CN115838760A - 含茶树NAC转录因子CsNAC002基因的质粒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含茶树NAC转录因子CsNAC002基因的质粒及其应用，本发明的茶树NAC转录因子CsNAC002基因的表达与植物的黄酮醇含量相关，在茶树中沉默该基因可显著降低茶树的黄酮醇含量；在植株如拟南芥中过量表达CsNAC002基因可以显著提高黄酮醇的含量。

Description

含茶树NAC转录因子CsNAC002基因的质粒及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种含茶树NAC转录因子CsNAC002的质粒及其在调控黄酮醇类化合物代谢中的应用。

背景技术

茶是世界上最受欢迎的非酒精饮料之一。我国是世界上最早种茶、制茶、饮茶的国家，茶作为饮品在我国已有几千年的历史。大量的研究表明每日饮茶对人体健康有益，喝茶可以降低癌症发病率(Hertog等,1993；Soobrattee等,2010)减少脂肪在人体的积累(Ogden等,2006；Nagao等,2007；Auvichayapat等,2008)，改善血糖平衡(Kao等,2006；Fukino等,2008)，以及保持心血管健康(Nakachi等,2010；Ryu等,2006)。饮茶也可以预防与衰老有关的疾病，如老年痴呆症和帕金森(Afzal等,2015)。这些保健功能归因于茶中丰富的类黄酮化合物(Sueoka等,2001；Liu等,2012；Jiang等,2013)。丰富的类黄酮化合物(如表儿茶素、茶多酚、原花青素、表儿茶素-3-表没食子儿茶素没食子酸、槲皮素和没食子酸等)赋予了成品茶独特的滋味

黄酮醇属于黄酮类化合物，是黄酮类化合物中数量最多，分布最广的一类。常见的有山奈酚、槲皮素、杨梅素、异鼠李素和芦丁5种。普遍存在于植物的根、茎、叶、花、果实、种子中，具有药用、抗氧化、调节花色、调控激素、抗紫外线和抗病虫害等作用。黄酮醇在植物抗干旱、盐胁迫、低温、紫外线胁迫和植物激素胁迫等非生物胁迫中也具有重要作用。

黄酮醇类有多种生理活性，包括抗氧化、抗菌、抗炎、防癌、抗病毒和预防心血管疾病(Kumar and Pandey,2013)。流行病学调查显示，黄酮醇类能降低罹患癌症的风险(Calderon-Montano et al.,2011,Wang et al.,2016)，其中槲皮素能使增殖的淋巴样细胞产生周期停滞，并可抑制多种恶性肿瘤细胞生长(Lamson and Brignall,2000)。槲皮素对狂犬病病毒和脊髓灰质炎病毒有抗性，芦丁则可抵御流感病毒和马铃薯病毒侵袭(Middleton,1998)。而且黄酮醇与黄酮在抗病毒中具有强烈的协同增效作用。据报道，山奈酚和木犀草素复配可显著提升其对单纯疱疹病毒(HSV)的防效，槲皮素还可增强5-乙基-2-二氧尿苷和阿昔洛韦对HSV和假狂犬病毒的治疗效果(Cushnie and Lamb,2005)。

黄酮醇类是茶树中常见的黄酮类物质，约占到茶叶干重的3％～4％(宛晓春,2003)。黄酮醇极易溶于水，呈现出黄绿色，被认为是形成绿茶汤色的主要成分。且该类物质易发生自动氧化，是多酚类化合物自动氧化的主要物质，从而导致绿茶汤色劣变，对茶饮料品质影响极大。研究表明，黄酮醇类不仅是茶汤中主要的涩味成分，还可以明显加强咖啡因的苦味(Scharbert and Hofmann,2005)。

植物组织内黄酮醇的合成与积累受到植物种类、发育阶段、组织部位以及生长环境等多方因素的协同调控，且黄酮醇合成酶(FLS)、查尔酮合成酶(CHS)、查尔酮异构酶(CHI)等关键酶基因的表达水平在调控黄酮醇的生物合成和组织积累中发挥重要作用。研究显示，黄酮类化合物的合成途径在转录水平上主要受R2R3-MYB转录因子、bHLH转录因子和WD40蛋白的调控。MYB、bHLH和WD40转录因子单独或形成复合体后调节CHS、CHI和FLS等关键酶基因的表达，进而调控黄酮醇的生物合成。其他类转录因子，如NAC、WRKY和bZIP等家族部分成员也被证实在转录水平上调控黄酮醇生物合成关键基因表达进而影响植物黄酮醇的合成。从挪威云杉中鉴定的NAC家族转录因子PaNAC03通过负调控CHS、F3'H和PaLAR3的表达，抑制黄酮类化合物的合成(Dalman et al.,2017)。在拟南芥中的研究发现，NAC转录因子ANAC078在高光条件下促进植物类黄酮合成途径中相关基因的转录(Morishita et al.,2009)。虽然对于NAC转录因子的研究随着生物技术的进步已经有了许多成果，但是相比于MYB、bHLH和WD40等类型的转录因子来说，NAC转录因子仍有很大的探索空间。截止目前，茶树中NAC转录因子调控黄酮醇类化合物合成的相关机理尚不明确，有待于进一步研究。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种茶树NAC转录因子CsNAC002基因。

本发明的另一个目的在于提供上述茶树NAC转录因子CsNAC002蛋白。

本发明的另一个目的在于提供一对用于扩增茶树NAC转录因子CsNAC002基因的引物。

本发明的另一个目的在于提供一种含有上述茶树NAC转录因子CsNAC002的重组表达载体。

本发明的另一个目的在于提供一种含有上述茶树NAC转录因子CsNAC002的转基因植株。

本发明的另一个目的在于提供上述茶树NAC转录因子CsNAC002在调控植物黄酮醇类合成过程中的应用。

本发明的另一个目的在于提供十对用于沉默茶树NAC转录因子CsNAC002基因表达的引物。

本发明的另一个目的在于提供上述茶树NAC转录因子CsNAC002在调控植物黄酮醇类合成过程中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案来实现：

第一方面，本发明提供一种含茶树NAC转录因子CsNAC002基因的表达质粒，所述表达质粒按如下方法制备：将茶树NAC转录因子CsNAC002基因***含有35S启动子(CaMV35S启动子)的表达载体得到。

在本发明的一个实施例中，所述茶树NAC转录因子CsNAC002基因编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。该序列有302个氨基酸。进一步，所述茶树NAC转录因子CsNAC002基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，最大开放阅读框(编码区)为906bp。

在本发明的一个实施例中，所述35S启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

在本发明的一个实施例中，所述表达载体为pCAMBIA2300。

实施例中提供了一对用于扩增茶树NAC转录因子CsNAC002基因的引物，包括上下游引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。以及十对用于沉默茶树NAC转录因子CsNAC002的引物，包括上下游引物。

在已经研究的NAC转录因子中发现相当一部分参与了植物类黄酮物质的生物合成。在苹果中发现MdNAC52在苹果着色的过程中转录水平提高，在苹果愈伤组织对该基因进行过表达发现它能够促进花色素的积累，此外还发现MdNAC52可与MdMYB9和MdMYB11的启动子相互作用，调控花青素的生物合成(Sun et al.,2019)。在MdNAC42表达水平较高的红瓤果实中，花色素的含量显著高于白瓤果实，在苹果愈伤组织中过表达MdNAC42后发现，MdCHS、MdCHI、MdF3H、MdDFR、MdANS和MdUFGT等类黄酮合成途径中的关键基因表达水平显著上调，促进花色素在苹果愈伤组织中的积累(Zhang et al.,2020)。

上述茶树NAC转录因子CsNAC002可以调控植物黄酮类化合物合成过程。

第二方面，本发明提供一种上述含茶树NAC转录因子CsNAC002基因的表达质粒转化农杆菌制备的转基因农杆菌。

第三方面，本发明还提供一种上述转基因农杆菌制备的过表达黄酮醇的转基因植株。

在本发明的一个实施例中，所述转基因植株的宿主为拟南芥(Arabidopsisthaliana)。

进一步，所述转基因植株按如下方法制备：

(1)培养所述的转基因农杆菌至菌液的OD₆₀₀为0.6，得到重组基因工程菌的菌液；将植株花序浸泡于所述重组基因工程菌的菌液中进行浸染，培养，收种，得到种子；

(2)步骤(1)所述的种子干燥后，培养至成株，取叶片进行凝胶电泳验证，即得到所述过表达黄酮醇的转基因植株。

在本发明的一个实施例中，提供一种转基因植株的制备方法，包括如下步骤：

1)将所述的茶树NAC转录因子CsNAC002基因***到含有35S启动子的表达载体后，得到含茶树NAC转录因子CsNAC002基因的表达质粒，将所述表达质粒转化农杆菌感受态细胞，获得用于侵染拟南芥的转基因农杆菌；

2)培养步骤(1)所述的转基因农杆菌至菌液的OD₆₀₀为0.6，得到重组基因工程菌的菌液；将拟南芥(Arabidopsis thaliana)花序浸泡于所述重组基因工程菌的菌液中1min进行浸染，取出放入暗箱中，覆膜保湿，暗培养一天；在28℃的培养温度下按照光照16hr/d，黑暗8hr/d进行培养，5-7天后再浸染一次，在28℃的培养温度下按照光照16hr/d，黑暗8hr/d进行培养，收种，得到拟南芥种子；

3)步骤(2)所述的拟南芥种子干燥后，播种于培养基中，在28℃的培养温度下按照光照16hr/d，黑暗8hr/d进行培养，待长出绿色嫩芽后，挪至土壤中，在28℃的培养温度下按照光照16hr/d，黑暗8hr/d进行培养；所得植株通过提取叶子DNA，凝胶电泳验证后，即得到所述过表达黄酮醇的转基因植株。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明的茶树NAC转录因子CsNAC002基因的表达与植物的黄酮醇含量相关，在茶树中沉默该基因可显著降低茶树的黄酮醇含量；在植株如拟南芥中过量表达CsNAC002基因可以显著提高黄酮醇的含量。

附图说明

图1为CsNAC002转录因子结构域示意图。

图2为CsNAC002氨基酸序列分析图。

图3为CsNAC002过表达载体的构建示意图。

图4为野生型拟南芥和过量表达CsNAC002基因拟南芥的黄酮醇含量图。

图5为黄酮醇合成途径关键结构基因FLS在野生型以及过表达CsNAC002基因拟南芥中的表达量图。

图6为茶树沉默CsNAC002基因后叶片中CsNAC002表达量情况图。

图7为茶树沉默CsNAC002基因后叶片中黄酮醇含量图。

图8为CsNAC002调控黄酮醇合成通路的模拟示意图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1茶树NAC转录因子CsNAC002基因的分离和克隆。

1、引物设计：本发明前期对‘紫娟’茶树(Camellia sinensis var.assamica‘Zijuan’)的不同发育阶段叶片进行转录组测序(百迈客生物科技有限公司)，在转录组数据库中分析获取CsNAC002基因。根据已知的序列全长设计扩增CsNAC002的特异引物：

F：5’-ATGACGAGCAGTAGCAGTCAGTTG-3’；

R：5’-CTAGAATGGCTTCGGCATGAA-3’；

2、RNA的提取：使用诺唯赞生物科技(南京)股份有限公司的

Universal

PlantTotal RNAIsolation Kit多糖多酚植物总RNA提取试剂盒以‘紫娟’茶树新梢叶片为材料提取总RNA，使用琼脂糖凝胶电泳分析检测RNA的完整性，使用Nanodrop检测RNA的浓度(OD₂₆₀/OD₂₈₀读数在1.8-2.1之间为高质量RNA)，剩余RNA在-80℃保存备用。

3、cDNA第一链的合成：使用杭州新景生物试剂开发有限公司的cDNA第一链合成试剂盒说明书反转录合成cDNA第一条链。在高压灭菌过的RNase-Free离心管中依次加入反应试剂(表1)，42℃恒温反应3min去除RNA中的DNA。将去除DNA的反应产物，加入第一链cDNA合成试剂(表2)。在42℃孵育15min后，95℃孵育3min后，获得cDNA溶液。贮存于-20℃冰箱备用。

表1去除基因组DNA反应体系

表2第一链cDNA合成体系

4、PCR扩增：反应条件：94℃预变性5min；94℃20s，58℃30s，72℃2min 30s，30个循环；72℃延伸7min。将扩增获得的PCR产物连接到pCAMBIA2300载体(实验室保存)，筛选阳性克隆并测序，获得CsNAC002基因全长。

序列分析发现：CsNAC002的开放阅读框为906bp，如SEQ ID NO：1所示，编码302个氨基酸(如SEQ ID NO：2所示)，具有NAC转录因子的保守结构域(见图1)。

实施例2茶树NAC转录因子CsNAC002过表达载体的构建和转化。

1、过表达载体的构建示意图如图3所示，具体步骤为：以实施列1得到的茶树‘紫娟’cDNA为模板，设计特异性引物：pCAMBIA2300-CsNAC002-F：5’-ATGACGAGCAGTAGCAGTCAGTTG-3’，pCAMBIA2300-CsNAC002-R：5’-CTAGAATGGCTTCGGCATGAA-3’，进行PCR扩增。同时用BamH I(TaKaRa)与Sal I(TaKaRa)双酶切含有35s启动子的pCAMBIA2300载体使其线性化后，采用

II One Step Cloning Kit(南京诺唯赞生物科技有限公司)进行连接。酶切体系：BamH I 1μL+Sal I 1μL+10×Buffer 2μL+质粒3μL+H₂O补齐到10μL，37℃温育2hr，琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果后回收。将回收产物和连接试剂混匀(表3)，置于37℃反应30min。待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min，待转化。

表3

II One Step Cloning Kit的连接体系

2、大肠杆菌感受态的制备

(1)从-80℃冰箱中取出保存的大肠杆菌菌株，接种在LB固体培养基上，37℃过夜培养(大约12h)；

(2)挑取LB固体培养基上的单菌落，接种到3～5mL LB液体培养基中，37℃过夜震荡培养(大约12h)；

(3)将该菌液以1：100接种，37℃震荡培养2～3hr至OD₆₀₀＝0.5；

(4)将菌液移入50mL离心管中，在冰上放置10min；

(5)4℃，4000r/min离心10min，弃上清液，并将管倒置1min以让培养液流净；

(6)用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液将菌轻轻悬浮，冰上放置30min；

(7)4℃，4000r/min离心10min，弃上清液，加入2mL预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液，轻轻重悬浮菌液，冰上放置；

(8)将制备好的感受态细胞与30％甘油1:1混合(甘油终浓度为15％)；

(9)将感受态细胞分装为100μL/管，液氮速冻后放入-80℃冰箱保存。

3、重组质粒转化大肠杆菌感受态以及阳性克隆鉴定

(1)在冰上融化大肠杆菌感受态细胞，取10μL重组产物加入100μL感受态细胞中，吸打混匀(避免剧烈震荡)，冰上放置30min；

(2)置于42℃水浴锅热激80s后，立即置于冰上放置3～5min；

(3)加入700μL LB液体培养基(不含任何抗生素)，37℃200r/min摇菌1hr；

(4)将菌液室温5,000r/min离心5min，弃700μL上清液，用管中剩余培养基对菌块重悬浮，涂布到含有50μg/ml Kana抗生素的平板上；

(5)37℃培养12～16hr；

(3)挑取单克隆，使用至少一条载体上的通用引物和克隆基因的特异性引物进行PCR扩增，按照PCR反应体系(表4)使用北京擎科新业生物技术有限公司的T5 DNA聚合酶进行阳性克隆的筛选。将阳性克隆的单菌落进行扩繁，送公司测序，序列比对正确后，提取质粒保存于-20℃备用。

表4菌落PCR体系

4、农杆菌感受态的制备

(1)挑取农杆菌GV3101(Agrobacterium tumefaciens)单菌落，接种于10mL YEP培养基中，28℃振荡培养过夜；

(2)取400μL菌液置于50mL YEP培养液中，28℃振荡培养5～6h至OD₆₀₀为0.5；

(3)菌液倒入50mL离心管中，6000rpm离心5min后，弃上清液；

(4)将菌体重悬于10mL 0.15M的NaCl中，之后6000rpm离心5min，弃上清液；

(5)菌体用l mL预冷的20mM CaCl₂溶液轻轻悬浮，加入预冷的15％甘油，100μL分装，-80℃冰箱保存备用。

5、重组质粒转化农杆菌感受态细胞

(1)取-80℃保存的100μL农杆菌感受态细胞置冰上，完全解冻后轻轻将细胞悬浮；

(2)加入5μL质粒混匀后冰上放置30min；

(3)将离心管放入液氮中速冻5min，37℃水浴中热激1min，迅速转移至冰上，冰浴2min；

(4)加入1mL YEP液体培养基，28℃振荡培养1hr；

(5)4000rpm离心5min，加100μL YEP培养液悬浮细胞；

(6)将菌液涂布于含有50μg/ml Kana和50μg/ml Rif抗生素的YEP平板上上，28℃培养32～48hr；

(7)挑取长出的农杆菌菌落于YEP液体培养基28℃摇菌24hr，再通过PCR对菌落进行检测筛选阳性克隆。

实施例3茶树基因沉默方法：

(1)设计反义寡聚核苷酸引物：利用网站http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/

index.pl设计特定基因的反义寡聚核苷酸引物；

(2)根据GC％和Oligo binding energy从网站给出的20对引物中筛选出10对，送公司合成；引物序列：S1-ATGCATGAATATCGGTTAGC、A1-GCTAACCGATATTCATGCAT；

S2-GCATGAATATCGGTTAGCCA、A2-TGGCTAACCGATATTCATGC；

S3-AACAAGAAGGGTGCTATTGA、A3-TCAATAGCACCCTTCTTGTT；

S4-ACAAGAAGGGTGCTATTGAG、A4-CTCAATAGCACCCTTCTTGT；

S5-GGTCCAAAGCCAACTCAATA、A5-TATTGAGTTGGCTTTGGACC；

S6-GTCCAAAGCCAACTCAATAT、A6-ATATTGAGTTGGCTTTGGAC；

S7-AATGACTTGGAAAATGCCCT、A7-AGGGCATTTTCCAAGTCATT；

S8-ATGACTTGGAAAATGCCCTC、A8-GAGGGCATTTTCCAAGTCAT；

S9-TGCCCTCGATTTTCAGTTTA、A9-TAAACTGAAAATCGAGGGCA；

S10-GCCCTCGATTTTCAGTTTAA、A10-TTAAACTGAAAATCGAGGGC。

(3)引物稀释：引物终浓度为5μM，用RNA-Free H₂O稀释；

(4)选择待沉默样本(健康的福鼎大白茶第五叶)；

(5)沉默方法：

注射：选择长势良好的‘福鼎大白茶’第五片叶，分别将sense和antisense引物注射进同一片叶子的两半叶片，用1mL注射器抽取稀释好的5μM的引物溶液，用注射器针头轻轻摩擦茶叶叶背，注射引物，直至注射半片叶子，对照为相同浓度的正义链稀释引物溶液，注射后放进霍格兰营养液中，并在植株室室温培养6天后进行下一步处理或者采取液氮固样-80°保存，进行下一步检测分析；该实验不低于3个重复。

表5为qRT-PCR检测茶树CsNAC002基因表达量的引物序列

结果如图6、7所示，图6为茶树沉默CsNAC002基因后的荧光定量结果，图7为茶树沉默CsNAC002基因后的黄酮醇含量图。同一片茶树叶片中，沉默CsNAC002的茶树叶片，黄酮醇含量也显著下降。

6、转基因拟南芥制备

(1)将SEQ ID NO：1所示茶树NAC转录因子CsNAC002通过多克隆位点***到含有35S启动子的表达载体，得到含有CsNAC002的重组载体，将重组载体转化农杆菌感受态细胞，获得用于侵染拟南芥的农杆菌菌株。

(2)将拟南芥(Arabidopsis thaliana)花序浸泡于所述重组基因工程菌的菌液中1min，所述重组基因工程菌的菌液的OD₆₀₀为0.6；

(3)将拟南芥取出放入暗箱中，上面覆膜保湿，暗培养一天；

(4)将拟南芥取出，在28℃的培养温度下按照光照16hr/d，黑暗8hr/d进行培养。

(5)隔5-7天再浸染一次，在28℃的培养温度下按照光照16hr/d，黑暗8hr/d进行培养。

(6)对拟南芥进行收种，待种子干燥后，播种于培养基中；

(7)将培养基在28℃的培养温度下按照光照16hr/d，黑暗8hr/d进行培养；

(8)待培养基长出绿色嫩芽后，挪至土盆中；

(9)将土盆中幼苗在28℃的培养温度下按照光照16hr/d，黑暗8hr/d进行培养。

(10)通过提取叶子DNA，凝胶电泳验证后，即得到所述过表达黄酮醇的植株。

实施例4NAC转录因子CsNAC002过表达拟南芥植株中黄酮醇含量的测定

(1)分别取野生型和过表达CsNAC002的拟南芥0.2g，在1mL提取液(含有0.1％盐酸的甲醇溶液)中均质，然后在4℃的黑暗环境中放置24hr。

(2)使用TSK ODS-80Ts QA(4.6mm×250mm，5μm，Tosoh)柱通过HPLC分析黄酮醇的含量。流动像中溶剂A是10％的甲酸(水的体积分数)，溶剂B是纯甲醇。梯度条件为：0min，17％溶剂B；15min，35％溶剂B；40min，37％溶剂B；42min，100％溶剂B；44min，100％溶剂B；45min，17％溶剂B；46min，17％溶剂B。进样量为10μL，色谱柱柱温为40℃，流速为1.0mL/min，在360nm处检测黄酮醇的吸收峰面积。黄酮醇以槲皮素-3-葡萄糖苷为标准品计算含量。最终的黄酮醇含量用(样品的吸收峰面积/标准品的吸收峰面积)*标准品的浓度g^-1(FW)表示。测定结果如图4。

实施例5黄酮醇合成酶基因FLS在野生型和CsNAC002过表达拟南芥中的表达分析

本实施例研究了黄酮醇合成途径酶基因FLS在野生型和过表达CsNAC002拟南芥中的表达量情况。具体步骤为，根据目的基因的序列设计特异引物和内参基因Actin引物(见表6)，使用天根生化科技(北京)有限公司的RNAprep Pμre多糖多酚植物总RNA提取试剂盒对拟南芥的叶片进行总RNA的提取，然后使用莫纳生物科技有限公司的MonScript^TMRTIIISuper Mix with dsDNase反转录试剂盒反转成cDNA，将cDNA稀释10倍作为qRT-PCR的模板。使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的ChamQ SYBR qPCR Master Mix进行qRT-PCR反应，每个反应设3次重复，qRT-PCR反应体系如下：cDNA模板2μL，2×SYBRGreenMIX 10μL，10μmol L^-1正向引物0.4μL，10μmol L^-1反向引物0.4μL，加水至总体积达到20μL。qRT-PCR程序：95℃，10min；95℃，10s；58℃，10s；72℃，15s；35个循环；72℃，20min。反应产物用融解曲线分析。使用耶拿分析仪器(北京)有限公司的实时荧光定量PCR仪收集数据，FLS基因的相对表达量用CT值的2^-△△CT法计算，结果见图5。

表6为qRT-PCR检测FLS基因表达量的引物序列

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Claims (10)

1.一种含茶树NAC转录因子CsNAC002基因的表达质粒，其特征在于所述表达质粒按如下方法制备：将茶树NAC转录因子CsNAC002基因***含有35S启动子的表达载体得到。

2.如权利要求1所述的含茶树NAC转录因子CsNAC002基因的表达质粒，其特征在于：所述茶树NAC转录因子CsNAC002基因编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1或2所述的含茶树NAC转录因子CsNAC002基因的表达质粒，其特征在于：所述茶树NAC转录因子CsNAC002基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.如权利要求1所述的含茶树NAC转录因子CsNAC002基因的表达质粒，其特征在于：所述35S启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

5.如权利要求1所述的含茶树NAC转录因子CsNAC002基因的表达质粒，其特征在于：所述表达载体为pCAMBIA2300。

6.如权利要求1所述的含茶树NAC转录因子CsNAC002基因的表达质粒转化农杆菌制备的转基因农杆菌。

7.如权利要求6所述的转基因农杆菌制备的过表达黄酮醇的转基因植株。

8.如权利要求7所述的转基因植株，其特征在于：所述转基因植株的宿主为拟南芥。

9.如权利要求7所述的转基因植株，其特征在于：所述转基因植株按如下方法制备：(1)培养步骤(1)所述的转基因农杆菌至菌液的OD₆₀₀为0.6，得到重组基因工程菌的菌液；将植株花序浸泡于所述重组基因工程菌的菌液中进行浸染，培养，收种，得到种子；(2)步骤(1)所述的种子干燥后，培养至成株，取叶片进行凝胶电泳验证，即得到所述过表达黄酮醇的转基因植株。

10.如权利要求9所述的转基因植株，其特征在于：所述转基因植株按如下方法制备：

1)将所述的茶树NAC转录因子CsNAC002基因***到含有35S启动子的表达载体后，得到含茶树NAC转录因子CsNAC002基因的表达质粒，将所述表达质粒转化农杆菌感受态细胞，获得用于侵染拟南芥的转基因农杆菌；

2)培养步骤(1)所述的转基因农杆菌至菌液的OD₆₀₀为0.6，得到重组基因工程菌的菌液；将拟南芥花序浸泡于所述重组基因工程菌的菌液中1min进行浸染，取出放入暗箱中，覆膜保湿，暗培养一天；在28℃的培养温度下按照光照16hr/d，黑暗8hr/d进行培养，5-7天后再浸染一次，在28℃的培养温度下按照光照16hr/d，黑暗8hr/d进行培养，收种，得到拟南芥种子；

3)步骤(2)所述的拟南芥种子干燥后，播种于培养基中，在28℃的培养温度下按照光照16hr/d，黑暗8hr/d进行培养，待长出绿色嫩芽后，挪至土壤中，在28℃的培养温度下按照光照16hr/d，黑暗8hr/d进行培养；所得植株通过提取叶子DNA，凝胶电泳验证后，即得到所述过表达黄酮醇的转基因植株。

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