任何合成或修饰的核碱基，其与未修饰的核碱基充分类似使得其能够与目标前mRNA上存在的核碱基氢键结。修饰的核碱基的实例包括但不限于次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲氧基胞嘧啶。
本文所述的ASO还包含连接寡聚物的组分的主链结构。术语“主链结构”与“寡聚物键联”可互换使用，并且是指ASO的单体之间的连接。在天然产生的寡核苷酸中，主链包含连接寡聚物的糖部分的3'-5'磷酸二酯键联。本文所述的ASO的主链结构或寡聚物键联可包括(但不限于)硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯(phosphoramidothioate)、氨基磷酸酯等。参见例如La Planche等人,Nucleic AcidsRes.14:9081(1986)；Stec等人,J.Am.Chem.Soc.106:6077(1984)，Stein等人,NucleicAcids Res.16:3209(1988)，Zon等人,Anti-Cancer Drug Design 6:539(1991)；Zon等人,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,第87-108页(F.Eckstein编,Oxford University Press,Oxford England(1991))；Stec等人,美国专利号5,151,510；Uhlmann和Peyman,Chemi cal Reviews 90:543(1990)。在一些实施方案中，ASO的主链结构不含磷，而是含有肽键(例如在肽核酸(PNA)中)，或含有包括氨基甲酸酯、酰胺以及直链和环状烃基团的连接基团。在一些实施方案中，主链修饰是硫代磷酸酯键联。在一些实施方案中，主链修饰是氨基磷酸酯键联。
在一些实施方案中，ASO主链的磷核苷酸间键联中的每一个处的立体化学是随机的。在一些实施方案中，ASO主链的磷核苷酸间键联中的每一个处的立体化学是受控的而非随机的。例如，以引用的方式并入本文的美国专利申请公布号2014/0194610，“Methods forthe Synthesis of Functionalized Nucleic Acids”描述了用于独立地选择核酸寡聚物中的每个磷原子处的手性倾向(handedness of chirality)的方法。在一些实施方案中，本公开方法中使用的ASO(包括但不限于本文表5和表6中所阐述的ASO中的任一种)包含具有并非随机的磷核苷酸间键联的ASO。在一些实施方案中，本公开方法中使用的组合物包含纯非对映体ASO。在一些实施方案中，本公开方法中使用的组合物包含具有以下非对映体纯度的ASO：至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、约100％、约90％至约100％、约91％至约100％、约92％至约100％、约93％至约100％、约94％至约100％、约95％至约100％、约96％至约100％、约97％至约100％、约98％至约100％，或约99％至约100％。
在一些实施方案中，ASO在其磷核苷酸间键联处具有Rp和Sp构型的非随机混合。例如，已提出，反义寡核苷酸中需要Rp和Sp的混合以在良好活性与核酸酶稳定性之间获得平衡(Wan,等人,2014,“Synthesis,biophysical properties and biological activity ofsecond generation antisense oligonucleotides containing chiralphosphorothioate linkages”,Nucleic Acids Research 42(22):13456-13468，以引用的方式并入本文)。在一些实施方案中，本公开方法中使用的ASO(包括但不限于在本文的SEQID NO:2-5中所阐述的ASO中的任一种)包含约5％-100％ Rp，包含至少约5％ Rp、至少约10％ Rp、至少约15％ Rp、至少约20％ Rp、至少约25％ Rp、至少约30％ Rp、至少约35％Rp、至少约40％ Rp、至少约45％ Rp、至少约50％ Rp、至少约55％ Rp、至少约60％ Rp、至少约65％ Rp、至少约70％ Rp、至少约75％ Rp、至少约80％ Rp、至少约85％ Rp、至少约90％Rp或至少约95％ Rp，其余是Sp；或包含约100％ Rp。在一些实施方案中，本公开方法中使用的ASO(包括但不限于包含与包含SEQ ID NO:2-5中的任一个的至少8个邻接核酸的区域具有至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列的本文所阐述的ASO中的任一种)包含约10％至约100％ Rp、约15％至约100％ Rp、约20％至约100％ Rp、约25％至约100％ Rp、约30％至约100％ Rp、约35％至约100％ Rp、约40％至约100％ Rp、约45％至约100％ Rp、约50％至约100％ Rp、约55％至约100％ Rp、约60％至约100％ Rp、约65％至约100％ Rp、约70％至约100％ Rp、约75％至约100％ Rp、约80％至约100％ Rp、约85％至约100％ Rp、约90％至约100％ Rp，或约95％至约100％ Rp、约20％至约80％ Rp、约25％至约75％ Rp、约30％至约70％ Rp、约40％至约60％ Rp，或约45％至约55％ Rp，其余是Sp。
在一些实施方案中，本公开方法中使用的ASO(包括但不限于包含与包含SEQ IDNO:2-5中的任一个的至少8个邻接核酸的区域具有至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列的本文所阐述的ASO中的任一种)包含约5％-100％ Sp，包含至少约5％Sp、至少约10％ Sp、至少约15％ Sp、至少约20％ Sp、至少约25％ Sp、至少约30％Sp、至少约35％ Sp、至少约40％ Sp、至少约45％ Sp、至少约50％ Sp、至少约55％ Sp、至少约60％ Sp、至少约65％ Sp、至少约70％ Sp、至少约75％ Sp、至少约80％ Sp、至少约85％Sp、至少约90％ Sp或至少约95％ Sp，其余是Rp；或包含约100％ Sp。在实施方案中，本公开方法中使用的ASO(包括但不限于包含与包含SEQ ID NO:2-5中的任一个的至少8个邻接核酸的区域具有至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列的本文所阐述的ASO中的任一种)包含约10％至约100％ Sp、约15％至约100％Sp、约20％至约100％ Sp、约25％至约100％ Sp、约30％至约100％ Sp、约35％至约100％ Sp、约40％至约100％ Sp、约45％至约100％ Sp、约50％至约100％ Sp、约55％至约100％ Sp、约60％至约100％ Sp、约65％至约100％ Sp、约70％至约100％ Sp、约75％至约100％ Sp、约80％至约100％ Sp、约85％至约100％ Sp、约90％至约100％ Sp，或约95％至约100％ Sp、约20％至约80％ Sp、约25％至约75％ Sp、约30％至约70％ Sp、约40％至约60％ Sp，或约45％至约55％ Sp，其余是Rp。
本文所述的ASO中的任一种可含有包含核糖或脱氧核糖的糖部分(如存在于天然存在的核苷酸中)，或含有修饰的糖部分或糖类似物(包括吗啉环)。修饰糖部分的非限制性实例包括2'取代，诸如2'-O-甲基(2'-O-Me)、2'-O-甲氧基乙基(2'MOE)、2'-O-氨基乙基、2'F；N3'->P5'氨基磷酸酯、2'二甲氨基氧基乙氧基、2'二甲氨基乙氧基乙氧基、2'-胍鎓、2'-O-乙基胍、氨基甲酸酯修饰糖和双环修饰糖。在一些实施方案中，糖部分修饰选自2'-O-Me、2'F和2'MOE。在一些实施方案中，糖部分修饰是额外桥键，诸如在锁核酸(LNA)中。在一些实施方案中，糖类似物含有吗啉环，诸如二氨基磷酸酯吗啉代(PMO)。在一些实施方案中，糖部分包含呋喃核糖基或2'脱氧呋喃核糖基修饰。在一些实施方案中，糖部分包含2'4'受约束的2'O-甲基氧基乙基(cMOE)修饰。在一些实施方案中，糖部分包含cEt 2',4'受约束的2'-O乙基BNA修饰。在一些实施方案中，糖部分包含三环DNA(tcDNA)修饰。在一些实施方案中，糖部分包含亚乙基核酸(ENA)修饰。在一些实施方案中，糖部分包含MCE修饰。修饰是本领域已知的，并且描述于例如如下文献中：Jarver,等人,2014,“A Chemical View ofOligonucleotides for Exon Skipping and Related Drug Applications”,NucleicAcid Therapeutics 24(1):37-47，出于此目的以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，ASO的每个单体以相同方式被修饰，例如ASO的主链的每个键联包含硫代磷酸酯键联或每个核糖部分包含2'O-甲基修饰。存在于ASO的单体组分中的每一个上的此类修饰被称为“均一修饰”。在一些实例中，可能需要不同修饰的组合，例如ASO可包含二氨基磷酸酯键联与包含吗啉环(吗啉代)的糖部分的组合。针对ASO的不同修饰的组合被称为“混合修饰”或“混合化学修饰(mixed chemistries)”。
在一些实施方案中，ASO包含一个或多个主链修饰。在一些实施方案中，ASO包含一个或多个糖部分修饰。在一些实施方案中，ASO包含一个或多个主链修饰和一个或多个糖部分修饰。在一些实施方案中，ASO包含2'MOE修饰和硫代磷酸酯主链。在一些实施方案中，ASO包含二氨基磷酸酯吗啉代(PMO)。在一些实施方案中，ASO包含肽核酸(PNA)。本文所述的ASO或ASO的任何组分(例如，核碱基、糖部分、主链)中的任一种可被修饰以获得ASO的期望特性或活性或降低ASO的不期望的特性或活性。例如，ASO或任何ASO的一个或多个组分可被修饰以：增强与mRNA前体转录物上的目标序列的结合亲和力；减少与任何非目标序列的结合；减少被细胞核酸酶(即，RNA酶H)的降解；改善ASO到细胞中和/或到细胞的细胞核中的摄取；改变ASO的药物动力学或药效学；和/或调节ASO的半衰期。
在一些实施方案中，ASO由2'-O-(2-甲氧基乙基)(MOE)硫代磷酸酯修饰的核苷酸构成。由此类核苷酸构成的ASO尤其适合于本文中所公开的方法；已经证明具有此类修饰的寡聚物具有显著增强的抗核酸酶降解性和增加的生物可用性，使得其在本文所述的一些实施方案中例如适于经口递送。参见例如Geary,等人,J Pharmacol Exp Ther.2001；296(3):890-7；Geary,等人,J Pharmacol Exp Ther.2001；296(3):898-904。
合成ASO的方法是本领域技术人员已知的。可选地或另外，ASO可获自市售来源。
除非另外规定，否则单链核酸(例如前mRNA转录物、寡核苷酸、ASO等)序列的左侧端是5'端，并且单链或双链核酸序列的左侧方向被称为5'方向。类似地，核酸序列(单链或双链)的右侧端或右侧方向是3'端或3'方向。一般而言，核酸中在参考点5'的区域或序列被称为“上游”，并且核酸中在参考点3'的区域或序列被称为“下游”。一般而言，mRNA的5'方向或端是起始密码子(initiation codon/start codon)所处位置，而3'端或方向是终止密码子所处位置。在一些方面中，核酸中参考点上游的核苷酸可以负数表示，而参考点下游的核苷酸可以正数表示。例如，参考点(例如，mRNA中的外显子-外显子连接处)可表示为“零”位点，并且与所述参考点直接相邻且在其上游的核苷酸表示为“减一”，例如“-1”，而与所述参考点直接相邻且在其下游的核苷酸表示为“加一”，例如“+1”。
在一些实施方案中，ASO与OPA1前mRNA(例如，含OPA1 NMD外显子的前mRNA)的目标部分互补(并且与其结合)，所述目标部分在OPA1前mRNA中包括的外显子的5'剪接位点(或NMD外显子的3'端)下游(沿3'方向)(例如，以相对于5'剪接位点的正数指示方向)。在一些实施方案中，ASO与OPA1前mRNA(例如，含OPA1 NMD外显子的前mRNA)的目标部分互补，所述目标部分在相对于包括的外显子的5'剪接位点(或3'端)的约+1至约+500的区域内。在一些实施方案中，ASO与OPA1前mRNA(例如，含OPA1 NMD外显子的前mRNA)的目标部分互补，所述目标部分在相对于包括的外显子的5'剪接位点(或3'端)的核苷酸+6与+40,000之间的区域内。在一些方面中，ASO与目标部分互补，所述目标部分在相对于包括的外显子的5'剪接位点(或3'端)约+1至约+40,000、约+1至约+30,000、约+1至约+20,000、约+1至约+15,000、约+1至约+10,000、约+1至约+5,000、约+1至约+4,000、约+1至约+3,000、约+1至约+2,000、约+1至约+1,000、约+1至约+500、约+1至约+490、约+1至约+480、约+1至约+470、约+1至约+460、约+1至约+450、约+1至约+440、约+1至约+430、约+1至约+420、约+1至约+410、约+1至约+400、约+1至约+390、约+1至约+380、约+1至约+370、约+1至约+360、约+1至约+350、约+1至约+340、约+1至约+330、约+1至约+320、约+1至约+310、约+1至约+300、约+1至约+290、约+1至约+280、约+1至约+270、约+1至约+260、约+1至约+250、约+1至约+240、约+1至约+230、约+1至约+220、约+1至约+210、约+1至约+200、约+1至约+190、约+1至约+180、约+1至约+170、约+1至约+160、约+1至约+150、约+1至约+140、约+1至约+130、约+1至约+120、约+1至约+110、约+1至约+100、约+1至约+90、约+1至约+80、约+1至约+70、约+1至约+60、约+1至约+50、约+1至约+40、约+1至约+30，或约+1至约+20的区域内。在一些方面中，ASO与目标部分互补，所述目标部分在相对于包括的外显子的5'剪接位点(或3'端)约+1至约+100、约+100至约+200、约+200至约+300、约+300至约+400，或约+400至约+500的区域内。
在一些实施方案中，ASO与OPA1前mRNA(例如，含OPA1 NMD外显子的前mRNA)的目标部分互补(并且与其结合)，所述目标部分在OPA1前mRNA(例如，含OPA1 NMD外显子的前mRNA)中包括的外显子的5'剪接位点(或3'端)上游(沿5'方向)(例如，以相对于5'剪接位点的负数指示方向)。在一些实施方案中，ASO与OPA1前mRNA(例如，含OPA1 NMD外显子的前mRNA)的目标部分互补，所述目标部分在相对于包括的外显子的5'剪接位点(或3'端)约-4至约-270的区域内。在一些实施方案中，ASO与OPA1前mRNA(例如，含OPA1NMD外显子的前mRNA)的目标部分互补，所述目标部分在相对于包括的外显子的5'剪接位点(或3'端)的核苷酸-1与-40,000之间的区域内。在一些方面中，ASO与目标部分互补，所述目标部分在相对于包括的外显子的5'剪接位点(或3'端)约-1至约-40,000、约-1至约-30,000、约-1至约-20,000、约-1至约-15,000、约-1至约-10,000、约-1至约-5,000、约-1至约-4,000、约-1至约-3,000、约-1至约-2,000、约-1至约-1,000、约-1至约-500、约-1至约-490、约-1至约-480、约-1至约-470、约-1至约-460、约-1至约-450、约-1至约-440、约-1至约-430、约-1至约-420、约-1至约-410、约-1至约-400、约-1至约-390、约-1至约-380、约-1至约-370、约-1至约-360、约-1至约-350、约-1至约-340、约-1至约-330、约-1至约-320、约-1至约-310、约-1至约-300、约-1至约-290、约-1至约-280、约-1至约-270、约-1至约-260、约-1至约-250、约-1至约-240、约-1至约-230、约-1至约-220、约-1至约-210、约-1至约-200、约-1至约-190、约-1至约-180、约-1至约-170、约-1至约-160、约-1至约-150、约-1至约-140、约-1至约-130、约-1至约-120、约-1至约-110、约-1至约-100、约-1至约-90、约-1至约-80、约-1至约-70、约-1至约-60、约-1至约-50、约-1至约-40、约-1至约-30，或约-1至约-20的区域内。
在一些实施方案中，ASO与OPA1前mRNA(例如，含OPA1 NMD外显子的前mRNA)的目标区域互补，所述目标区域在OPA1前mRNA中包括的外显子的3'剪接位点(或5'端)上游(沿5'方向)(例如，在以负数指示的方向上)。在一些实施方案中，ASO与OPA1前mRNA(例如，含OPA1NMD外显子的前mRNA)的目标部分互补，所述目标部分在相对于包括的外显子的3'剪接位点(或5'端)的约-1至约-500的区域内。在一些实施方案中，ASO与OPA1前mRNA的目标部分互补，所述目标部分在相对于包括的外显子的3'剪接位点-1至-40,000的区域内。在一些方面中，ASO与目标部分互补，所述目标部分在相对于包括的外显子的3'剪接位点约-1至约-40,000、约-1至约-30,000、-1至约-20,000、约-1至约-15,000、约-1至约-10,000、约-1至约-5,000、约-1至约-4,000、约-1至约-3,000、约-1至约-2,000、约-1至约-1,000、约-1至约-500、约-1至约-490、约-1至约-480、约-1至约-470、约-1至约-460、约-1至约-450、约-1至约-440、约-1至约-430、约-1至约-420、约-1至约-410、约-1至约-400、约-1至约-390、约-1至约-380、约-1至约-370、约-1至约-360、约-1至约-350、约-1至约-340、约-1至约-330、约-1至约-320、约-1至约-310、约-1至约-300、约-1至约-290、约-1至约-280、约-1至约-270、约-1至约-260、约-1至约-250、约-1至约-240、约-1至约-230、约-1至约-220、约-1至约-210、约-1至约-200、约-1至约-190、约-1至约-180、约-1至约-170、约-1至约-160、约-1至约-150、约-1至约-140、约-1至约-130、约-1至约-120、约-1至约-110、约-1至约-100、约-1至约-90、约-1至约-80、约-1至约-70、约-1至约-60、约-1至约-50、约-1至约-40、约-1至约-30，或约-1至约-20的区域内。在一些方面中，ASO与目标部分互补，所述目标部分在相对于包括的外显子的3'剪接位点约-1至约-100、约-100至约-200、约-200至约-300、约-300至约-400，或约-400至约-500的区域内。
在一些实施方案中，ASO与OPA1前mRNA(例如，含OPA1 NMD外显子的前mRNA)的目标区域互补，所述目标区域在OPA1前mRNA(例如，含OPA1 NMD外显子的前mRNA)中包括的外显子的3'剪接位点(或5'端)下游(沿3'方向)(例如，在以正数指示的方向上)。在一些实施方案中，ASO与OPA1前mRNA的目标部分互补，所述目标部分在相对于包括的外显子的3'剪接位点约+1至约+40,000的区域内。在一些方面中，ASO与目标部分互补，所述目标部分在相对于包括的外显子的3'剪接位点约+1至约+40,000、约+1至约+30,000、约+1至约+20,000、约+1至约+15,000、约+1至约+10,000、约+1至约+5,000、约+1至约+4,000、约+1至约+3,000、约+1至约+2,000、约+1至约+1,000、约+1至约+500、约+1至约+490、约+1至约+480、约+1至约+470、约+1至约+460、约+1至约+450、约+1至约+440、约+1至约+430、约+1至约+420、约+1至约+410、约+1至约+400、约+1至约+390、约+1至约+380、约+1至约+370、约+1至约+360、约+1至约+350、约+1至约+340、约+1至约+330、约+1至约+320、约+1至约+310、约+1至约+300、约+1至约+290、约+1至约+280、约+1至约+270、约+1至约+260、约+1至约+250、约+1至约+240、约+1至约+230、约+1至约+220、约+1至约+210、约+1至约+200、约+1至约+190、约+1至约+180、约+1至约+170、约+1至约+160、约+1至约+150、约+1至约+140、约+1至约+130、约+1至约+120、约+1至约+110、约+1至约+100、约+1至约+90、约+1至约+80、约+1至约+70、约+1至约+60、约+1至约+50、约+1至约+40、约+1至约+30，或约+1至约+20，或约+1至约+10的区域内。
在一些实施方案中，OPA1前mRNA(例如，含OPA1 NMD外显子的前mRNA)的目标部分在相对于包括的外显子的5'剪接位点(3'端)+100至相对于包括的外显子的3'剪接位点(5'端)-100的区域内。在一些实施方案中，含OPA1 NMD外显子的前mRNA的目标部分在NMD外显子内。在一些实施方案中，含OPA1 NMD外显子的前mRNA的目标部分包含假外显子和内含子边界。
ASO可具有适合于特异性结合以及有效增强剪接的任何长度。在一些实施方案中，ASO由8至50个核碱基组成。例如，ASO的长度可以是8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45或50个核碱基。在一些实施方案中，ASO由超过50个核碱基组成。在一些实施方案中，ASO的长度是8至50个核碱基、8至40个核碱基、8至35个核碱基、8至30个核碱基、8至25个核碱基、8至20个核碱基、8至15个核碱基、9至50个核碱基、9至40个核碱基、9至35个核碱基、9至30个核碱基、9至25个核碱基、9至20个核碱基、9至15个核碱基、10至50个核碱基、10至40个核碱基、10至35个核碱基、10至30个核碱基、10至25个核碱基、10至20个核碱基、10至15个核碱基、11至50个核碱基、11至40个核碱基、11至35个核碱基、11至30个核碱基、11至25个核碱基、11至20个核碱基、11至15个核碱基、12至50个核碱基、12至40个核碱基、12至35个核碱基、12至30个核碱基、12至25个核碱基、12至20个核碱基、12至15个核碱基、13至50个核碱基、13至40个核碱基、13至35个核碱基、13至30个核碱基、13至25个核碱基、13至20个核碱基、14至50个核碱基、14至40个核碱基、14至35个核碱基、14至30个核碱基、14至25个核碱基、14至20个核碱基、15至50个核碱基、15至40个核碱基、15至35个核碱基、15至30个核碱基、15至25个核碱基、15至20个核碱基、20至50个核碱基、20至40个核碱基、20至35个核碱基、20至30个核碱基、20至25个核碱基、25至50个核碱基、25至40个核碱基、25至35个核碱基，或25至30个核碱基。在一些实施方案中，ASO的长度是18个核苷酸。在一些实施方案中，ASO的长度是15个核苷酸。在一些实施方案中，ASO的长度是25个核苷酸。
在一些实施方案中，使用具有不同化学修饰(chemistries)但与前mRNA(例如，含NMD外显子的前mRNA)的相同目标部分互补的两个或更多个ASO。在一些实施方案中，使用与前mRNA(例如，含NMD外显子的前mRNA)的不同目标部分互补的两个或更多个ASO。
在一些实施方案中，本公开的反义寡核苷酸与一个或多个部分或缀合物，例如靶向部分或增强寡核苷酸的活性或细胞摄取的另一个缀合物化学连接。此类部分包括但不限于脂质部分，例如作为胆固醇部分、胆固醇基部分、脂族链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)、多胺或聚乙二醇链或金刚烷乙酸。包含亲脂性部分的寡核苷酸和制备方法已描述于所公开文献中。在实施方案中，反义寡核苷酸与以下部分缀合，包括但不限于：无碱基核苷酸、聚醚、多胺、聚酰胺、肽、碳水化合物(例如，N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-Ac-葡萄糖胺(GluNAc)或甘露糖(例如，甘露糖-6-磷酸))、脂质或多烃化合物。如本领域所理解以及文献中所描述，缀合物可例如使用接头在糖、碱基或磷酸基团上的若干位置中的任一个处与包含反义寡核苷酸的任何核苷酸中的一个或多个连接。接头可包括二价或三价支链接头。在实施方案中，缀合物连接至反义寡核苷酸的3'端。制备寡核苷酸缀合物的方法例如描述于以引用的方式并入本文的美国专利号8,450,467，“Carbohydrate conjugates asdelivery agents for oligonucleotides”中。
在一些实施方案中，由ASO靶向的核酸是表达于细胞(诸如真核细胞)中的OPA1前mRNA，例如含NMD外显子的前mRNA。在一些实施方案中，术语“细胞”可指细胞群。在一些实施方案中，细胞在受试者中。在一些实施方案中，细胞从受试者分离。在一些实施方案中，细胞是离体的。在一些实施方案中，细胞是疾患或疾病相关的细胞或细胞系。在一些实施方案中，细胞是体外的(例如，在细胞培养物中)。
药物组合物
包含所描述组合物的剂(例如，反义寡核苷酸)并且可用于所描述方法中的任一种的药物组合物或制剂可根据医药行业中众所周知以及所公开文献中描述的常规技术来制备。在实施方案中，用于治疗受试者的药物组合物或制剂包含有效量的如本文所描述的任何反义寡聚物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或酯。包含反义寡聚物的药物制剂可还包含药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
药学上可接受的盐适用于与人和低等动物的组织接触而无异常毒性、刺激、过敏反应等，并且具有合理的效益/风险比。参见例如S.M.Berge等人,J.PharmaceuticalSciences,66:1-19(1977)，其出于此目的以引用的方式并入本文。所述盐可在化合物的最终分离和纯化期间原位制备，或通过使游离碱形式与合适的有机酸反应而单独制备。药学上可接受的无毒性酸加成盐的实例是用无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸)或用有机酸(诸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)或通过使用其他所记载方法(诸如离子交换)形成的氨基的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐等。其他药学上可接受的盐包括(适当时)无毒性铵、季铵和使用抗衡离子(诸如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低碳烷基磺酸根和芳基磺酸根)形成的胺阳离子。
在一些实施方案中，组合物被配制成许多可能剂型中的任一种，诸如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。在实施方案中，组合物在水性、非水性或混合介质中被配制成混悬液。水性混悬液还可含有提高混悬液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或右旋糖酐。混悬液还可含有稳定剂。在实施方案中，本公开的药物制剂或组合物包括但不限于溶液、乳液、微乳液、泡沫体或含有脂质体的制剂(例如，阳离子脂质体或非阳离子脂质体)。
适当时并且如本领域技术人员众所周知或如所公开文献中所描述，本文所描述的药物组合物或制剂可包含一种或多种渗透促进剂、载剂、赋形剂或其他活性或非活性成分。在实施方案中，脂质体还包括空间稳定型脂质体，例如包含一个或多个特化脂质的脂质体。这些特化脂质产生循环寿命增加的脂质体。在实施方案中，空间稳定型脂质体包含一种或多种糖脂，或通过一种或多种亲水性聚合物(诸如聚乙二醇(PEG)部分)衍生。在一些实施方案中，药物制剂或组合物中包括表面活性剂。表面活性剂在药品、制剂和乳液中的用途是本领域众所周知的。在实施方案中，本公开采用渗透促进剂来实现反义寡核苷酸的有效递送，例如辅助跨细胞膜的扩散和/或增强亲脂性药物的渗透性。在一些实施方案中，渗透促进剂是表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂或非螯合性非表面活性剂。
在一些实施方案中，药物制剂包含多种反义寡核苷酸。在实施方案中，反义寡核苷酸与另一种药物或治疗剂组合施用。
组合疗法
在一些实施方案中，本公开中所公开的ASO可与一种或多种其他治疗剂组合使用。在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂可包含小分子。例如，一种或多种其他治疗剂可包含WO2016128343A1、WO2017053982A1、WO2016196386A1、WO201428459A1、WO201524876A2、WO2013119916A2和WO2014209841A2中所描述的小分子，所述文献以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂包含可用于纠正内含子保留的ASO。
受试者的治疗
本文所提供的组合物中的任一种可向个体施用。“个体”可与“受试者”或“患者”互换使用。个体可以是哺乳动物，例如人或动物，诸如非人灵长类动物、啮齿动物、兔、大鼠、小鼠、马、驴、山羊、猫、狗、母牛、猪或绵羊。在实施方案中，个体是人。在实施方案中，个体是胎儿、胚胎或儿童。在其他实施方案中，个体可以是另一种真核生物体，诸如植物。在一些实施方案中，本文所提供的组合物被施用于离体细胞。
在一些实施方案中，作为治疗疾病或病症的方法，向个体施用本文所提供的组合物。在一些实施方案中，个体患有遗传疾病，诸如本文所描述的疾病中的任一种。在一些实施方案中，个体具有患上疾病的风险，所述疾病诸如本文所描述的疾病中的任一种。在一些实施方案中，个体患上由蛋白质的量不足或蛋白质的活性不足引起的疾病或病症的风险增加。如果个体患上由蛋白质的量不足或蛋白质的活性不足引起的疾病或病症的“风险增加”，则所述方法涉及预防性或防治性治疗。例如，个体可由于家族病史而患上此类疾病或病症的风险增加。通常，患上此类疾病或病症的风险增加的个体受益于防治性治疗(例如，通过阻止或延迟疾病或病症的发作或进展)。在实施方案中，例如通过直接或间接地(例如，经由母亲)向胎儿施用ASO组合物而在子宫内治疗胎儿。
在一些情况下，本发明药物组合物和方法适用于治疗与OPA1缺乏相关的疾患或疾病。在一些情况下，本发明药物组合物和方法适用于治疗眼部疾病或疾患。在一些情况下，本发明药物组合物和方法适用于治疗1型视神经萎缩、常染色体显性视神经萎缩(ADOA)、ADOA叠加综合征；线粒体病症；青光眼；正常眼压青光眼；夏-马-图三氏病；线粒体功能失调；糖尿病性视网膜病变；年龄相关性黄斑变性；视网膜神经节细胞死亡；线粒体裂变介导的线粒体功能失调；进行性眼外肌麻痹；耳聋；共济失调；运动神经病；感觉神经病；肌病；贝尔综合征；脑部功能失调；脑病；周围神经病变；致死性婴儿线粒体脑肌病；肥厚性心肌病；痉挛性共济失调综合征；感觉运动周围神经病变；张力减退；胃肠道蠕动异常和吞咽困难；视神经萎缩；视神经萎缩叠加综合征；线粒体DNA耗竭综合征14；晚发型心肌病；糖尿病性心肌病；阿尔茨海默氏病；局灶节段性肾小球硬化；肾病；亨廷顿氏病；健康老化中的认知功能下降；朊病毒疾病；晚发型痴呆和帕金森氏症；线粒体肌病；利氏综合征；弗里德希氏共济失调；帕金森氏病；MELAS(线粒体脑肌病、乳酸中毒和中风样发作)；丙酮酸脱氢酶复合物缺乏症；慢性肾病；莱伯遗传性视神经病变；肥胖；年龄相关的全身性神经变性；骨胳肌萎缩；心脏和大脑缺血性损伤；或大量肝细胞凋亡。
常染色体显性视神经萎缩(ADOA)是最常见遗传性视神经病症并且特征在于视网膜神经节细胞损失。在一些情况下，65％-90％的ADOA病例由OPA1基因的一个等位基因中的突变引起。OPA1基因编码作为线粒体GTP酶的OPA1蛋白，在线粒体结构和功能中可具有关键维持作用。大部分OPA1突变可导致单倍剂量不足，使得正常OPA1蛋白水平降低约50％。全球大约30,000人中有1人受到影响，由于奠基者效应(founder effect)，丹麦的发病率较高，为约10,000人中有1人。ADOA可在生命的前十年内呈现。80％的ADOA患者在10岁之前有症状。所述疾病可导致进行性和不可逆视力丧失并且高达46％的患者被登记为法定失明。
在一些情况下，治疗剂包含寡核苷酸。在一些情况下，治疗剂包含载体(例如，病毒载体)，其表达结合至编码目标肽序列的前mRNA的目标区域的寡核苷酸。本文所提供的方法可适于使编码剂(例如，寡核苷酸)的载体与细胞接触，以使得所述剂与细胞中的前mRNA结合并调节前mRNA的加工。在一些情况下，病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)病毒载体、逆转录病毒载体或任何可应用的病毒载体。在一些情况下，治疗剂包含基因编辑工具，所述基因编辑工具被配制为修饰编码目标肽序列的基因，使得编码低效翻译区的基因区缺失。在一些情况下，基因编辑工具包含用于基于CRISPR-Cas9、TALEN、锌指(Zinc Finger)或其他可应用技术来进行基因编辑的载体，例如病毒载体。
用于施用本公开的ASO的合适途径可根据ASO需要递送至的细胞类型而变化。多个组织和器官受ADOA影响，其中眼睛是最显著受影响的组织。本公开的ASO可以胃肠外方式，例如通过玻璃体内注射、鞘内注射、脑室内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、皮下注射或静脉内注射向患者施用。
在实施方案中，反义寡核苷酸通过本领域已知的任何方法与一种或多种能够促进本公开反义寡核苷酸穿过血脑屏障的剂一起施用。例如，通过向肌肉组织中的运动神经元施用腺病毒载体进行的剂的递送描述于以引用的方式并入本文的美国专利号6,632,427，“Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons”中。载体向大脑(例如，纹状体、丘脑、海马区或黑质)的直接递送描述于例如以引用的方式并入本文的美国专利号6,756,523，“Adenovirus vectorsfor the transfer of foreign genesinto cells of the central nervous s ystem particularly in brain”中。
在一些实施方案中，反义寡核苷酸与提供所需药物或药效学特性的剂连接或缀合。在实施方案中，反义寡核苷酸与本领域已知用于促进跨血脑屏障的穿透或转运的物质(例如，针对转铁蛋白受体的抗体)偶联。在实施方案中，反义寡核苷酸与病毒载体连接，例如以使反义化合物更有效或增加跨血脑屏障的转运。在实施方案中，通过输注糖或氨基酸来辅助渗透性血脑屏障破坏，所述糖例如内消旋赤藓糖醇、木糖醇、D(+)半乳糖、D(+)乳糖、D(+)木糖、卫矛醇、肌醇、L(-)果糖、D(-)甘露醇、D(+)葡萄糖、D(+)***糖、D(-)***糖、纤维二糖、D(+)麦芽糖、D(+)棉子糖、L(+)鼠李糖、D(+)蜜二糖、D(-)核糖、福寿草醇、D(+)***糖醇、L(-)***糖醇、D(+)岩藻糖、L(-)岩藻糖、D(-)来苏糖、L(+)来苏糖和L(-)来苏糖；所述氨基酸例如谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸和牛磺酸。用于增强血脑屏障穿透的方法和材料描述于例如以下文献中：美国专利号9,193,969，“Compositions an d methods for selective delivery of oligonucleotidemolecules to spe cific neuron types”；美国专利号4,866,042，“Method for thedeliver y of genetic material across the blood brain barrier”；美国专利号6,294,520，“Material for passage through the blood-brain barrier”；和美国专利号6,936,589，“Parenteral delivery systems”，其各自以引用的方式并入本文。
在一些实施方案中，使用本领域已知和描述的任何方法来评价使用所述方法和组合物治疗的受试者的疾患改善。
鉴定诱导外显子跳读的额外ASO的方法
本公开的范围内还包括用于鉴定或确定诱导含OPA1 NMD外显子的前mRNA的外显子跳读的ASO的方法。例如，方法可包括鉴定或确定诱导含OPA1 NMD外显子的前mRNA的假外显子跳读的ASO。特异性杂交至前mRNA的目标区域内的不同核苷酸的ASO可被筛选以鉴定或确定提高目标内含子的剪接速率和/或程度的ASO。在一些实施方案中，ASO可阻断或干扰剪接抑制子/沉默子的结合位点。本领域已知的任何方法可用于鉴定(确定)当与外显子的目标区域杂交时产生所需效应(例如，假外显子跳读、蛋白质或功能性RNA产生)的ASO。这些方法还可用于鉴定通过与在侧接包括的外显子的内含子中，或在未包括的外显子中的目标区域结合而诱导包括的外显子的外显子跳读的ASO。下文提供了可使用的方法的实例。
可使用被设计以与前mRNA的目标区域杂交的ASO进行一轮筛选，称为ASO“步移”。例如，ASO步移中所用的ASO可从包括的外显子的3'剪接位点上游大约100个核苷酸(例如，位于目标/包括的外显子上游的外显子序列的一部分)至目标/包括的外显子的3'剪接位点下游大约100个核苷酸，和/或从包括的外显子的5'剪接位点上游的大约100个核苷酸至目标/包括的外显子的5'剪接位点下游大约100个核苷酸(例如，位于目标/包括的外显子下游的外显子序列的一部分)每5个核苷酸平铺一次。例如，长度是15个核苷酸的第一ASO可被设计以与相对于目标/包括的外显子的3'剪接位点+6至+20的核苷酸特异性杂交。第二ASO可被设计以与相对于目标/包括的外显子的3'剪接位点+11至+25的核苷酸特异性杂交。ASO被设计为跨越前mRNA的目标区域。在实施方案中，ASO可更紧密地平铺，例如每1、2、3或4个核苷酸。另外，ASO可从5'剪接位点下游100个核苷酸至3'剪接位点上游100个核苷酸平铺。在一些实施方案中，ASO可从3'剪接位点上游约1,160个核苷酸至5'剪接位点下游约500个核苷酸平铺。在一些实施方案中，ASO可从3'剪接位点上游约500个核苷酸至3'剪接位点下游约1,920个核苷酸平铺。
例如通过转染将一个或多个ASO，或对照ASO(具有乱序序列，预期不与目标区域杂交的序列的ASO)递送至表达目标前mRNA(例如，本文所述的含NMD外显子的前mRNA)的疾病相关细胞系中。可通过本领域已知的任何方法，例如通过逆转录酶(RT)-PCR，使用跨越剪接连接处的引物评估ASO中的每一个的外显子跳读效应，如实施例4中所述。相比于对照ASO处理的细胞，在ASO处理的细胞中，使用跨越含有包括的外显子(例如，包括NMD外显子的侧接外显子)的区域的引物产生的较长RT-PCR产物的减少或不存在指示目标NMD外显子的剪接已增强。在一些实施方案中，可使用本文所述的ASO提高外显子跳读效率(或剪接含有NMD外显子的内含子的剪接效率)、剪接与未剪接前mRNA的比、剪接速率或剪接程度。还可评估由目标前mRNA编码的蛋白质或功能性RNA的量，以确定每个ASO是否实现所需效应(例如，增强的功能性蛋白产生)。可使用本领域已知用于评估和/或量化蛋白质产生的任何方法，诸如蛋白质印迹、流式细胞术、免疫荧光显微镜术和ELISA。
可使用被设计以与前mRNA的目标区域杂交的ASO进行第二轮筛选，称为ASO“微步移”。ASO微步移中所用的ASO每1个核苷酸平铺一次，以进一步细化当与ASO杂交时产生外显子跳读(或NMD外显子的剪接增强)的前mRNA的核苷酸序列。
由ASO定义的促进目标内含子剪接的区域通过ASO“微步移”进行更详细地探究，所述微步移涉及间隔为1-nt步长的ASO，以及通常为18-25nt的较长ASO。
如上文针对ASO步移所描述，例如通过转染将一个或多个ASO，或对照ASO(具有乱序序列，预期不与目标区域杂交的序列的ASO)递送至表达目标前mRNA的疾病相关细胞系中来进行ASO微步移。可通过本领域已知的任何方法，例如通过逆转录酶(RT)-PCR，使用跨越NMD外显子的引物评估ASO中的每一个的剪接诱导效应，如本文所述(参见例如实施例4)。相比于对照ASO处理的细胞，在ASO处理的细胞中，使用跨越NMD外显子的引物产生的较长RT-PCR产物的减少或不存在指示外显子跳读(或含有NMD外显子的目标内含子的剪接)已增强。在一些实施方案中，可使用本文所述的ASO提高外显子跳读效率(或剪接含有NMD外显子的内含子的剪接效率)、剪接与未剪接前mRNA的比、剪接速率或剪接程度。还可评估由目标前mRNA编码的蛋白质或功能性RNA的量，以确定每个ASO是否实现所需效应(例如，增强的功能性蛋白产生)。可使用本领域已知用于评估和/或量化蛋白质产生的任何方法，诸如蛋白质印迹、流式细胞术、免疫荧光显微镜术和ELISA。
当与前mRNA的区域杂交时产生外显子跳读(或含有NMD外显子的内含子的剪接增强)和蛋白质产生增加的ASO可使用动物模型在体内测试，动物模型例如是其中全长人基因已被敲入的转基因小鼠模型中或人源化小鼠疾病模型。用于施用ASO的合适途径可根据需要递送ASO的疾病和/或细胞类型而变化。ASO可例如通过玻璃体内注射、鞘内注射、脑室内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、皮下注射或静脉内注射来施用。在施用之后，模型动物的细胞、组织和/或器官可被评估以通过例如通过本领域已知和本文所述的方法评价剪接(例如，效率、速率、程度)和蛋白质产生来确定ASO处理的效应。动物模型还可以是疾病或疾病严重性的任何表型或行为指示。
本公开的范围内还包括用于在NMD抑制剂，例如环己酰亚胺存在的情况下鉴定或验证NMD诱导外显子的方法。示例性方法提供于实施例2中。
特定实施方案(A)
实施方案A1.一种治疗有需要的受试者的1型视神经萎缩的方法，其通过增加所述受试者的细胞的目标蛋白或功能性RNA的表达，其中所述细胞具有含有无义介导的RNA衰变诱导外显子(NMD外显子mRNA)的mRNA，并且其中所述NMD外显子mRNA编码所述目标蛋白或功能性RNA，所述方法包括使所述受试者的所述细胞与治疗剂接触，所述治疗剂结合至编码所述目标蛋白或功能性RNA的所述NMD外显子mRNA的目标部分，由此将所述无义介导的RNA衰变诱导外显子从编码所述目标蛋白或功能性RNA的所述NMD外显子mRNA排除，从而增加编码所述目标蛋白或功能性RNA的mRNA的水平，以及增加所述目标蛋白或功能性RNA在所述受试者的所述细胞中的表达。
实施方案A2.如实施方案A1所述的方法，其中所述目标蛋白是OPA1。
实施方案A3.一种增加细胞的OPA1蛋白的表达的方法，所述细胞具有含有无义介导的RNA衰变诱导外显子(NMD外显子mRNA)并编码OPA1蛋白的mRNA，所述方法包括使所述细胞与剂接触，所述剂结合至编码OPA1蛋白的所述NMD外显子mRNA的目标部分，由此将所述无义介导的RNA衰变诱导外显子从编码OPA1蛋白的所述NMD外显子mRNA排除，从而增加编码OPA1蛋白的mRNA的水平，以及增加OPA1蛋白在所述细胞中的表达。
实施方案A4.如实施方案A1至A3中任一项所述的方法，其中所述无义介导的RNA衰变诱导外显子从编码所述目标蛋白或功能性RNA的所述NMD外显子mRNA被剪接掉。
实施方案A5.如实施方案A1至A4中任一项所述的方法，其中所述目标蛋白不包含由所述无义介导的RNA衰变诱导外显子编码的氨基酸序列。
实施方案A6.如实施方案A1至A5中任一项所述的方法，其中所述目标蛋白是全长目标蛋白。
实施方案A7.如实施方案A1至A6中任一项所述的方法，其中所述剂是与所述NMD外显子mRNA的目标部分互补的反义寡聚物(ASO)。
实施方案A8.如实施方案A1至A7中任一项所述的方法，其中所述mRNA是前mRNA。
实施方案A9.如实施方案A1至A8中任一项所述的方法，其中所述接触包括使所述治疗剂与所述mRNA接触，其中所述mRNA在所述细胞的细胞核中。
实施方案A10.如实施方案A1至A9中任一项所述的方法，其中所述目标蛋白或功能性RNA纠正所述受试者中的所述目标蛋白或功能性RNA的缺陷。
实施方案A11.如实施方案A1至A10中任一项所述的方法，其中所述细胞在患有由OPA1蛋白的量或活性不足引起的疾患的受试者体内或来自所述受试者。
实施方案A12.如实施方案A1至A11中任一项所述的方法，其中所述目标蛋白的量不足由所述目标蛋白的单倍剂量不足引起，其中所述受试者具有编码功能性目标蛋白的第一等位基因，和不产生所述目标蛋白的第二等位基因，或编码非功能性目标蛋白的第二等位基因，并且其中所述反义寡聚物结合至转录自所述第一等位基因的NMD外显子mRNA的目标部分。
实施方案A13.如实施方案A1至A11中任一项所述的方法，其中所述受试者患有由病症引起的疾患，所述病症由所述目标蛋白的量或功能不足产生，其中所述受试者具有
(a)第一突变等位基因，由所述第一突变等位基因
(i)产生的所述目标蛋白比来自野生型等位基因的产量低，
(ii)产生的所述目标蛋白是以呈相比于等效野生型蛋白具有降低功能的形式，或
(iii)未产生所述目标蛋白，和
(b)第二突变等位基因，由所述第二突变等位基因
(i)产生的所述目标蛋白比来自野生型等位基因的产量低，
(ii)产生的所述目标蛋白是以呈相比于等效野生型蛋白具有降低功能的形式，或
(iii)未产生所述目标蛋白，并且
其中当所述受试者具有第一突变等位基因(a)(iii)时，所述第二突变等位基因是(b)(i)或(b)(ii)，并且其中当所述受试者具有第二突变等位基因(b)(iii)时，所述第一突变等位基因是(a)(i)或(a)(ii)，并且其中所述NMD外显子mRNA转录自是(a)(i)或(a)(ii)的所述第一突变等位基因，和/或是(b)(i)或(b)(ii)的所述第二等位基因。
实施方案A14.如实施方案A13所述的方法，其中产生的所述目标蛋白质是以呈相比于等效野生型蛋白具有降低功能的形式。
实施方案A15.如实施方案A13所述的方法，其中产生的所述目标蛋白是以呈相比于等效野生型蛋白具有完全功能的形式。
实施方案A16.如实施方案A1至A15中任一项所述的方法，其中所述NMD外显子mRNA的所述目标部分在所述无义介导的RNA衰变诱导外显子内。
实施方案A17.如实施方案A1至A15中任一项所述的方法，其中所述NMD外显子mRNA的所述目标部分在所述无义介导的RNA衰变诱导外显子上游或下游。
实施方案A18.如实施方案A1至A17中任一项所述的方法，其中所述NMD外显子mRNA包含与SEQ ID NO:2或3具有至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。
实施方案A19.如实施方案A1至A17中任一项所述的方法，其中所述NMD外显子mRNA由与SEQ ID NO:1具有至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的基因序列编码。
实施方案A20.如实施方案A1至A17中任一项所述的方法，其中所述NMD外显子mRNA的目标部分包含与包含SEQ ID NO:2或3的至少8个邻接核酸的区域具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。
实施方案A21.如实施方案A1至A20中任一项所述的方法，其中所述剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述ASO包含与SEQ ID NO:2或3的至少8个邻接核酸至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％互补的序列。
实施方案A22.如实施方案A1至A15中任一项所述的方法，其中所述NMD外显子mRNA的所述目标部分在OPA1的所述无义介导的RNA衰变诱导外显子6x、OPA1的外显子7x或OPA1的外显子28x内。
实施方案A23.如实施方案A1至A15中任一项所述的方法，其中所述NMD外显子mRNA的所述目标部分在OPA1的所述无义介导的RNA衰变诱导外显子6x、OPA1的外显子7x或OPA1的外显子28x上游或下游。
实施方案A24.如实施方案A1至A15中任一项所述的方法，其中所述NMD外显子mRNA的所述目标部分包含OPA1的外显子6x、OPA1的外显子7x或OPA1的外显子28x的外显子-内含子连接处。
实施方案A25.如实施方案A1至A24中任一项所述的方法，其中产生的所述目标蛋白是全长蛋白或野生型蛋白。
实施方案A26.如实施方案A1至A25中任一项所述的方法，其中相比于对照细胞中产生的编码所述目标蛋白或功能性RNA的所述mRNA的总量，与所述反义寡聚物接触的所述细胞中产生的编码所述目标蛋白或功能性RNA的所述mRNA的总量增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍，或至少约10倍。
实施方案A27.如实施方案A1至A25中任一项所述的方法，其中相比于对照细胞中产生的编码所述目标蛋白或功能性RNA的所述mRNA的总量，与所述反义寡聚物接触的所述细胞中产生的编码所述目标蛋白或功能性RNA的所述mRNA的总量增加约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％。
实施方案A28.如实施方案A1至A25中任一项所述的方法，其中相比于由对照细胞产生的所述目标蛋白的总量，由与所述反义寡聚物接触的所述细胞产生的所述目标蛋白的总量增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍，或至少约10倍。
实施方案A29.如实施方案A1至A25中任一项所述的方法，其中相比于由对照细胞产生的所述目标蛋白的总量，由与所述反义寡聚物接触的所述细胞产生的所述目标蛋白的总量增加约20％至约300％、约50％至约300％、约100％至约300％、约150％至约300％、约20％至约50％、约20％至约100％、约20％至约150％、约20％至约200％、约20％至约250％、约50％至约100％、约50％至约150％、约50％至约200％、约50％至约250％、约100％至约150％、约100％至约200％、约100％至约250％、约150％至约200％、约150％至约250％、约200％至约250％、至少约10％、至少约20％、至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％或至少约300％。
实施方案A30.如实施方案A1至29中任一项所述的方法，其中所述剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物包含含有硫代磷酸酯键联或二氨基磷酸酯键联的主链修饰。
实施方案A31.如实施方案A1至A30中任一项所述的方法，其中所述剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物包含二氨基磷酸酯吗啉代、锁核酸、肽核酸、2'-O-甲基、2’-氟基或2’-O-甲氧基乙基部分。
实施方案A32.如实施方案A1至A31中任一项所述的方法，其中所述剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物包含至少一个修饰的糖部分。
实施方案A33.如实施方案A32所述的方法，其中每个糖部分是修饰的糖部分。
实施方案A34.如实施方案A1至A33中任一项所述的方法，其中所述剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物由8至50个核碱基、8至40个核碱基、8至35个核碱基、8至30个核碱基、8至25个核碱基、8至20个核碱基、8至15个核碱基、9至50个核碱基、9至40个核碱基、9至35个核碱基、9至30个核碱基、9至25个核碱基、9至20个核碱基、9至15个核碱基、10至50个核碱基、10至40个核碱基、10至35个核碱基、10至30个核碱基、10至25个核碱基、10至20个核碱基、10至15个核碱基、11至50个核碱基、11至40个核碱基、11至35个核碱基、11至30个核碱基、11至25个核碱基、11至20个核碱基、11至15个核碱基、12至50个核碱基、12至40个核碱基、12至35个核碱基、12至30个核碱基、12至25个核碱基、12至20个核碱基，或12至15个核碱基组成。
实施方案A35.如实施方案A1至A34中任一项所述的方法，其中所述剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物与编码所述蛋白质的所述NMD外显子mRNA的所述目标部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％互补。
实施方案A36.如实施方案A1至A35中任一项所述的方法，其中所述方法还包括评估OPA1 mRNA或蛋白表达。
实施方案A37.如实施方案A1至A36中任一项所述的方法，其中治疗1型视神经萎缩，并且其中所述反义寡聚物结合至OPA1 NMD外显子mRNA的目标部分，其中所述目标部分在SEQ ID NO:2或3内。
实施方案A38.如实施方案A1至A37中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
实施方案A39.如实施方案A1至A38中任一项所述的方法，其中所述受试者是非人动物。
实施方案A40.如实施方案A1至A39中任一项所述的方法，其中所述受试者是胎儿、胚胎或儿童。
实施方案A41.如实施方案A1至A40中任一项所述的方法，其中所述细胞是离体的。
实施方案A42.如实施方案A1至A41中任一项所述的方法，其中治疗剂通过鞘内注射、脑室内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、皮下注射或静脉内注射向所述受试者施用。
实施方案A43.如实施方案A1至A42中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用第二治疗剂。
实施方案A44.如实施方案A43所述的方法，其中所述第二治疗剂是小分子。
实施方案A45.如实施方案A43所述的方法，其中所述第二治疗剂是ASO。
实施方案A46.如实施方案A43至A45中任一项所述的方法，其中所述第二治疗剂纠正内含子保留。
实施方案A47.一种如实施方案A1至A46中任一项所述的方法中所用的反义寡聚物。
实施方案A48.一种反义寡聚物，其包含与包含SEQ ID NO:2或3的至少8个邻接核酸的区域具有至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。
实施方案A49.一种药物组合物，其包含如实施方案A47或A48所述的反义寡聚物和赋形剂。
实施方案A50.一种治疗有需要的受试者的方法，其包括向所述受试者施用如实施方案A49所述的药物组合物，其中所述施用通过玻璃体内注射、鞘内注射、脑室内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、皮下注射或静脉内注射。
实施方案A51.一种包含治疗剂的组合物，其用于增加细胞的目标蛋白或功能性RNA的表达以治疗有需要的受试者的与缺陷型蛋白或缺陷型功能性RNA相关的1型视神经萎缩的方法，其中所述缺陷型蛋白或缺陷型功能性RNA在所述受试者中的量或活性不足，其中所述目标蛋白是：
(a)所述缺陷型蛋白；或
(b)补偿蛋白，其在功能上加强或替换所述受试者中的所述缺陷型蛋白；
并且其中所述功能性RNA是：
(c)所述缺陷型RNA；或
(d)补偿功能性RNA，其在功能上加强或替换所述受试者中的所述缺陷型功能性RNA；
其中所述治疗剂增强所述无义介导的RNA衰变诱导外显子从编码所述目标蛋白或功能性RNA的所述NMD外显子mRNA的排除，从而增加所述受试者中的所述目标蛋白或所述功能性RNA的产量或活性。
实施方案A52.一种包含治疗剂的组合物，其用于治疗有需要的受试者的与OPA1蛋白相关的疾患的方法，所述方法包括增加所述受试者的细胞的OPA1蛋白的表达的步骤，其中所述细胞具有mRNA，其含有无义介导的RNA衰变诱导外显子(NMD外显子mRNA)并编码OPA1蛋白，所述方法包括使所述细胞与所述治疗剂接触，由此将所述无义介导的RNA衰变诱导外显子从编码OPA1蛋白的所述NMD外显子mRNA排除，从而增加编码OPA1蛋白的mRNA的水平，以及增加OPA1蛋白在所述受试者的所述细胞中的表达。
实施方案A53.如实施方案A52所述的组合物，其中所述疾患是疾病或病症。
实施方案A54.如实施方案A53所述的组合物，其中所述疾病或病症是1型视神经萎缩。
实施方案A55.如实施方案A52至54中任一项所述的组合物，其中所述OPA1蛋白和NMD外显子mRNA由OPA1基因编码。
实施方案A56.如实施方案A51至A55中任一项所述的组合物，其中所述无义介导的RNA衰变诱导外显子从编码所述OPA1蛋白的所述NMD外显子mRNA剪接掉。
实施方案A57.如实施方案A51至A56中任一项所述的组合物，其中所述OPA1蛋白不包含由所述无义介导的RNA衰变诱导外显子编码的氨基酸序列。
实施方案A58.如实施方案A51至A57中任一项所述的组合物，其中所述OPA1蛋白是全长OPA1蛋白。
实施方案A59.如实施方案A51至A58中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂是与所述NMD外显子mRNA的所述目标部分互补的反义寡聚物(ASO)。
实施方案A60.如实施方案A51至A59中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物靶向在所述无义介导的RNA衰变诱导外显子内的所述NMD外显子mRNA的一部分。
实施方案A61.如实施方案A51至A59中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物靶向在所述无义介导的RNA衰变诱导外显子上游或下游的所述NMD外显子mRNA的一部分。
实施方案A62.如实施方案A51至A61中任一项所述的组合物，其中所述目标蛋白是OPA1。
实施方案A63.如实施方案A62所述的组合物，其中所述NMD外显子mRNA包含与SEQID NO:2或3具有至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。
实施方案A64.如实施方案A62所述的组合物，其中所述NMD外显子mRNA由与SEQ IDNO:1具有至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的基因序列编码。
实施方案A65.如实施方案A62所述的组合物，其中所述NMD外显子mRNA的所述目标部分包含与包含SEQ ID NO:2或3的至少8个邻接核酸的区域具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。
实施方案A66.如实施方案A62至A65中任一项所述的组合物，其中所述NMD外显子mRNA的所述目标部分在OPA1的所述无义介导的RNA衰变诱导外显子6x、OPA1的外显子7x或OPA1的外显子28x内。
实施方案A67.如实施方案A62至A65中任一项所述的组合物，其中所述NMD外显子mRNA的所述目标部分在OPA1的所述无义介导的RNA衰变诱导外显子6x、OPA1的外显子7x或OPA1的外显子28x上游或下游。
实施方案A68.如实施方案A62至A65中任一项所述的组合物，其中所述NMD外显子mRNA的所述目标部分包含OPA1的外显子6x、OPA1的外显子7x或OPA1的外显子28x的外显子-内含子连接处。
实施方案A69.如实施方案A62至A68中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述ASO包含与包含SEQ ID NO:2或3的至少8个邻接核酸的区域至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％互补的序列。
实施方案A70.如实施方案A51至A69中任一项所述的组合物，其中编码所述目标蛋白或功能性RNA的所述mRNA是全长成熟mRNA或野生型成熟mRNA。
实施方案A71.如实施方案A51至A70中任一项所述的组合物，其中产生的所述目标蛋白是全长蛋白或野生型蛋白。
实施方案A72.如实施方案A51至A71中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物包含含有硫代磷酸酯键联或二氨基磷酸酯键联的主链修饰。
实施方案A73.如实施方案A51至A72中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物是反义寡核苷酸。
实施方案A74.如实施方案A51至A73中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物包含二氨基磷酸酯吗啉代、锁核酸、肽核酸、2'-O-甲基、2’-氟基或2’-O-甲氧基乙基部分。
实施方案A75.如实施方案A51至A74中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物包含至少一个修饰的糖部分。
实施方案A76.如实施方案A75所述的组合物，其中每个糖部分是修饰的糖部分。
实施方案A77.如实施方案A51至A76中任一项所述的组合物，其中所述治疗剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物由8至50个核碱基、8至40个核碱基、8至35个核碱基、8至30个核碱基、8至25个核碱基、8至20个核碱基、8至15个核碱基、9至50个核碱基、9至40个核碱基、9至35个核碱基、9至30个核碱基、9至25个核碱基、9至20个核碱基、9至15个核碱基、10至50个核碱基、10至40个核碱基、10至35个核碱基、10至30个核碱基、10至25个核碱基、10至20个核碱基、10至15个核碱基、11至50个核碱基、11至40个核碱基、11至35个核碱基、11至30个核碱基、11至25个核碱基、11至20个核碱基、11至15个核碱基、12至50个核碱基、12至40个核碱基、12至35个核碱基、12至30个核碱基、12至25个核碱基、12至20个核碱基，或12至15个核碱基组成。
实施方案A78.一种药物组合物，其包含如实施方案A51至A77所述的组合物中的任一种的治疗剂和赋形剂。
实施方案A79.一种治疗有需要的受试者的方法，其包括向所述受试者施用如实施方案A78所述的药物组合物，其中所述施用通过玻璃体内注射、鞘内注射、脑室内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、皮下注射或静脉内注射。
实施方案A80.如实施方案A51至A79中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用第二治疗剂。
实施方案A81.如实施方案A80所述的方法，其中所述第二治疗剂是小分子。
实施方案A82.如实施方案A80所述的方法，其中所述第二治疗剂是ASO。
实施方案A83.如实施方案A80至A82中任一项所述的方法，其中所述第二治疗剂纠正内含子保留。
实施方案A84.一种药物组合物，其包含：与OPA1 mRNA转录物的目标序列杂交的反义寡聚物，其中所述OPA1 mRNA转录物包含无义介导的RNA衰变诱导外显子，其中所述反义寡聚物诱导所述无义介导的RNA衰变诱导外显子从OPA1 mRNA转录物的排除；和药学上可接受的赋形剂。
实施方案A85.如实施方案A84所述的药物组合物，其中所述OPA1 mRNA转录物是OPA1 NMD外显子mRNA转录物。
实施方案A86.如实施方案A84或A85所述的药物组合物，其中所述NMD外显子mRNA的所述目标部分在OPA1的所述无义介导的RNA衰变诱导外显子6x、OPA1的外显子7x或OPA1的外显子28x内。
实施方案A87.如实施方案A84或A85所述的药物组合物，其中所述NMD外显子mRNA的所述目标部分在OPA1的所述无义介导的RNA衰变诱导外显子6x、OPA1的外显子7x或OPA1的外显子28x上游或下游。
实施方案A88.如实施方案A84或A85所述的药物组合物，其中所述NMD外显子mRNA的所述目标部分包含OPA1的外显子6x、OPA1的外显子7x或OPA1的外显子28x的外显子-内含子连接处。
实施方案A89.如实施方案A84至A88中任一项所述的药物组合物，其中所述OPA1NMD外显子mRNA转录物由与SEQ ID NO:1具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的基因序列编码。
实施方案A90.如实施方案A84或A88所述的药物组合物，其中所述OPA1 NMD外显子mRNA转录物包含与SEQ ID NO:2或3具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的序列。
实施方案A91.如实施方案A84所述的药物组合物，其中所述反义寡聚物包含含有硫代磷酸酯键联或二氨基磷酸酯键联的主链修饰。
实施方案A92.如实施方案A84所述的药物组合物，其中所述反义寡聚物是反义寡核苷酸。
实施方案A93.如实施方案A84所述的药物组合物，其中所述反义寡聚物包含二氨基磷酸酯吗啉代、锁核酸、肽核酸、2'-O-甲基、2’-氟基或2’-O-甲氧基乙基部分。
实施方案A94.如实施方案A84所述的药物组合物，其中所述反义寡聚物包含至少一个修饰的糖部分。
实施方案A95.如实施方案A84所述的药物组合物，其中所述反义寡聚物包含8至50个核碱基、8至40个核碱基、8至35个核碱基、8至30个核碱基、8至25个核碱基、8至20个核碱基、8至15个核碱基、9至50个核碱基、9至40个核碱基、9至35个核碱基、9至30个核碱基、9至25个核碱基、9至20个核碱基、9至15个核碱基、10至50个核碱基、10至40个核碱基、10至35个核碱基、10至30个核碱基、10至25个核碱基、10至20个核碱基、10至15个核碱基、11至50个核碱基、11至40个核碱基、11至35个核碱基、11至30个核碱基、11至25个核碱基、11至20个核碱基、11至15个核碱基、12至50个核碱基、12至40个核碱基、12至35个核碱基、12至30个核碱基、12至25个核碱基、12至20个核碱基，或12至15个核碱基。
实施方案A96.如实施方案A84或A85所述的药物组合物，其中所述反义寡聚物与所述OPA1 NMD外显子mRNA转录物的目标部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％互补。
实施方案A97.如实施方案A84或A85所述的药物组合物，其中所述OPA1 NMD外显子mRNA转录物的所述目标部分在SEQ ID NO:2或3内。
实施方案A98.如实施方案A84所述的药物组合物，其中所述反义寡聚物包含与包含SEQ ID NO:2或3的至少8个邻接核酸的区域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。
实施方案A99.如实施方案A84所述的药物组合物，其中反义寡聚物包含与包含SEQID NO:2或3的至少8个邻接核酸的区域相同的核苷酸序列。
实施方案A100.如实施方案A84至A99中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于玻璃体内注射、鞘内注射、脑室内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、皮下注射或静脉内注射。
实施方案A101.如实施方案A84至A100中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用第二治疗剂。
实施方案A102.如实施方案A101所述的方法，其中所述第二治疗剂是小分子。
实施方案A103.如实施方案A101所述的方法，其中所述第二治疗剂是ASO。
实施方案A104.如实施方案A101至A103中任一项所述的方法，其中所述第二治疗剂纠正内含子保留。
实施方案A105.一种诱导缺陷型OPA1 mRNA转录物的加工以促进去除无义介导的RNA衰变诱导外显子以产生编码OPA1蛋白的功能形式的完全加工的OPA1 mRNA转录物的方法，所述方法包括：
(a)使反义寡聚物与受试者的目标细胞接触；
(b)使所述反义寡聚物与所述缺陷型OPA1 mRNA转录物杂交，其中所述缺陷型OPA1mRNA转录物能够编码OPA1蛋白的功能形式并且包含至少一个无义介导的RNA衰变诱导外显子；
(c)从所述缺陷型OPA1 mRNA转录物去除所述至少一种无义介导的RNA衰变诱导外显子以产生编码OPA1蛋白的功能形式的所述完全加工的OPA1 mRNA转录物；以及
(d)从所述完全加工的OPA1 mRNA转录物翻译OPA1蛋白的功能形式。
实施方案A106.一种治疗患有由OPA1蛋白的量或活性不足引起的疾患的受试者的方法，其包括向所述受试者施用反义寡聚物，所述反义寡聚物包含与包含SEQ ID NO:2或3的至少8个邻接核酸的区域具有至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。
实施方案A107.一种治疗有需要的受试者的1型视神经萎缩的方法，其通过增加所述受试者的细胞对目标蛋白或功能性RNA的表达，其中所述细胞具有含有无义介导的RNA衰变诱导外显子的mRNA(NMD外显子mRNA)，并且其中所述NMD外显子mRNA编码所述目标蛋白或功能性RNA，所述方法包括使所述受试者的所述细胞与治疗剂接触，所述治疗剂调节编码所述目标蛋白或功能性RNA的所述NMD外显子mRNA的剪接，由此将所述无义介导的RNA衰变诱导外显子从编码所述目标蛋白或功能性RNA的所述NMD外显子mRNA排除，从而增加编码所述目标蛋白或功能性RNA的mRNA的水平，以及增加目标蛋白或功能性RNA在受试者的细胞中的表达。
实施方案A108.一种增加细胞的OPA1蛋白的表达的方法，所述细胞具有含有无义介导的RNA衰变诱导外显子(NMD外显子mRNA)并编码OPA1蛋白的mRNA，所述方法包括使所述细胞与剂接触，所述剂调节编码OPA1蛋白的所述NMD外显子mRNA的剪接，由此将所述无义介导的RNA衰变诱导外显子从编码OPA1蛋白的所述NMD外显子mRNA排除，从而增加编码OPA1蛋白的mRNA的水平，以及增加OPA1蛋白在所述细胞中的表达。
实施方案A109.如实施方案A107或A108所述的方法，其中所述剂
(a)结合至编码所述目标蛋白或功能性RNA的所述NMD外显子mRNA的目标部分；
(b)结合至剪接体的一种或多种组分；或
(c)(a)与(b)的组合。
实施方案B1.一种调节细胞的目标蛋白的表达的方法，所述细胞具有包含无义介导的RNA衰变诱导外显子(NMD外显子)并编码所述目标蛋白的mRNA，所述方法包括使治疗剂与所述细胞接触，由此所述治疗剂调节所述NMD外显子从所述mRNA的剪接，从而调节编码所述目标蛋白的经加工mRNA的水平，以及调节所述目标蛋白在所述细胞中的表达，其中所述目标蛋白选自由以下组成的组：OPA1蛋白。
实施方案B2.一种治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，其通过调节目标蛋白在所述受试者的细胞中的表达，所述方法包括：使所述受试者的所述细胞与治疗剂接触，所述治疗剂调节无义介导的mRNA衰变诱导外显子(NMD外显子)从所述细胞中的mRNA的剪接，其中所述mRNA包含所述NMD外显子并编码问问目标蛋白，从而调节编码所述目标蛋白的经加工mRNA的水平，以及调节所述目标蛋白在所述受试者的所述细胞中的表达，其中所述目标蛋白选自由以下组成的组：OPA1蛋白。
实施方案B3.如实施方案B1或B2所述的方法，其中所述治疗剂
(a)结合至编码所述目标蛋白的所述mRNA的目标部分；
(b)调节涉及所述NMD外显子的剪接的因子的结合；或
(c)(a)与(b)的组合。
实施方案B4.如实施方案B3所述的方法，其中所述剂干扰涉及所述NMD外显子的剪接的所述因子与所述目标部分的区域的结合。
实施方案B5.如实施方案B3或B4所述的方法，其中所述目标部分接近所述NMD外显子。
实施方案B6.如实施方案B3至B5中任一项所述的方法，其中所述目标部分在所述NMD外显子的5'端上游至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。
实施方案B7.如实施方案B3至B6中任一项所述的方法，其中所述目标部分在所述NMD外显子的5'端上游至少约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸、约40个核苷酸、约30个核苷酸、约20个核苷酸、约10个核苷酸、约5个核苷酸、约4个核苷酸、约2个核苷酸、约1个核苷酸处。
实施方案B8.如实施方案B3至B5中任一项所述的方法，其中所述目标部分在所述NMD外显子的3'端下游至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。
实施方案B9.如实施方案B3至B5或B8中任一项所述的方法，其中所述目标部分在所述NMD外显子的3'端下游至少约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸、约40个核苷酸、约30个核苷酸、约20个核苷酸、约10个核苷酸、约5个核苷酸、约4个核苷酸、约2个核苷酸、约1个核苷酸处。
实施方案B10.如实施方案B3至B5中任一项所述的方法，其中所述目标部分在选自由以下组成的组的基因组位点上游至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处：GRCh38/hg38:chr3193628509；和GRCh38/hg38:chr3 193603500。
实施方案B11.如实施方案B3至B5或B10中任一项所述的方法，其中所述目标部分在选自由以下组成的组的基因组位点上游约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处：GRCh38/hg38:chr3193628509；和GRCh38/hg38:chr3 193603500。
实施方案B12.如实施方案B3至B5中任一项所述的方法，其中所述目标部分在选自由以下组成的组的基因组位点下游至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处：GRCh38/hg38:chr3193628616；和GRCh38/hg38:chr3 193603557。
实施方案B13.如实施方案B3至B5或B12中任一项所述的方法，其中所述目标部分在选自由以下组成的组的基因组位点下游约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处：GRCh38/hg38:chr3193628616；和GRCh38/hg38:chr3 193603557。
实施方案B14.如实施方案B3至B13中任一项所述的方法，其中所述目标部分位于编码所述目标蛋白的所述mRNA的两个典型外显子区域之间的内含子区域中，并且其中所述内含子区域含有所述NMD外显子。
实施方案B15.如实施方案B3至B14中任一项所述的方法，其中所述目标部分与所述NMD外显子至少部分重叠。
实施方案B16.如实施方案B3至B15中任一项所述的方法，其中所述目标部分与在所述NMD外显子上游或下游的内含子至少部分重叠。
实施方案B17.如实施方案B3至B16中任一项所述的方法，其中所述目标部分包含5'NMD外显子-内含子连接处或3'NMD外显子-内含子连接处。
实施方案B18.如实施方案B3至B16中任一项所述的方法，其中所述目标部分在所述NMD外显子内。
实施方案B19.如实施方案B1至B18中任一项所述的方法，其中所述目标部分包含所述NMD外显子的约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续核苷酸。
实施方案B20.如实施方案B1至B19中任一项所述的方法，其中编码所述目标蛋白的所述mRNA包含与SEQ ID NO:4或5具有至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。
实施方案B21.如实施方案B1至B20中任一项所述的方法，其中编码实施目标蛋白的实施mRNA由与SEQ ID NO:1具有至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的基因序列编码。
实施方案B22.如实施方案B3至B21中任一项所述的方法，其中实施mRNA的实施目标部分包含与包含SEQ ID NO:4或5的至少8个邻接核酸的区域具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。
实施方案B23.如实施方案B1至B22中任一项所述的方法，其中所述剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述ASO包含与SEQ ID NO:4或5的至少8个邻接核酸至少约80％、85％、90％、95％、97％或100％互补的序列。
实施方案B24.如实施方案B3至B23中任一项所述的方法，其中所述mRNA的所述目标部分在选自由以下组成的组的所述无义介导的RNA衰变诱导外显子内：GRCh38/hg38:chr3 193628509 193628616；和GRCh38/hg38:chr3 193603500 193603557。
实施方案B25.如实施方案B3至B23中任一项所述的方法，其中所述mRNA的所述目标部分在选自由以下组成的组的所述无义介导的RNA衰变诱导外显子上游或下游：GRCh38/hg38:chr3 193628509 193628616；和GRCh38/hg38:chr3 193603500 193603557。
实施方案B26.如实施方案B3至B23中任一项所述的方法，其中所述mRNA的所述目标部分包含选自由以下组成的组的外显子的外显子-内含子连接处：GRCh38/hg38:chr3193628509 193628616；和GRCh38/hg38:chr3 193603500 193603557。
实施方案B27.如实施方案B1至B26中任一项所述的方法，其中产生的所述目标蛋白是全长蛋白或野生型蛋白。
实施方案B28.如实施方案B1至B27中任一项所述的方法，其中所述治疗剂促进所述NMD外显子从编码所述目标蛋白的所述前mRNA排除。
实施方案B29.如实施方案B28所述的方法，其中相比于对照细胞中从编码所述目标蛋白的所述前mRNA排除所述NMD外显子，与所述治疗剂接触的所述细胞中从编码所述目标蛋白的所述前mRNA排除所述NMD外显子增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍，或至少约10倍。
实施方案B30.如实施方案B28或B29所述的方法，其中所述治疗剂增加所述细胞中编码所述目标蛋白的所述经加工mRNA的水平。
实施方案B31.如实施方案B28至B30中任一项所述的方法，其中相比于对照细胞中编码所述目标蛋白的所述经加工mRNA的水平，与所述治疗剂接触的所述细胞中产生的编码所述目标蛋白的所述经加工mRNA的水平增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍，或至少约10倍。
实施方案B32.如实施方案B28至B31中任一项所述的方法，其中所述治疗剂增加所述目标蛋白在所述细胞中的表达。
实施方案B33.如实施方案B28至B32中任一项所述的方法，其中相比于对照细胞中产生的所述目标蛋白的水平，与所述治疗剂接触的所述细胞中产生的所述目标蛋白的水平增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
实施方案B34.如实施方案B2至B33中任一项所述的方法，其中所述疾病或疾患由所述目标蛋白中的功能丧失型突变诱导。
实施方案B35.如实施方案B34所述的方法，其中所述疾病或疾患与编码所述目标蛋白的基因的单倍剂量不足相关，并且其中所述受试者具有编码功能性目标蛋白的第一等位基因，和不产生或产生低水平所述目标蛋白的第二等位基因，或编码非功能性目标蛋白或部分功能性目标蛋白的第二等位基因。
实施方案B36.如实施方案B2至B35中任一项所述的方法，其中所述疾病或疾患选自由以下组成的组：1型视神经萎缩。
实施方案B37.如实施方案B34至B36中任一项所述的方法，其中所述治疗剂促进所述NMD外显子从编码所述目标蛋白的所述前mRNA排除并增加所述目标蛋白在所述细胞中的表达。
实施方案B38.如实施方案B1至B27中任一项所述的方法，其中所述治疗剂抑制所述NMD外显子从编码所述目标蛋白的所述前mRNA排除。
实施方案B39.如实施方案B38所述的方法，其中相比于对照细胞中从编码所述目标蛋白的所述前mRNA排除所述NMD外显子，与所述治疗剂接触的所述细胞中从编码所述目标蛋白的所述前mRNA排除所述NMD外显子减少约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍，或至少约10倍。
实施方案B40.如实施方案B38或B39所述的方法，其中所述治疗剂减少所述细胞中编码所述目标蛋白的所述经加工mRNA的水平。
实施方案B41.如实施方案B38至B40中任一项所述的方法，其中相比于对照细胞中编码所述目标蛋白的所述经加工mRNA的水平，与所述治疗剂接触的所述细胞中产生的编码所述目标蛋白的所述经加工mRNA的水平减少约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍，或至少约10倍。
实施方案B42.如实施方案B38至B41中任一项所述的方法，其中所述治疗剂减少所述目标蛋白在所述细胞中的表达。
实施方案B43.如实施方案B38至B42中任一项所述的方法，其中相比于对照细胞中产生的所述目标蛋白的水平，与所述治疗剂接触的所述细胞中产生的所述目标蛋白的水平减少约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
实施方案B44.如实施方案B2至B27或B38至B43中任一项所述的方法，其中所述疾病或疾患由所述目标蛋白中的功能获得型突变诱导。
实施方案B45.如实施方案B44所述的方法，其中所述受试者具有以增加的水平产生所述目标蛋白的等位基因，或编码在所述细胞中表现出增加的活性的突变型目标蛋白的等位基因。
实施方案B46.如实施方案B44或B45所述的方法，其中所述治疗剂抑制所述NMD外显子从编码所述目标蛋白的所述前mRNA排除并减少所述目标蛋白在所述细胞中的表达。
实施方案B47.如实施方案B1至B46中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物包含含有硫代磷酸酯键联或二氨基磷酸酯键联的主链修饰。
实施方案B48.如实施方案B1至B47中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物包含二氨基磷酸酯吗啉代、锁核酸、肽核酸、2'-O-甲基、2’-氟基或2’-O-甲氧基乙基部分。
实施方案B49.如实施方案B1至B48中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物包含至少一个修饰的糖部分。
实施方案B50.如实施方案B49所述的方法，其中每个糖部分是修饰的糖部分。
实施方案B51.如实施方案B1至B50中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物由8至50个核碱基、8至40个核碱基、8至35个核碱基、8至30个核碱基、8至25个核碱基、8至20个核碱基、8至15个核碱基、9至50个核碱基、9至40个核碱基、9至35个核碱基、9至30个核碱基、9至25个核碱基、9至20个核碱基、9至15个核碱基、10至50个核碱基、10至40个核碱基、10至35个核碱基、10至30个核碱基、10至25个核碱基、10至20个核碱基、10至15个核碱基、11至50个核碱基、11至40个核碱基、11至35个核碱基、11至30个核碱基、11至25个核碱基、11至20个核碱基、11至15个核碱基、12至50个核碱基、12至40个核碱基、12至35个核碱基、12至30个核碱基、12至25个核碱基、12至20个核碱基，或12至15个核碱基组成。
实施方案B52.如实施方案B3至B51中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物与所述mRNA的所述目标部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％互补。
实施方案B53.如实施方案B1至B52中任一项所述的方法，其中所述方法还包括评估所述目标蛋白的mRNA水平或表达水平。
实施方案B54.如实施方案B1至B53中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
实施方案B55.如实施方案B1至B53中任一项所述的方法，其中所述受试者是非人动物。
实施方案B56.如实施方案B2至B54中任一项所述的方法，其中所述受试者是胎儿、胚胎或儿童。
实施方案B57.如实施方案B1至B56中任一项所述的方法，其中所述细胞为离体的。
实施方案B58.如实施方案B2至B56中任一项所述的方法，其中所述治疗剂通过玻璃体内注射、鞘内注射、脑室内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、皮下注射、玻璃体内或静脉内注射向所述受试者施用。
实施方案B59.如实施方案B2至B56或B58中任一项所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用第二治疗剂。
实施方案B60.如实施方案B1至B59中任一项所述的方法，其中所述第二治疗剂是小分子。
实施方案B61.如实施方案B1至B59中任一项所述的方法，其中所述第二治疗剂是反义寡聚物。
实施方案B62.如实施方案B1至B61中任一项所述的方法，其中所述第二治疗剂纠正内含子保留。
实施方案B63.如实施方案B2至B62中任一项所述的方法，其中所述疾病或疾患是1型视神经萎缩。
另外的特定实施方案
实施方案1.一种调节具有前mRNA的细胞中的OPA1蛋白的表达的方法，所述前mRNA从OPA1基因转录并包含无义介导的RNA衰变诱导外显子(NMD外显子)，所述方法包括使剂或编码所述剂的载体与所述细胞接触，由此所述剂调节所述NMD外显子从所述前mRNA的剪接，从而调节从所述前mRNA加工的经加工mRNA的水平，以及调节所述细胞中的所述OPA1蛋白的表达，其中所述剂包含与选自由SEQ ID NO:6-275和280-299组成的组的序列具有至少80％序列同一性的反义寡聚物。
实施方案2.如实施方案1所述的方法，其中所述剂：
(a)结合至所述前mRNA的目标部分；
(b)调节涉及所述NMD外显子的剪接的因子的结合；或
(c)(a)与(b)的组合。
实施方案3.如实施方案2所述的方法，其中所述剂干扰涉及所述NMD外显子的剪接的所述因子与所述目标部分的区域的结合。
实施方案4.如实施方案2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分接近所述NMD外显子。
实施方案5.如实施方案2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述NMD外显子的5'端上游至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。
实施方案6.如实施方案2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述NMD外显子的5'端上游至少约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸、约40个核苷酸、约30个核苷酸、约20个核苷酸、约10个核苷酸、约5个核苷酸、约4个核苷酸、约2个核苷酸、约1个核苷酸处。
实施方案7.如实施方案2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述NMD外显子的3'端下游至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。
实施方案8.如实施方案2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述NMD外显子的3'端下游至少约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸、约40个核苷酸、约30个核苷酸、约20个核苷酸、约10个核苷酸、约5个核苷酸、约4个核苷酸、约2个核苷酸、约1个核苷酸处。
实施方案9.如实施方案2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193628509上游至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。
实施方案10.如实施方案2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193628509上游约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。
实施方案11.如实施方案2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193628616下游至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。
实施方案12.如实施方案2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193628616下游约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。
实施方案13.如实施方案2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分位于所述前mRNA的两个典型外显子区域之间的内含子区域中，并且其中所述内含子区域含有所述NMD外显子。
实施方案14.如实施方案2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分与所述NMD外显子至少部分重叠。
实施方案15.如实施方案2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分与在所述NMD外显子上游或下游的内含子至少部分重叠。
实施方案16.如实施方案2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分包含5'NMD外显子-内含子连接处或3'NMD外显子-内含子连接处。
实施方案17.如实施方案2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述NMD外显子内。
实施方案18.如实施方案2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分包含NMD外显子的约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续核苷酸。
实施方案19.如实施方案1至18中任一项所述的方法，其中所述NMD外显子包含与SEQ ID NO:279具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。
实施方案20.如实施方案1至18中任一项所述的方法，其中所述NMD外显子包含SEQID NO:279的序列。
实施方案21.如实施方案2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述无义介导的RNA衰变诱导外显子GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616内。
实施方案22.如实施方案2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述无义介导的RNA衰变诱导外显子GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616上游或下游。
实施方案23.如实施方案2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分包含外显子GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616的外显子-内含子连接处。
实施方案24.如实施方案1至23中任一项所述的方法，其中由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是全长OPA1蛋白或野生型OPA1蛋白。
实施方案25.如实施方案1至23中任一项所述的方法，其中由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是功能性OPA1蛋白。
实施方案26.如实施方案1至23中任一项所述的方法，其中相比于野生型OPA1蛋白，由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是至少部分功能性的。
实施方案27.如实施方案1至23中任一项所述的方法，其中相比于全长野生型OPA1蛋白，由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是至少部分功能性的。
实施方案28.如实施方案1至23或25至27中任一项所述的方法，其中由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是缺乏由与SEQ ID NO:277具有至少80％序列同一性的核酸序列编码的氨基酸序列的OPA1蛋白。
实施方案29.如实施方案1至28中任一项所述的方法，其中所述方法促进从所述前mRNA排除所述NMD外显子。
实施方案30.如实施方案29所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中从所述前mRNA排除所述NMD外显子增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
实施方案31.如实施方案1至30中任一项所述的方法，其中所述方法使得细胞中的经加工mRNA的水平增加。
实施方案32.如实施方案31所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，与所述剂接触的所述细胞中的所述经加工mRNA的水平增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
实施方案33.如实施方案1至32中任一项所述的方法，其中所述方法使得所述细胞中的所述OPA1蛋白的所述表达增加。
实施方案34.如实施方案33所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白的水平增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
实施方案35.如实施方案1至34中任一项所述的方法，其中所述剂包含与选自由SEQ ID NO:36、236、242、250、280-283、288和290-292组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。
实施方案36.如实施方案1至34中任一项所述的方法，其中所述剂还包含基因编辑分子。
实施方案37.如实施方案36所述的方法，其中所述基因编辑分子包含CRISPR-Cas9。
实施方案38.一种调节OPA1蛋白在具有从OPA1基因转录的前mRNA的细胞中的表达的方法，其中所述前mRNA包含编码外显子，所述方法包括使剂或编码所述剂的载体与所述细胞接触，藉此所述剂促进从前mRNA排除编码外显子，由增加所述细胞中从所述前mRNA加工并缺乏所述编码外显子的经加工mRNA的水平。
实施方案39.如实施方案38所述的方法，其中所述剂：
(a)结合至所述前mRNA的目标部分；
(b)调节涉及所述编码外显子的剪接的因子的结合；或
(c)(a)与(b)的组合。
实施方案40.如实施方案39所述的方法，其中所述剂干扰涉及所述编码外显子的剪接的所述因子与所述目标部分的区域的结合。
实施方案41.如实施方案39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分接近所述编码外显子。
实施方案42.如实施方案39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分位于紧邻所述编码外显子上游的内含子区域中。
实施方案43.如实施方案39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越所述编码外显子的5'端上游的100至50、90至50、80至50、70至50、60至50、60至40、60至30、60至20、60至10、49至1、39至1、29至1或19至1个核苷酸的区域内。
实施方案44.如实施方案39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越所述编码外显子的5'端上游的49至1、39至1、29至1或19至1个核苷酸的区域内。
实施方案45.如实施方案39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分位于紧邻编码外显子下游的内含子区域中。
实施方案46.如实施方案39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越所述编码外显子的3'端下游的1至49、1至39、1至29、1至19、10至60、20至60、30至60、40至60、50至60、50至70、50至80、50至90或50至100个核苷酸的区域内。
实施方案47.如实施方案39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越所述编码外显子的3'端下游的1至49、1至39、1至29或1至19个核苷酸的区域内。
实施方案48.如实施方案39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分与所述编码外显子至少部分重叠。
实施方案49.如实施方案39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分与紧邻所述编码外显子上游或紧邻编码外显子下游的内含子至少部分重叠。
实施方案50.如实施方案39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分包含5'编码外显子-内含子连接处或3'编码外显子-内含子连接处。
实施方案51.如实施方案39所述的方法，其中所述目标部分在所述前mRNA的所述编码外显子内。
实施方案52.如实施方案39至51中任一项所述的方法，其中所述编码外显子是选择性剪接外显子。
实施方案53.如实施方案39至52中任一项所述的方法，其中所述编码外显子包含与SEQ ID NO:277具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。
实施方案54.如实施方案39至52中任一项所述的方法，其中所述编码外显子包含SEQ ID NO:277。
实施方案55.如实施方案39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分紧邻编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202上游。
实施方案56.如实施方案39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193626092上游的49至1、39至1、29至1或19至1个核苷酸的区域内。
实施方案57.如实施方案39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分紧邻所述编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202下游。
实施方案58.如实施方案39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193626202下游的1至49、1至39、1至29或1至19个核苷酸的区域内。
实施方案59.如实施方案39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202内。
实施方案60.如实施方案39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分包含外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202的外显子-内含子连接处。
实施方案61.如实施方案39所述的方法，其中所述目标部分包含所述编码外显子的约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续核苷酸。
实施方案62.如实施方案39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分包含与包含SEQ ID NO:277的至少8个邻接核酸的区域具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。
实施方案63.如实施方案38至62中任一项所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中从所述前mRNA排除所述编码外显子增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
实施方案64.如实施方案38至63中任一项所述的方法，其中所述方法使得所述细胞中的所述OPA1蛋白的表达增加。
实施方案65.如实施方案64所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白的水平增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
实施方案66.如实施方案64所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白的水平增加至少约1.5倍。
实施方案67.如实施方案64至66中任一项所述的方法，其中由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是功能性OPA1蛋白。
实施方案68.如实施方案64至66中任一项所述的方法，其中相比于野生型OPA1蛋白，由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是至少部分功能性的。
实施方案69.如实施方案64至66中任一项所述的方法，其中相比于全长野生型OPA1蛋白，由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是至少部分功能性的。
实施方案70.如实施方案64至69中任一项所述的方法，其中与由含有所述编码外显子的对应mRNA编码的OPA1蛋白相比，由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白包含较少蛋白质裂解位点。
实施方案71.如实施方案38至70中任一项所述的方法，其中所述剂促进从所述前mRNA排除无义介导的RNA衰变诱导外显子(NMD外显子)。
实施方案72.如实施方案71的方法，其中所述NMD外显子包含与SEQ ID NO:279具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。
实施方案73.如实施方案71的方法，其中所述NMD外显子包含SEQ ID NO:279的序列。
实施方案74.如实施方案64至73中任一项所述的方法，其中与由含有所述编码外显子的对应mRNA编码的OPA1蛋白相比，由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白包含较少蛋白质裂解位点。
实施方案75.如实施方案38至74中任一项所述的方法，其中所述剂包含与选自由SEQ ID NO:227-242、250、280-283、288和290-292组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。
实施方案76.如实施方案38至74中任一项所述的方法，其中所述剂包含基因编辑分子。
实施方案77.如实施方案76的方法，其中所述基因编辑分子包含CRISPR-Cas9。
实施方案78.一种调节OPA1蛋白于具有从OPA1基因转录的前mRNA的细胞中的表达的方法，其中所述前mRNA包含编码外显子，所述方法包括使剂或编码所述剂的载体与所述细胞接触，
其中所述剂包含结合至以下各项的反义寡聚物：
(a)在紧邻所述前mRNA的所述编码外显子的5'端上游的内含子区域内的所述前mRNA的目标部分；或
(b)在紧邻所述前mRNA的所述编码外显子的3'端下游的内含子区域内的所述前mRNA的目标部分。
由此所述剂增加所述细胞中从所述前mRNA加工并含有所述编码外显子的经加工mRNA的水平。
实施方案79.如实施方案78所述的方法，其中所述编码外显子是选择性剪接外显子。
实施方案80.如实施方案78或79所述的方法，其中所述方法促进在所述细胞中的所述前mRNA的剪接期间，在所述经加工mRNA中包含所述编码外显子。
实施方案81.如实施方案78至80中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越所述编码外显子的5'端上游的100至50、100至60、100至70、100至80或100至90个核苷酸的区域内。
实施方案82.如实施方案78至80中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越所述编码外显子的3'端下游的40至100、50至100、60至100、70至100、80至100或90至100个核苷酸的区域内。
实施方案83.如实施方案78至80中任一项所述的方法，其中所述编码外显子包含与SEQ ID NO:277具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。
实施方案84.如实施方案78至80中任一项所述的方法，其中所述编码外显子包含SEQ ID NO:277。
实施方案85.如实施方案78至80中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越基因组位点GRCh38/hg38:chr3193626092上游的100至50、100至60、100至70、100至80或100至90个核苷酸的区域内。
实施方案86.如实施方案78至80中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越基因组位点GRCh38/hg38:chr3193626202下游的40至100、50至100、60至100、70至100、80至100或90至100个核苷酸的区域内。
实施方案87.如实施方案78至86中任一项所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中在所述经加工mRNA中包含所述编码外显子增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
实施方案88.如实施方案78至87中任一项所述的方法，其中所述剂包含与SEQ IDNO:267具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。
实施方案89.一种调节目标蛋白在具有从编码所述目标蛋白的基因转录的前mRNA的细胞中的表达的方法，其中所述前mRNA包含编码外显子和无义介导的RNA衰变诱导外显子(NMD外显子)，所述方法包括使剂或编码所述剂的载体与所述细胞接触，
其中所述剂促进从所述前mRNA排除所述编码外显子和所述NMD外显子两者，从而增加所述细胞中从所述前mRNA加工并缺乏所述NMD外显子和所述编码外显子两者的经加工mRNA的水平。
实施方案90.如实施方案89所述的方法，其中所述剂：
(a)结合至所述前mRNA的目标部分；
(b)调节涉及所述编码外显子、所述NMD外显子或两者的剪接的因子的结合；或
(c)(a)与(b)的组合。
实施方案91.如实施方案90所述的方法，其中所述剂干扰涉及所述编码外显子、所述NMD外显子或两者的剪接的所述因子与所述目标部分的区域的结合。
实施方案92.如实施方案89至91中任一项所述的方法，其中所述NMD外显子在邻近于所述编码外显子的内含子区域内。
实施方案93.如实施方案92所述的方法，其中所述NMD外显子在紧邻所述编码外显子上游的内含子区域内。
实施方案94.如实施方案92所述的方法，其中所述NMD外显子在紧邻所述编码外显子下游的内含子区域内。
实施方案95.如实施方案90至94中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分接近所述编码外显子。
实施方案96.如实施方案90至94中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分位于紧邻所述编码外显子上游的内含子区域中。
实施方案97.如实施方案90至94中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分位于紧邻所述编码外显子下游的内含子区域中。
实施方案98.如实施方案90至94中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分位于所述编码外显子内。
实施方案99.如实施方案90至94中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越所述编码外显子的5'端上游的49至1、39至1、29至1或19至1个核苷酸的区域内。
实施方案100.如实施方案90至94中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越所述编码外显子上游的100个核苷酸至所述编码外显子下游的100个核苷酸的区域内。
实施方案101.如实施方案89至100中任一项所述的方法，其中所述编码外显子是选择性剪接外显子。
实施方案102.如实施方案89至101中任一项所述的方法，其中所述编码外显子包含与SEQ ID NO:277具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。
实施方案103.如实施方案89至101中任一项所述的方法，其中所述编码外显子包含SEQ ID NO:277。
实施方案104.如实施方案90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分紧邻所述编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202上游。
实施方案105.如实施方案90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分紧邻所述编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202下游。
实施方案106.如实施方案90至94中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越GRCh38/hg38:chr3 193626092上游的49至1、39至1、29至1或19至1个核苷酸的区域内。
实施方案107.如实施方案90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193626092上游的100个核苷酸至基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193626202下游的100个核苷酸的区域内。
实施方案108.如实施方案90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202内。
实施方案109.如实施方案90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分包含所述编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202的外显子-内含子连接处。
实施方案110.如实施方案90所述的方法，其中所述目标部分包含编码外显子的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续核苷酸。
实施方案111.如实施方案90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分接近所述NMD外显子。
实施方案112.如实施方案90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分位于紧邻所述NMD外显子上游的内含子区域中。
实施方案113.如实施方案90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分位于紧邻所述NMD外显子下游的内含子区域中。
实施方案114.如实施方案90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分位于所述NMD外显子内。
实施方案115.如实施方案90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越所述NMD外显子上游的100个核苷酸至所述NMD外显子下游的100个核苷酸的区域内。
实施方案116.如实施方案89至115中任一项所述的方法，其中所述NMD外显子包含与SEQ ID NO:279具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。
实施方案117.如实施方案89所述的方法，其中所述NMD外显子包含SEQ ID NO:279。
实施方案118.如实施方案90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分紧邻所述NMD外显子GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616上游。
实施方案119.如实施方案90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分紧邻所述NMD外显子GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616下游。
实施方案120.如实施方案90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193628509上游的100个核苷酸至基因组位点GRCh38/hg38:chr3193628616下游的100个核苷酸的区域内。
实施方案121.如实施方案90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述NMD外显子GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616内。
实施方案122.如实施方案90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分包含所述NMD外显子GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616的外显子-内含子连接处。
实施方案123.如实施方案90所述的方法，其中所述目标部分包含所述NMD外显子的约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续核苷酸。
实施方案124.如实施方案89至123中任一项所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中从所述前mRNA排除所述编码外显子增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
实施方案125.如实施方案89至124中任一项所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中从所述前mRNA排除所述NMD外显子增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
实施方案126.如实施方案89至125中任一项所述的方法，其中所述剂使得细胞中的经加工mRNA的水平增加。
实施方案127.如实施方案126所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，与所述剂接触的所述细胞中的所述经加工mRNA的水平增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
实施方案128.如实施方案89至127中任一项所述的方法，其中所述方法使得所述细胞中的所述目标蛋白的表达增加。
实施方案129.如实施方案128所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中由所述经加工mRNA表达的所述目标蛋白的水平增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
实施方案130.如实施方案89至128中任一项所述的方法，其中所述目标蛋白是OPA1蛋白。
实施方案131.如实施方案130所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白的水平增加至少约1.5倍。
实施方案132.如实施方案130所述的方法，其中由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是功能性OPA1蛋白。
实施方案133.如实施方案130所述的方法，其中相比于野生型OPA1蛋白，由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是至少部分功能性的。
实施方案134.如实施方案130所述的方法，其中相比于全长野生型OPA1蛋白，由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是至少部分功能性的。
实施方案135.如实施方案89至127中任一项所述的方法，其中所述剂包含与选自由SEQ ID NO:236、242、250、280-283、288和290-292组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。
实施方案136.如实施方案78至135中任一项所述的方法，其中所述剂包含基因编辑分子。
实施方案137.如实施方案136的方法，其中所述基因编辑分子包含CRISPR-Cas9。
实施方案138.如实施方案1至75或78至135中任一项所述的方法，其中所述剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物包含含有硫代磷酸酯键联或二氨基磷酸酯键联的主链修饰。
实施方案139.如实施方案1至75或78至138中任一项所述的方法，其中所述剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物包含二氨基磷酸酯吗啉代、锁核酸、肽核酸、2'-O-甲基部分、2'-氟基部分或2'-O-甲氧基乙基部分。
实施方案140.如实施方案1至75或78至139中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物包含至少一个修饰的糖部分。
实施方案141.如实施方案140所述的方法，其中每个糖部分是修饰的糖部分。
实施方案142.如实施方案1至75或78至141中任一项所述的方法，其中所述剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物由8至50个核碱基、8至40个核碱基、8至35个核碱基、8至30个核碱基、8至25个核碱基、8至20个核碱基、8至15个核碱基、9至50个核碱基、9至40个核碱基、9至35个核碱基、9至30个核碱基、9至25个核碱基、9至20个核碱基、9至15个核碱基、10至50个核碱基、10至40个核碱基、10至35个核碱基、10至30个核碱基、10至25个核碱基、10至20个核碱基、10至15个核碱基、11至50个核碱基、11至40个核碱基、11至35个核碱基、11至30个核碱基、11至25个核碱基、11至20个核碱基、11至15个核碱基、12至50个核碱基、12至40个核碱基、12至35个核碱基、12至30个核碱基、12至25个核碱基、12至20个核碱基，或12至15个核碱基组成。
实施方案143.如实施方案1至142中任一项所述的方法，其中所述载体包括编码所述剂的病毒载体。
实施方案144.如实施方案143所述的方法，其中所述病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)病毒载体或逆转录病毒载体。
实施方案145.如实施方案1至144中任一项所述的方法，其中所述方法还包括评估所述OPA1蛋白的mRNA水平或表达水平。
实施方案146.如实施方案1至145中任一项所述的方法，其中所述剂是治疗剂。
实施方案147.一种药物组合物，其包含如实施方案146所述的治疗剂或编码如实施方案146所述的治疗剂的载体，和药学上可接受的赋形剂。
实施方案148.一种药物组合物，其包含治疗剂或编码治疗剂的载体，和药学上可接受的赋形剂，其中所述治疗剂包含与选自由SEQ ID NO:6-275和280-299组成的组的序列具有至少80％序列同一性的反义寡聚物。
实施方案149.如实施方案148所述的药物组合物，其中所述治疗剂包含与选自由SEQ ID NO:227-242和250组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。
实施方案150.如实施方案148所述的药物组合物，其中所述治疗剂包含与SEQ IDNO:267具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。
实施方案151.如实施方案148所述的药物组合物，其中所述治疗剂包含与选自由SEQ ID NO:36、236、242、250和280-299组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。
实施方案152.一种组合物，其包含与选自由SEQ ID NO:6-275和280-299组成的组的序列具有至少80％序列同一性的反义寡聚物，其中所述反义寡聚物包含主链修饰、糖部分修饰或它们的组合。
实施方案153.如实施方案152所述的组合物，其中所述反义寡聚物与选自由SEQID NO:227-242和250组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性。
实施方案154.如实施方案152所述的组合物，其中所述反义寡聚物与SEQ ID NO:267具有至少80％、至少90％或100％序列同一性。
实施方案155.如实施方案152所述的组合物，其中所述反义寡聚物与选自由SEQID NO:36、236、242、250和280-299组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性。
实施方案156.一种药物组合物，其包含治疗剂或编码所述治疗剂的载体和药学上可接受的赋形剂，其中所述治疗剂促进从前mRNA排除编码外显子，从而增加细胞中从所述前mRNA加工并缺乏所述编码外显子的经加工mRNA的水平，其中所述前mRNA从OPA1基因转录并包含所述编码外显子。
实施方案157.一种药物组合物，其包含治疗剂或编码所述治疗剂的载体和药学上可接受的赋形剂，其中所述治疗剂包含结合至从细胞中的OPA1基因转录的前mRNA的反义寡聚物，其中所述反义寡聚物结合至：
(a)在紧邻所述前mRNA的所述编码外显子的5'端上游的内含子区域内的所述前mRNA的目标部分；或
(b)在紧邻所述前mRNA的所述编码外显子的3'端下游的内含子区域内的所述前mRNA的目标部分；
由此所述治疗剂增加所述细胞中从所述前mRNA加工并含有所述编码外显子的经加工mRNA的水平。
实施方案158.一种药物组合物，其包含治疗剂或编码所述治疗剂的载体和药学上可接受的赋形剂，其中所述治疗剂促进从前mRNA排除编码外显子和无义介导的RNA衰变诱导外显子(NMD外显子)两者，从而增加细胞中从所述前mRNA加工并缺乏所述编码外显子和所述NMD外显子的经加工mRNA的水平，其中所述前mRNA从所述细胞中的OPA1基因转录并包含所述编码外显子和所述NMD外显子。
实施方案159.如实施方案147至158中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于脑室内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、鞘内注射、皮下注射、经口施用、滑膜注射、玻璃体内施用、视网膜下注射、局部应用、植入或静脉内注射。
实施方案160.如实施方案147至158中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于玻璃体内注射。
实施方案161.如实施方案147至160中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含第二治疗剂。
实施方案162.如实施方案161所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂包含小分子。
实施方案163.如实施方案161所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂包含反义寡聚物。
实施方案164.如实施方案161所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂纠正内含子保留。
实施方案165.如实施方案147至160中任一项所述的药物组合物或组合物，其中所述反义寡聚物选自由化合物ID NO:1-303组成的组。
实施方案166.一种通过调节OPA1蛋白在有需要的受试者的细胞中的表达来治疗所述受试者的疾病或疾患或降低发展出所述疾病或疾患的可能性的方法，其包括使所述受试者的细胞与如实施方案147至165中任一项所述的治疗剂接触。
实施方案167.如实施方案166所述的方法，其中所述疾病或疾患与OPA1基因中的功能丧失型突变相关。
实施方案168.如实施方案166或167所述的方法，其中所述疾病或疾患与所述OPA1基因的单倍剂量不足相关，并且其中所述受试者具有编码功能性OPA1蛋白的第一等位基因，和不产生或产生低水平所述OPA1蛋白的第二等位基因，或编码非功能性OPA1蛋白或部分功能性OPA1蛋白的第二等位基因。
实施方案169.如实施方案166至168中任一项所述的方法，其中所述疾病或疾患包括眼部疾病或疾患。
实施方案170.如实施方案166至168中任一项所述的方法，其中所述疾病或疾患包括ADOA叠加综合征；线粒体病症；青光眼；正常眼压青光眼；夏-马-图三氏病；线粒体功能失调；糖尿病性视网膜病变；年龄相关性黄斑变性；视网膜神经节细胞死亡；线粒体裂变介导的线粒体功能失调；进行性眼外肌麻痹；耳聋；共济失调；运动神经病；感觉神经病；肌病；贝尔综合征；脑部功能失调；脑病；周围神经病变；致死性婴儿线粒体脑肌病；肥厚性心肌病；痉挛性共济失调综合征；感觉运动周围神经病变；张力减退；胃肠道蠕动异常和吞咽困难；视神经萎缩；视神经萎缩叠加综合征；线粒体DNA耗竭综合征14；晚发型心肌病；糖尿病性心肌病；阿尔茨海默氏病；局灶节段性肾小球硬化；肾病；亨廷顿氏病；健康老化中的认知功能下降；朊病毒疾病；晚发型痴呆和帕金森氏症；线粒体肌病；利氏综合征；弗里德希氏共济失调；帕金森氏病；MELAS(线粒体脑肌病、乳酸中毒和中风样发作)；丙酮酸脱氢酶复合物缺乏症；慢性肾病；莱伯遗传性视神经病变；肥胖；年龄相关的全身性神经变性；骨胳肌萎缩；心脏和大脑缺血性损伤；或大量肝细胞凋亡。
实施方案171.如实施方案166至168中任一项所述的方法，其中所述疾病或疾患包括1型视神经萎缩。
实施方案172.如实施方案166至168中任一项所述的方法，其中所述疾病或疾患包括常染色体显性视神经萎缩(ADOA)。
实施方案173.如实施方案166或167所述的方法，其中所述疾病或疾患与OPA1基因的常染色体隐性突变相关，其中所述受试者具有第一等位基因，由所述第一等位基因：
(i)不产生或产生比野生型等位基因低水平的OPA1蛋白；或
(ii)产生的所述OPA1蛋白相比于野生型等位基因是非功能性或部分功能性的，和
第二等位基因，由所述第二等位基因：
(iii)产生比于野生型等位基因低水平的所述OPA1蛋白，并且产生的所述OPA1蛋白相比于野生型等位基因是至少部分功能性的；或
(iv)产生的所述OPA1蛋白相比于野生型等位基因是部分功能性的。
实施方案174.如实施方案166至173中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
实施方案175.如实施方案166至173中任一项所述的方法，其中所述受试者是非人动物。
实施方案176.如实施方案166至173中任一项所述的方法，其中所述受试者是胎儿、胚胎或儿童。
实施方案177.如实施方案166至173中任一项所述的方法，其中所述细胞是离体的。
实施方案178.如实施方案166至173中任一项所述的方法，其中所述治疗剂通过脑室内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、鞘内注射、皮下注射、经口施用、滑膜注射、玻璃体内施用、视网膜下注射、局部应用、植入或静脉内注射来施用。
实施方案179.如实施方案166至173中任一项所述的方法，其中所述治疗剂通过玻璃体内注射来施用。
实施方案180.如实施方案166至179中任一项所述的方法，其中所述方法治疗所述疾病或疾患。
实施例
将通过以下实施例更确切地说明本公开。然而，应理解，本公开不以任何方式受这些实施例限制。
实施例1：通过RNAseq使用下一代测序鉴定转录物中的NMD诱导外显子包含事件
使用下一代测序进行全转录组鸟枪法测序以展现由本文所述的基因产生的转录物的快照，从而鉴定NMD外显子包含事件。出于此目的，来自人细胞的细胞核和细胞质部分的polyA+RNA被分离并使用Illumina的TruSeq Stranded mRNA library Prep Kit构建cDNA库。所述库经双端测序，产生映射到人类基因组的100个核苷酸的读段(2009年2月，GRCh37/hg19组装体)。图2和图3描绘了各种基因中的不同示例性无义介导的mRNA衰变(NMD)诱导外显子的鉴定。
示例性基因和内含子序列总结于表1和表2中(SEQ ID NO指示由Gene ID No表示的对应核苷酸序列)。每个内含子的序列总结于表3和表4中。表5列出了本公开的OPA1反义寡聚物的序列。
表1.示例性目标基因序列的清单。
Figure BDA0004049378390001381
表2.示例性目标基因序列的清单。
Figure BDA0004049378390001382
表3.前mRNA转录物中的示例性目标内含子的序列。
Figure BDA0004049378390001383
/>
Figure BDA0004049378390001391
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Figure BDA0004049378390001401
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Figure BDA0004049378390001411
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Figure BDA0004049378390001421
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Figure BDA0004049378390001431
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Figure BDA0004049378390001441
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Figure BDA0004049378390001451
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Figure BDA0004049378390001461
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Figure BDA0004049378390001471
/>
Figure BDA0004049378390001481
表4.示例性目标基因内含子序列
Figure BDA0004049378390001482
/>
Figure BDA0004049378390001491
/>
Figure BDA0004049378390001501
/>
Figure BDA0004049378390001511
/>
Figure BDA0004049378390001521
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Figure BDA0004049378390001531
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Figure BDA0004049378390001541
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Figure BDA0004049378390001551
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Figure BDA0004049378390001561
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Figure BDA0004049378390001571
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Figure BDA0004049378390001581
/>
Figure BDA0004049378390001591
实施例2：经由环己酰亚胺处理确认NMD外显子。
使用来自DMSO处理或嘌呤霉素或环己酰亚胺处理的人细胞的细胞质RNA和外显子中的引物进行的RT-PCR分析用于确认对应于NMD诱导外显子的条带的存在。通过测序确认产物的身份。对条带进行光密度分析以计算总转录物的NMD外显子包含百分比。用环己酰亚胺或嘌呤霉素处理细胞以抑制NMD可使得对应于细胞质部分中的NMD诱导外显子的产物增加。图4描绘了分别使用环己酰亚胺或嘌呤霉素处理对OPA1基因转录物中的示例性NMD外显子的确认。
实施例3：NMD外显子区域ASO步移。
使用2'-MOE ASO，PS主链，对靶向紧邻3'剪接位点上游、跨3'剪接位点、NMD外显子、跨5'剪接位点和5'剪接位点下游的序列的NMD外显子区域进行ASO步移。ASO经设计为通过一次位移5个核苷酸而覆盖这些区。图5描绘示例性OPA1 NMD外显子区域的ASO步移。
实施例4：通过RT-PCR评价的NMD外显子区域ASO步移。
通过RT-PCR评价ASO步移序列。如本文所述，使用脂质转染胺(Lipofectamine)RNAiMax，在对照ASO处理(Ctrl)下，或在靶向OPA1 NMD外显子区域的2'-MOE ASO下转染HEK293细胞。对应于OPA1 mRNA的产物被量化并归一化为RPL32内部对照，并且绘制相对于对照的倍数变化。图6描绘了经由沿示例性NMD外显子区域的各种示例性ASO步移的TaqManqPCR进行的评价。通过Taqman qPCR使用跨越外显子7和外显子8的探针，在不存在环己酰亚胺的情况下用80nM示例性ASO处理后24小时，用HEK293细胞进行OPA1 mRNA的量的测量。
实施例5：通过RT-qPCR评价的NMD外显子区域ASO微步移。
通过RT-PCR评价ASO微步移序列(跨外显子7x)。如本文所述，使用脂质转染胺RNAiMax，在对照ASO处理(Ctrl)下，或在靶向OPA1NMD外显子区域的2'-MOE ASO下转染HEK293细胞。对应于NMD外显子包含和全长的产物被量化，并且绘制NMD外显子包含百分比。图7描绘了沿示例性NMD外显子区域的各种示例性ASO步移的评估。通过Taqman qPCR使用跨越外显子7和外显子8的探针，在不存在环己酰亚胺的情况下用80nM示例性ASO转染后24小时，用HEK293细胞进行OPA1 mRNA的量的测量(图7的上图)。将qPCR扩增结果归一化为RPL32，并且绘制为相对于对照的倍数变化。通过基于RT-PCR使用跨越外显子7和外显子8的探针量化外显子7x包含来进行外显子7x包含的测量(图7的下图)。
实施例6：CXH处理的细胞中的所选ASO的剂量依赖性效应。
PAGE可用于显示出通过RNAiMAX转染在小鼠或人细胞中以30nM、80nM和200nM浓度用模拟处理(Sham，仅RNAiMAX)或用靶向NMD外显子的2'-MOE ASO处理的SYBR安全染色RT-PCR产物。对应于NMD外显子包含和全长的产物被量化，并且可绘制NMD外显子包含百分比。全长产物还可归一化为HPRT内部对照，并且可绘制相对于Sham的倍数变化。
实施例7：所选ASO的玻璃体内(IVT)注射。
来自以10mM浓度注射PBS(1μL)(-)或注射ASO或Cep290(阴性对照ASO；Gerard等人,Mol.Ther.Nuc.Ac.,2015)2'-MOE ASO(1μL)(+)的小鼠的SYBR安全染色RT-PCR产物的PAGE。对应于NMD外显子包含和全长的产物被量化，并且可绘制NMD外显子包含百分比。全长产物可归一化为GAPDH内部对照，并且可绘制ASO注射相对于PBS注射的倍数变化。
实施例8：所选ASO的脑室内(ICV)注射。
来自未注射(-，无ASO对照)或注射300μg Cep290(阴性对照ASO；Gerard等人,Mol.Ther.Nuc.Ac.,2015)、2'-MOE ASO的大脑的小鼠SYBR安全染色RT-PCR产物的PAGE。对应于NMD外显子包含和全长的产物可被量化，并且可绘制NMD外显子包含百分比。可使用跨越NMD外显子连接处的两种不同探针进行Taqman PCR，并且产物可归一化为GAPDH内部对照并且可绘制ASO注射相对于Cep290注射大脑的倍数变化。
实施例9：OPA1非生产性剪接事件鉴定和验证。
在OPA1基因中鉴定新型无义介导的衰变(NMD)外显子包含事件(外显子X)，其导致引入提前终止密码子(PTC)，从而导致非生产性mRNA转录物被NMD降解，如图1C中所示。由于NMD是翻译依赖性过程，因此使用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)来评价事件的真实丰度。图8示出了HEK293细胞中含有NMD外显子的OPA1转录物随着CHX剂量增加而增加。其他眼细胞系也验证了NMD外显子的存在(ARPE-19，Y79)。
实施例10：OPA1 NMD事件在灵长类动物眼睛中是保守的。
图9A示出了对于右眼(OD)和左眼(OS)，在产后第P93天(3个月)和产后第P942天(2.6年)时，来自西非绿猴(绿猴)的眼后段的逆转录PCR数据。图9B示出了在3个月和2.6年(N＝1/岁)时的NMD外显子丰度的量化。数据表示每只动物的右眼和左眼值的平均值。鉴于假定NMD在组织中具有活性，事件的丰度在体内可能更高。
实施例11：OPA1反义寡核苷酸在体外减少非生产性剪接并增加生产性OPA1 mRNA水平。
使用脂质转染胺RNAiMax作为转染剂，以80nM剂量将示例性反义寡聚物(ASO)转染至HEK293细胞中。为评估对NMD外显子的影响，在转染后21小时用CHX(50μg/ml，3小时)处理细胞。分离RNA以使用跨越外显子7和外显子8的探针进行RT-PCR，如图10A中所示，并且在图10B中量化。为评估生产性OPA1 mRNA表达的水平，非环己酰亚胺处理的细胞用于使用跨越外显子23和外显子24的探针进行Taqman qPCR，并且将OPA1的mRNA表达归一化为RPL32，如图11中所示。箭头突出显示减少非生产性剪接并增加OPA1mRNA表达至少20％的ASO。其中，ASO-14产生的OPA1 mRNA增加最多(30％)。
实施例12：ASO-14在体外以剂量依赖性方式减少非生产性OPA1 mRNA并增加OPA1表达。
用不同剂量的ASO-14或非靶向(NT)ASO转染HEK293细胞。类似于实施例11，RNA在转染之后24小时分离并分析对非生产性OPA1 mRNA(图12A)和OPA1 mRNA表达(图12B)的影响。对于蛋白质分析，在转染之后48小时用RIPA缓冲液溶解细胞，并且用靶向OPA1和β-肌动蛋白的抗体探测蛋白质印迹，如图12C中所示。多个条带对应于OPA1的不同同工型。数据表示三个独立实验的平均值(*P<0.05，根据单因素ANOVA，相比于“无ASO”组)。非靶向ASO靶向无关基因。
实施例13：ASO-14增加OPA1单倍剂量不足(OPA1+/-)细胞系中的OPA1表达。
使用CRISPR-Cas9基因编辑产生OPA1单倍剂量不足(OPA1+/-)HEK293细胞。与ADOA患者细胞类似，OPA1+/-HEK293细胞显示出OPA1+/+细胞中观察到的mRNA和蛋白质水平的大约50％(图13A)。如图13B中所指示，用不同剂量的ASO-14转染OPA1+/-HEK293细胞，并且在转染之后72小时分离总蛋白。用靶向OPA1和β-微管蛋白的抗体探测蛋白质印迹，代表性印迹示于图13B中，并且两个独立实验的量化示于图13C中(*P<0.05，根据单因素ANOVA，相比于“无ASO”组)。ASO-14使OPA1+/-HEK293细胞中的OPA1蛋白的水平增加50％，其相当于野生型水平的75％。
实施例14：在玻璃体内注射之后，示例性OPA1 ASO在野生型兔视网膜中减少非生产性剪接并增加OPA1表达。
向雌性成年新西兰白(NZW)兔注射媒介物、非靶向(NT)或测试反义寡核苷酸。在15天之后使动物安乐死，以获得视网膜组织。图14A概述了研究设计，(*假设兔中的玻璃体体积为1.5mL来计算玻璃体中的最终浓度)。图14B示出了生产性和非生产性OPA1 mRNA和蛋白，并且图14C示出了此数据的量化(*P<0.05，根据单因素ANOVA，相比于媒介物组)。OD：右眼(oculus dextrus/right eye)，OS：左眼(oculus sinister/left eye)。
还发现在玻璃体内注射之后，反义寡核苷酸在野生型兔中耐受良好至多28天。
实施例15：ASO-14调节OPA1 mRNA转录物中外显子7和外显子7x两者的包含。
在存在或不存在环己酰亚胺的情况下用不同剂量的ASO-14或无ASO转染HEK293细胞。类似于实施例11，RNA在转染之后24小时分离并分析对OPA1 mRNA剪接和OPA1 mRNA表达的影响。图16A示出了来自使用跨越外显子7和8的探针的RT-PCR反应的PCR产物的凝胶图像。如图中所示，ASO-14的剂量从1nM、5nM增加至20nM，具有外显子7与8之间的外显子7x的转录物(“7+7x+8”)的量逐渐减少，相比之下，缺少外显子7与8之间的外显子7x的转录物(“7+8”)的量相对稳定。图16B示出了总结使用不同探针对通过qPCR反应量化的各种OPA1 mRNA转录物的相对量的图：“Ex6-8”，跨越外显子6和8的探针；“Ex7-8”，跨越外显子7和8的探针；以及“Ex23-24”，跨越外显子23和24的探针。结果归一化为作为内部对照的RPL32。图16C示出了总结基于在不存在环己酰亚胺的情况下对来自处理的HEK293细胞的RNA提取物的测序，各种OPA1mRNA转录物的量化的图表。如图所示，ASO-14似乎诱导OPA1外显子7x包含的减少、OPA1 Ex6-8转录物(具有串联的外显子6和外显子8，因此缺少外显子7和外显子7x的转录物)的增加、OPA1 Ex7-8转录物(具有串联的外显子7和外显子8，因此缺少外显子7x的转录物)的适当减少或无变化。
实施例16：示例性OPA1反义寡聚物调节OPA1 mRNA转录物中外显子7、外显子7x或两者的包含。
用不同示例性OPA1修饰的2'MOE-PS(2'甲氧基乙基和硫代磷酸酯)ASO转染HEK293细胞。在0.9μL
Figure BDA0004049378390001641
RNAiMax存在下，在不存在环己酰亚胺的情况下用80nM最终浓度的示例性ASO处理HEK 293细胞的每个孔(约100,000个细胞/孔)。类似于实施例11，细胞在转染之后24小时收获，并且分离RNA并分析对OPA1mRNA剪接和OPA1 mRNA表达的影响。图17A示出了来自使用跨越外显子6和8的探针的RT-PCR反应的PCR产物的凝胶图像，并且图17B是总结具有串联的外显子6、7和8的转录物(“6-7-8”)的量相对于“6-7-8”转录物和具有串联的外显子6和8的转录物(“6-8”)的总量的相对比的图。如图中所示，某些ASO，诸如ASO-19、ASO-20、ASO-21、ASO-22诱导“6-7-8”转录物的相对量的增加，表明外显子7在成熟OPA1 mRNA转录物中的包含增加。相比之下，一些ASO，诸如ASO-23、ASO-24、ASO-25、ASO-26、ASO-28、ASO-29、ASO-30、ASO-31、ASO-32、ASO-33、ASO-34、ASO-35、ASO-36、ASO-37和ASO-38诱导“6-7-8”转录物的相对量的减少，表明外显子7在成熟OPA1 mRNA转录物中的包含减少。图17C和图17D分别示出了具有外显子6和8的OPA1转录物(“Ex6-8”)和具有外显子7和8的OPA1转录物(“Ex7-8”)的qPCR反应的Ct值(上图)和相对量的量化(下图)。用ASO-29、ASO20、ASO-21和ASO-22处理的细胞显示出“Ex6-8”转录物的量减少和“Ex7-8”转录物的量增加，与这些ASO促进OPA1成熟mRNA转录物中包含外显子7所表明的一致。用ASO-23、ASO-24、ASO-25、ASO-26、ASO-28、ASO-29、ASO-30、ASO-31、ASO-32、ASO-33、ASO-34、ASO-35、ASO-36、ASO-37和ASO-38处理的细胞显示出“Ex6-8”转录物的量增加和“Ex7-8”转录物的量减少，与这些ASO促进从OPA1成熟mRNA转录物排除外显子7所表明的一致。
实施例17：示例性OPA1反义寡聚物调节OPA1 mRNA转录物中外显子7、外显子7x或两者的包含并调节OPA1蛋白的表达水平。
用不同示例性OPA1修饰的2'MOE-PS(2'甲氧基乙基和硫代磷酸酯)ASO转染HEK293细胞。在0.9μL
Figure BDA0004049378390001651
RNAiMax存在下用80nM最终浓度的示例性ASO处理HEK 293细胞的每个孔(约50,000个细胞/孔)。在此，在转染之后72小时收获细胞，以测试ASO对OPA1mRNA和蛋白表达的影响。在收获用于mRNA分析之前，细胞用环己酰亚胺(50μg/mL)处理3小时。图18A示出了来自使用跨越外显子6和8的探针的RT-PCR反应的PCR产物的凝胶图像。如图中所示，ASO-14诱导具有串联的外显子6、7、7x和8的转录物(“6-7-7x-8”)的量减少。ASO-32、ASO-38和ASO-39诱导“6-7-8”转录物的量的显著减少，以及“6-7-7x-8”转录物的量的适度减少，而ASO-40诱导“6-7-8”转录物的量的增加。这些数据表明ASO-14促进从OPA1 mRNA转录物排除外显子7x，ASO-32、ASO-38和ASO-39促进从OPA1 mRNA转录物排除外显子7，并且其还促进从OPA1mRNA转录物排除外显子7x。相比之下，数据表明ASO-40促进在OPA1 mRNA转录物中包含外显子7。
图18B示出了在用不同ASO或无ASO(对照)处理后，细胞中使用针对OPA1蛋白的抗体和针对β-微管蛋白的抗体的蛋白质印迹的图像，以及相同印迹的丽春红染色图像。图18B还示出了总结相对于β-微管蛋白或丽春红染色强度的量归一化的不同处理条件下的OPA1蛋白的量的图。数据表明ASO-14、ASO-32、ASO-38和ASO-39均可诱导OPA1蛋白表达增加，而ASO-40可能不会显著改变OPA1蛋白的表达水平。
还与ASO-14一起测试了ASO-32和ASO-38的剂量反应。在此实施例中与上述实验类似地进行ASO处理、细胞收获和RNA分离和分析。用20nM或80nM的ASO-14、ASO-32、ASO-38或无ASO处理HEK293细胞的每个孔(约50,000个细胞/孔)。图18C示出了来自使用跨越外显子6和8的探针的RT-PCR反应的产物的凝胶图像。图18D示出了使用跨越外显子和8的探针(“Ex6-8”)、跨越外显子7和8的探针(“Ex7-8”)以及跨越外显子23和24的探针(“Ex23-24”)在不同实验条件下的反应的qPCR Ct值的量化，并且图18E示出了对应转录物的相对量的量化。数据示出了ASO-32和ASO-38促进从成熟OPA1 mRNA转录物排除外显子7的一致观察结果。图18F示出了在ASO-14、ASO-32或ASO-38处理之后的OPA1表达水平的数据。一致地，ASO-32和ASO-38增加OPA1蛋白水平。
实施例18：通过RT-qPCR评价的ASO微步移。
在一个实验中，进行微步移以测试具有表7中列出的序列的ASO。简言之，每孔约30,000个HEK293细胞用20μM表7中列出的20种示例性ASO(自由摄取)中的一种裸处理72小时。在处理之后，收获细胞用于分析。对于对应于外显子7或外显子7x包含和全长的产物进行RT-PCR反应。
图19A-图20B示出了来自表7中列出的一些18聚体(命名为ASO-41至ASO-48)的实验的数据。图19A-图19B分别示出了具有外显子6和8的OPA1转录物(“Ex6-8”)和具有外显子7和8的OPA1转录物(“Ex7-8”)的qPCR反应的Ct值(上图)，以及相对量的量化(下图；归一化为RPL32 qPCR产物的Ct的值)。图19C示出了具有外显子23和24的OPA1转录物(“Ex23-24”)的qPCR反应的Ct值(上图)和相对量的量化(下图；归一化为RPL32 qPCR产物的Ct值)，并且图19D示出了作为上样对照的RPL32转录物的Ct值。这些数据展示用ASO-41至ASO-47处理的细胞均显示出“Ex6-8”转录物的量增加和“Ex7-8”转录物的量减少，表明这些ASO促进从OPA1转录物排除外显子7。未将环己酰亚胺应用于经历这些外显子7包含分析的细胞。图20A示出了具有外显子7x和8的OPA1转录物(“Ex7x-8”)的qPCR反应的Ct值(上图)和相对量的量化(下图；归一化为RPL32 qPCR产物的Ct值)，并且图20B示出了作为上样对照的RPL32转录物的Ct值。这些数据展示用ASO-41至ASO-44处理的细胞均显示出“Ex7x-8”转录物的量减少，表明这些ASO促进从OPA1转录物排除外显子7x。将环己酰亚胺应用于细胞以进行这些外显子7x包含分析。
图21A-图22C示出了来自表7中所列的一些16聚体(命名为ASO-49至ASO-60)的实验的数据。图21A-图21B分别示出了具有外显子6和8的OPA1转录物(“Ex6-8”)和具有外显子7和8的OPA1转录物(“Ex7-8”)的qPCR反应的Ct值(上图)，以及相对量的量化(下图；归一化为RPL32 qPCR产物的Ct的值)。图21C示出了具有外显子23和24的OPA1转录物(“Ex23-24”)的qPCR反应的Ct值(上图)和相对量的量化(下图；归一化为RPL32 qPCR产物的Ct值)，并且图21D示出了RPL32转录物的Ct值。这些数据展示用ASO-49至ASO-60处理的细胞均显示出“Ex6-8”转录物的量增加和“Ex7-8”转录物的量减少，表明这些ASO促进从OPA1转录物排除外显子7。未将环己酰亚胺应用于经历这些外显子7包含分析的细胞。图22A示出了具有外显子7x和8的OPA1转录物(“Ex7x-8”)的qPCR反应的Ct值(上图)和相对量的量化(下图；归一化为RPL32 qPCR产物的Ct值)，并且图22C示出了作为上样对照的RPL32转录物的Ct值。这些数据展示用ASO-49至ASO-56处理的细胞均显示出“Ex7x-8”转录物的量减少，表明这些ASO促进从OPA1转录物排除外显子7x。将环己酰亚胺应用于细胞以进行这些外显子7x包含分析。
进行另一个实验以评估在微步移分析中以上所测试的ASO中与所选ASO的转染剂量反应关系。简言之，每孔100,000个HEK293细胞用1、3、10或30nM示例性ASO与0.45μL脂质转染胺转染24小时。随后收获细胞用于如上的qPCR分析。图23A-图23B示出了描绘相对量的不同OPA1转录物相对于示例性ASO，ASO-14、38、41、42、43、44、49、51、52和53的转染浓度的剂量反应曲线的图。所述图显示出作为一般趋势，在用如ASO-38、41、42、43、44、49、51、52或53的ASO处理的细胞中，随着示例性ASO的浓度增加，具有外显子6和8的OPA1转录物(“6-8”)的量增加，而具有外显子7和8在OPA1转录物(“7-8”)以及具有外显子7x和8的OPA1转录物(“7x-8”)的量减少。相比之下，在用ASO-14处理的细胞中，尽管“7x-8”减少并且“6-8”转录物增加，但“7-8”转录物无显著变化。这些数据表明ASO-38、41、42、43、44、49、51、52和53均可促进外显子7和外显子7x两者的排除，而ASO-14可促进外显子7x的排除。
表5.示例性OPA1 ASO序列
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Figure BDA0004049378390001691
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Figure BDA0004049378390001731
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表6.示例性OPA1 ASO序列
Figure BDA0004049378390001742
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Figure BDA0004049378390001751
表7.示例性OPA1 ASO序列
Figure BDA0004049378390001752
实施例19：ASO-14介导OPA1单倍剂量不足HEK293细胞系中的ATP上调。
使用可商购获得的试剂盒(目录号ab83355，Abcam；USA)根据制造商说明书在HEK293细胞溶解物中测量通过线粒体氧化磷酸化和糖酵解途经产生的ATP水平。简言之，将约3×105个OPA1+/+(野生型)和OPA1+/-HEK293细胞铺板在T-25烧瓶中并用10μMASO-14处理。对于ATP测试，在处理后96小时，收获细胞，并且制备细胞悬浮液的两个等分试样。一个等分试样使用可商购获得的试剂盒(目录号ab204708，Abcam；USA)处理以去蛋白来移除残余蛋白质，用于执行ATP荧光测定以测量总ATP水平。第二等分试样用于BCA测定(目录号23225，Thermo Fisher；USA)以测量总蛋白水平。然后通过将测量的总ATP水平归一化为测量的总蛋白水平来计算ATP水平。
图24A总结了在每种条件下测量的ATP水平。在模拟组中，发现相比于未处理的OPA1+/+HEK293细胞，未处理的OPA1+/-HEK293细胞具有0.79±0.02ATP水平。OPA1+/-HEK293细胞中存在约20％ ATP缺乏。相比之下，用ASO-14处理的OPA1+/-HEK293细胞具有显著高于模拟处理的OPA1+/-HEK293细胞的ATP水平0.88±0.01，表明ASO-14处理使缺乏减少约50％。从三个独立实验收集数据。(统计：普通单因素ANOVA；***P<0.0001；**P<0.0080)。
图24B-图24C展示了在每种条件下的OPA1蛋白。在用ASO-14处理或未处理(模拟)之后96小时，用RIPA缓冲液溶解细胞，并且用靶向OPA1和β-肌动蛋白的抗体探测免疫印迹。数据显示出ASO-14处理使OPA1+/-细胞中的OPA1蛋白上调约18％。图24B示出了免疫印迹凝胶图像。免疫印迹图像上的多个条带表示OPA1的各种同工型。图24C总结了免疫印迹结果的量化。发现相比于未处理(模拟)OPA1+/+HEK293细胞，未处理(模拟)OPA1+/-HEK293细胞具有46±0.5％ OPA1蛋白水平。用ASO-14处理的OPA1+/+细胞具有未处理的OPA1+/+细胞的123.2±1.3的OPA1水平。用ASO-14处理的OPA1+/-细胞具有未处理的OPA1+/+细胞的54.54±0.6％的OPA1水平。用对应模拟进行统计。***P<0.0001，根据普通单因素ANOVA以及###P<0.0001，根据韦尔奇氏t检验(Welch's t test)。数据表示三个技术重复的平均值。
实施例20：示例性反义寡聚物恢复来自诊断患者的具有OPA1突变的细胞中的OPA1表达。
此实施例检查来自诊断患有常染色体显性视神经萎缩(ADOA)的患者的具有OPA1基因突变的细胞中的OPA1 mRNA和蛋白水平，以及示例性反义寡聚物ASO-14对OPA1 mRNA和蛋白水平和患者细胞中的线粒体生物能量学的影响。
图25A-图25C总结了来自具有OPA1基因的单倍剂量不足突变的诊断患者的成纤维细胞中的OPA1基因的mRNA和蛋白质表达：F34(c.1608+1delGTGAGG处的OPA1典型剪接突变)；F35(c.2873_2876del处的OPA1读框移位突变)；F36(c.635_636delAA处的OPA1读框移位突变)。患者细胞中OPA1基因的mRNA表达水平是野生型(WT)细胞中的mRNA水平的约50％至60％(图25A)；患者细胞中的OPA1蛋白水平约是WT细胞中的蛋白质水平的30％至约40％(图25B)。图25A-图25B中的直方图示出了3个独立实验的平均值±SEM；相比于WT组的单因素ANOVA(****P<.0001)。图25C示出了患病成纤维细胞中的OPA蛋白表达水平的代表性免疫印迹图像。
图26A-图26D示出了示例性反义寡聚物ASO-14对野生型(WT)成纤维细胞和来自具有OPA1基因的单倍剂量不足突变的诊断患者的成纤维细胞中的OPA1 NMD外显子包含、mRNA水平和蛋白质水平的影响。用ASO-14(40nM)转染成纤维细胞，并且在转染之后24小时分离RNA并进行分析。对于非生产性OPA1 mRNA测量，细胞在RNA分离之前用环己酰亚胺(50μg/mL)处理3小时。在转染后72小时用靶向OPA1和β-微管蛋白的抗体进行免疫印迹。如图26A中所示，ASO-14显著减少NMD外显子(外显子7x)包含，通过WT细胞和所有患病细胞中的非生产性OPA1 mRNA的水平低于WT细胞中的归一化水平的20％水平所测量。通过ASO-14处理使所有类型的细胞中的总OPA1 mRNA水平存在增加趋势(图26B)。图26A-图26B中的直方图示出了2-3个独立实验的平均值±SEM；相应细胞系的相对于模拟的单因素ANOVA(*P<.05；***P<.001；****P<.0001)。相应地，在所有类型的细胞中通过ASO-14处理显著增加OPA1蛋白水平(图26C-图26D)。图26C示出了OPA1蛋白和上样对照β-微管蛋白在所有类型的条件下的代表性免疫印迹图像；图26D示出了OPA1蛋白水平的统计汇总，直方图示出了3个独立实验的平均值±SEM；相应细胞系的相对于模拟的非配对t检验(*P<0.05，**P<0.01，***<0.001)。
图27A-图27E展示了患者成纤维细胞(细胞系F35和F36)显示出线粒体生物能量学的缺陷。图27A示出了WT细胞、F35细胞和F36细胞在基线水平下和依序用寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素A激发时的耗氧率的代表性时程。发现相比于WT成纤维细胞，患者成纤维细胞F35和F36细胞具有降低的基础耗氧率(图27B)、ATP相关呼吸(图27C)、最大呼吸(图27D)和备用呼吸容量(图27E)。图27B-图27E中的单位是pmol/min/细胞，归一化为野生型(WT)的数据。图27B-图27E中的直方图示出了来自2个独立实验的>18个单独测量值的平均值±SEM；相比于WT的单因素ANOVA(**P<.01；****P<.0001)。
图28A-图28D展示了ASO-14增加F35患者细胞系中的线粒体能量学。如图中所示，用40nM或60nM ASO-14处理以剂量依赖性方式增加了F35患者细胞的基础耗氧率(图28A)、ATP相关呼吸(图28B)、最大呼吸(图28C)和备用呼吸容量(图28D)。用20nM ASO-14处理也显著增加备用呼吸容量(图28D)。相比之下，非靶向ASO(NT ASO，靶向无关基因)在任一测试浓度下都没有显著改变参数。图中的单位是pmol/min/细胞；将耗氧率(OCR)归一化为总细胞计数并绘制为模拟(无ASO)。直方图示出了来自至少3个独立实验的>20个单独测量值的平均值±SEM；相对于模拟的单因素ANOVA(*P<.05；***P<.001；****P<.0001)。
图29A-图29D展示了ASO-14增加F36患者细胞系中的线粒体能量学。如图中所示，从20nM、40nM至60nM，ASO-14还以剂量依赖性方式增加了F36患者细胞的基础耗氧率(图29A)、ATP相关呼吸(图29B)、最大呼吸(图29C)和备用呼吸容量(图29D)。相比之下，非靶向ASO未显著改变40nM下的参数。图中的单位是pmol/min/细胞；将耗氧率(OCR)归一化为总细胞计数并绘制为模拟(无ASO)。直方图示出了来自2-5个独立实验的>20个单独测量值的平均值±SEM；相对于模拟的单因素ANOVA(*P<.05；**P<.01；***P<.001；****P<.0001)。
F35和F36细胞中的实验表明通过ASO-14的线粒体生物能量学的剂量依赖性改善是突变非依赖性的。
前述临床前数据支持ADOA中的TANGO疾病改善方法。如通过数据所展示，示例性反义寡聚物ASO-14减少非生产性外显子包含；增加所有三个患者成纤维细胞细胞系中的总OPA1 mRNA和蛋白表达；增加ASO-14剂量会增加两个成纤维细胞细胞系中的线粒体呼吸。数据进一步表明，ASO介导的OPA1蛋白表达增加在ADOA中以突变非依赖性方式改善疾病。
虽然本文已示出并描述了本公开的优选实施方案，但对于本领域技术人员应显而易见，此类实施方案仅以举例方式提供。技术人员现将在不背离本公开的情况下想到许多变化、改变和替代。应理解，本公开的实施方案的各种替代方案可用于实践本公开。预期以下权利要求限定本公开的范围，并且由此涵盖这些权利要求及其等效物的范围内的方法和结构。

Claims (180)

1.一种在具有从OPA1基因转录并包含无义介导的RNA衰变诱导外显子(NMD外显子)的前mRNA的细胞中调节OPA1蛋白表达的方法，所述方法包括使剂或编码所述剂的载体与所述细胞接触，由此所述剂调节所述NMD外显子从所述前mRNA的剪接，从而调节从所述前mRNA加工的经加工mRNA的水平，以及调节所述细胞中所述OPA1蛋白的表达，其中所述剂包含与选自由SEQ ID NO:6-275和280-299组成的组的序列具有至少80％序列同一性的反义寡聚物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述剂：
(a)结合至所述前mRNA的目标部分；
(b)调节涉及所述NMD外显子剪接的因子的结合；或
(c)(a)与(b)的组合。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述剂干扰涉及所述NMD外显子剪接的所述因子与所述目标部分的区域的结合。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分接近所述NMD外显子。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述NMD外显子5'端上游至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述NMD外显子5'端上游至少约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸、约40个核苷酸、约30个核苷酸、约20个核苷酸、约10个核苷酸、约5个核苷酸、约4个核苷酸、约2个核苷酸、约1个核苷酸处。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述NMD外显子3'端下游至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。
8.如权利要求2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述NMD外显子3'端下游至少约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸、约40个核苷酸、约30个核苷酸、约20个核苷酸、约10个核苷酸、约5个核苷酸、约4个核苷酸、约2个核苷酸、约1个核苷酸处。
9.如权利要求2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193628509上游至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。
10.如权利要求2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193628509上游约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。
11.如权利要求2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193628616下游至多约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。
12.如权利要求2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193628616下游约1500个核苷酸、约1000个核苷酸、约800个核苷酸、约700个核苷酸、约600个核苷酸、约500个核苷酸、约400个核苷酸、约300个核苷酸、约200个核苷酸、约100个核苷酸、约80个核苷酸、约70个核苷酸、约60个核苷酸、约50个核苷酸处。
13.如权利要求2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分位于所述前mRNA的两个典型外显子区域之间的内含子区域中，并且其中所述内含子区域含有所述NMD外显子。
14.如权利要求2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分与所述NMD外显子至少部分重叠。
15.如权利要求2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分与在所述NMD外显子上游或下游的内含子至少部分重叠。
16.如权利要求2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分包含5'NMD外显子-内含子连接处或3'NMD外显子-内含子连接处。
17.如权利要求2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述NMD外显子内。
18.如权利要求2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分包含所述NMD外显子约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续核苷酸。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述NMD外显子包含与SEQ ID NO:279具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。
20.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述NMD外显子包含SEQ ID NO:279的序列。
21.如权利要求2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述无义介导的RNA衰变诱导外显子GRCh38/hg38:chr3193628509至193628616内。
22.如权利要求2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述无义介导的RNA衰变诱导外显子GRCh38/hg38:chr3193628509至193628616上游或下游。
23.如权利要求2所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分包含外显子GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616的外显子-内含子连接处。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是全长OPA1蛋白或野生型OPA1蛋白。
25.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是功能性OPA1蛋白。
26.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中相比于野生型OPA1蛋白，由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是至少部分功能性的。
27.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中相比于全长野生型OPA1蛋白，由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是至少部分功能性的。
28.如权利要求1至23或25至27中任一项所述的方法，其中由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是缺乏由与SEQ ID NO:277具有至少80％序列同一性的核酸序列所编码的氨基酸序列的OPA1蛋白。
29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述方法促进所述NMD外显子从所述前mRNA排除。
30.如权利要求29所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中从所述前mRNA排除所述NMD外显子增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述方法使得所述细胞中所述经加工mRNA的水平增加。
32.如权利要求31所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中的所述经加工mRNA的水平增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述方法使得所述细胞中所述OPA1蛋白的表达增加。
34.如权利要求33所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白的水平增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
35.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述剂包含与选自由SEQ ID NO:36、236、242、250、280-283、288和290-292组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。
36.如权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述剂还包含基因编辑分子。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述基因编辑分子包含CRISPR-Cas9。
38.一种在具有从OPA1基因转录的前mRNA的细胞中调节OPA1蛋白表达的方法，其中所述前mRNA包含编码外显子，所述方法包括使剂或编码所述剂的载体与所述细胞接触，由此所述剂促进从所述前mRNA排除所述编码外显子，从而增加所述细胞中从所述前mRNA加工并缺乏所述编码外显子的经加工mRNA的水平。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述剂：
(a)结合至所述前mRNA的目标部分；
(b)调节涉及所述编码外显子剪接的因子的结合；或
(c)(a)与(b)的组合。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述剂干扰涉及所述编码外显子剪接的所述因子与所述目标部分的区域的结合。
41.如权利要求39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分接近所述编码外显子。
42.如权利要求39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分位于紧邻所述编码外显子上游的内含子区域中。
43.如权利要求39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越所述编码外显子5'端上游的100至50、90至50、80至50、70至50、60至50、60至40、60至30、60至20、60至10、49至1、39至1、29至1或19至1个核苷酸的区域内。
44.如权利要求39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越所述编码外显子5'端上游的49至1、39至1、29至1或19至1个核苷酸的区域内。
45.如权利要求39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分位于紧邻所述编码外显子下游的内含子区域中。
46.如权利要求39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越所述编码外显子3'端下游的1至49、1至39、1至29、1至19、10至60、20至60、30至60、40至60、50至60、50至70、50至80、50至90或50至100个核苷酸的区域内。
47.如权利要求39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越所述编码外显子3'端下游的1至49、1至39、1至29或1至19个核苷酸的区域内。
48.如权利要求39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分与所述编码外显子至少部分重叠。
49.如权利要求39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分与紧邻所述编码外显子上游或紧邻所述编码外显子下游的内含子至少部分重叠。
50.如权利要求39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分包含5'编码外显子-内含子连接处或3'编码外显子-内含子连接处。
51.如权利要求39所述的方法，其中所述目标部分在所述前mRNA的所述编码外显子内。
52.如权利要求39至51中任一项所述的方法，其中所述编码外显子是选择性剪接外显子。
53.如权利要求39至52中任一项所述的方法，其中所述编码外显子包含与SEQ ID NO:277具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。
54.如权利要求39至52中任一项所述的方法，其中所述编码外显子包含SEQ ID NO:277。
55.如权利要求39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分紧邻所述编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202上游。
56.如权利要求39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193626092上游的49至1、39至1、29至1或19至1个核苷酸的区域内。
57.如权利要求39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分紧邻所述编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202下游。
58.如权利要求39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193626202下游的1至49、1至39、1至29或1至19个核苷酸的区域内。
59.如权利要求39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202内。
60.如权利要求39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分包含外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202的外显子-内含子连接处。
61.如权利要求39所述的方法，其中所述目标部分包含所述编码外显子约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续核苷酸。
62.如权利要求39所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分包含与包含SEQ IDNO:277的至少8个邻接核酸的区域具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％序列同一性的序列。
63.如权利要求38至62中任一项所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中从所述前mRNA排除所述编码外显子增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
64.如权利要求38至63中任一项所述的方法，其中所述方法使得所述细胞中所述OPA1蛋白的表达增加。
65.如权利要求64所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白的水平增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
66.如权利要求64所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白的水平增加至少约1.5倍。
67.如权利要求64至66中任一项所述的方法，其中由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是功能性OPA1蛋白。
68.如权利要求64至66中任一项所述的方法，其中相比于野生型OPA1蛋白，由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是至少部分功能性的。
69.如权利要求64至66中任一项所述的方法，其中相比于全长野生型OPA1蛋白，由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是至少部分功能性的。
70.如权利要求64至69中任一项所述的方法，其中与由含有所述编码外显子的对应mRNA编码的OPA1蛋白相比，由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白包含较少蛋白质裂解位点。
71.如权利要求38至70中任一项所述的方法，其中所述剂促进从所述前mRNA排除无义介导的RNA衰变诱导外显子(NMD外显子)。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述NMD外显子包含与SEQ ID NO:279具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。
73.如权利要求71所述的方法，其中所述NMD外显子包含SEQ ID NO:279的序列。
74.如权利要求64至73中任一项所述的方法，其中与由含有所述编码外显子的对应mRNA编码的OPA1蛋白相比，由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白包含较少蛋白质裂解位点。
75.如权利要求38至74中任一项所述的方法，其中所述剂包含与选自由SEQ ID NO:227-242、250、280-283、288和290-292组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。
76.如权利要求38至74中任一项所述的方法，其中所述剂包含基因编辑分子。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述基因编辑分子包含CRISPR-Cas9。
78.一种在具有从OPA1基因转录的前mRNA的细胞中调节OPA1蛋白表达的方法，其中所述前mRNA包含编码外显子，所述方法包括使剂或编码所述剂的载体与所述细胞接触，
其中所述剂包含结合至以下各项的反义寡聚物：
(a)在紧邻所述前mRNA的所述编码外显子5'端上游的内含子区域内的所述前mRNA的目标部分；或
(b)在紧邻所述前mRNA的所述编码外显子3'端下游的内含子区域内的所述前mRNA的目标部分；
由此所述剂增加所述细胞中从所述前mRNA加工并含有所述编码外显子的经加工mRNA的水平。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述编码外显子是选择性剪接外显子。
80.如权利要求78或79所述的方法，其中所述方法促进在所述细胞中的所述前mRNA的剪接期间，在所述经加工mRNA中包含所述编码外显子。
81.如权利要求78至80中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越所述编码外显子5'端上游的100至50、100至60、100至70、100至80或100至90个核苷酸的区域内。
82.如权利要求78至80中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越所述编码外显子3'端下游的40至100、50至100、60至100、70至100、80至100或90至100个核苷酸的区域内。
83.如权利要求78至80中任一项所述的方法，其中所述编码外显子包含与SEQ ID NO:277具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。
84.如权利要求78至80中任一项所述的方法，其中所述编码外显子包含SEQ ID NO:277。
85.如权利要求78至80中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越基因组位点GRCh38/hg38:chr3193626092上游的100至50、100至60、100至70、100至80或100至90个核苷酸的区域内。
86.如权利要求78至80中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越基因组位点GRCh38/hg38:chr3193626202下游的40至100、50至100、60至100、70至100、80至100或90至100个核苷酸的区域内。
87.如权利要求78至86中任一项所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中在所述经加工mRNA中包含所述编码外显子增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
88.如权利要求78至87中任一项所述的方法，其中所述剂包含与SEQ ID NO:267具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。
89.一种在具有从编码目标蛋白的基因转录的前mRNA的细胞中调节所述目标蛋白表达的方法，其中所述前mRNA包含编码外显子和无义介导的RNA衰变诱导外显子(NMD外显子)，所述方法包括使剂或编码所述剂的载体与所述细胞接触，
其中所述剂促进从所述前mRNA排除所述编码外显子和所述NMD外显子两者，从而增加所述细胞中从所述前mRNA加工并缺乏所述NMD外显子和所述编码外显子两者的经加工mRNA的水平。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述剂：
(a)结合至所述前mRNA的目标部分；
(b)调节涉及所述编码外显子、所述NMD外显子或两者剪接的因子的结合；或
(c)(a)与(b)的组合。
91.如权利要求90所述的方法，其中所述剂干扰涉及所述编码外显子、所述NMD外显子或两者的剪接的所述因子与所述目标部分的区域的结合。
92.如权利要求89至91中任一项所述的方法，其中所述NMD外显子在邻近于所述编码外显子的内含子区域内。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述NMD外显子在紧邻所述编码外显子上游的内含子区域内。
94.如权利要求92所述的方法，其中所述NMD外显子在紧邻所述编码外显子下游的内含子区域内。
95.如权利要求90至94中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分接近所述编码外显子。
96.如权利要求90至94中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分位于紧邻所述编码外显子上游的内含子区域中。
97.如权利要求90至94中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分位于紧邻所述编码外显子下游的内含子区域中。
98.如权利要求90至94中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分位于所述编码外显子内。
99.如权利要求90至94中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越所述编码外显子5'端上游的49至1、39至1、29至1或19至1个核苷酸的区域内。
100.如权利要求90至94中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越所述编码外显子上游的100个核苷酸至所述编码外显子下游的100个核苷酸的区域内。
101.如权利要求89至100中任一项所述的方法，其中所述编码外显子是选择性剪接外显子。
102.如权利要求89至101中任一项所述的方法，其中所述编码外显子包含与SEQ IDNO:277具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。
103.如权利要求89至101中任一项所述的方法，其中所述编码外显子包含SEQ ID NO:277。
104.如权利要求90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分紧邻所述编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202上游。
105.如权利要求90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分紧邻所述编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202下游。
106.如权利要求90至94中任一项所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越GRCh38/hg38:chr3 193626092上游的49至1、39至1、29至1或19至1个核苷酸的区域内。
107.如权利要求90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193626092上游的100个核苷酸至基因组位点GRCh38/hg38:chr3193626202下游的100个核苷酸的区域内。
108.如权利要求90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202内。
109.如权利要求90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分包含所述编码外显子GRCh38/hg38:chr3 193626092至193626202的外显子-内含子连接处。
110.如权利要求90所述的方法，其中所述目标部分包含所述编码外显子约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续核苷酸。
111.如权利要求90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分接近所述NMD外显子。
112.如权利要求90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分位于紧邻所述NMD外显子上游的内含子区域中。
113.如权利要求90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分位于紧邻所述NMD外显子下游的内含子区域中。
114.如权利要求90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分位于所述NMD外显子内。
115.如权利要求90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在跨越所述NMD外显子上游的100个核苷酸至所述NMD外显子下游的100个核苷酸的区域内。
116.如权利要求89至115中任一项所述的方法，其中所述NMD外显子包含与SEQ ID NO:279具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的序列。
117.如权利要求89所述的方法，其中所述NMD外显子包含SEQ ID NO:279。
118.如权利要求90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分紧邻所述NMD外显子GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616上游。
119.如权利要求90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分紧邻所述NMD外显子GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616下游。
120.如权利要求90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在基因组位点GRCh38/hg38:chr3 193628509上游的100个核苷酸至基因组位点GRCh38/hg38:chr3193628616下游的100个核苷酸的区域内。
121.如权利要求90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分在所述NMD外显子GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616内。
122.如权利要求90所述的方法，其中所述前mRNA的所述目标部分包含所述NMD外显子GRCh38/hg38:chr3 193628509至193628616的外显子-内含子连接处。
123.如权利要求90所述的方法，其中所述目标部分包含所述NMD外显子约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续核苷酸。
124.如权利要求89至123中任一项所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中从所述前mRNA排除所述编码外显子增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
125.如权利要求89至124中任一项所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中从所述前mRNA排除所述NMD外显子增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
126.如权利要求89至125中任一项所述的方法，其中所述剂使得所述细胞中的所述经加工mRNA的水平增加。
127.如权利要求126所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中的所述经加工mRNA的水平增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
128.如权利要求89至127中任一项所述的方法，其中所述方法使得所述细胞中的所述目标蛋白的表达增加。
129.如权利要求128所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中由所述经加工mRNA表达的所述目标蛋白的水平增加约1.1至约10倍、约1.5至约10倍、约2至约10倍、约3至约10倍、约4至约10倍、约1.1至约5倍、约1.1至约6倍、约1.1至约7倍、约1.1至约8倍、约1.1至约9倍、约2至约5倍、约2至约6倍、约2至约7倍、约2至约8倍、约2至约9倍、约3至约6倍、约3至约7倍、约3至约8倍、约3至约9倍、约4至约7倍、约4至约8倍、约4至约9倍、至少约1.1倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约5倍或至少约10倍。
130.如权利要求89至128中任一项所述的方法，其中所述目标蛋白是OPA1蛋白。
131.如权利要求130所述的方法，其中相比于不存在所述剂的情况下，在与所述剂接触的所述细胞中由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白的水平增加至少约1.5倍。
132.如权利要求130所述的方法，其中由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是功能性OPA1蛋白。
133.如权利要求130所述的方法，其中相比于野生型OPA1蛋白，由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是至少部分功能性的。
134.如权利要求130所述的方法，其中相比于全长野生型OPA1蛋白，由所述经加工mRNA表达的所述OPA1蛋白是至少部分功能性的。
135.如权利要求89至127中任一项所述的方法，其中所述剂包含与选自由SEQ ID NO:236、242、250、280-283、288和290-292组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。
136.如权利要求78至135中任一项所述的方法，其中所述剂包含基因编辑分子。
137.如权利要求136所述的方法，其中所述基因编辑分子包含CRISPR-Cas9。
138.如权利要求1至75或78至135中任一项所述的方法，其中所述剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物包含含有硫代磷酸酯键联或二氨基磷酸酯键联的主链修饰。
139.如权利要求1至75或78至138中任一项所述的方法，其中所述剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物包含二氨基磷酸酯吗啉代、锁核酸、肽核酸、2'-O-甲基部分、2'-氟基部分或2'-O-甲氧基乙基部分。
140.如权利要求1至75或78至139中任一项所述的方法，其中所述治疗剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物包含至少一个修饰的糖部分。
141.如权利要求140所述的方法，其中每个糖部分是修饰的糖部分。
142.如权利要求1至75或78至141中任一项所述的方法，其中所述剂是反义寡聚物(ASO)，并且其中所述反义寡聚物由8至50个核碱基、8至40个核碱基、8至35个核碱基、8至30个核碱基、8至25个核碱基、8至20个核碱基、8至15个核碱基、9至50个核碱基、9至40个核碱基、9至35个核碱基、9至30个核碱基、9至25个核碱基、9至20个核碱基、9至15个核碱基、10至50个核碱基、10至40个核碱基、10至35个核碱基、10至30个核碱基、10至25个核碱基、10至20个核碱基、10至15个核碱基、11至50个核碱基、11至40个核碱基、11至35个核碱基、11至30个核碱基、11至25个核碱基、11至20个核碱基、11至15个核碱基、12至50个核碱基、12至40个核碱基、12至35个核碱基、12至30个核碱基、12至25个核碱基、12至20个核碱基，或12至15个核碱基组成。
143.如权利要求1至142中任一项所述的方法，其中所述载体包括编码所述剂的病毒载体。
144.如权利要求143所述的方法，其中所述病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒(HSV)病毒载体或逆转录病毒载体。
145.如权利要求1至144中任一项所述的方法，其中所述方法还包括评估所述OPA1蛋白的mRNA水平或表达水平。
146.如权利要求1至145中任一项所述的方法，其中所述剂是治疗剂。
147.一种药物组合物，其包含如权利要求146所述的治疗剂或编码如权利要求146所述的治疗剂的载体，和药学上可接受的赋形剂。
148.一种药物组合物，其包含治疗剂或编码治疗剂的载体和药学上可接受的赋形剂，其中所述治疗剂包含与选自由SEQ ID NO:6-275和280-299组成的组的序列具有至少80％序列同一性的反义寡聚物。
149.如权利要求148所述的药物组合物，其中所述治疗剂包含与选自由SEQ ID NO:227-242和250组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。
150.如权利要求148所述的药物组合物，其中所述治疗剂包含与SEQ ID NO:267具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。
151.如权利要求148所述的药物组合物，其中所述治疗剂包含与选自由SEQ ID NO:36、236、242、250和280-299组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性的反义寡聚物。
152.一种组合物，其包含与选自由SEQ ID NO:6-275和280-299组成的组的序列具有至少80％序列同一性的反义寡聚物，其中所述反义寡聚物包含主链修饰、糖部分修饰或它们的组合。
153.如权利要求152所述的组合物，其中所述反义寡聚物与选自由SEQ ID NO:227-242和250组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性。
154.如权利要求152所述的组合物，其中所述反义寡聚物与SEQ ID NO:267具有至少80％、至少90％或100％序列同一性。
155.如权利要求152所述的组合物，其中所述反义寡聚物与选自由SEQ ID NO:36、236、242、250和280-299组成的组的序列具有至少80％、至少90％或100％序列同一性。
156.一种药物组合物，其包含治疗剂或编码所述治疗剂的载体和药学上可接受的赋形剂，其中所述治疗剂促进从前mRNA排除编码外显子，从而增加细胞中从所述前mRNA加工并缺乏所述编码外显子的经加工mRNA的水平，其中所述前mRNA从OPA1基因转录并包含所述编码外显子。
157.一种药物组合物，其包含治疗剂或编码所述治疗剂的载体和药学上可接受的赋形剂，其中所述治疗剂包含结合至从细胞中OPA1基因转录的前mRNA的反义寡聚物，其中所述反义寡聚物结合至：
(a)在紧邻所述前mRNA的所述编码外显子5'端上游的内含子区域内的所述前mRNA的目标部分；或
(b)在紧邻所述前mRNA的所述编码外显子3'端下游的内含子区域内的所述前mRNA的目标部分；
由此所述治疗剂增加所述细胞中从所述前mRNA加工并含有所述编码外显子的经加工mRNA的水平。
158.一种药物组合物，其包含治疗剂或编码所述治疗剂的载体和药学上可接受的赋形剂，其中所述治疗剂促进从前mRNA排除编码外显子和无义介导的RNA衰变诱导外显子(NMD外显子)两者，从而增加细胞中从所述前mRNA加工并缺乏所述编码外显子和所述NMD外显子的经加工mRNA的水平，其中所述前mRNA从所述细胞中OPA1基因转录并包含所述编码外显子和所述NMD外显子。
159.如权利要求147至158中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于脑室内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、鞘内注射、皮下注射、经口施用、滑膜注射、玻璃体内施用、视网膜下注射、局部应用、植入或静脉内注射。
160.如权利要求147至158中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制用于玻璃体内注射。
161.如权利要求147至160中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含第二治疗剂。
162.如权利要求161所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂包含小分子。
163.如权利要求161所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂包含反义寡聚物。
164.如权利要求161所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂纠正内含子保留。
165.如权利要求147至160中任一项所述的药物组合物或组合物，其中所述反义寡聚物选自由化合物ID NO:1-303组成的组。
166.一种通过调节OPA1蛋白在有需要受试者的细胞中的表达来治疗所述受试者的疾病或疾患或降低发展出所述疾病或疾患的可能性的方法，其包括使所述受试者的细胞与如权利要求147至165中任一项所述的治疗剂接触。
167.如权利要求166所述的方法，其中所述疾病或疾患与OPA1基因中的功能丧失型突变相关。
168.如权利要求166或167所述的方法，其中所述疾病或疾患与所述OPA1基因的单倍剂量不足相关，并且其中所述受试者具有编码功能性OPA1蛋白的第一等位基因，和不产生或产生低水平所述OPA1蛋白的第二等位基因，或编码非功能性OPA1蛋白或部分功能性OPA1蛋白的第二等位基因。
169.如权利要求166至168中任一项所述的方法，其中所述疾病或疾患包括眼部疾病或疾患。
170.如权利要求166至168中任一项所述的方法，其中所述疾病或疾患包括ADOA叠加综合征；线粒体病症；青光眼；正常眼压青光眼；夏-马-图三氏病；线粒体功能失调；糖尿病性视网膜病变；年龄相关性黄斑变性；视网膜神经节细胞死亡；线粒体裂变介导的线粒体功能失调；进行性眼外肌麻痹；耳聋；共济失调；运动神经病；感觉神经病；肌病；贝尔综合征；脑部功能失调；脑病；周围神经病变；致死性婴儿线粒体脑肌病；肥厚性心肌病；痉挛性共济失调综合征；感觉运动周围神经病变；张力减退；胃肠道蠕动异常和吞咽困难；视神经萎缩；视神经萎缩叠加综合征；线粒体DNA耗竭综合征14；晚发型心肌病；糖尿病性心肌病；阿尔茨海默氏病；局灶节段性肾小球硬化；肾病；亨廷顿氏病；健康老化中的认知功能下降；朊病毒疾病；晚发型痴呆和帕金森氏症；线粒体肌病；利氏综合征；弗里德希氏共济失调；帕金森氏病；MELAS(线粒体脑肌病、乳酸中毒和中风样发作)；丙酮酸脱氢酶复合物缺乏症；慢性肾病；莱伯遗传性视神经病变；肥胖；年龄相关的全身性神经变性；骨胳肌萎缩；心脏和大脑缺血性损伤；或大量肝细胞凋亡。
171.如权利要求166至168中任一项所述的方法，其中所述疾病或疾患包括1型视神经萎缩。
172.如权利要求166至168中任一项所述的方法，其中所述疾病或疾患包括常染色体显性视神经萎缩(ADOA)。
173.如权利要求166或167所述的方法，其中所述疾病或疾患与OPA1基因的常染色体隐性突变相关，其中所述受试者具有第一等位基因，由所述第一等位基因：
(i)不产生或产生比野生型等位基因低水平的OPA1蛋白；或
(ii)产生的所述OPA1蛋白相比于野生型等位基因是非功能性或部分功能性的，和
第二等位基因，由所述第二等位基因：
(iii)产生比野生型等位基因低水平的所述OPA1蛋白，并且产生的所述OPA1蛋白相比于野生型等位基因是至少部分功能性的；或
(iv)产生的所述OPA1蛋白相比于野生型等位基因是部分功能性的。
174.如权利要求166至173中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
175.如权利要求166至173中任一项所述的方法，其中所述受试者是非人动物。
176.如权利要求166至173中任一项所述的方法，其中所述受试者是胎儿、胚胎或儿童。
177.如权利要求166至173中任一项所述的方法，其中所述细胞是离体的。
178.如权利要求166至173中任一项所述的方法，其中所述治疗剂通过脑室内注射、腹膜内注射、肌肉内注射、鞘内注射、皮下注射、经口施用、滑膜注射、玻璃体内施用、视网膜下注射、局部应用、植入或静脉内注射来施用。
179.如权利要求166至173中任一项所述的方法，其中所述治疗剂通过玻璃体内注射来施用。
180.如权利要求166至179中任一项所述的方法，其中所述方法治疗所述疾病或疾患。
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