CN110387359B

CN110387359B - 羰基还原酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN110387359B
Application number: CN201810343484.8A
Authority: CN
Inventors: 陶荣盛; 朱傅赟; 沈青; 郑云; 潘震华; 沈正权; 孙梁栋; 刘萍; 王亚夫
Original assignee: Huzhou Yisheng Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Huzhou Yisheng Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2018-04-17
Filing date: 2018-04-17
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2038-04-17
Also published as: CN110387359A

Abstract

本发明公开了一种通过点突变法构建的羰基还原酶突变体，其氨基酸序列选自SEQ ID NO:2‑4。相比Candida magnoliae ifo 0705菌株来源的野生型羰基还原酶，本发明的羰基还原酶突变体的酶活力显著提高，能够高效地催化6‑氰基‑(5R)‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯不对称还原为6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯，并且可以催化(S)‑6‑氯‑5‑羟基‑3‑羰基己酸叔丁酯不对称还原为6‑氯‑(3R,5S)‑二羟基己酸叔丁酯，生产他汀类化合物中间体。

Description

羰基还原酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及通过点突变法构建的羰基还原酶突变体、及其用于生产他汀类化合物中间体的应用。

背景技术

阿托伐他汀和瑞舒伐他汀是临床上最常用的他汀类血脂调节药，属HMG-CoA还原酶抑制剂，用于治疗高胆固醇血症、混合型高脂血症、冠心病和脑中风，是国内外心脑血管疾病防治的重大基础药物。比如活性成分为阿托伐他汀的药物“立普妥”年销售额曾超过100亿美元，是历史上最畅销的药物。

作为他汀类药物的重要手性化合物中间体，式A7所示的阿伐他汀中间体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯(CAS号：125971-93-9)、式A8所示的(4R,6R)-6-氰甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-乙酸叔丁酯(CAS号为125971-94-0，阿伐他汀钙侧链ATS-8)、式D3所示的瑞舒伐他汀中间体6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯(CAS号：154026-93-4)通常采用化学合成方法制备，主要是采用化学法羰基底物不对称还原法。具体是以硼氢化物为还原剂，利用手性噁唑硼烷、过渡金属配合物等手性催化剂催化潜手性底物的羰基不对称还原。该技术立体专一性控制困难，反应过程非对映诱导不充分，产物光学纯度低；且反应需在深冷条件下加氢，设备要求高；所用手性催化剂价格昂贵，生产成本高；硼氢化物易燃易爆，安全隐患大，反应产生的硼化物废物处理困难，不符合绿色化学的理念。由于化学合成法具有环境污染大、生产成本高的缺点，目前正逐渐开始用生物酶催化法结合化学方法来代替。

然而，目前采用的酶比如羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的催化活性普遍较低，导致催化反应中酶用量很大，影响提取收率，并且生产成本依旧较高。

因此，本领域迫切需要开发一种具有高效催化活性的酶，从而降低生产成本，并减少污染。

发明内容

为了得到酶活性更高的羰基还原酶，本发明利用基因工程技术来对木兰假丝酵母Candida magnoliae ifo 0705来源的野生型羰基还原酶(SEQ ID NO:1)进行改造和筛选，构建高酶活性的羰基还原酶突变体，从而实现酶法生产他汀类药物中间体的工业化。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种高酶活力的羰基还原酶，其氨基酸序列选自SEQ ID NO:2-4：

其中SEQ ID NO:2是SEQ ID NO:1第95位的苯丙氨酸F替换为异亮氨酸I的突变体，其氨基酸序列为：

MSTPLNALVTGASRGIGAATAIKLAENGYSVTLAARNVAKLNEVKEKLPVVKDGQKHHIWELDLASVEAASSFKGAPLPASDYDLFVSNAGIAQITPTADQTDKDFLNILTVNLSSPIALTKALLKGVSERSNEKPFHIIFLSSAAALHGVPQTAVYSASKAGLDGFVRSLAREVGPKGIHVNVIHPGWTKTDMTDGIDDPNDTPIKGWIQPEAIADAVVFLAKSKNITGTNIVVDNGLLA(SEQ ID NO:2)；

其中SEQ ID NO:3是SEQ ID NO:1第95位的苯丙氨酸F替换为异亮氨酸I、第154位的苏氨酸T替换为丙氨酸A的突变体，其氨基酸序列为：

MSTPLNALVTGASRGIGAATAIKLAENGYSVTLAARNVAKLNEVKEKLPVVKDGQKHHIWELDLASVEAASSFKGAPLPASDYDLFVSNAGIAQITPTADQTDKDFLNILTVNLSSPIALTKALLKGVSERSNEKPFHIIFLSSAAALHGVPQAAVYSASKAGLDGFVRSLAREVGPKGIHVNVIHPGWTKTDMTDGIDDPNDTPIKGWIQPEAIADAVVFLAKSKNITGTNIVVDNGLLA(SEQ ID NO:3)；

SEQ ID NO:4又是SEQ ID NO:3第129位的丝氨酸S替换为精氨酸R、第145位的丙氨酸A替换为缬氨酸V的突变体，其氨基酸序列为：

MSTPLNALVTGASRGIGAATAIKLAENGYSVTLAARNVAKLNEVKEKLPVVKDGQKHHIWELDLASVEAASSFKGAPLPASDYDLFVSNAGIAQITPTADQTDKDFLNILTVNLSSPIALTKALLKGVRERSNEKPFHIIFLSSVAALHGVPQAAVYSASKAGLDGFVRSLAREVGPKGIHVNVIHPGWTKTDMTDGIDDPNDTPIKGWIQPEAIADAVVFLAKSKNITGTNIVVDNGLLA(SEQ ID NO:4)；

其中SEQ ID NO:1的氨基酸序列为：

MSTPLNALVTGASRGIGAATAIKLAENGYSVTLAARNVAKLNEVKEKLPVVKDGQKHHIWELDLASVEAASSFKGAPLPASDYDLFVSNAGIAQFTPTADQTDKDFLNILTVNLSSPIALTKALLKGVSERSNEKPFHIIFLSSAAALHGVPQTAVYSASKAGLDGFVRSLAREVGPKGIHVNVIHPGWTKTDMTDGIDDPNDTPIKGWIQPEAIADAVVFLAKSKNITGTNIVVDNGLLA(SEQ ID NO:1)。

优选上述羰基还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

本发明的第二个目的在于提供编码上述羰基还原酶突变体的基因。

在一种优选的实施方式中，编码上述羰基还原酶突变体SEQ ID NO:2的基因为SEQID NO:5：

atgtctacgccgctgaatgctctggtgacgggtgcttctcgtggtattggtgctgcgaccgcgatcaaactggccgaaaacggttacagcgtgaccctggcggcccgtaacgtcgcaaaactgaatgaagtgaaagaaaaactgccggtggttaaagatggccagaaacatcacatttgggaactggacctggcctctgtcgaagctgctagctcttttaaaggcgcaccgctgccggcttcagattatgacctgtttgtttcgaacgcaggtatcgcacagatcaccccgacggcggatcaaaccgataaagacttcctgaacattctgacggtgaatctgagttccccgatcgcgctgaccaaagccctgctgaaaggcgttagtgaacgctccaatgaaaaaccgtttcatattatcttcctgtcatcggcagcagcactgcacggtgtgccgcagacggcagtttacagcgcgtctaaagccggcctggatggttttgttcgttcactggctcgcgaagtcggcccgaaaggtattcatgttaacgtcatccacccgggctggaccaaaacggatatgaccgacggtattgatgacccgaatgatacgccgattaaaggttggattcagccggaagctatcgcggacgccgtcgtgttcctggcgaaatcaaaaaacatcacgggcacgaacattgtggtggataacggtctgctggcgtga(SEQ IDNO:5)。

在一种优选的实施方式中，编码上述羰基还原酶突变体SEQ ID NO:3的基因为SEQID NO:6：

atgtctacgccgctgaatgctctggtgacgggtgcttctcgtggtattggtgctgcgaccgcgatcaaactggccgaaaacggttacagcgtgaccctggcggcccgtaacgtcgcaaaactgaatgaagtgaaagaaaaactgccggtggttaaagatggccagaaacatcacatttgggaactggacctggcctctgtcgaagctgctagctcttttaaaggcgcaccgctgccggcttcagattatgacctgtttgtttcgaacgcaggtatcgcacagatcaccccgacggcggatcaaaccgataaagacttcctgaacattctgacggtgaatctgagttccccgatcgcgctgaccaaagccctgctgaaaggcgttagtgaacgctccaatgaaaaaccgtttcatattatcttcctgtcatcggcagcagcactgcacggtgtgccgcaggcggcagtttacagcgcgtctaaagccggcctggatggttttgttcgttcactggctcgcgaagtcggcccgaaaggtattcatgttaacgtcatccacccgggctggaccaaaacggatatgaccgacggtattgatgacccgaatgatacgccgattaaaggttggattcagccggaagctatcgcggacgccgtcgtgttcctggcgaaatcaaaaaacatcacgggcacgaacattgtggtggataacggtctgctggcgtga(SEQ IDNO:6)。

在一种优选的实施方式中，编码上述羰基还原酶突变体SEQ ID NO:4的基因为SEQID NO:7：

atgtctacgccgctgaatgctctggtgacgggtgcttctcgtggtattggtgctgcgaccgcgatcaaactggccgaaaacggttacagcgtgaccctggcggcccgtaacgtcgcaaaactgaatgaagtgaaagaaaaactgccggtggttaaagatggccagaaacatcacatttgggaactggacctggcctctgtcgaagctgctagctcttttaaaggcgcaccgctgccggcttcagattatgacctgtttgtttcgaacgcaggtatcgcacagatcaccccgacggcggatcaaaccgataaagacttcctgaacattctgacggtgaatctgagttccccgatcgcgctgaccaaagccctgctgaaaggcgttagggaacgctccaatgaaaaaccgtttcatattatcttcctgtcatcggtagcagcactgcacggtgtgccgcaggcggcagtttacagcgcgtctaaagccggcctggatggttttgttcgttcactggctcgcgaagtcggcccgaaaggtattcatgttaacgtcatccacccgggctggaccaaaacggatatgaccgacggtattgatgacccgaatgatacgccgattaaaggttggattcagccggaagctatcgcggacgccgtcgtgttcctggcgaaatcaaaaaacatcacgggcacgaacattgtggtggataacggtctgctggcgtga(SEQ IDNO:7)。

本发明的第三个目的在于提供包含上述基因的质粒。

本发明的第四个目的在于提供转化了上述质粒的微生物。所述微生物可以选自枯草芽孢杆菌、短乳杆菌、木兰假丝酵母、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌。

优选地，所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第五个目的在于提供上述羰基还原酶突变体或其表达微生物在生产他汀类药物中间体中的用途。所述中间体包括但不限于6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯(CAS号：125971-93-9)、(4R,6R)-6-氰甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-乙酸叔丁酯(CAS号为125971-94-0，阿伐他汀钙侧链ATS-8)、6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯(CAS号：154026-93-4)。

在生产6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯(CAS号：125971-93-9)中，以式A6所示的(R)-6-氰基-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯(CAS号：125988-01-4)为底物原料，用上述羰基还原酶突变体或者其表达微生物作为催化剂来催化反应。

在生产6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯中，以式D2所示的(S)-6-氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯(CAS号：154026-92-3)为底物原料，用上述羰基还原酶突变体或者其表达微生物作为催化剂来催化反应。

在一种实施方式中，上述的反应在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP⁺的存在下进行。

上述的葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列优选为SEQ ID NO:8：

MYPDLKGKVVAITGAASGLGKAMAIRFGKEQAKVVINYYSNKQDPNEVKEEVIKAGGEAVVVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWDKVIGTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHEVIPWPLFVHYAASKGGIKLMTRTLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQKADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEASYVTGITLFADGGMTLYPSFQAGRG(SEQ ID NO:8)。

优选地，6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯可以进一步通过化学反应，例如与2,2-二甲氧基丙烷和甲磺酸反应，合成(4R,6R)-6-氰甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-乙酸叔丁酯(CAS号为125971-94-0)。

相较野生酶SEQ ID NO:1，本发明的羰基还原酶突变体SEQ ID NO:2-4的酶活性大幅度提高，并且对于阿伐他汀中间体底物和瑞舒伐他汀中间体底物均具有高度的立体特异性，极具工业化前景。

附图说明

图1是CRHZ及3个突变体催化化合物A6反应4h后的TLC点板跟踪照片；

图2是CRHZ及3个突变体催化化合物D2反应4h后的TLC点板跟踪照片。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

在本发明中，术语“羰基还原酶突变体”、“突变体羰基还原酶”、“突变羰基还原酶”和“突变酶”表示相同的意义，都是指羰基还原酶的突变体。为简要起见，本文中可将“羰基还原酶突变体”简称为“羰基还原酶”，只要不与野生型羰基还原酶SEQ ID NO:1混淆即可。

在本发明中，术语“野生(型)羰基还原酶”、“野生羰基还原酶”表示相同的意义，都是指野生型的羰基还原酶或称CRHZ(SEQ ID NO:1)。

为描述简便起见，在本文中有时将“羰基还原酶”简称为“CRHZ”，它们表示相同的意义，可以互换使用。有时将“葡萄糖脱氢酶”简称为“GDH”，它们表示相同的意义，可以互换使用。

本发明的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。

这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

当作为生物催化剂用于生产阿托伐他汀和瑞舒伐他汀中间体时，本发明的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体。

本发明的羰基还原酶和葡萄糖脱氢酶分离纯化、包括固定化酶制备技术也是本领域技术人员所熟知的。

实施例

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠，pH7.2，121℃高温高压灭菌20min；

TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K₂HPO₄.3H₂O、2.31g/LKH₂PO₄、5g/L甘油，pH7.0-7.5，121℃高温高压灭菌20min；

斜面培养基：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、20g/L琼脂粉，混匀后按30-40mL装液量分装到茄子瓶，竖立放置于121℃高温高压灭菌20min，降温后加入100μg/mL硫酸卡那霉素，摆放成斜面，待冷凝成固体即可。

发酵培养

种子活化：取种子甘油保藏管，取100μL种子保藏液，用接种环均匀涂抹于茄子瓶斜面，然后置于37℃培养箱培养过夜(18h)；

种子培养：取100mL无菌水导入茄子瓶做成菌悬液，取菌悬液50μl接入装有50mLTB培养基的250mL摇瓶，30℃，220rpm培养16h；

发酵：将一级种子培养液接入装有1L TB培养基的5L摇瓶，37℃，220rpm培养4-6h后，加入0.3mM IPTG并降温至28℃，220rpm诱导培养12h。

菌体收集：收集发酵液，置于离心机4000rpm离心30min，弃上清后收集菌泥，放置于-20℃冷冻收藏。

酶液的制备：分别称取GDH、CRHZ及其突变体菌泥各5g，然后各加入20mL去离子水重悬浮后，通过超声波进行细胞破碎，破碎液经过12000rpm离心10min后取上清，即为酶液，放置于冰浴中待用。

实施例1野生型羰基还原酶(CRHZ)基因重组大肠杆菌的构建

根据专利EP1152054A1提供的木兰假丝酵母Candida magnoliae ifo 0705来源的羰基还原酶CRHZ的氨基酸序列进行适于大肠杆菌表达的密码子优化，并全基因合成该基因序列，在两端设计酶切位点NdeI和EcoRI，并亚克隆到载体pET24a(购自Novagen)上相应位点，从而获得重组质粒pET24a-CRHZ。将构建好的重组质粒pET24a-CRHZ用氯化钙法转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)，得到表达野生型羰基还原酶的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET24a-CRHZ。

密码子优化的基因序列为(SEQ ID NO:9)：

atgtctacgccgctgaatgctctggtgacgggtgcttctcgtggtattggtgctgcgaccgcgatcaaactggccgaaaacggttacagcgtgaccctggcggcccgtaacgtcgcaaaactgaatgaagtgaaagaaaaactgccggtggttaaagatggccagaaacatcacatttgggaactggacctggcctctgtcgaagcagctagctcttttaaaggcgcaccgctgccggcttcagattatgacctgtttgtttcgaacgcaggtatcgctcagttcaccccgacggcggatcaaaccgataaagacttcctgaacattctgacggtgaatctgagttccccgatcgcgctgaccaaagccctgctgaaaggcgttagtgaacgctccaatgaaaaaccgtttcatattatcttcctgtcatcggcagcagcactgcacggtgtgccgcagacggcagtttacagcgcgtctaaagccggcctggatggttttgttcgttcactggctcgcgaagtcggcccgaaaggtattcatgttaacgtcatccacccgggctggaccaaaacggatatgaccgacggtattgatgacccgaatgatacgccgattaaaggttggattcagccggaagctatcgcggacgccgtcgtgttcctggcgaaatcaaaaaacatcacgggcacgaacattgtggtggataacggtctgctggcgtga(SEQ ID NO:9)。

氨基酸序列测定为SEQ ID NO:1。

实施例2葡萄糖脱氢酶GDH表达菌种的构建

将枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168接种于LB液体培养基中，30℃220rpm培养24小时。总DNA的提取参照基因组提取试剂盒说明书(购自生工生物工程上海股份有限公司)。

根据已报道的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168来源的葡萄糖脱氢酶GDH的基因序列(NCBI登录号：AL009126.3)，设计引物如下：

正向引物GDH-F：5’-CGGGATCCATGTATCCGGATTTAAAAG-3’(BamHI)，

反向引物GDH-R：5’-CCCAAGCTTTTAACCGCGGCCTGCCTGG-3’(HindIII)。

PCR反应体系包括：GDH-F和GDH-R各50pmol，总DNA 100ng，1X KOD plus buffer，0.2mM dNTP，25mM MgSO₄，KOD plus 2U，补水至总体系50μL。

PCR扩增条件为：95℃5min，94℃45s，55℃45s，68℃1min，重复30个循环，68℃10min。

PCR反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳进行分析，检测到一条大约800bp的特异条带，为所需条带。使用小量胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，用BamHI和HindIII于37℃双酶切3-6小时，过柱纯化回收。回收产物与同样酶切处理的表达载体pET24a用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取转化子进行测序验证，获得重组质粒。

对GDH氨基酸序列的第252位和第170位两个位点做定点突变，将第170位的谷氨酸(E)突变为精氨酸(R)，将第252位的谷氨酰胺(Q)突变为亮氨酸(L)。根据待突变的氨基酸及突变位点E170R、Q252L设计引物，采用MEGA WHOP方法(Arnold and Georgiou 2003)进行突变。设计引物如下：

正向引物GDHE170R-F：AAGCTGATGACACGAACATTAGCGTT，

反向引物GDHQ252L-R：AATGAAGGATATAGTGTCATACCGC。

用这对引物扩增出含有突变位点Q252L/E170R的序列。PCR反应体系包括：

GDHE170R-F和GDHQ252L-R各50pmol，质粒模板pET24a-GDH 50ng，1X KOD plusbuffer，0.2mM dNTP，25mM MgSO₄，KOD plus 2U，补水至总体系50μL。

PCR扩增条件为：95℃5min，94℃45s，55℃45s，68℃30s，重复30个循环，68℃10min。PCR反应结束后，用琼脂糖凝胶电泳进行分析，检测到一条大约250bp的特异条带，为所需条带。小量胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。将此PCR产物作为大引物，以pET24a-GDH为模板，采用高保真DNA聚合酶KOD plus做全质粒线性扩增，PCR反应体系包括：大引物片段50-100pmol，质粒模板pET24a-GDH 50ng，1X KOD plus buffer，0.2mM dNTP，25mM MgSO₄，KOD plus 2U，补水至总体系50μL。

PCR扩增条件为：95℃5min，94℃45s，55℃45s，68℃6min，重复25个循环，68℃10min。扩增完成后，在体系中加入DpnI于37℃消化去除质粒模板，然后将消化产物直接转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞。挑取克隆进行测序验证，测序正确的菌种命名为BL21(DE3)/pET24a-GDH。

基因序列如下：

atgtatccggatttaaaaggaaaagtcgtcgctattacaggagctgcttcagggctcggaaaggcgatggccattcgcttcggcaaggagcaggcaaaagtggttatcaactattatagtaataaacaagatccgaacgaggtaaaagaagaggtcatcaaggcgggcggtgaagctgttgtcgtccaaggagatgtcacgaaagaggaagatgtaaaaaatatcgtgcaaacggcaattaaggagttcggcacactcgatattatgattaataatgccggtcttgaaaatcctgtgccatctcacgaaatgccgctcaaggattgggataaagtcatcggcacgaacttaacgggtgcctttttaggaagccgtgaagcgattaaatatttcgtagaaaacgatatcaagggaaatgtcattaacatgtccagtgtgcacgaagtgattccttggccgttatttgtccactatgcggcaagtaaaggcgggataaagctgatgacacgaacattagcgttggaatacgcgccgaagggcattcgcgtcaataatattgggccaggtgcgatcaacacgccaatcaatgctgaaaaattcgctgaccctaaacagaaagctgatgtagaaagcatgattccaatgggatatatcggcgaaccggaggagatcgccgcagtagcagcctggcttgcttcgaaggaagccagctacgtcacaggcatcacgttattcgcggacggcggtatgacactatatccttcattccaggcaggccgcggttaa(SEQ ID NO:10)。

氨基酸序列测定为SEQ ID NO:8。

实施例3易错PCR和随机突变库的构建

以CRHZ的编码基因为模板，应用易错PCR和大引物PCR技术构建随机突变体库。设计引物如下：

正向引物CRHZerr-F：5’-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAC；

反向引物CRHZerr-R：5’-CTTGTCGACGGAGCTCGAAT-3’。

100μL易错PCR反应体系包括：50ng质粒模板，各0.2μM一对引物CRHZerr-F和CRHZerr-R，1X Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl₂，(0.2mM,0.3mM,0.4mM)MnCl₂，1U Taq。

PCR反应条件为：95℃，5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，40个循环；72℃7min。胶回收1kb随机突变片段作为大引物，用KOD FX neo DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃，2min，68℃10min；98℃10s，55℃30s，68℃3min，25个循环；68℃10min。

在PCR产物中加入DpnI于37℃消化去除质粒模板，纯化回收后电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，加入1mLLB培养基37℃复苏1h，涂布Kan平板37℃培养过夜，得到超过10⁴个克隆的随机突变体库。

实施例4高通量筛选CRHZ突变体

将突变体库中的转化子用牙签接种到含200μL LB培养基的96孔深孔培养板中，含100μg/mL Kan(卡那霉素)，37℃、220rpm培养6h以上；每孔添加200μL LB+100μg/mL、Kan+0.6mM IPTG培养基，28℃、220rpm培养过夜。

诱导过夜的96孔板振荡打匀菌体，取15μL菌液移至另一块96孔板，放入-70℃冻1-2小时，37℃融化20min。每孔加入100μL水稀释，振荡混匀后每孔吸15μL稀释后的酶液转移到另一块96孔板上，加入显色反应液185μL/孔(60g/L葡萄糖，1.8g/L EDTA，8.4g/L三乙醇胺，6μL化合物A6，9μL异丙醇，46μL甲基红，5μL 4000U/mL GDH酶液，0.05g/L NADP+，pH7.0)，37℃180rpm反应1.5h观察颜色变化，将颜色变红的突变子从对应的母板上检出进行复筛和酶活测定。

甲基红的配制：0.1g甲基红溶于100mL 60％乙醇。

酶活测定方法：取250mL烧杯，称取0.5g三乙醇胺，24g葡萄糖和25g化合物A6置于烧杯中，并加入25mL的水搅拌均匀后并升温至30℃。用20％的H₂SO₄调节pH7.0，分别加入羰基还原酶酶液(2.5mL)和GDH酶液(1.39mL)，最后加入NADP⁺(0.315mL)开始反应，反应过程中滴加1M的碳酸钠溶液控制pH7.0，以1小时滴加的碳酸钠溶液溶液量表征酶活。

通过这种筛选方法，从以CRHZ编码基因为模板的突变体库中筛选出了酶活提高的突变体CRHZ18；再以CRHZ18编码基因为模板重新构建随机突变体库，应用同样的筛选方法筛选出酶活进一步提高的突变体154A6；重复上述操作步骤，在154A6的基础上继续进行随机突变和定向筛选，最终获得一个酶活大幅提高的突变体246G12。

羰基还原酶突变体编号	突变位点(与CRHZ比较)	SEQ ID NO:
			CRHZ18	F95I	2
154A6	F95I,T154A	3
			246G12	F95I,T154A,S129R,A145V	4

实施例5野生型CRHZ及3个突变体对化合物A6的催化活性比较

5.1、实验方法：

1)取250mL烧杯，称取0.5g三乙醇胺，24g葡萄糖和25g化合物A6置于烧杯中，并加入25mL的水搅拌均匀后并升温至30℃。

2)用20％的H₂SO₄调节pH7.0，分别加入羰基还原酶酶液(1.25mL)和GDH酶液(1.39mL)，最后加入NADP⁺(0.315mL)开始反应，反应过程中用1M的碳酸钠溶液控制pH7.0，并分时段记录加量。用TLC跟踪反应。

3)其中1#反应加入的羰基还原酶为CRHZ；2#反应加入的羰基还原酶为CRHZ18；3#反应加入的羰基还原酶为154A6；4#反应加入的羰基还原酶为246G12。

5.2、实验数据：由于每转化1分子底物A6，就会产生1分子葡萄糖酸，需要0.5分子的碳酸钠，所以碳酸钠溶液的使用速度即代表催化反应的速度快慢和酶活的高低。

5.2.1、碳酸钠溶液的加量比较：

上述结果表明，当催化A6还原时，相较野生酶CRHZ，突变体154A6和突变体246G12的酶活性大幅度提高，例如反应1h时，突变体154A6的酶活性显示为野生型的2倍多，而突变体246G12的酶活性显示为野生型的7倍多。反应4h时，突变体154A6的酶活性显示为野生型的2倍多，而突变体246G12的酶活性显示为野生型的4倍多。

5.2.2、TLC点板：

参见图1，薄层色谱层析TLC检测结果也证明了246G12反应最快，反应4h后，底物已经反应完了。

5.2.3手性测定

由于产物A7的检测要求高，在生产上，都采用进一步合成至化合物A8再进行手性检测。具体方法如下：

待上述1#、2#和3#反应继续反应至16h，TLC检测都已经反应完全，反应完毕的料液按照如下步骤分别处理：

步骤1：反应完的料液中加入乙酸乙酯250mL和硅藻土25g，升温至50～60℃，过滤后分层，水层用150mL乙酸乙酯萃取两次，合并有机层，浓缩得到化合物A7粗品，为油状物。

在烧瓶中加入步骤1获得的油状物、2,2-二甲氧基丙烷25g、甲苯50mL和甲磺酸0.2g，升温至25℃，保温反应3小时。反应结束后，加入100mL甲苯，加饱和碳酸氢钠水溶液中和至pH7.5，分去水层，浓缩干有机层。加入75mL已烷，升温溶解，然后冷却至0℃，结晶，过滤，得化合物A8粗品。再用正已烷(50mL)和乙醇(2.5mL)混合溶剂重结晶，过滤，烘干得化合物A8。

化合物A8的手性分析：

检测仪器：Agilent 1200型高效液相色谱仪

液相流动相：正已烷：异丙醇厚98：2

波长λ＝215nm，流速0.6mL/min，溶剂：流动相；

色谱柱：Chiralcel OD-H 250×4.6mm 5μm；

进样量：20μl，柱温：30℃，运行时间：28min。

化合物A8的保留时间为19.8min左右；4R,6S-异构体保留时间14.1min左右；4S,6S-异构体保留时间15.5min左右；4S,6R-异构体保留时间16.9min左右。

样品分析：称取CRHZ(1#)、CRHZ18(2#)、154A6(3#)和246G12(4#)分别催化并处理得到的A8样品200mg，置于10ml的容量瓶中，用溶剂溶解、定容、摇匀，作为样品溶液。取样品溶液20μL，注入液相色谱仪，进行检测。

结果表明，在液相手性分析条件下，4个样品中对映异构体4S,6S-异构体的含量均不超过0.02％，其他异构体未检测到。表明本发明构建的野生型CRHZ及3个突变体对于底物A6均具有高度的立体特异性。

实施例6野生型CRHZ及3个突变体对化合物D2的催化活性比较

6.1、实验方法：

1)取250mL烧杯，称取0.5g三乙醇胺，24g葡萄糖和25g底物化合物D2置于烧杯中，并加入25mL的水搅拌均匀后升温至30℃。

2)用20％的H₂SO₄调节pH7.0，分别加入羰基还原酶酶液(1.25mL)和GDH酶液(1.39mL)，最后加入NADP⁺(0.315ml)开始反应，反应过程中用1M的碳酸钠溶液控制pH7.0，并分时段记录加碱量。用TLC跟踪反应。

6.2、实验数据：由于每转化1分子底物D2，就会产生1分子葡萄糖酸，需要0.5分子的碳酸钠，所以碳酸钠溶液的使用速度即代表催化反应的速度快慢和酶活的高低。

6.2.1、加碱量比较：

上述结果表明，当催化D2还原时，相较野生酶CRHZ，突变体154A6和突变体246G12的酶活性大幅度提高，例如反应1h时，突变体154A6的酶活性显示为野生型的3倍多，而突变体246G12的酶活性显示为野生型的8倍。反应4h时，突变体154A6的酶活性显示为野生型的近4倍，而突变体246G12的酶活性显示为野生型的4倍多。

6.2.2、TLC点板：

参见图2，薄层色谱层析TLC检测结果也证明了246G12反应最快，反应4h后，底物已经反应完了。

6.2.3液相和手性检测

检测仪器：Agilent 1200型高效液相色谱仪。

本发明中产物的检测方法：

HPLC色谱柱：ZORBAX SB-C8，4.6×150mm，5-Micron，

流动相：30％乙腈，流速：1.0mL/min，

柱温：40℃，检测波长：210nm。

产物D3保留时间：7.1min左右；底物D2保留时间：12.0min左右。

液相检测转化4h结果显示，底物转化率与加碳酸钠溶液量对应，分别为22.7％、48.26％、84.6％和99.7％；

检测手性时，采用手性色谱柱OD-H柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：正己烷：异丙醇＝85：15，流速1mL/min，检测波长215nm。化合物D3和(3S,5S)-异构体的保留时间分别为5.1min和4.9min。检测结果显示，CRHZ、CRHZ18、154A6和246G12催化还原的产品ee值都在99.9％以上，表明本发明构建的野生型CRHZ及3个突变体对于底物D2均具有高度的立体特异性。

综上所述，本发明构建了羰基还原酶突变体SEQ ID NO:2-4，相比野生型羰基还原酶，两个突变体的酶活力得到了明显提高，并且对于底物阿伐他汀中间体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯和瑞舒伐他汀中间体6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯均具有高度的立体特异性，具有广阔的工业化前景。

序列表

<110> 湖州颐辉生物科技有限公司

<120> 羰基还原酶突变体及其应用

<130> SHPI810323

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 241

<212> PRT

<213> Candida magnoliae ifo 0705

<400> 1

Met Ser Thr Pro Leu Asn Ala Leu Val Thr Gly Ala Ser Arg Gly Ile

1 5 10 15

Gly Ala Ala Thr Ala Ile Lys Leu Ala Glu Asn Gly Tyr Ser Val Thr

20 25 30

Leu Ala Ala Arg Asn Val Ala Lys Leu Asn Glu Val Lys Glu Lys Leu

35 40 45

Pro Val Val Lys Asp Gly Gln Lys His His Ile Trp Glu Leu Asp Leu

50 55 60

Ala Ser Val Glu Ala Ala Ser Ser Phe Lys Gly Ala Pro Leu Pro Ala

65 70 75 80

Ser Asp Tyr Asp Leu Phe Val Ser Asn Ala Gly Ile Ala Gln Phe Thr

85 90 95

Pro Thr Ala Asp Gln Thr Asp Lys Asp Phe Leu Asn Ile Leu Thr Val

100 105 110

Asn Leu Ser Ser Pro Ile Ala Leu Thr Lys Ala Leu Leu Lys Gly Val

115 120 125

Ser Glu Arg Ser Asn Glu Lys Pro Phe His Ile Ile Phe Leu Ser Ser

130 135 140

Ala Ala Ala Leu His Gly Val Pro Gln Thr Ala Val Tyr Ser Ala Ser

145 150 155 160

Lys Ala Gly Leu Asp Gly Phe Val Arg Ser Leu Ala Arg Glu Val Gly

165 170 175

Pro Lys Gly Ile His Val Asn Val Ile His Pro Gly Trp Thr Lys Thr

180 185 190

Asp Met Thr Asp Gly Ile Asp Asp Pro Asn Asp Thr Pro Ile Lys Gly

195 200 205

Trp Ile Gln Pro Glu Ala Ile Ala Asp Ala Val Val Phe Leu Ala Lys

210 215 220

Ser Lys Asn Ile Thr Gly Thr Asn Ile Val Val Asp Asn Gly Leu Leu

225 230 235 240

Ala

<210> 2

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Ser Thr Pro Leu Asn Ala Leu Val Thr Gly Ala Ser Arg Gly Ile

1 5 10 15

Gly Ala Ala Thr Ala Ile Lys Leu Ala Glu Asn Gly Tyr Ser Val Thr

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Leu Ala Ala Arg Asn Val Ala Lys Leu Asn Glu Val Lys Glu Lys Leu

35 40 45

Pro Val Val Lys Asp Gly Gln Lys His His Ile Trp Glu Leu Asp Leu

50 55 60

Ala Ser Val Glu Ala Ala Ser Ser Phe Lys Gly Ala Pro Leu Pro Ala

65 70 75 80

Ser Asp Tyr Asp Leu Phe Val Ser Asn Ala Gly Ile Ala Gln Ile Thr

85 90 95

Pro Thr Ala Asp Gln Thr Asp Lys Asp Phe Leu Asn Ile Leu Thr Val

100 105 110

Asn Leu Ser Ser Pro Ile Ala Leu Thr Lys Ala Leu Leu Lys Gly Val

115 120 125

Ser Glu Arg Ser Asn Glu Lys Pro Phe His Ile Ile Phe Leu Ser Ser

130 135 140

Ala Ala Ala Leu His Gly Val Pro Gln Thr Ala Val Tyr Ser Ala Ser

145 150 155 160

Lys Ala Gly Leu Asp Gly Phe Val Arg Ser Leu Ala Arg Glu Val Gly

165 170 175

Pro Lys Gly Ile His Val Asn Val Ile His Pro Gly Trp Thr Lys Thr

180 185 190

Asp Met Thr Asp Gly Ile Asp Asp Pro Asn Asp Thr Pro Ile Lys Gly

195 200 205

Trp Ile Gln Pro Glu Ala Ile Ala Asp Ala Val Val Phe Leu Ala Lys

210 215 220

Ser Lys Asn Ile Thr Gly Thr Asn Ile Val Val Asp Asn Gly Leu Leu

225 230 235 240

Ala

<210> 3

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

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1 5 10 15

Gly Ala Ala Thr Ala Ile Lys Leu Ala Glu Asn Gly Tyr Ser Val Thr

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Leu Ala Ala Arg Asn Val Ala Lys Leu Asn Glu Val Lys Glu Lys Leu

35 40 45

Pro Val Val Lys Asp Gly Gln Lys His His Ile Trp Glu Leu Asp Leu

50 55 60

Ala Ser Val Glu Ala Ala Ser Ser Phe Lys Gly Ala Pro Leu Pro Ala

65 70 75 80

Ser Asp Tyr Asp Leu Phe Val Ser Asn Ala Gly Ile Ala Gln Ile Thr

85 90 95

Pro Thr Ala Asp Gln Thr Asp Lys Asp Phe Leu Asn Ile Leu Thr Val

100 105 110

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Ala Ala Ala Leu His Gly Val Pro Gln Ala Ala Val Tyr Ser Ala Ser

145 150 155 160

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165 170 175

Pro Lys Gly Ile His Val Asn Val Ile His Pro Gly Trp Thr Lys Thr

180 185 190

Asp Met Thr Asp Gly Ile Asp Asp Pro Asn Asp Thr Pro Ile Lys Gly

195 200 205

Trp Ile Gln Pro Glu Ala Ile Ala Asp Ala Val Val Phe Leu Ala Lys

210 215 220

Ser Lys Asn Ile Thr Gly Thr Asn Ile Val Val Asp Asn Gly Leu Leu

225 230 235 240

Ala

<210> 4

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

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1 5 10 15

Gly Ala Ala Thr Ala Ile Lys Leu Ala Glu Asn Gly Tyr Ser Val Thr

20 25 30

Leu Ala Ala Arg Asn Val Ala Lys Leu Asn Glu Val Lys Glu Lys Leu

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Pro Val Val Lys Asp Gly Gln Lys His His Ile Trp Glu Leu Asp Leu

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100 105 110

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130 135 140

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165 170 175

Pro Lys Gly Ile His Val Asn Val Ile His Pro Gly Trp Thr Lys Thr

180 185 190

Asp Met Thr Asp Gly Ile Asp Asp Pro Asn Asp Thr Pro Ile Lys Gly

195 200 205

Trp Ile Gln Pro Glu Ala Ile Ala Asp Ala Val Val Phe Leu Ala Lys

210 215 220

Ser Lys Asn Ile Thr Gly Thr Asn Ile Val Val Asp Asn Gly Leu Leu

225 230 235 240

Ala

<210> 5

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

atgtctacgc cgctgaatgc tctggtgacg ggtgcttctc gtggtattgg tgctgcgacc 60

gcgatcaaac tggccgaaaa cggttacagc gtgaccctgg cggcccgtaa cgtcgcaaaa 120

ctgaatgaag tgaaagaaaa actgccggtg gttaaagatg gccagaaaca tcacatttgg 180

gaactggacc tggcctctgt cgaagctgct agctctttta aaggcgcacc gctgccggct 240

tcagattatg acctgtttgt ttcgaacgca ggtatcgcac agatcacccc gacggcggat 300

caaaccgata aagacttcct gaacattctg acggtgaatc tgagttcccc gatcgcgctg 360

accaaagccc tgctgaaagg cgttagtgaa cgctccaatg aaaaaccgtt tcatattatc 420

ttcctgtcat cggcagcagc actgcacggt gtgccgcaga cggcagttta cagcgcgtct 480

aaagccggcc tggatggttt tgttcgttca ctggctcgcg aagtcggccc gaaaggtatt 540

catgttaacg tcatccaccc gggctggacc aaaacggata tgaccgacgg tattgatgac 600

ccgaatgata cgccgattaa aggttggatt cagccggaag ctatcgcgga cgccgtcgtg 660

ttcctggcga aatcaaaaaa catcacgggc acgaacattg tggtggataa cggtctgctg 720

gcgtga 726

<210> 6

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

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ctgaatgaag tgaaagaaaa actgccggtg gttaaagatg gccagaaaca tcacatttgg 180

gaactggacc tggcctctgt cgaagctgct agctctttta aaggcgcacc gctgccggct 240

tcagattatg acctgtttgt ttcgaacgca ggtatcgcac agatcacccc gacggcggat 300

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<210> 7

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

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gaactggacc tggcctctgt cgaagctgct agctctttta aaggcgcacc gctgccggct 240

tcagattatg acctgtttgt ttcgaacgca ggtatcgcac agatcacccc gacggcggat 300

caaaccgata aagacttcct gaacattctg acggtgaatc tgagttcccc gatcgcgctg 360

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catgttaacg tcatccaccc gggctggacc aaaacggata tgaccgacgg tattgatgac 600

ccgaatgata cgccgattaa aggttggatt cagccggaag ctatcgcgga cgccgtcgtg 660

ttcctggcga aatcaaaaaa catcacgggc acgaacattg tggtggataa cggtctgctg 720

gcgtga 726

<210> 8

<211> 261

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 8

Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala

1 5 10 15

Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu Val

35 40 45

Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln Gly

50 55 60

Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Ile

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Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu

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100 105 110

Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile

115 120 125

Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser

130 135 140

Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala

145 150 155 160

Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Arg Thr Leu Ala Leu Glu Tyr

165 170 175

Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn

180 185 190

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala Asp

195 200 205

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile

210 215 220

Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val Thr

225 230 235 240

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser Phe

245 250 255

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260

<210> 9

<211> 726

<212> DNA

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aaagccggcc tggatggttt tgttcgttca ctggctcgcg aagtcggccc gaaaggtatt 540

catgttaacg tcatccaccc gggctggacc aaaacggata tgaccgacgg tattgatgac 600

ccgaatgata cgccgattaa aggttggatt cagccggaag ctatcgcgga cgccgtcgtg 660

ttcctggcga aatcaaaaaa catcacgggc acgaacattg tggtggataa cggtctgctg 720

gcgtga 726

<210> 10

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gctattacag gagctgcttc agggctcgga 60

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ggcatcacgt tattcgcgga cggcggtatg acactatatc cttcattcca ggcaggccgc 780

ggttaa 786

Claims

1.一种羰基还原酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

2.编码如权利要求1所述羰基还原酶的基因。

3.如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述基因为SEQ ID NO:7。

4.包含如权利要求2或3所述基因的质粒。

5.转化了如权利要求4所述质粒的微生物。

6.如权利要求5所述的微生物，其特征在于，所述微生物选自枯草芽孢杆菌、短乳杆菌、木兰假丝酵母、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌。

7.如权利要求6所述的微生物，其特征在于，是所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。

8.如权利要求1所述羰基还原酶或者如权利要求6所述微生物在生产他汀类化合物中间体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯、6-氯-(3R,5S)-二羟基己酸叔丁酯中的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，反应在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP⁺的存在下进行。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列为SEQ IDNO:8。