CN115851469A - 一种高产海藻酸裂解酶的毕赤酵母菌株 - Google Patents
一种高产海藻酸裂解酶的毕赤酵母菌株 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115851469A CN115851469A CN202210886007.2A CN202210886007A CN115851469A CN 115851469 A CN115851469 A CN 115851469A CN 202210886007 A CN202210886007 A CN 202210886007A CN 115851469 A CN115851469 A CN 115851469A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pichia pastoris
- alginate lyase
- strain
- algh
- alginate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010004131 poly(beta-D-mannuronate) lyase Proteins 0.000 title claims abstract description 55
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 title claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 14
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims abstract description 14
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 10
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims abstract description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 16
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 abstract description 14
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 abstract description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 abstract description 6
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 abstract description 5
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 abstract description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 abstract description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 abstract description 3
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 abstract description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 7
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 6
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 6
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 6
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 5
- -1 alginate oligosaccharide Chemical class 0.000 description 5
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 3
- 241000199919 Phaeophyceae Species 0.000 description 3
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- AEMOLEFTQBMNLQ-AZLKCVHYSA-N (2r,3s,4s,5s,6r)-3,4,5,6-tetrahydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound O[C@@H]1O[C@@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AZLKCVHYSA-N 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 2
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 108091022901 polysaccharide lyase Proteins 0.000 description 2
- 102000020244 polysaccharide lyase Human genes 0.000 description 2
- 150000004804 polysaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- IAJILQKETJEXLJ-KLVWXMOXSA-N (2s,3r,4r,5r)-2,3,4,5-tetrahydroxy-6-oxohexanoic acid Chemical group O=C[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-KLVWXMOXSA-N 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-SYJWYVCOSA-N (2s,3s,4s,5s,6r)-3,4,5,6-tetrahydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound O[C@@H]1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-SYJWYVCOSA-N 0.000 description 1
- OOSZCNKVJAVHJI-UHFFFAOYSA-N 1-[(4-fluorophenyl)methyl]piperazine Chemical compound C1=CC(F)=CC=C1CN1CCNCC1 OOSZCNKVJAVHJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 108010076804 DNA Restriction Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 208000032536 Pseudomonas Infections Diseases 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 101150001652 algL gene Proteins 0.000 description 1
- VLSMHEGGTFMBBZ-UHFFFAOYSA-N alpha-Kainic acid Natural products CC(=C)C1CNC(C(O)=O)C1CC(O)=O VLSMHEGGTFMBBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000007068 beta-elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- DGLRDKLJZLEJCY-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogenphosphate dodecahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O DGLRDKLJZLEJCY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 229950006874 kainic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000003760 magnetic stirring Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940074545 sodium dihydrogen phosphate dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产海藻酸裂解酶的毕赤酵母菌株及其应用。申请人首先将海藻酸裂解酶基因在毕赤酵母（Pichia pastoris）宿主中进行过表达，构建得到重组菌株；然后通过紫外诱变的方法获得海藻酸裂解酶产量显著提高的突变菌，命名为毕赤酵母ALGH‑33（Pichia pastoris ALGH‑33），保藏编号为CCTCC NO：M 20221120。该菌株摇瓶发酵上清液中海藻酸裂解酶酶活高达2361U/ml，比出发菌提高了41%，可广泛应用于海藻酸裂解酶的生产，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域中的推广与应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种高产海藻酸裂解酶的毕赤酵母菌株及其应用。
背景技术
海洋的水体环境具有高盐、高压、低温、寡营养的特点，因此赋予了海洋生物更多特殊的生理功效，是人类膳食营养和生物医药的巨大资源宝库。以海洋糖类为代表的海洋食品和生物医药产业等新型产业快速发展，为我国海洋产业的结构升级和可持续发展注入了新的动力。
褐藻有超过250个属，约1800余种，是我国十分重要的经济藻类。褐藻胶是广泛存在于各种褐藻中的一类多糖物质，由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronic acid，M）和 α-L-古罗糖醛酸（α-L-guluronic acid，G）通过1，4-糖苷键聚合而成的线性多糖，可以形成多聚甘露糖醛酸片段、多聚古罗糖醛酸片段和甘露糖醛酸-古罗糖醛酸混合片段。不同藻类来源的褐藻胶M与G的比值不同，其成胶性、离子结合能力、流动性等理化性质也各不相同。褐藻胶水溶液黏度高，常被用作增稠剂、稳定剂、赋形剂等应用到食品行业中。然而，褐藻胶分子量大，导致其水溶性差和生物利用度低，严重限制了其应用范围。
褐藻寡糖，是一种聚合度在2~25的分子，由褐藻胶分解而成，具有调节人体免疫、抗氧化、抗肿瘤、抑菌、保护神经***、促进植物生长等多种功能。由于褐藻寡糖具有良好的水溶性、 较强的稳定性、高生物利用度和安全无毒等特点，广受国内外研究学者的关注。而近年来的研究证明褐藻寡糖还具有多种生物活性， 如抗肿瘤、抗菌、增强巨噬细胞吞噬作用、促进白细胞因子的产生、促植物生长等， 在药物研制、功能食品开发、农业等领域具有广阔的开发前景。
褐藻寡糖的生产主要包括化学分解法、物理分解法和生物酶法。化学物理方法主要包括酸水解法、H2O2 法、臭氧法、辐照法等，但存在耗能大、副产物复杂等问题。与化学物理法生产的寡糖片段在两个末端都具有未修饰的己糖醛酸残基不同的是，酶法能生成含有不饱和双键还原末端的寡糖，反应副产物少、耗能低、产物生物活性高，具有很高的应用价值。在褐藻寡糖的生物转化中，海藻酸裂解酶发挥着至关重要的作用。
海藻酸裂解酶，是一种多糖裂解酶，通过β消除机制催化1，4-糖苷键发生水解，然后在断裂后新生成的C4-羟基处发生C4与C5间的脱去反应，生成非还原性末端的C4-C5双键。该双键与C5-羧羰基形成共轭结构，在紫外230nm~240nm处有特征性的强吸收。海藻酸裂解酶有多种分类方式，以不同底物偏好性可分为聚甘露糖醛酸（polyM）特异性酶、聚古罗糖醛酸（polyG）特异性酶和双功能酶；以酶的基因序列和主要结构来分, 在CAZy数据库中的21个多糖裂解酶家族中海藻酸裂解酶可分为PL-5、6、7、14、15、17、18；以反应方式可分为内切酶和外切酶；以分子量大小可分为小型（25kDa~30kDa）、中型（约40kDa）和大型裂解酶（>60kDa）。
海藻酸裂解酶用途广泛，除去降解褐藻胶生产褐藻寡糖作为食品与农业原料，在医学上还可以被加入到抗菌药物中协助对铜绿假单胞菌感染的治疗。海藻酸裂解酶主要来源于某些微生物和一些海洋动植物。2009年岳明等以 P.aeruginosa基因组DNA 为模板，克隆出 1.0 kb的海藻酸裂解酶基因algL，以pPIC9K-aly为表达载体利用聚乙二醇(PEG)转化法成功地在Pichia pastoris GS115 中表达。这是首次把海藻酸裂解酶在酵母菌株中进行表达。因为其具有甲醇诱导的强启动子，表达后通过加工、折叠使异源蛋白分泌到胞外，有利于产生活性蛋白，从而简化纯化过程，降低生产成本，为实现海藻酸裂解酶的工业化生产提供了可能性。但目前海藻酸裂解酶生产菌株的产量普遍偏低，导致该酶的成本居高不下，极大的限制了其广泛应用，因此开发海藻酸裂解酶高产菌株是当前的研究热点。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产海藻酸裂解酶的毕赤酵母菌株及其应用。申请人首先将海藻酸裂解酶基因在毕赤酵母（Pichia pastoris）宿主中进行过表达，构建得到重组菌株；然后通过紫外诱变的方法获得海藻酸裂解酶产量得到显著提高的突变菌，从而大幅度降低海藻酸裂解酶的生产成本，促进该酶在工业领域中的广泛应用。
本发明一方面涉及一种毕赤酵母工程菌，其携带有表达海藻酸裂解酶基因的重组质粒。
所述海藻酸裂解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的氨基酸序列为SEQID NO：2。
本发明另一方面涉及一种毕赤酵母突变菌株，是以上述毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。
所述突变菌株为毕赤酵母ALGH-33（Pichia pastoris ALGH-33），已于2022年7月15日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20221120。
本发明还涉及上述毕赤酵母菌株在海藻酸裂解酶生产中的应用。
本发明提供的毕赤酵母突变菌株能大幅度提高海藻酸裂解酶的产量，摇瓶发酵上清液中海藻酸裂解酶酶活高达2361U/ml，比出发菌提高了41%，取得了意料不到的技术效果。
所述突变菌株可广泛应用于海藻酸裂解酶的生产，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域中的推广与应用。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
主要试剂：海藻酸钠购自sigma-aldrich西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，各种限制性内切酶、DNA聚合酶等购自日本宝生物工程有限公司（大连），质粒提取纯化试剂盒购自上海生工生物工程有限公司。其余试剂均为国产分析纯，引物序列合成、核酸测序均由华大基因完成。
菌株与载体：大肠杆菌DH5α购自日本宝生物工程有限公司（大连），毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、G418购自Invitrogen公司。
主要培养基：
LB培养基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0；
YPD培养基：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；
MD培养基：1.34% YNB，4×10-5生物素，1%甘油、2%琼脂糖；
BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10-5%生物素，1%甘油；
BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10-5%生物素，0.5%甲醇。
氨苄青霉素（Amp）：储存浓度为100mg/ml，工作浓度为100mg/l；抗生素用ddH2O溶解，滤膜（0.22μm）过滤后，-20度保存。
遗传霉素G418：用ddH2O制备30ml遗传霉素（100mg/ml）储存液，过滤除菌，-20度保存。
下面结合具体实施方式，对本发明做进一步阐述。
实施例1基因克隆
以海藻酸裂解酶基因（GenBank号为QGU34249.1）的氨基酸序列为基础，分析该海藻酸裂解酶的氨基酸序列，去除其自身的信号肽，再根据毕赤酵母的密码子偏好性，对其进行密码子优化，由华大基因公司进行全基因合成。将该海藻酸裂解酶基因命名为ALGH，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。。
引物设计和反应条件如下：
上游引物1(F)：GCGCGAATTCTCTTTGACTAATCCTGGTTTTGAAA（下划线为EcoR I酶切位点）；
下游引物1(R)：TAAAGCGGCCGCTTAATCATGAGTATGTTCCAAAGAA（下划线为Not I酶切位点）。
采用PCR反应克隆海藻酸裂解酶基因ALGH片段，PCR条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸2min，35个循环后，72℃保温10min。ALGH基因全长1668bp。
实施例2 毕赤酵母工程菌的构建
1、重组质粒的构建
将克隆得到的海藻酸裂解酶基因ALGH，用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，100 μl酶切体系如下：海藻酸裂解酶基因ALGH的 PCR产物40 μl、10×H buffer 10 μl、10×BSA 10 μl、EcoR I 5 μl、Not I 5 μl、ddH2O 30 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
将表达载体pPIC9K先用限制性内切酶EcoR I进行单酶切，100 μl酶切体系如下：表达载体pPIC9K 20 μl、10×H buffer 10 μl、EcoR I 5 μl、ddH2O 65 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。将回收片段再用限制性内切酶Not I进行单酶切，100 μl酶切体系如下：pPIC9K回收片段 20 μl、10×H buffer 10 μl、10×BSA 10 μl、10×Triton 10 μl、Not I 5 μl、ddH2O 45 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
将经EcoR I和Not I双酶切的ALGH片段与表达载体pPIC9K连接，构建表达载体pPIC9K-ALGH。连接体系如下：表达载体pPIC9K双酶切产物5 μl、ALGH基因双酶切产物3 μl、10×T4 ligase buffer 1 μl、T4 ligase 1 μl。22 ℃连接过夜。
连接产物转化到大肠杆菌DH5α，把转化后的大肠杆菌涂于加有氨苄青霉素的LB平板上，37 ℃过夜培养，筛选Amp抗性重组子菌落，委托华大基因测序。测序验证正确的转化子转接到LB+Amp液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为重组酵母表达质粒pPIC9K-ALGH。
2、转化、筛选和摇瓶发酵验证
将重组酵母表达质粒pPIC9K-ALGH用Sal I进行线性化，线性化产物用柱纯化试剂盒纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，涂布于MD平板上，30℃培养3-5天。挑取单克隆划线接种于MD平板，之后点样于含G418的YPD抗性梯度平板。挑取高浓度平板上的单克隆，接种于BMGY培养基中，30℃、220rpm振荡培养24小时后再转入BMMY培养基中，30℃、220rpm振荡培养，每24小时添加终浓度0.5%的甲醇诱导。
甲醇诱导表达4d后，离心去除菌体，将上清液进行海藻酸裂解酶酶活力测定。结果显示，在摇瓶条件下，上述构建得到的毕赤酵母工程菌发酵上清液中海藻酸裂解酶酶活最高达到1680U/ml。将该转化子命名为毕赤酵母ALGH（Pichia pastoris ALGH）。
海藻酸裂解酶酶活检测方法
1、酶活定义
在40℃、pH7.5的条件下，每分钟降解底物海藻酸钠产生不饱和键，在235nm下，吸光度每增加0.1，为一个酶活单位U。
2、检测试剂
磷酸缓冲液（0.05M，pH7.5）
1）配制0.05M磷酸二氢钠溶液
称取3.9g二水合磷酸二氢钠，去离子水溶解后，定容至500ml。
2）配制0.05m磷酸氢二钠溶液
称取17.91g十二水合磷酸氢二钠，去离子水溶解后，定容至1000ml。
3）混合配制0.05M磷酸缓冲液
将2中的磷酸氢二钠溶液放置于2L烧杯中，用1中的磷酸二氢钠溶液调节其pH至7.5。
底物：0.3%海藻酸钠溶液
取100ml小烧杯，加入约80ml磷酸缓冲液；称取0.3g海藻酸钠，磁力搅拌条件下均匀加入到小烧杯中，搅拌至溶解；用磷酸缓冲液定容至100ml，配制当天使用。
终止液：0.06mol/L的磷酸终止液。根据不同的磷酸浓度进行计算。
（3）海藻酸裂解酶酶活测定步骤
取三支15mm×150mm试管，加入1.8ml底物，40℃水浴预热5min，加入准备好的酶液0.2ml，准确计时，涡旋振荡，40℃保温10min，将试管从水浴中取出并立即加入2ml磷酸终止液，涡旋振荡，将试管放置在水浴锅外的试管架上。
空白：取15mm×150mm试管，加入1.8ml底物，40℃水浴预热5min，加入0.2ml缓冲液，准确计时，涡旋振荡，40℃保温10min，将试管从水浴中取出并立即加入2ml磷酸终止液，涡旋振荡，将试管放置在水浴锅外的试管架上。
比色：每个样品的空白和酶反应终止后，立即在235nm比色，并记录吸光值A0和A样。
计算：X=（A0-A样）×2×N/（t×0.1）。
X——酶活力，U/ml或U/g；
2——加入2ml磷酸终止液的体积系数；
t（min）——酶促反应时间（在酶反应的线性范围内）；
0.1——体系系数，即将吸光值增长单位换算为0.1；
N——稀释倍速。
经简化：酶活力（U/ml）=吸光值差值×2×N。
实施例3 紫外诱变筛选
诱变育种是指在人为的条件下，利用物理、化学等因素，诱发生物体产生突变，从中选择，培育成动植物和微生物的新品种。具体方法包括物理诱变和化学诱变。
诱变育种的优缺点在于可在较短时间内获得优良品种，大幅度地改变某些性状。但是有益突变频率仍然较低，变异的方向和性质尚难控制。
紫外诱变导致的突变随机性很强，为了获得有效的正突变，通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但紫外诱变所需设备简单、费用少，且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。
申请人以毕赤酵母ALGH为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行诱变育种，进一步提高海藻酸裂解酶的产量。
将出发菌毕赤酵母ALGH接种于YPD平板，30℃培养2-3天，使用无菌水洗菌体，制成悬浮液，稀释至1×106个/mL，紫外灯（40W）照射2-10min，距离约22cm，致死率达到90%以上，涂布平板，30℃培养48h。
第一轮紫外诱变共获得了约500个突变菌单菌落，将各单菌落分别接种于装有200ul BMGY液体培养基的96孔板，30℃、220rpm振荡培养1天后，离心去掉上层培养基，再加入200ul BMMY培养基，30℃、220rpm振荡培养2天，每天添加0.5%的甲醇。诱导表达2天后，离心取上清液，分别测定海藻酸裂解酶酶活。
结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的突变菌中，没有一株突变菌的海藻酸裂解酶产量高于出发菌。申请人又按照上述方法继续进行了71轮诱变筛选，最终获得1株海藻酸裂解酶酶活明显高于出发菌的突变菌株，命名为毕赤酵母ALGH-33（Pichia pastoris ALGH-33）。
所述突变菌在摇瓶条件下，其发酵上清液中海藻酸裂解酶酶活高达2361U/ml，比出发菌提高了41%，取得了意料不到的技术效果。
申请人已于2022年7月15日将毕赤酵母ALGH-33（Pichia pastorisALGH-33）保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20221120。
本发明提供的毕赤酵母突变菌可用于海藻酸裂解酶的生产，有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域的广泛应用。
Claims (5)
1.一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述的毕赤酵母工程菌携带有表达海藻酸裂解酶基因的重组质粒。
2.如权利要求1所述的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述海藻酸裂解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
3.一种毕赤酵母突变菌，其特征在于，所述的突变菌是以权利要求1或2所述的毕赤酵母工程菌为出发菌，通过紫外诱变的方法获得的。
4.如权利要求3所述的毕赤酵母突变菌，其特征在于，所述突变菌为毕赤酵母ALGH-33（Pichia pastoris ALGH-33），已于2022年7月15日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20221120。
5.权利要求3或4所述的毕赤酵母突变菌在海藻酸裂解酶生产中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210886007.2A CN115851469A (zh) | 2022-07-26 | 2022-07-26 | 一种高产海藻酸裂解酶的毕赤酵母菌株 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210886007.2A CN115851469A (zh) | 2022-07-26 | 2022-07-26 | 一种高产海藻酸裂解酶的毕赤酵母菌株 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115851469A true CN115851469A (zh) | 2023-03-28 |
Family
ID=85660386
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210886007.2A Pending CN115851469A (zh) | 2022-07-26 | 2022-07-26 | 一种高产海藻酸裂解酶的毕赤酵母菌株 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115851469A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115161210A (zh) * | 2022-08-03 | 2022-10-11 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一株毕赤酵母突变菌及其在海藻酸裂解酶生产中的应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105154458A (zh) * | 2015-10-13 | 2015-12-16 | 滨州医学院 | 一种新型内切型褐藻胶裂解酶基因及工程菌和应用 |
| CN108929878A (zh) * | 2018-08-01 | 2018-12-04 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 褐藻胶裂解酶的编码基因及其应用 |
| CN109295043A (zh) * | 2018-10-19 | 2019-02-01 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种新型褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用 |
| CN109957536A (zh) * | 2017-12-14 | 2019-07-02 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌及其在海藻酸裂解酶生产中的应用 |
-
2022
- 2022-07-26 CN CN202210886007.2A patent/CN115851469A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105154458A (zh) * | 2015-10-13 | 2015-12-16 | 滨州医学院 | 一种新型内切型褐藻胶裂解酶基因及工程菌和应用 |
| CN109957536A (zh) * | 2017-12-14 | 2019-07-02 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一种枯草芽孢杆菌及其在海藻酸裂解酶生产中的应用 |
| CN108929878A (zh) * | 2018-08-01 | 2018-12-04 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 褐藻胶裂解酶的编码基因及其应用 |
| CN109295043A (zh) * | 2018-10-19 | 2019-02-01 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 一种新型褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115161210A (zh) * | 2022-08-03 | 2022-10-11 | 青岛蔚蓝生物集团有限公司 | 一株毕赤酵母突变菌及其在海藻酸裂解酶生产中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109295043B (zh) | 一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用 | |
| JP6771644B2 (ja) | 微生物発酵によるｎ−アセチル−ｄ−グルコサミン及び／又はｄ−グルコサミン塩の製造方法 | |
| CN106884025B (zh) | 一种酶法水解定向制备褐藻胶寡糖的方法 | |
| CN106995811B (zh) | 一种褐藻胶裂解酶、其制备方法及应用 | |
| CN112725319B (zh) | polyG底物特异性的褐藻胶裂解酶FaAly7及其应用 | |
| CN110951714B (zh) | 一种透明质酸水解酶及其编码序列和利用其制备寡聚透明质酸盐的方法 | |
| CN115851469A (zh) | 一种高产海藻酸裂解酶的毕赤酵母菌株 | |
| CN113106112B (zh) | 一种异源表达黄原胶内切酶的基因工程菌及应用 | |
| CN110144341B (zh) | 海藻酸裂解酶突变体 | |
| CN116064484B (zh) | 一种突变的几丁质酶SsChi18A-2及其应用 | |
| CN108865913B (zh) | 一种构建高效分泌表达硫酸软骨素水解酶重组菌的方法 | |
| CN116640744A (zh) | 壳聚糖酶OUC-CsnA4-S49I及其应用和制备壳寡糖的方法 | |
| CN115141841A (zh) | 一种毕赤酵母突变菌株及其在海藻酸裂解酶生产中的应用 | |
| CN114457062A (zh) | 用于制备褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶及其用途 | |
| CN105647898A (zh) | 一种海洋褐藻酸裂解酶及其表达基因与应用 | |
| CN106978410B (zh) | 一种具有壳聚糖水解活性的双功能葡聚糖酶、基因、载体、工程菌及其应用 | |
| CN113493747A (zh) | 一种高产环糊精葡萄糖基转移酶的突变菌株及其应用 | |
| CN109988723B (zh) | 一株产硫酸软骨素abc裂解酶的重组酵母菌及其构建方法与应用 | |
| CN114277044B (zh) | 一种分泌结冷胶裂解酶特异性降解结冷胶的基因工程菌及应用 | |
| CN115725555A (zh) | 一种褐藻胶裂解酶突变体 | |
| CN116064485B (zh) | 一种突变的几丁质酶SsChi18A-3及其应用 | |
| CN115232805B (zh) | 一种硫酸软骨素裂解酶及其重组菌株和应用 | |
| CN115161210A (zh) | 一株毕赤酵母突变菌及其在海藻酸裂解酶生产中的应用 | |
| CN115975829A (zh) | 一株高产海藻酸裂解酶的毕赤酵母突变菌及其应用 | |
| CN113403332B (zh) | 一种α-琼胶酶基因及其编码酶的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |