CN104120137A - 调控水稻叶片衰老和抗旱能力的基因OsNAP及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一个调控水稻叶片衰老和抗旱能力的基因OsNAP及应用。该基因的核酸序列如SEQ ID NO：1所示；其cDNA序列如SEQ ID NO：2所示。其蛋白质的序列如SEQ ID NO：3所示。该基因在幼嫩的水稻叶片中有一定的表达，随着叶片衰老程度加深其表达量逐渐上升，当叶片衰老程度到达晚期时表达活性达到顶点。通过对超量表达和抑制表达该基因的转基因水稻植株的研究，发现超量表达转基因植株叶片衰老进程加速，同时苗期抗旱性明显提高。抑制表达转基因植株的叶片衰老进程明显延缓。表明该基因具有调控水稻叶片衰老和提高抗逆性的功能。

Description

调控水稻叶片衰老和抗旱能力的基因OsNAP及应用

技术领域

本发明属于植物基因工程和水稻分子育种技术领域，具体涉及一个调控水稻叶片衰老和抗旱能力的基因OsNAP及应用。

背景技术

叶片衰老是叶片发育过程中的一个必经阶段，它伴随着叶片颜色的变化，反映在叶绿素的丧失，最后导致叶片的死亡和脱落。叶片衰老会导致光合作用的下降，导致碳同化的减少，从而影响农作物的产量。因此近几十年，人们一直在研究叶片衰老产生的原因和机理，希望能够有计划的控制叶片衰老的发生。

NAC转录因子(NAM,ATAF and CUC)是植物中特有的转录因子，很多研究表明它们在调控叶片衰老的过程起着重要的作用。小麦中的一个NAC基因NAM-B1受衰老调控，在调节谷粒蛋白中锌和铁的含量中起着一定的作用(Uauy等，A NAC gene regulating senescenceimproves grain protein,zinc,and iron content in wheat.Science,2006,314:1298-1301)。ANAC092/AtNAC2/ORE1是拟南芥中的一个NAC基因，其表达量也受叶片衰老调控，它能正调控拟南芥叶片中年龄依赖的细胞死亡；oresara1(ore1)突变体由于缺少ANAC092/AtNAC2/ORE1基因的功能，表现出延缓叶片衰老的表型；ANAC092/AtNAC2/ORE1也能被盐胁迫诱导表达，其突变体anac092-1的离体叶片在盐胁迫处理下叶绿素降解速度下降，表现出延缓叶片衰老的表型；在ANAC092/AtNAC2/ORE1的超量表达植株中有170个基因激活表达，其中很多基因能被盐胁迫诱导，说明ANAC092/AtNAC2/ORE1在盐胁迫诱导的叶片衰老过程起着重要的作用(Oh等，Identification of three genetic loci controlling leafsenescence in Arabidopsis thaliana.Plant J,1997,12:527-535；Kim等，Trifurcate feed-forwardregulation of age-dependent cell death involving miR164 in Arabidopsis.Science,2009,323:1053-1057；Balazadeh等，A gene regulatory network controlled by the NAC transcription factorANAC092/AtNAC2/ORE1 during salt-promoted senescence.Plant J,2010a,62:250-264；Balazadeh等，Salt-triggered expression of the ANAC092-dependent senescence regulon inArabidopsis thaliana.Plant Signal Behav,2010b,5:733-735)。ORS1是ORE1/ANAC092/AtNAC2的同源基因，在衰老的组织中表达量很高且能被盐和H₂O₂诱导，ORS1超量表达植株叶片早衰，同时ORS1的突变体ors1-1和RNAi转基因植株叶片延缓衰老，说明ORS1可能在盐和H₂O₂诱导的叶片衰老过程起着一定的作用(Balazadeh等，ORS1,an H₂O₂-responsive NACtranscription factor,controls senescence in Arabidopsis thaliana.Mol Plant,2011,4:346-360)。拟南芥中的VND-INTERACTING2(VNI2)也编码一个NAC转录因子，它的表达量受ABA和叶片衰老诱导，通过调控RESPONSIVE TO DEHYDRATION(RD)和COLD-REGULATED(COR)来介导盐胁迫和叶片衰老途径(Yang等，The Arabidopsis NAC transcription factor VNI2integrates abscisic acid signals into leaf senescence via the COR/RD genes.Plant Cell,2011,23:2155-2168)。AtNAP仅在衰老叶片中表达，而且它的表达量随着叶片的衰老逐渐上升；突变体atnap在自然生长状态和黑暗诱导状态下均表现出延缓叶片衰老的表型，超量表达AtNAP的转基因植株出现明显的早衰现象，而且水稻、四季豆的NAP同源基因都能异源互补拟南芥突变体atnap的持绿表型；进一步研究发现AtNAP可以和SENESCENCE-ASSOCIATEDGENE113(SAG113)的启动子结合，形成一个ABA-AtNAP-SAG113蛋白调控链来控制叶片衰老时的气孔运动和失水速率(Guo等，AtNAP,a NAC family transcription factor,has an importantrole in leaf senescence.Plant J,2006,46:601-612；Zhang等，An abscisic acid-AtNAP transcriptionfactor-SAG113 protein phosphatase 2C regulatory chain for controlling dehydration in senescingArabidopsis leaves.Plant Physiol,2012,158:961-969)。尽管很多NAC转录因子的表达量都能被衰老所上调，但是它们在叶片衰老中的作用还不是很清楚，还有待人们去研究。

水稻是人类主要的粮食作物之一，水稻中60％到100％的碳都是在籽粒灌浆期间固定的，因而水稻在生育期内叶片衰老的快慢会直接影响其产量(Murchie等，Interactions betweensenescence and leaf orientation determine in situ patterns of photosynthesis and photoinhibition infield-grown rice.Plant Physiol,1999,119:553-564)。随着生物技术的发展，在培育持绿性水稻的策略中，采用分子遗传调控的手段来延缓叶片衰老是一条经济有效且保护环境的措施。因此，对优良的衰老相关基因加以改良，培育出延缓叶片衰老的水稻品种，对于增加水稻的产量有着重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺限，提供一个能调控叶片衰老和提高抗旱性的基因及应用，所述的基因与NAC转录因子基因有关。

本发明提供了一种能调控水稻叶片衰老和提高抗旱性的NAC转录因子，该转录因子基因是OsNAP基因，该基因来源于水稻。其cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO：2中第1-1783位所示；其蛋白质的序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明还涉及所述能调控水稻叶片衰老和提高抗旱性的相关基因OsNAP的表达载体的构建，所述表达载体包含有如SEQ ID NO：1中第1-1895位所示的核苷酸序列。

本发明还涉及利用所述水稻叶片相关衰老基因OsNAP表达载体转化水稻宿主。

本发明的OsNAP基因可以构建到不同的表达载体中发挥其功能，例如：

1)为了便于对转基因的细胞或植物进行筛选，可以对所使用的载体进行改造，如加入植物可选择性标记(Bar基因、GUS基因、GFP基因和Lux基因等)；

2)为了改变目的基因OsNAP的表达量，可在其转录起始核苷酸前使用不同的启动子，如增强型启动子、诱导型启动子、组成型启动子、组织特异性启动子、发育时期特异性启动子等。

3)带有本发明的OsNAP基因的表达载体转化不同的植物细胞或组织，以获得叶片衰老进程改变、抗旱能力增强等性状的转基因植物。其中，被转化的宿主可以是单子叶植物，如水稻、玉米、小麦和草坪草等；也可以是双子叶植物，如拟南芥、杨树、大豆和棉花等，但不局限于以上所述物种。

4)带有本发明的OsNAP基因的表达载体除了可以通过农杆菌Ti质粒介导法来进行转化外，还可以通过Ri质粒、植物病毒载体、显微注射等方法来转化不同的植物细胞或组织，并将其育成植株，以得到含有目的性状的转基因植物。

实现本发明的具体步骤是：

(1)超量表达载体p1301-OsNAP的构建及表型分析

1)以水稻品种中花11基因组DNA为模板，经PCR扩增得到OsNAP的基因组DNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2)将步骤1)中得到的DNA片段连接到质粒pCAMBIA1301(由澳大利亚CAMBIA惠赠)上，得到p1301-OsNAP载体，然后将其导入农杆碱型的根癌农杆菌EHA105(由澳大利亚CAMBIA惠赠)，再利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述的载体导入水稻品种中花11，获得转基因植株。

3)用qRT-PCR的方法检测转基因植株及野生型中OsNAP基因的表达量。

4)测定转基因植株及野生型各时期叶片的叶绿素含量和净光合速率，观察其表型并拍照，分析转基因和野生型植株叶片衰老情况的差异。

5)将正常生长至4叶期的野生型和转基因植株进行干旱胁迫处理，观察其表型，比较转基因和野生型植株对干旱胁迫的抗性差别。

(2)RNAi载体的构建及表型分析

1)以水稻品种中花11衰老叶片RNA反转录的cDNA为模板，经PCR扩增OsNAP非保守的3’-UTR区域，然后分别连接到pMCG161和pDS1301上(Yuan等，Mitogen-activated proteinkinase OsMPK6 negatively regulates rice disease resistance to bacterial pathogens.Planta,2007,226:953-960)，形成pMCG161-OsNAP和pDS1301-OsNAP。再分别酶切pMCG161-OsNAP和pDS1301-OsNAP，将pMCG161-OsNAP的外源和pDS1301-OsNAP的载体相互连接形成RNAi载体。

2)将步骤1)中得到的RNAi载体导入农杆碱型的根癌农杆菌EHA105，再利用农杆菌介导的遗传转化方法将所述的载体导入水稻品种中花11，获得转基因植株。

3)测定转基因植株各时期叶片的叶绿素含量，观察其表型并拍照，分析转基因和野生型植株叶片衰老情况的差异。

4)用qRT-PCR的方法检测转基因植株中OsNAP和衰老Marker基因的表达量，分析它们在转基因和野生型植株叶片中的表达量差异。

本发明的优点在于：

(1)本发明鉴定了一个叶片衰老相关基因OsNAP，可以作为水稻中研究叶片衰老的Marker基因，为后续的研究者提供参考。

(2)本发明中鉴定叶片衰老相关基因的方法，可为后续的研究者提供参考。

(3)本发明得到的改变叶片衰老进程的转化植株为基因工程和分子育种提供了新的资源。

(4)本发明得到的超量表达转化植株可以一定程度上提高抗旱能力，为水稻抗旱改良提供了新的资源。

(5)带有本发明的OsNAP基因的表达载体可以转化不同的植物细胞或组织，以获得衰老进程改变、抗旱能力增强等性状的转基因植物。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的OsNAP基因的核苷酸序列，序列长度为1895 bp。

序列表SEQ ID NO：2是本发明克隆的OsNAP基因的全长cDNA序列；长度为1783 bp；在该序列的172-1350 bp区段是该基因的CDS区，长度为1179 bp。

序列表SEQ ID NO：3是OsNAP基因的蛋白质序列，编码392个氨基酸。

图1：是本发明商购的原始载体pCAMBIA1301的图谱。

图2：是本发明制备的重组载体，即表达载体p1301-OsNAP的构建图。图中标记说明：LB，T-DNA左边界；hyg，潮霉素磷酸转移酶基因；35S，CaMV 35S启动子；RB，T-DNA右左边界。

图3：是本发明制备的OsNAP RNAi载体的构建图。图中标记说明：LB，T-DNA左边界；hyg，潮霉素磷酸转移酶基因；35S，CaMV 35S启动子；intron，水稻Waxy基因内含子；GUS，β-葡萄糖苷酸酶基因；RB，T-DNA右左边界。

图4：是用qRT-PCR的方法对野生型植株不同时期叶片中OsNAP基因的表达量的检测结果。图中标记说明：SL1：孕穗期的剑叶；SL2：开花期的剑叶；SL3：乳熟期的剑叶；SL4：黄熟期的剑叶。

图5：是用qRT-PCR的方法对野生型(非转基因)和OsNAP基因超量表达转基因植株中OsNAP的表达量的检测结果。图中标记说明：图5中的a图和b图中的RNA样分别来自于转基因家系line15、line17和line19及野生型苗期叶片和成熟后期的剑叶。

图6：显示的是OsNAP超表达转基因水稻植株叶片衰老表型的分析。图中标记：图6中的a图和b图分别表示OsNAP超表达转基因水稻家系和野生型水稻植株分别在抽穗后30 d和40 d时剑叶的照片。

图7：是OsNAP超表达转基因水稻家系和野生型水稻植株的剑叶在抽穗后各时期叶绿素含量的测定。误差线表示4次重复的标准差；“*”表示t测验的P值小于0.05，差异显著；“**”表示t测验的P值小于0.01，差异极显著。

图8：是OsNAP超表达转基因水稻家系和野生型水稻植株的剑叶在抽穗后各时期净光合速率的测定。误差线表示4次重复的标准差；“*”表示t测验的P值小于0.05，差异显著；“**”表示t测验的P值小于0.01，差异极显著。

图9：是本发明OsNAP RNAi转基因水稻植株的表型分析情况。图中标记：图9中的a图表示抽穗后50 d的OsNAP RNAi转基因家系(RNAi-1和RNAi-2)和野生型植株的整株照片。图9中的b图和c图分别抽穗后50 d的野生型植株和OsNAP RNAi转基因家系(RNAi-1和RNAi-2)的剑叶和倒二叶照片。

图10：是本发明的转基因水稻家系RNAi-1、RNAi-2和野生型水稻的剑叶和倒二叶的叶绿素含量的测定。误差线表示3次重复的标准差；“**”表示t测验的P值小于0.01，差异极显著。

图11：是用qRT-PCR的方法对野生型(非转基因)和OsNAP RNAi转基因水稻家系(RNAi-1和RNAi-2)剑叶中OsNAP和OsDOS的表达量的检测结果。

图12：显示的是野生型(非转基因)和OsNAP超量表达转基因植株苗期干旱处理情况。图中标记说明：干旱胁迫复水后，高表达量家系line17和line19的存活率显著高于低表达量家系line15和野生型对照。

具体实施方式

实施例1：候选片段的获得

利用生物信息学网站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)软件BlastP(Gish等，Identification of protein coding regions by database similarity search.Nature Genet.1993,3:266-272)搜索拟南芥叶片衰老特异性蛋白AtNAP在水稻基因组的同源序列，申请人以AtNAP的蛋白序列为基础，在水稻全基因组中搜索与其同源的NAC蛋白，得到其同源蛋白OsNAP，TIGR号码为LOC_Os03g21060。利用其LOC号在TIGR(http://rice.plantbiology.msu.edu)中搜索，得到OsNAP的CDS、基因组(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示)和蛋白质序列(其序列如序列表SEQ ID NO：3所示)。利用OsNAP的CDS序列在KOME(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/)中进行比对，得到OsNAP的cDNA序列(其cDNA序列如SEQ ID NO：2所示)。

以水稻中花11(来自中国农业科学院作物科学研究所)基因组DNA为模板，经PCR扩增OsNAP的基因组DNA。扩增该片段的引物的DNA序列为：正向引物F：5’-ATCGggtcaccTTCGCCATGTGCAATTATGT-3’；反向引物R：5’-ATCGccatggCAGGGAGGTGTGTGTTGTGT-3’。PCR反应程序：94℃5 min；94℃1 min，58℃3 min，72℃1 min，30个循环；72℃7 min。回收PCR产物后，将其连入pGEM-T载体(购自Promega公司)；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过抗性筛选、酶切及测序检测(为常规方法)，得到OsNAP基因组DNA的阳性TA克隆。对阳性TA克隆进行测序(为常规方法)，结果表明，该阳性TA克隆含有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在中花11不同发育时期取叶片抽提总RNA(SL1：孕穗期的剑叶；SL2：开花期的剑叶；SL3：乳熟期的剑叶；SL4：黄熟期的剑叶)，提取总RNA方法根据该Trizol的试剂说明书(Invitrogen公司)。3μg总RNA用1 units RNase-free DNaseⅠ(购自Invitrogen公司)处理15 min以除去基因组DNA污染，然后加入0.5 mg Oligo(dT)₁₅，1 mM dNTPs，10 mMdithiothreitol，200 units SuperScript^TMⅢ反转录酶(购自Invitrogen公司)进行反转录，终体积20μl。50℃水浴1 h后，加20μl ddH₂O对反转录产物进行稀释。qRT-PCR采用SYBR GreenⅠ(购自TaKaRa公司)的试剂盒在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System(购自Applied Biosystems公司)上进行，每次反应每个样品设置3次重复。反应程序：95℃10 s；95℃5 s，60℃36 s，40个循环。以Actin1作为内标来判断OsNAP在中花11不同发育时期的表达情况。OsNAP基因的qRT-PCR引物序列为：正向引物F：5’-aaccatttcatcgcgaacaac-3’；反向引物R：5’-cagtgacgatccctgcaagg-3’。Actin1基因的qRT-PCR引物序列为：正向引物F：5’-tggcatctctcagcacattcc-3’；反向引物R：5’-tgcacaatggatgggtcaga-3’。结果表明：随着叶片的衰老，OsNAP基因的表达量逐渐上升(图4)，说明是OsNAP基因一个叶片衰老相关基因。

实施例2：OsNAP基因抑制和超量表达载体的构建

(1)超量表达载体p1301-OsNAP的构建：

1)将实施例1中含有OsNAP基因组DNA的阳性TA克隆用Nco Ⅰ和BstE Ⅱ双酶切，与经Nco Ⅰ和BstE Ⅱ双酶切的载体pCAMBIA1301骨架片段连接。pCAMBIA1301载体图如图1所示。

2)将步骤1)中的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

3)通过抗性筛选和酶切检测证实，重组载体p1301-OsNAP为载体pCAMBIA1301的NcoⅠ和BstE Ⅱ位点间***了如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，重组载体p1301-OsNAP的T-DNA区结构示意图如图2所示。

(2)RNAi载体的构建：

1)取中花11衰老的叶片，利用Trizol试剂(购自Invitrogen公司)抽提总RNA(提取方法参考Trizol试剂的操作手册)。3μg总RNA用1 units RNase-free DNase Ⅰ(购自Invitrogen公司)处理15 min以除去基因组DNA污染，然后加入0.5 mg Oligo(dT)₁₅，1 mM dNTPs，10mM dithiothreitol，200 units SuperScript^TMⅢ反转录酶(购自Invitrogen公司)进行反转录，终体积20μl。50℃水浴1 h后，加20μl ddH₂O对反转录产物进行稀释。

2)以中花11衰老叶片RNA反转录的cDNA为模板，经PCR扩增OsNAP非保守的3’-UTR区域。PCR反应程序：94℃5 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，30个循环；72℃7 min。引物序列为：正向引物F：5’-ATCggatccCCACCACCAACAACAACAAC-3’；反向引物R：5’-ATCggtaccCTCAGTCCCAGTGACGATCC-3’。

3)回收PCR产物后，将其连入pGEM-T载体(购自Promega公司)。

4)将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过抗性筛选、酶切及测序检测(为常规方法)，得到含有OsNAP非保守的3’-UTR区域的阳性TA克隆。

5)对阳性TA克隆用KpnⅠ和BamHⅠ进行酶切，然后分别连接到pMCG161和pDS1301上(Yuan等，Mitogen-activated protein kinase OsMPK6 negatively regulates rice disease resistanceto bacterial pathogens.Planta,2007,226:953-960)，形成pMCG161-OsNAP和pDS1301-OsNAP。再用Sac Ⅰ和Spe Ⅰ分别酶切pMCG161-OsNAP和pDS1301-OsNAP，将pMCG161-OsNAP的外源和pDS1301-OsNAP的载体相互连接形成RNAi载体，重组载体的T-DNA区结构示意图如图3所示。

实施例3：表达载体的转化

将上述构建好的表达载体导入农杆碱型的根癌农杆菌EHA105，构成转化菌株。农杆菌介导的遗传转化方法主要参照本申请人华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室发表的“农杆菌介导的遗传转化操作手册”所示的方法(林拥军等，农杆菌介导的牡丹江8号高效转基因体系的建立，作物学报，2002，28：294-300)。具体步骤如下：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-BA(6-BenzylaminoPurine，6-苄基腺嘌呤)；CN(Carbenicillin，羧苄青霉素)；KT(Kinetin，激动素)；NAA(Napthaleneacetic acid，萘乙酸)；IAA(Indole-3-acetic acid，吲哚乙酸)；2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyaceticacid，2,4-二氯苯氧乙酸)；AS(Acetosringone，乙酰丁香酮)；CH(Casein Enzymatic Hydrolysate，水解酪蛋白)；HN(Hygromycin B，潮霉素)；DMSO(Dimethyl Sulfoxide，二甲基亚砜)；N6max(N6大量元素成分溶液)；N6mix(N6微量元素成分溶液)；MSmax(MS大量元素成分溶液)；MSmix(MS微量元素成分溶液)。

(2)主要溶液配方

1)N6培养基大量元素母液(按照10×浓缩液配制)：

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000 ml。

2)N6培养基微量元素母液(按照100×浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000 ml。

3)铁盐(Fe²⁺EDTA)贮存液(按照100×浓缩液配制)

将3.73 g乙二铵四乙酸二钠(Na₂EDTA·2H₂O)和2.78 g FeSO₄·7H₂O分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000 ml，至70℃温浴2 h，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(按照100×浓缩液配制)

加蒸馏水定容至1000 ml，4℃保存备用。

5)MS培养基大量元素母液(按照10×浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000 ml。

6)MS培养基微量元素母液(按照100×浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000 ml。

7)2,4-D贮存液(1 mg/ml)的配制：

称取2,4-D 100 mg，用1 ml 1 N氢氧化钾溶解5 min，然后加10 ml蒸馏水溶解完全后定容至100 ml，于室温下保存。

8)6-BA贮存液(1 mg/ml)的配制：

称取6-BA 100 mg，用1 ml 1 N氢氧化钾溶解5 min，然后加10 ml蒸馏水溶解完全后定容至100 ml，室温保存。

9)萘乙酸(NAA)贮存液(1 mg/ml)的配制：

称取NAA 100 mg，用1 ml 1 N氢氧化钾溶解5 min，然后加10 ml蒸馏水溶解完全后定容至100 ml，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(IAA)贮存液(1 mg/ml)的配制：

称取IAA 100 mg，用1 ml 1 N氢氧化钾溶解5 min，然后加10 ml蒸馏水溶解完全后定容至100 ml，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5 g/ml)的配制：

称取葡萄糖125 g，然后用蒸馏水溶解定容至250 ml，灭菌后4℃保存备用。

12)AS贮存液的配制：

称取AS 0.392 g，加入DMSO 10 ml溶解，分装至1.5 ml离心管内，4℃保存备用。

13)1N氢氧化钾贮存液

称取氢氧化钾5.6 g，用蒸馏水溶解定容至100 ml，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900 ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000 ml，分装到50 ml三角瓶(25 ml/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25 min，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

2)继代培养基

加蒸馏水至900 ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.9，煮沸并定容至1000 ml，分装到50 ml三角瓶(25 ml/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

3)预培养基

加蒸馏水至250 ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5 ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25 ml/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250 ml，1N氢氧化钾调节pH值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5 ml葡萄糖贮存液和250μl AS贮存液，分装倒入培养皿中(25 ml/每皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100 ml，调pH值到5.4，分装到两个100 ml的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。

使用前加入1 ml无菌葡萄糖贮存液和100μl AS贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250 ml，调节pH值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250μl HN(50 mg/ml)和400μl CN(250 mg/ml)分装倒入培养皿中(25 ml/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400 mg/l，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250 mg/l)。

7)分化培养基

加蒸馏水至900 ml，1 N氢氧化钾调节pH值到6.0。煮沸并用蒸馏水定容至1000 ml，分装到50 ml三角瓶(50 ml/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

8)生根培养基

加蒸馏水至900 ml，用1N氢氧化钾调节pH值到5.8。煮沸并用蒸馏水定容至1000 ml，分装到生根管中(25 ml/管左右)，封口，按上述方法灭菌。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

1)愈伤诱导

将成熟的中花11水稻种子去壳，然后依次70％的乙醇处理1 min，0.15％氯化汞(HgCl₂)溶液处理15 min，灭菌水清洗4-5次后将种子转移到诱导培养基上。将接种后的培养基暗培养4周，温度26℃左右。

2)愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上暗培养2周，温度26℃左右。

3)预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上暗培养2周，温度26℃左右。

4)农杆菌培养

首先在带有对应抗性选择的LA培养基(LA培养基的配制参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上预培养农杆菌EHA105(该菌株来自CAMBIA公司公开使用的农杆菌菌株)2天，温度28℃；随后，将农杆菌转移至悬浮培养基中，28℃摇床上培养2-3 h。

5)农杆菌侵染

首先调节农杆菌悬浮液至OD₆₀₀值为0.8-1.0，随后将预培养的愈伤转移至农杆菌悬浮液中浸泡30 min，将愈伤转移至灭菌好的滤纸上吸干，然后放置在共培养基上培养3d，温度19-20℃。

6)愈伤洗涤和选择培养

灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；浸泡在含400 mg/l CN的灭菌水中30 min；转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

7)分化

将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7 d；转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照(1500-2000 lx)培养30-40 d，培养温度26℃。

8)生根

剪掉分化时产生的根，然后将其转移至生根培养基中光照(1500-2000 lx)培养2-3周，培养温度26℃。

9)移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入温室。

实施例4：超量表达转基因后代调控水稻叶片衰老进程的生物验证分析

(1)申请人首先在水稻野生型(非转基因)和T₂代的OsNAP超量表达转基因植株(line15、line17和line19)的苗期用qRT-PCR的方法验证了OsNAP基因的表达量。结果显示：和野生型相比，OsNAP的表达量在line17和line19中很高，而在line15中则上升不大(图5中的a图)。随后在成熟期检测了转基因植株中OsNAP基因的表达量。结果显示：与野生型相比，line15、line17和line19中OsNAP基因的表达量上升倍数不大，但是趋势和苗期相同(图5中的b图)。进一步说明OsNAP基因的表达量随叶片的衰老而上升。

(2)表型观察

在抽穗后30天时，高表达转基因家系line17和line19剑叶的叶尖变黄，而低表达量家系line15和野生型仍是绿色(图6中的a图)。在抽穗后40 d时，高表达转基因家系line17和line19剑叶叶片明显比line15和野生型的叶片要黄(图6中的b图)。

(3)叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定采用丙酮分光光度计法。取约0.04 g水稻野生型(非转基因)和T₂代的OsNAP超量表达转基因植株(line15、line17和line19)叶片样品于叶绿素抽提液(抽提液为丙酮：乙醇：水体积比＝4.5：4.5：1)中，4℃抽提过夜，待叶片全部变白后用分光光度计在663 nm和645 nm处测定样品的吸光值，叶绿素含量按文献方法进行计算(Mao等，Twocomplementary recessive genes in duplicated segments control etiolation in rice.Theor Appl Genet,2011,122:373-383)，用mg/g叶鲜重来表示。结果显示：在抽穗后20 d左右时，高表达转基因家系line17和line19剑叶的叶绿素含量与低表达转基因家系line15和野生型相比没有明显差异；但是在抽穗后30 d左右时，line17和line19剑叶的叶绿素含量明显低于line15和野生型，在抽穗后40 d左右时更为明显(图7)。

(4)净光合速率的测定

申请人用光合测定仪CIRAS-2(购自PP system公司)来测定水稻野生型(非转基因)和T₂代的OsNAP超量表达转基因植株(line15、line17和line19)不同发育时期叶片的净光合速率，测定时间为上午9:00至11:00或者下午3:00至5:00。结果显示：在抽穗后20 d左右时，高表达转基因家系line17和line19剑叶的净光合速率与低表达转基因家系line15和野生型相比没有明显差异；但是在抽穗后30 d左右时，line17和line19剑叶的净光合速率明显低于line15和野生型，在抽穗后40 d左右时更为明显(图8)。说明OsNAP的超量表达植株加速了叶片的衰老。

实施例5：RNAi转基因后代调控水稻叶片衰老进程的生物验证分析

(1)表型观察

当野生型植株叶片表现出明显的黄色时，转基因家系RNAi-1和RNAi-2的叶片大部分都是绿色的(图9中的a)。在抽穗后50 d时，OsNAP的RNAi转基因家系RNAi-1和RNAi-2的剑叶衰老明显延缓(图9中的b)，同时野生型的倒二叶大部分已经变黄，而RNAi转基因家系的叶片只有尖端变黄(图9中的c)。

(2)叶绿素含量的测定

叶绿素含量的测定见实施例4。样品来自于水稻野生型(非转基因)和OsNAP的RNAi转基因家系(RNAi-1和RNAi-2)的叶片。结果显示：2个RNAi转基因家系(RNAi-1和RNAi-2)叶片的叶绿素含量明显高于野生型(图10)。说明OsNAP的RNAi转基因植株延缓了叶片的衰老。

(3)申请人用qRT-PCR的方法在RNAi转基因家系(RNAi-1和RNAi-2)中检测了OsNAP和OsDOS表达量的变化。结果显示：和野生型相比，RNAi-1和RNAi-2中OsNAP的表达量明显下降；而RNAi-1和RNAi-2的叶片中OsDOS表达量明显高于野生型(图11)，OsNAP的表达量越低，剑叶和倒二叶的叶绿素含量越高，同时OsDOS表达量也越高，说明OsNAP的RNAi转基因植株延缓了叶片的衰老。OsDOS基因的qRT-PCR引物序列为：正向引物F：5’-ATGATGATGATGGGGGAAGG-3’；反向引物R：5’-CTCACGGGGAGGTGAGACC-3’。

实施例6：转基因植株苗期抗旱性试验

将超量表达家系line15、line17和line19在1/2 MS培养基(实施例3中的生根培养基)发芽，一周后将幼苗种入小红桶中。植株在正常生长条件下长至4叶期，进行断水干旱胁迫7 d，然后复水3 d，观察表型，并拍照。结果显示：断水干旱胁迫7 d，复水3 d后，野生型植株中花11叶片发黄后枯死，低表达量家系line15叶片还有少许绿色，而高表达量家系line17和line19的叶片大部分都是绿色的(图12)。说明OsNAP的超量表达转基因植株可以增强抗旱能力。

Claims (7)

1.一个来源于水稻的OsNAP基因在调控叶片衰老进程和抗旱能力中的应用，其特征在于，所述的基因是下列序列之一：

1)SEQ ID NO：1所示的基因组核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：2所示的全长cDNA核苷酸序列。

2.一个来源于水稻的OsNAP基因的编码蛋白在调控叶片衰老进程和抗旱能力中的应用，其特征在于，所述的基因编码蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：3所示。

3.如权利要求1所述的基因OsNAP的应用，其特征在于，将含有权利要求1所述基因OsNAP的表达载体转入水稻，以超量表达该基因从而加速叶片衰老进程和/或提高苗期抗旱能力，还包括通过抑制该基因的表达从而延缓叶片衰老进程。

4.一种改变目标植物叶片衰老进程的方法，其特征在于，通过提高权利要求1所述基因OsNAP的表达量来加速叶片衰老进程或通过下调权利要求1所述基因OsNAP的表达量来延缓叶片衰老进程。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的目标植物为单子叶植物或双子叶植物。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的单子叶植物为水稻、玉米、小麦和草坪草。

7.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述的双子叶植物为拟南芥、杨树、大豆和棉花。