CN115838697A - 亚胺还原酶突变体及其在拉罗替尼手性中间体合成中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及亚胺还原酶突变体及其在拉罗替尼手性中间体合成中的应用，属于生物工程技术领域。本发明所述的亚胺还原酶突变体的比活力高达19.2U/mg，能够高效催化2‑(2,5‑二氟苯基)吡咯啉不对称还原，合成拉罗替尼的手性中间体(R)‑2‑(2,5‑二氟苯基)吡咯烷，酶促反应中的底物浓度高达80g/L，产物时空得率高达350g/L/d，光学纯度达99.5％以上。此外，该亚胺还原酶突变体对于一些2‑芳基取代的吡咯啉也具有高的催化活性，产物的光学纯度均高达99％以上。本发明所述突变体具有极高的催化活性、底物耐受性和时空产率，在手性2‑芳基吡咯烷特别是拉罗替尼手性中间体(R)‑2‑(2,5‑二氟苯基)吡咯烷的合成中具有较强的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及亚胺还原酶突变体及其编码基因，包含所述亚胺还原酶突变体基因的重组表达载体和重组表达转化体，所述重组亚胺还原酶突变体的制备方法，及其在催化2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉及其类似物不对称还原制备拉罗替尼手性中间体(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷及手性2-芳基吡咯烷中的应用。
背景技术
手性2-芳基吡咯烷作为一种氮杂环手性胺砌块，广泛用于药物分子的合成，如礼来公司开发的化合物LY2456302是一种高亲和力和高选择性的κ阿片受体拮抗剂，可阻断身体自源的κ激动剂或外源激动剂如***等介导的刺激，相对于μ和δ阿片类受体，具有超过30倍的功能选择性，可应用于成瘾治疗和抗重度抑郁治疗中。另外一种化合物LY27950503也是一种(KOR)PET放射κ阿片受体拮抗剂，具有类似的作用。肌球蛋白相关激酶(TRK)受体家族参与神经元的发育，当其发生异常融合后，致癌性TRK融合物诱导癌细胞增殖，并参与癌症相关的关键下游信号通路。拉罗替尼(LOXO-101)是第一个针对TRK受体家族ATP结合位点靶向的实体瘤抗癌药物，其分子结构如下，该药物分子已经在2018年于美国上市。
关于手性2-取代吡咯烷的合成，Helmchen在2009年利用铑催化剂(Synlett,2009,4:1413-1416)对烯丙胺进行不对称加氢反应，从而合成各种手性2-取代吡咯烷。Zhang利用Ir-f-Binaphane催化剂(Advanced Synthesis&Catalysis,2010,352:3121-3125)对一系列2-芳基吡咯啉进行还原，生成了各种手性2-芳基吡咯烷。然而这些化学过程不仅使用了重金属催化剂，如铱、铑和钌等，导致去除成本显著增加，而且反应时需要复杂的保护与去保护过程。因此，迫切开发更加绿色高效、操作安全的合成方法。
酶法不对称还原方法具有选择性高、反应条件温和、操作简单等诸多优点，因此近几年来酶法催化亚胺不对称还原合成手性胺的方法受到越来越多的关注。针对2-取代吡咯烷的酶促合成，Turner课题组(ChemCatChem,2015,7:579-583；ChemCatChem,2013,5:3505-3508)筛选分别具有R与S选择性的亚胺还原酶RIR与SIR，但随着取代基变大，酶选择性变低且催化活力变低，无法满足对大位阻底物2-芳基吡咯烷的合成需要。2016年，Turner课题组(ACS Catalysis,2016,6:3880-3889)鉴定了一个天然来源的S选择性亚胺还原酶AoIRED，可催化2-取代吡咯啉还原，虽对于位阻较小的2-甲基吡咯啉有较高的催化效率，但对于大位阻取代基如2-芳基与对氟苯基取代的吡咯啉催化活力较低。近期，针对2-芳基取代吡咯啉底物筛选获得了一些天然的亚胺还原酶(Organic Letters,2020,22:3367-3372，Org.Process Res.Dev.2022,26,2067–2074)，实现了一系列2-芳基吡咯啉底物的不对称还原，也存在活力低、底物浓度低的问题。近年来，亚胺还原酶在催化不对称还原反应中取得了非常大的进展，但天然酶大多存在底物抑制，催化活力低下等缺点，导致底物上载量低下。高底物浓度反应则需要大量酶的加入，使后处理繁琐且成本增高，工业化应用受限。
发明人在前期研究中，从细菌Streptomyces clavuligerus中克隆得到一个亚胺还原酶ScIR，该酶能够高立体选择性地催化2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉及多种2-芳基吡咯啉的不对称氢化，制备相应的拉罗替尼手性中间体(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷及手性2-芳基吡咯烷(Org.Lett.,2017,19,3151–3154)。但该酶存在活性低、热稳定性差、不能转化高浓度底物的问题，例如对2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉的比活力仅有0.18U/mg，底物浓度只有2g/L。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题和不足，通过定点突变、随机突变等蛋白质工程技术对野生型亚胺还原酶ScIR进行分子改造，获得催化活性、热稳定性和底物耐受性显著提高的亚胺还原酶突变体，提高反应中的底物上载量。并实现了拉罗替尼手性中间体(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的高效绿色酶法合成，同时也为手性2-芳基吡咯烷提供一个绿色高效的酶促合成工艺，也将加速亚胺还原酶在工业中的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明采取的技术方案之一：提供一种对2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉催化活性、稳定性和底物耐受性均提高的亚胺还原酶ScIR突变体。
对具有如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的亚胺还原酶ScIR进行突变，将第122位缬氨酸、第177位苯丙氨酸、第169位甲硫氨酸、第185位色氨酸、第211位丝氨酸、第270位甲硫氨酸、第214位甘氨酸、第45位谷氨酸、第53位天冬酰胺及第265位苯丙氨酸中的一个或多个氨基酸残基替换为其它氨基酸残基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白质。
其中，编辑亚胺还原酶ScIR的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
其中，SEQ ID No.1序列如下：
SEQ ID No.2序列如下：
针对亚胺还原酶ScIR进行随机突变或单点饱和突变，使用底物2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉进行活性检测，筛选活性和热稳定性显著提升的突变体。具体的，所述亚胺还原酶突变体，为野生型亚胺还原酶ScIR的氨基酸序列发生如下任意一种情况的突变所获得的突变体：
(1)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第122位缬氨酸替换为半胱氨酸；
(2)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第122位缬氨酸替换为半胱氨酸，第177位苯丙氨酸换为谷氨酸、精氨酸或色氨酸；
(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第122位缬氨酸替换为半胱氨酸，第177位苯丙氨酸替换为谷氨酸、精氨酸或色氨酸；第169位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸或色氨酸、第185位色氨酸替换为亮氨酸或异亮氨酸、第211位丝氨酸替换为丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸、第270位甲硫氨酸替换为谷氨酸、精氨酸或色氨酸；
(3)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第122位缬氨酸替换为半胱氨酸，第177位苯丙氨酸替换为谷氨酸、精氨酸或色氨酸；第169位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸或色氨酸、第185位色氨酸替换为亮氨酸或异亮氨酸、第211位丝氨酸替换为丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸、第270位甲硫氨酸替换为谷氨酸、精氨酸或色氨酸；
(4)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第122位缬氨酸替换为半胱氨酸，第177位苯丙氨酸替换为谷氨酸、精氨酸或色氨酸；第169位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸或色氨酸、第185位色氨酸替换为亮氨酸或异亮氨酸、第211位丝氨酸替换为丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸、第270位甲硫氨酸替换为谷氨酸、精氨酸或色氨酸；第214位甘氨酸替换为苯丙氨酸或色氨酸；
(5)将如SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第122位缬氨酸替换为半胱氨酸，第177位苯丙氨酸替换为谷氨酸、精氨酸或色氨酸；第169位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸或色氨酸、第185位色氨酸替换为亮氨酸或异亮氨酸、第211位丝氨酸替换为丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸、第270位甲硫氨酸替换为谷氨酸、精氨酸或色氨酸；第214位甘氨酸替换为苯丙氨酸或色氨酸；第45位谷氨酸替换为丙氨酸或甘氨酸、第53位天冬酰胺替换为苏氨酸或色氨酸及第265位苯丙氨酸替换为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。
所述突变体的获得方法具体为：
以来源于Streptomyces clavuligerus中的野生型亚胺还原酶ScIR的基因序列为模板，采用易错PCR策略构建随机突变库，对构建的各轮突变库进行高通量筛选，获得上述各种突变体。
其中所述随机突变库构建的易错PCR扩增是本领域常规技术，PCR扩增反应的体系为：模板0.5～20ng，一对突变引物各1.5μl(10μM)，8.75μl MnCl2(1mM)，25μl 2×Taq mix，加灭菌蒸馏水至50μl。
所述易错PCR扩增的程序为：(1)95℃变性3min；(2)95℃变性30s，(3)55℃退火30s，(4)72℃延伸1min，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸10min，12℃保藏产物。
本发明采取的技术方案之二：提供一种分离的核酸，所述核酸编码所述亚胺还原酶突变体。
本发明所述核酸的制备方法为本领域常规制备方法，所述制备方法包括：通过基因克隆技术获得编码所述亚胺还原酶突变体的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码所述亚胺还原酶突变体的核酸分子。
本发明所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，所述较佳的制备方法为：以技术方案一获得的突变体DNA序列为模板，对所需目的基因进行PCR扩增，得到带有点突变的所述核酸分子。
其中所述PCR扩增技术为本领域常规技术，一种可选择的PCR扩增体系为：模板0.5～20ng，一对扩增引物各1μl(10μM)，10μl 2×Primestar mix，加灭菌蒸馏水至20μl。
一种可选择的PCR扩增的程序为：(1)98℃变性10s；(2)98℃变性10s，(3)55℃退火15s，(4)72℃延伸6.5min，步骤(2)～(4)共进行25个循环，最后72℃延伸10min，12℃保藏产物。
本发明采取的技术方案之三：提供一种包含上述核酸的重组表达载体。
其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的亚胺还原酶突变体基因的核酸分子连接于各种市售表达载体上构建而成。本发明所述表达载体优选地为质粒pET-28a(+)。可通过下述方法制得本发明所述的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的核酸产物与表达载体pET-28a分别用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切，形成互补的粘性末端，经T4 DNA连接酶连接，形成含有本发明所述亚胺还原酶基因的重组表达质粒。
本发明采取的技术方案之四：提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
其中所述重组表达转化体的制备方法较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。其中所述宿主微生物较佳地为：大肠杆菌(Escherichia coli，简写为E.coli)，更佳的为大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌DH5α。将前述重组表达质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，得到本发明优选的基因工程菌株。质粒转化方法可选择本领域常规方法，如电转法，热激法等，较佳地选择热激法进行转化，将质粒溶液与感受态细胞混合，42℃，热激90秒，然后冰浴3min，随后37℃复苏1h，涂布含卡那霉素的LB琼脂培养基平板，培养得到目标重组表达转化体。
本发明采取的技术方案之五：提供一种亚胺还原酶突变体的制备方法，包括如下步骤：培养所述重组表达转化体，从培养物中获得重组亚胺还原酶突变体。
所述重组亚胺还原酶突变体的制备方法较佳的为：将所述重组大肠杆菌接种至含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基(酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，置于37℃和180rpm摇床中振荡培养，当培养液的吸光度OD600达到0.6～0.8时，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度为25℃，诱导24小时后，将培养液离心，并用生理盐水洗涤两次，得到静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于磷酸钾缓冲液(KPB,100mM,pH 7.0)中，在冰水浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组酶的粗酶液。粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，重组蛋白在细胞中以完全可溶的形式存在。
本发明中催化2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉及其类似物进行不对称还原反应形成光学活性(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷及其类似物的催化剂，可以是上述重组亚胺还原酶突变体蛋白，或者是包含所述重组亚胺还原酶突变体的重组表达转化体静息细胞。
本发明采取的技术方案之六：提供所述亚胺还原酶突变体或所述重组大肠杆菌整细胞作为催化剂催化2-芳基吡咯啉衍生物进行不对称还原反应形成手性胺的应用。
所述的2-芳基吡咯啉衍生物选自如下结构式1a-1l所示的A结构中的一种或几种：
本发明所述亚胺还原酶突变体或所述重组大肠杆菌整细胞作为催化剂催化2-芳基吡咯啉衍生物进行不对称还原反应形成手性胺的应用中，以2-芳基吡咯啉衍生物作为底物，辅酶NADPH存在下，使用亚胺还原酶突变体或所述重组大肠杆菌整细胞催化2-芳基吡咯啉衍生物不对称还原制备光学活性(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷及其类似物，同时NADPH氧化生成NADP+。
反应过程中，耦联葡萄糖脱氢酶催化的葡萄糖脱氢反应，将NADP+酶法还原再生为NADPH。
本发明所述的不对称还原反应的各项条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，所述应用较佳的为：反应在水相中进行，所述底物的浓度为2-80g/L，助溶剂DMSO的添加浓度为0～5％(w/v)，所述亚胺还原酶突变体静息细胞的用量为0.1～10kU/L，额外添加辅酶NADP+的浓度是0～0.5mM，辅底物葡萄糖浓度为20～700mM，葡萄糖脱氢酶添加量为0.1～10kU/L，反应pH为6.0～8.0，反应温度为20～40℃。
本发明所述的多个亚胺还原酶突变体适用于催化2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉及其类似物还原制备光学纯的(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷及其类似物手性药物中间体。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：本发明所述亚胺还原酶突变体具有更高的催化活性和热稳定性，对2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉底物的催化活性高达19.2U/mg，远远高于目前已报道的亚胺还原酶，能够高效催化2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉不对称还原，合成拉罗替尼的手性中间体(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷，酶促反应中的底物浓度高达80g/L，产物时空得率高达350g/L/d，光学纯度达99.5％以上，底物浓度和时空产率远远高于目前已报道的亚胺还原酶催化的过程。相对于金属催化，本发明所述的酶催化剂催化反应具有产品光学纯度高，反应条件温和，操作安全，过程绿色环保等优势，具有很好的工业应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1亚胺还原酶ScIR的随机突变
利用易错PCR技术向亚胺还原酶ScIR基因序列中引入随机碱基突变，其中所用引物如下：
上游引物(如SEQ ID No.3所示)：
5’-AACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCCATCATCATCATCATCACATGTCCCGCCCCGCGCCCCTCACC-3’
下游引物(如SEQ ID No.4所示)：
5’-GTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCTCAGGACGGCTTCTTCAGCAGCTCC-3’
其中模板为亚胺还原酶ScIR的重组质粒pET28a-ScIR。
PCR反应的体系如下：模板0.5ng，一对突变引物(10μM)各1.5μl，8.75μl MnCl2(1mM)，2×Taq mix 25μl，加灭菌蒸馏水至50μl。
易错PCR扩增的程序如下：(1)95℃变性3min；(2)95℃变性30s，(3)55℃退火30s，(4)72℃延伸1min，步骤(2)～(4)共进行30个循环，最后72℃延伸10min，12℃保藏产物。
PCR扩增产物纯化之后，用限制性内切酶BamH I和Hind III分别对PCR扩增产物和载体质粒pET28a于37℃双酶切12h，回收酶切产物，用T4 DNA连接酶于16℃下过夜连接，然后转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并均匀涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基平板上，37℃培养过夜，构建随机突变体文库。挑选单克隆至深孔板进行培养，一级板每孔中含有300μL LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)，37℃、220rpm培养过夜，吸取50μL一级种子液转接至每孔含600μL LB培养基(含50μg/mL卡那霉素)的二级板中，37℃、220rpm培养3h，至OD600约1.0时，加入终浓度0.2mM的IPTG进行诱导，16℃继续培养24h，3,500rpm离心10min，弃上清，每孔加入200μL裂解液(含750mg/L溶菌酶和12mg/L DNA酶)，振荡使细胞充分悬浮，37℃保温1h，再次3,500rpm离心10min，分别吸取50μL上清液至96孔酶标板，加入含10mM 2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉、0.15mM NADPH的磷酸钾缓冲液(100mM,pH 7.0)，通过酶标仪检测进行突变库的活力筛选，筛选得到对底物2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉活性提高的突变体，进行序列测定。总计进行11轮随机突变。
实施例2亚胺还原酶ScIR突变体的表达、纯化和酶活性测定
挑取平板上生长的亚胺还原酶突变体的重组表达单菌落接种至4mL含Kan(50ng/μL)的LB试管中，放入37C摇床中在200rpm条件下培养12-16h，再将菌液按照1:50的接种比例转接到含有50ng/μL Kan的100mL LB培养基中，放入37℃摇床中，在200rpm条件下培养3h，待其OD600达到0.6-0.8时，加入20μL IPTG(1M)进行目标蛋白的诱导表达，在25℃和180rpm条件下培养24h后，离心收集菌体。将所得的静息细胞悬浮于KPB缓冲液(100mM,pH 7.0)中，在冰水浴中超声破碎，离心收集上清液，得到重组亚胺还原酶突变体的细胞破碎液。将细胞破碎液冷冻干燥，即得到粗酶粉。
使用Ni柱亲和层析纯化亚胺还原酶突变体蛋白，具体方法如下：
(1)用磷酸钠缓冲液(20mM，pH 7.5，含有500mM NaCl)平衡亲和Ni柱(床层体积5ml)；
(2)用磷酸钠缓冲液(20mM，pH 7.5，含500mM NaCl)重悬获得的静息细胞，超声破碎，10000×g离心45min，收集上清液，以1mL/min的流速通过Ni柱，使目的蛋白结合到Ni柱上；
(3)用含有0～50mM咪唑的磷酸钠缓冲液(20mM，pH 7.5，含有500mM NaCl)洗脱与Ni柱没有结合能力的杂蛋白；
(4)再用含有250mM咪唑的磷酸钠缓冲液(20mM，pH 7.5，含有500mM NaCl)洗脱目的蛋白；
(5)收集到的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳检测。取20μl样品加入5μl 5×SDS上样缓冲液，进行加热处理，电泳上样量均为10μl，标准分子量蛋白(Protein MolecularWeight Marker)购于美国Thermo公司。SDS-PAGE胶的浓度为12％，选用90V电压进行浓缩，再改为120V电压进行分离。
以10mM 2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉和0.15mM NADPH的磷酸钾缓冲液(100mM,pH7.0)作为底物，通过检测340nm处吸光值变化的方法进行重组亚胺还原酶的活性测定，结果如表1所示。
表1 ScIR及其突变体的性质
其中，ScIRWT是指氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的天然亚胺还原酶ScIR。
实施例3 ScIR与其突变体ScIRM3对各种2-取代吡咯啉的活力
在使用各种2-取代吡咯啉1a-1i作为测活底物，对ScIR与其突变体ScIRM3进行活力测定，结果如表2所示。对于大部分底物来说，突变体ScIRM3相较于母本活力都有大幅提高。对于1d，1g，1h与1k来说，甚至实现了活力从无到有的突破，这说明突变体对2-芳基吡咯啉底物具有更好的普适性。
表2 ScIR与其突变体ScIRM3对各种2-取代吡咯啉的活力
实施例4亚胺还原酶突变体催化2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉的不对称还原
5mL 100g/L亚胺还原酶突变体ScIRM1、ScIRM2和ScIRM3湿细胞的破碎液(KPB7.0buffer，100mM)，BmGDH 20mg/mL(冻干酶粉，5U/mg)，0.15mM NADP+，2-5g/L底物2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉(1％ DMSO)，1.5倍当量的葡萄糖，用KPB 7.0缓冲液补足至10mL，将反应混合液于30℃下反应，反应过程中间隔取样，每次取样100μL，加入20μL 10mM氢氧化钠溶液，加入500μL乙酸乙酯充分混匀。12000rpm条件下离心5min，取上层有机相，加入适量无水硫酸钠干燥8h后，气相色谱检测底物反应情况。结果如表3所示，同样的催化剂上载量下，野生酶在5g/L的底物上载量情况下，转化率仅有26％，而对于突变体ScIRM3在5h内便可将80g/L的底物全部转化，这充分说明突变体的催化性能相比于母本有了大幅提高，时空产量高达384g/L/d。
表3 ScIR及其突变体催化转化底物2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉的反应
a The reaction mixture(10mL)contained 2-100g/L substrate,5mL cellfree extract(from 100g/L wet
实施例5拉罗替尼手性中间体(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷的酶法规模合成
在10-L的反应釜中，加入9.9L KPB缓冲液(100mM，pH 7.0)、1000g葡萄糖、800g底物2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉(溶解在100ml DMSO中)、0.5g辅酶NADP+，500g表达重组ScIRM3的静息细胞，10kU葡萄糖脱氢酶粗酶粉，在30℃恒温，150rpm的机械搅拌下反应，5h后转化率达到98％，使用乙酸乙酯萃取反应得到的产物，加入适量无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去溶剂，得到656g产物(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷，分离得率为82％，光学纯度为99％。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明的范畴所作出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种亚胺还原酶突变体，其特征在于：所述亚胺还原酶突变体的氨基酸序列选自以下中的一种：
(1)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第122位缬氨酸替换为半胱氨酸；
(2)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第122位缬氨酸替换为半胱氨酸，第177位苯丙氨酸换为谷氨酸、精氨酸或色氨酸；
(3)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第122位缬氨酸替换为半胱氨酸，第177位苯丙氨酸替换为谷氨酸、精氨酸或色氨酸；第169位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸或色氨酸、第185位色氨酸替换为亮氨酸或异亮氨酸、第211位丝氨酸替换为丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸、第270位甲硫氨酸替换为谷氨酸、精氨酸或色氨酸；
(4)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第122位缬氨酸替换为半胱氨酸，第177位苯丙氨酸替换为谷氨酸、精氨酸或色氨酸；第169位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸或色氨酸、第185位色氨酸替换为亮氨酸或异亮氨酸、第211位丝氨酸替换为丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸、第270位甲硫氨酸替换为谷氨酸、精氨酸或色氨酸；第214位甘氨酸替换为苯丙氨酸或色氨酸；
(5)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第122位缬氨酸替换为半胱氨酸，第177位苯丙氨酸替换为谷氨酸、精氨酸或色氨酸；第169位甲硫氨酸替换为苯丙氨酸或色氨酸、第185位色氨酸替换为亮氨酸或异亮氨酸、第211位丝氨酸替换为丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸、第270位甲硫氨酸替换为谷氨酸、精氨酸或色氨酸；第214位甘氨酸替换为苯丙氨酸或色氨酸；第45位谷氨酸替换为丙氨酸或甘氨酸、第53位天冬酰胺替换为苏氨酸或色氨酸及第265位苯丙氨酸替换为丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。
2.一种分离的核酸，其特征在于：所述核酸编码如权利要求1所述亚胺还原酶突变体。
3.一种包含如权利要求2所述核酸的重组表达载体。
4.一种包含如权利要求3所述重组表达载体的重组表达转化体。
5.一种亚胺还原酶突变体的制备方法，其特征在于：培养如权利要求4所述重组表达转化体，从培养物中获得亚胺还原酶突变体。
6.如权利要求1所述亚胺还原酶突变体或包含如权利要求4所述重组表达转化体的静息细胞在催化2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉及其类似物不对称还原合成拉罗替尼手性中间体(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷及手性2-芳基吡咯烷中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：以2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉及其类似物作为底物，辅酶NADPH存在下，使用亚胺还原酶突变体催化2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉及其类似物生物不对称还原制备拉罗替尼手性中间体(R)-2-(2,5-二氟苯基)吡咯烷及手性2-芳基吡咯烷，同时NADPH氧化生成NADP+。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，耦联葡萄糖脱氢酶催化的葡萄糖脱氢反应，将NADP+酶法还原再生为NADPH。
9.如权利要求6-8中任一项所述的应用，其特征在于：所述的亚胺还原酶突变体以酶蛋白或重组表达转化体静息细胞的形式使用。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的2-(2,5-二氟苯基)吡咯啉及其类似物如下化合物中的一种：
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