CN115820932B - 一种基于crispr***反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法 - Google Patents

一种基于crispr***反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法。所述方法包括：使用石墨烯场效应晶体管放大溶液中Cas12b反式切割检测信号，检测猴痘病毒核酸。利用Cas12b‑sgRNA对DNA片段具有较高的活性和特异性，基于石墨烯场效应晶体管进行检测信号放大，实现靶DNA的超灵敏检测，检测时间短、灵敏度高，可以更好地应用于猴痘病毒的快速筛检。

Description

一种基于CRISPR***反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸 检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基于CRISPR***反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法。
背景技术
感染性疾病是临床上非常重要的、发病率最高的一类疾病，如猴痘病毒(Monkeypox virus，MPXV)是全长约197kb双链DNA病毒，属于痘病毒科正痘病毒属，猴痘病毒发病早期出现发热、寒战、头痛、嗜睡、乏力、背部疼痛和肌痛等前驱症状，90％患者出现明显的浅表***肿大。RT-qPCR是目前核酸检测的金标准，该方法灵敏度高，特异性较强。但RT-qPCR检测时间较长且仪器设备复杂，需要专业人员多步操作，限制其在现场进行快速检测。
近年，作为遗传操作工具，基因编辑技术发展迅速，受到广大科研工作者的青睐，在分子诊断中也展现中也展现出巨大的潜力。其中，Cas12蛋白具有独特的反式切割活性，近年来被广泛地应用于生物传感领域。目前，基于Cas12的高灵敏核酸检测方式主要依赖于核酸等温扩增技术，但存在反应***复杂、检测时间长以及样品易污染等问题。因此，亟待开发一种无扩增、高灵敏的单分子检测方式。
场效应晶体管传感器兼具信号转换和信号放大功能，通过目标分子与半导体沟道材料结合引起的电流信号变化实现对目标物质的定量检测，具有灵敏度高、选择性好，易于集成等优点。石墨烯具有比表面积大、无悬挂键、载流子浓度和载流子迁移率高、能带结构易于调节等特点，使其表面易于感知微小的电荷变化。石墨烯场效应晶体管(gFET)传感器是以石墨烯为沟道材料制作的场效应晶体管器件，将目标DNA与固定于石墨烯表面的互补DNA杂交实现核酸检测，因其检测时间短，灵敏度高，在微生物快速筛检方面具有巨大的应用价值，如CN114150089A公开了一种基于CRISPR-Cas13a/Cas12a反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法，将Cas13a/Cas12a固定在石墨烯表面后或者在溶液中与靶向不同病毒核酸的crRNA结合，构建Cas13a/Cas12a-crRNA复合物，用于快速切割修饰在gFET上的ssRNA/ssDNA，进而引发转移特性曲线的变化，实现对SARS-CoV-2N基因、SARS-CoV-2E基因、SARS-CoV-2Orf1ab基因、HPV-16或HPV-18核酸的响应。检测受多种复杂因素影响，针对不同目标病毒如何设计对应的高效检测方法仍存在挑战。
综上所述，开发一种针对猴痘病毒的基于CRISPR-Cas反式切割和gFET核酸检测方法，对于猴痘病毒检测领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种基于CRISPR***反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法，利用Cas12b-sgRNA对DNA片段具有较高的活性和特异性，实现靶DNA的超灵敏检测，检测时间短、灵敏度高，可以更好地应用于猴痘病毒的快速筛检。
为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种基于CRISPR-Cas反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法，所述方法包括：
使用石墨烯场效应晶体管放大溶液中Cas12b反式切割检测信号，检测猴痘病毒核酸。
本发明中，Cas12b蛋白来源于Alicyclobacillus acidiphilus细菌，Cas12b具有反式切割活性，通过sgRNA对目标片段的识别，激活Cas12b核酸内切酶的特性，从而能够非特异性地切割固定在石墨烯层上的单链核酸(ssDNA)，导致石墨烯场效应晶体管(gFET)中源极和漏极之间电流发生快速改变，从而实现靶DNA的超灵敏检测，Cas12b与同家族的Cas12a相比，Cas12b识别5’-TTN的PAM序列(Cas12aPAM序列为5’-TTTN)，能够更好地区分猴痘与其他同源性极高的正痘病毒属，从而实现高特异性和灵敏度检测猴痘病毒。
优选地，所述方法包括石墨烯场效应晶体管制备步骤、报告分子修饰步骤以及核酸检测步骤。
优选地，所述石墨烯场效应晶体管制备步骤包括：
定制商业化石墨烯场效应晶体管芯片，经引线后，构建聚二甲基硅氧烷微流控腔室，将微流控腔室用环氧树脂胶固定于芯片上，并将进液管和出液管道***腔室及进行胶封，出液管另一端与泵相连，得到石墨烯场效应晶体管。
优选地，所述报告分子修饰步骤包括：
将PBASE溶液在石墨烯场效应晶体管的石墨烯通道表面孵育，将氨基修饰的ssDNA在石墨烯表面孵育，并进行封闭。
优选地，所述ssDNA为20～40nt的随机序列。
优选地，所述报告分子修饰步骤包括：
将PBASE溶液在石墨烯场效应晶体管的石墨烯通道表面孵育1～3h，将氨基修饰的ssDNA在石墨烯表面孵育3～9h(例如可以是4h、5h、6h、7h或8h)，并进行封闭1～3h。
优选地，所述PBASE溶液的溶剂选自乙醇和/或DMF。
本发明中，所述PBASE溶液的浓度为1mM～3mM。
优选地，所述封闭的试剂包括乙醇胺。
优选地，所述乙醇胺的浓度为100mM～200mM，包括但不限于101mM(mmol/L)、102mM、103mM、105mM、106mM、110mM、120mM、130mM、150mM、160mM、180mM、190mM、192mM、193mM、195mM、196mM、197mM、198mM或199mM。
优选地，所述ssDNA的浓度为1μM～5μM，包括但不限于2μM(μmol/L)、3μM或4μM。
优选地，所述核酸检测步骤包括：
将Cas12b与sgRNA形成Cas12b-sgRNA复合物，将待检测样本与Cas12b-sgRNA复合物混合后加入石墨烯场效应晶体管中进行反应，反应后记录转移特性曲线的变化。
优选地，所述sgRNA的靶点包括猴痘病毒B6R基因和/或F3L基因。
优选地，所述sgRNA的靶点选自SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示核酸序列中的任意一种或至少两种的组合。
SEQ ID NO.1：5’-TGGGTGTCATATTTCTAATC-3’。
SEQ ID NO.2：5’-TATATGATAAGCCATTATAC-3’。
SEQ ID NO.3：5’-TGACAGGGTTAACACCTTTC-3’。
SEQ ID NO.4：5’-CTATTATAGCATCAGCATCA-3’。
优选地，所述sgRNA选自SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示核酸序列中的任意一种或至少两种的组合。
SEQ ID NO.5：
GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGGCAAAGCCCGUUGAGCUUCUCAAAUCUGAGAAGUGGCACUGGGUGUCAUAUUUCUAAUC。
SEQ ID NO.6：
GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGGCAAAGCCCGUUGAGCUUCUCAAAUCUGAGAAGUGGCACGUAUAAUGGCUUAUCAUAUA。
SEQ ID NO.7：
GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGGCAAAGCCCGUUGAGCUUCUCAAAUCUGAGAAGUGGCACGAAAGGUGUUAACCCUGUCA。
SEQ ID NO.8：
GUCUAGAGGACAGAAUUUUUCAACGGGUGUGCCAAUGGCCACUUUCCAGGUGGCAAAGCCCGUUGAGCUUCUCAAAUCUGAGAAGUGGCACUGAUGCUGAUGCUAUAAUAG。
本发明中，针对猴痘病毒，设计并筛选特定序列的sgRNA，以进一步提高检测特异性和灵敏度。
优选地，所述的Cas12b和sgRNA的浓度比为1:(1～5)，包括但不限于1:2、1:3或1:4。
优选地，所述Cas12b的浓度为100nM～500nM，包括但不限于102nM、104nM、106nM、108nM、109nM、150nM、200nM、250nM、280nM、320nM、350nM、380nM、400nM、410nM、420nM、450nM、460nM、480nM、490nM、492nM、494nM、496nM、498nM或499nM。
优选地，所述sgRNA的浓度为100nM～500nM，包括但不限于102nM、104nM、106nM、108nM、109nM、150nM、200nM、250nM、280nM、320nM、350nM、380nM、400nM、410nM、420nM、450nM、460nM、480nM、490nM、492nM、494nM、496nM、498nM或499nM。
优选地，所述反应的温度为40～60℃，包括但不限于41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、50℃、52℃、54℃、56℃、58℃或59℃时间为30～50min，包括但不限于31min、32min、33min、34min、35min、36min、37min、38min、39min、42min、44min、45min、46min或48min。
作为优选的技术方案，所述基于CRISPR-Cas反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法包括以下步骤：
(1)定制商业化石墨烯场效应晶体管芯片，经引线后，构建聚二甲基硅氧烷微流控腔室，将微流控腔室用环氧树脂胶固定于芯片上，并将进液管和出液管道***腔室及进行胶封，出液管另一端与泵相连，得到石墨烯场效应晶体管；
(2)将PBASE溶液在所述石墨烯场效应晶体管的石墨烯通道表面孵育，将氨基修饰的ssDNA在石墨烯表面孵育，并进行封闭；
(3)将Cas12b与sgRNA形成Cas12b-sgRNA复合物，将待检测样本与Cas12b-sgRNA复合物混合后加入步骤(2)处理后石墨烯场效应晶体管中进行反应，反应后记录转移特性曲线的变化；
所述sgRNA选自SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示核酸序列中的任意一种或至少两种的组合。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种基于CRISPR-Cas12b反式切割和石墨烯场效应晶体管核酸检测猴痘病毒的方法，该方法利用Cas12b-sgRNA复合物对DNA片段具有较高的活性和特异性，当sgRNA识别靶DNA片段激活Cas12b后，Cas12b可以快速切割固定于石墨烯表面的ssDNA，导致gFET中源极和漏极之间电流发生快速改变，从而实现靶DNA的超灵敏检测，此外通过设计特定的sgRNA，进一步提高检测灵敏度、特异性，该方法检测时间短，灵敏度高，可以更好地应用于猴痘病毒的快速筛检。
附图说明
图1为B6R基因两靶点体外酶切的荧光检测结果图；
图2为F3L基因两靶点体外酶切的荧光检测结果图；
图3为转移特性曲线图；
图4为利用F3L sgRNA1与sgRNA2体外酶切不同浓度猴痘核酸的荧光检测结果图；
图5为利用gFET检测不同浓度猴痘核酸的结果图；
图6为与猴痘同源性较高的病毒B6R基因部分核酸序列图；
图7为Cas12a/Cas12b检测B6R基因的荧光结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
本发明具体实施例中以针对猴痘病毒B6R基因和F3L基因为例验证本发明基于Cas12b反式切割和gFET检测猴痘病毒的方法。
实施例1
本实施例检测猴痘病毒B6R基因。
1.筛选特异性猴痘病毒B6R基因sgRNA
查找猴痘、牛痘、水痘、骆驼痘、疫苗、天花病毒基因组，比对B6R基因序列，找出差异序列，其中B6R两个靶点分别为：5’-TGGGTGTCATATTTCTAATC-3’(SEQ ID NO.1)；5’-TATATGATAAGCCATTATAC-3’(SEQ ID NO.2)，并设计对应的sgRNA(B6R-sgRNA1和B6R-sgRNA2，如表1所示)，进行体外酶切实验验证sgRNA的活性及特异性，在20μL反应体系中加入2μL缓冲液，500nM Cas12b蛋白、500nM sgRNA、10μM分子探针和10nM靶DNA，以未加sgRNA的反应体系为阴性对照(negative control)，50℃温育40min，酶标仪测定荧光值，结果如图1所示，表明B6R两个靶点的sgRNA效率较高。
2.gFET制备。
定制商业化gFET芯片，经引线后，构建聚二甲基硅氧烷微流控腔室，将其用环氧树脂胶固定于芯片上，然后将进液管和出液管道***腔室，并用胶封保证腔室密闭，出液管另一端与泵相连，以便抽吸液体。
3.报告分子的修饰。
(1)将1μL溶于乙醇中浓度为1mM的PBASE溶液滴到gFET器件的栅电极部分，在25℃下孵育2h，使PBASE结合到石墨烯表面，随后用100％乙醇和1×PBS溶液充分清洗，最后用氮气将器件吹干用于下一步修饰实验；
(2)将1μL过饱和(1μM)的NH2-ssDNA滴到gFET器件的栅电极部分，在25℃下孵育6h，使ssDNA报告分子与PBASE连接，进而固定在石墨烯表面，随后用1×PBS溶液充分清洗，最后用PBS溶液进行冲洗，并用氮气吹干；
(3)将1μL封闭液(100mM MHA)滴在栅电极区域，在25℃下孵育2h，滴在栅电极区域，以填充器件栅极表面未结合的位点，减少探测过程中非特异性结合所导致的假阳性信号，最后用PBS溶液进行冲洗，并用氮气吹干。
4.猴痘病毒B6R基因的检测。
(1)取商业化购买猴痘病毒相关的假病毒(擎科生物，货号：TSV4731，TSV4724)，其包含B6R与F3L基因序列，使用病毒核酸提取试剂盒提取假病毒的核酸，同时使用qPCR对假病毒拷贝数进行绝对定量；
(2)将Cas12b与B6R-sgRNA1或sgRNA2以1:1的浓度进行混合，形成Cas12b-sgRNA复合物，并与假病毒核酸进行混合添加到gFET中，50℃下反应40min，分析转移特性曲线，结果如图3所示，为石墨烯芯片接入PBASE和探针后，表面载流子迁移率变大，表明探针连接芯片成功。
表1
实施例2
本实施例检测猴痘病毒F3L基因。
1.筛选特异性猴痘病毒F3L基因sgRNA。
比对F3L基因序列，找出差异序列，F3L两个靶点分别为：5’-TGACAGGGTTAACACCTTTC-3’(SEQ ID NO.3)；5’-CTATTATAGCATCAGCATCA-3’(SEQ ID NO.4)，并设计对应的sgRNA(F3L-sgRNA1和F3L-sgRNA2，如表1所示)，体外酶切实验验证sgRNA的活性及特异性，操作步骤参照实施例1，结果如图2所示，表明F3L两个靶点的sgRNA效率较高，并且我们测试了体外酶切不同浓度的猴痘核酸，分别为1fM、10fM、100fM、1pM、10pM、100pM、1nM及10nM，检测结果如图4所示，针对F3L-sgRNA1，当猴痘核酸浓度低于100fM时，荧光强度几乎没有发生改变，说明F3L-sgRNA1结合Cas12b检测猴痘核酸的灵敏度约为100fM；同样地，针对F3L-sgRNA2，当猴痘核酸浓度低于10fM时，荧光强度几乎没有发生改变，说明F3L-sgRNA2结合Cas12b检测猴痘核酸的灵敏度约为10fM，以上结果表明sgRNA1与sgRNA2的靶向效率较高，并且sgRNA2的靶向效率更高一些。
2.gFET制备：操作步骤参照实施例1。
3.报告分子的修饰：操作步骤参照实施例1。
4.猴痘病毒F3L基因的检测。
使用试剂盒提取猴痘假病毒核酸，将Cas12b与F3L-sgRNA2以1:1的浓度进行混合，形成Cas12b-sgRNA复合物，并与假病毒核酸进行混合添加到gFET中，通过4200SCS半导体分析仪观察电压的信号可判断gFET是否发生了Cas12b-sgRNA复合物切割DNA片段，当Cas12b-sgRNA复合物识别并切割猴痘核酸，会产生电压，图5为gFET对不同浓度猴痘核酸F3L基因和B6R基因的检测结果，without ssDNA组表示未加入探针，其作为阴性对照，因此未观察到电压的变化；with ssDNA(B6R)与with ssDNA(F3L)表示将单链DNA探针包被到gFET后分别检测B6R与F3L基因片段，纵坐标ΔI/I0为实时电压与初始电压的差值/初始电压，横坐标为时间，从图中电压的变化可知，Cas12b-sgRNA能够识别并切割B6R与F3L核酸片段，并且核酸浓度与时间呈正相关，最低检测限可达0.5fg/mL。
对比例1
本对比例是采用Cas12a酶与Cas12b酶进行检测灵敏度的对比，由于Cas12a酶的PAM位点为5'-TTTN-3'，因此在sgRNA设计方面存在一定的局限性，Cas12b酶的PAM位点为5'-TTN-3'，对于设计区分同源性较高的病毒核酸具有一定的优势。图6为猴痘同源性较高的病毒核酸B6R基因部分序列，针对这段序列设计了B6R-sgRNA2，并设计了Cas12a相关的B6R-crRNA1(详见表1)，将Cas12a与B6R-crRNA1、Cas12b与B6R-sgRNA2以1:1的浓度进行混合，通过体外酶切实验检测荧光值，如图7所示，针对不同同源病毒B6R序列，Cas12b与B6R-sgRNA2复合物的酶切效率大于Cas12a与B6R-crRNA1复合物，因此本发明所使用的Cas12b并配合设计的sgRNA对于区分猴痘病毒同源性高的其他病毒具有一定的优势。
综上所述，本发明提供了一种基于CRISPR-Cas12b反式切割和石墨烯场效应晶体管核酸检测猴痘病毒的方法，该方法利用Cas12b-sgRNA复合物对DNA片段具有较高的活性和特异性，当sgRNA识别靶DNA片段激活Cas12b后，Cas12b可以快速切割固定于石墨烯表面的ssDNA，导致gFET中源极和漏极之间电流发生快速改变，从而实现靶DNA的超灵敏检测，此外通过设计特定的sgRNA，进一步提高检测灵敏度、特异性，该方法检测时间短，灵敏度高，可以更好地应用于猴痘病毒的快速筛检。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.一种非诊断目的的基于CRISPR-Cas反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法，其特征在于，所述方法包括：
使用石墨烯场效应晶体管放大溶液中Cas12b反式切割检测信号，检测猴痘病毒核酸；
所述方法包括石墨烯场效应晶体管制备步骤、报告分子修饰步骤以及核酸检测步骤；
所述核酸检测步骤包括：
将Cas12b与sgRNA形成Cas12b-sgRNA复合物，将待检测样本与Cas12b-sgRNA复合物混合后加入石墨烯场效应晶体管中进行反应，反应后记录转移特性曲线的变化；
所述sgRNA的靶点选自猴痘病毒B6R基因和F3L基因；
所述sgRNA的靶点选自SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；
所述sgRNA选自SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。
2.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法，其特征在于，所述石墨烯场效应晶体管制备步骤包括：
定制商业化石墨烯场效应晶体管芯片，经引线后，构建聚二甲基硅氧烷微流控腔室，将微流控腔室用环氧树脂胶固定于芯片上，并将进液管和出液管道***腔室及进行胶封，出液管另一端与泵相连，得到石墨烯场效应晶体管。
3.根据权利要求2所述的基于CRISPR-Cas反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法，其特征在于，所述报告分子修饰步骤包括：
将PBASE溶液在石墨烯场效应晶体管的石墨烯通道表面孵育，将氨基修饰的ssDNA在石墨烯表面孵育，并进行封闭。
4.根据权利要求3所述的基于CRISPR-Cas反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法，其特征在于，所述ssDNA为20~40 nt的随机序列；
所述报告分子修饰步骤包括：
将PBASE溶液在石墨烯场效应晶体管的石墨烯通道表面孵育1~3 h，将氨基修饰的ssDNA在石墨烯表面孵育3~9 h，并进行封闭1~3 h。
5.根据权利要求4所述的基于CRISPR-Cas反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法，其特征在于，所述PBASE溶液的溶剂选自乙醇和/或DMF。
6.根据权利要求4所述的基于CRISPR-Cas反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法，其特征在于，所述封闭的试剂包括乙醇胺。
7.根据权利要求6所述的基于CRISPR-Cas反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法，其特征在于，所述的Cas12b和sgRNA的浓度比为1:(1~5)；
所述Cas12b的浓度为100 nM~500 nM；
所述sgRNA的浓度为100 nM~500 nM。
8.根据权利要求7所述的基于CRISPR-Cas反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法，其特征在于，所述反应的温度为40~60℃，时间为30~50 min。
9.根据权利要求1-8任一项所述的基于CRISPR-Cas反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）定制商业化石墨烯场效应晶体管芯片，经引线后，构建聚二甲基硅氧烷微流控腔室，将微流控腔室用环氧树脂胶固定于芯片上，并将进液管和出液管道***腔室及进行胶封，出液管另一端与泵相连，得到石墨烯场效应晶体管；
（2）将PBASE溶液在所述石墨烯场效应晶体管的石墨烯通道表面孵育，将氨基修饰的ssDNA在石墨烯表面孵育，并进行封闭；
（3）将Cas12b与sgRNA形成Cas12b-sgRNA复合物，将待检测样本与Cas12b-sgRNA复合物混合后加入步骤（2）处理后石墨烯场效应晶体管中进行反应，反应后记录转移特性曲线的变化。
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CN202211275598.6A Active CN115820932B (zh) 2022-10-18 2022-10-18 一种基于crispr***反式切割和石墨烯场效应晶体管的核酸检测方法

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