CN115820678B

CN115820678B - 激发机体抗prrsv gp3的基因、包含该基因的新功能型乳酸菌及其应用

Info

Publication number: CN115820678B
Application number: CN202210816326.6A
Authority: CN
Inventors: 王春凤; 牛天明; 杨桂连; 王汝钰; 范书慧; 江雨鑫
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2022-07-12
Filing date: 2022-07-12
Publication date: 2023-08-29
Anticipated expiration: 2042-07-12
Also published as: CN115820678A

Abstract

本申请提供激发机体抗PRRSV GP3的基因、包含该基因的新功能型乳酸菌及其应用。该专利所述基因能够激发机体抗PRRSV GP3感染，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示，分别命名为Nyc1‑S、Nyc1‑H和Nyc1‑L。以三种基因构建的工程菌为重组植物乳杆菌，该菌株能够高效表达抗PRRSVGP3的蛋白，产生的蛋白对细胞无细胞毒性并且抗病毒效果较好，可用于防治PRRSV；尤其在本发明的实验中采用该重组植物乳杆菌免疫仔猪，可产生有效地攻毒保护，并且可以明显减轻病症，使血清和各脏器中病毒载量较少，组织病理学减轻。

Description

激发机体抗PRRSV GP3的基因、包含该基因的新功能型乳酸菌及其应用

技术领域

本申请涉及基因工程技术领域，具体涉及一种激发机体抗PRRSV GP3的基因、包含该基因的新功能型乳酸菌及其应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息旨在增加对本发明总体背景的理解，而该公开不应必然被视为承认或以任何形式暗示该信息已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRS)俗称“猪蓝耳病”。猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV)是一种极容易变异的正链RNA病毒，家猪和野猪是已知的感染宿主，能够引发母猪的繁殖障碍及各成长阶段特别是仔猪十分严重的呼吸道疾病，是世界范围内对养猪业产生较大影响的重要病原体之一。

PRRSV主要通过包括口腔、呼吸道和***等多种接触途径感染宿主，也有研究表明鸟类可能携带病毒造成疾病的传播，携带病原体的易感动物将通过唾液、喷嚏、***、***物等分泌物水平或垂直感染健康猪只，导致猪只高热、食欲废绝、呼吸困难、眼睑水肿、耳部呈***等临床症状，怀孕母猪感染后流产率高达30％，感染仔猪为100％的发病率。2016年国际病毒学分类委员会(ICTV)将该病毒分为欧洲型(PRRSV-1)和美洲型(PRRSV-2)，两者的氨基酸同源性仅为60％-80％；且PPRSV先天免疫逃逸机制复杂且适应性免疫调控水平低下，病毒可以存活在宿主体内数月导致长期病毒血症，且宿主感染后可引发抗体依赖性感染增强(antibody dependent enhancement，ADE)，这使防控PRRS变得十分棘手。因此研发一种对易感动物具有广泛性保护的中和抗体是当下的重点。

目前，此病在各国仍有流行，为减轻其对养猪业的巨大影响，各国不断研发预防PRRSV的有效疫苗，除临床上最常见的通过接种灭活疫苗、弱毒活苗对PRRSV进行防控外，还对亚单位疫苗病、病毒活载体疫苗、核酸疫苗以及重组疫苗等疫苗进行探索研发。而通过大量试验及临床验证表明，多数疫苗可刺激诱导机体产生部分免疫保护，但疫苗的安全性仍是研发过程中需要攻克的难点，且弱毒活疫苗存在毒力返强的现象，因此研发更加安全可控且高效的疫苗仍是世界各地学者今后的主要目标和巨大挑战。

发明内容

本发明提供了一种激发机体抗PRRSV GP3的基因、该基因编码的抗原蛋白以及包含该基因的工程菌及其应用。本发明所述激发机体抗PRRSV GP3的基因分别命名为Nyc1-S、Nyc1-H和Nyc1-L，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，三组基因能够经原核表达产生Nyc1-S、Nyc1-H或Nyc1-L蛋白，三种蛋白无细胞毒性，且表现出良好的对PRRSV的中和活性，可抑制PRRSV在细胞中的复制从而起到抑制PRRSV感染的作用。同时，本发明以三种基因构建重组植物乳杆菌，该菌株能够高效表达抗PRRSV GP3的蛋白Nyc1-S、Nyc1-H和Nyc1-L，产生的蛋白对细胞无细胞毒性并且抗病毒效果较好，可用于防治PRRSV，在本发明的实验中采用该重组植物乳杆菌免疫PRRSV攻毒仔猪，可产生有效地攻毒保护，并且可以明显减轻病症，使血清和各脏器中病毒载量较少，组织病理学减轻；同时可激活T细胞免疫，促进对PRRSV病毒的清除作用。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

在本发明的第一方面，本发明提供了一种基因，其激发机体抗PRRSV GP3感染，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示，所述基因分别命名为Nyc1-S、Nyc1-H和Nyc1-L。

在本发明的第二方面，本发明提供了含有上述第一方面中所述基因的表达载体。

在本发明的一些实施方式中，所述表达载体为pSIP409-pgsA’-Nyc1-S、pSIP409-pgsA’-Nyc1-H或pSIP409-pgsA’-Nyc1-L，其分别由载体片段pSIP409-pgsA’与基因Nyc1-S、Nyc1-H或Nyc1-L连接得到。

在本发明的第三方面，本发明提供了含有上述第一方面中所述的基因的转基因细胞系。

在本发明的第四方面，本发明提供了含有上述第一方面中所述基因的工程菌。

在本发明的一些实施方式中，所述工程菌为重组植物乳杆菌，其以植物乳杆菌为出发菌株。在一些具体地实施方式中，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum,L.plantarum)NC8时具有较好的表达效果。

在本发明的实施方式中，所述工程菌为NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-S、NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-H或NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-L，其能够表达激发机体抗PRRSV GP3感染的蛋白Nyc1-S、Nyc1-H和Nyc1-L。本发明的重组植物乳杆菌NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-S、NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-H或NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-L经酶切鉴定，其重组质粒能酶切出约6167bp载体条带和400bp、1400bp、700bp目的片段条带，具有保护性抗原Nyc1-S和Nyc1-H和Nyc1-L基因序列片段。

本发明的重组植物乳杆菌NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-S、NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-H或NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-L短杆、中等大小、凸起、微白色边缘整齐，革兰氏染色呈阳性，过氧化氢酶试验为阴性，符合植物乳杆菌的形态。三株重组植物乳杆菌相较于原始出发菌株NC8具有更优的生长性能和发酵性能，有利于工业化生产。

本发明的重组植物乳杆菌NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-S、NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-H或NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-L可使用MRS培养基培养，在本发明的一些实施方式中，所述MRS培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸锰0.2g/L，柠檬酸铵2g/L，乙酸钠5g/L，吐温-80 1mL/L，pH值6.0±0.05，121℃灭菌20min。

黏膜免疫是抵抗病毒入侵机体的首要屏障，本发明的重组植物乳杆菌NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-S、NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-H或NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-L可耐胃酸和肠液的消化定植于肠道中，能有效诱导***免疫，同时诱发大部分的黏膜部位反应，有效的保护机体免遭病原体的侵袭。在本发明的实施方式中，采用灌喂重组植物乳杆菌免疫仔猪，强化黏膜屏障并刺激黏膜免疫及细胞免疫。本发明的实验证明重组植物乳杆菌NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-S(E)、NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-H(E)、NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-L(E)可以刺激CD3+CD8+T细胞的活化，延缓病毒被靶细胞释放入血，造成的仔猪感染，对PRRSV感染仔猪发挥了积极的免疫保护作用，尤其是三株菌株的复合使用，免疫保护作用更优。

在本发明的实施方式中，本发明提供了上述工程菌的构建方法，包括：

将Nyc1-S和Nyc1-H、Nyc1-L片段***锚定表达载体pSIP409-pgsA’中，构建重组质粒pSIP409-pgsA’-Nyc1-S(E)、pSIP409-pgsA’-Nyc1-H(E)、pSIP409-pgsA’-Nyc1-L(E)菌株；将步骤所述重组质粒转入植物乳杆菌NC8中即得。其中，植物乳杆菌NC8红霉素抗性的植物乳杆菌，是食品级乳酸菌表达***，安全可靠。

在本发明的第五方面，本发明提供了一种激发机体抗PRRSV GP3感染的蛋白，其上述第一方面中所述的基因编码或由上述第四方面所述的工程菌表达产生。比如，在本发明实施方式中，抗PRRSV GP3感染的蛋白被相应命名为Nyc1-S蛋白、Nyc1-H蛋白和Nyc1-L蛋白。

在本发明的实施方式中，通过CCK-8细胞毒性实验验证了三种蛋白Nyc1-S和Nyc1-H和Nyc1-L对MARC-145细胞无细胞毒性，并在体外细胞实验中验证了三种蛋白对PRRSV的中和活性，结果表明蛋白Nyc1-S、Nyc1-H蛋白能更有效的中和PRRSV，抑制病毒在MARC-145细胞中复制，抑制PRRSV的感染。

在本发明的第六方面，本发明提供了一种药物组合物或药物制剂或疫苗或饲料，其包含上述第五方面所述的激发机体抗PRRSV GP3感染的蛋白中的一种或多种，即包含蛋白Nyc1-S、Nyc1-H和Nyc1-L中的一种或多种，或者包含上述第四方面中所述的工程菌中一种或多种，即包含NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-S、NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-H和NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-L中的一种或多种。

在本发明的实施方式中，所述药物制剂或疫苗可以为口服冻干粉剂，所述疫苗为猪疫苗。

在本发明的一些实施方式中，所述药物组合物或药物制剂或饲料同时包含Nyc1-S、Nyc1-H和Nyc1-L三种蛋白或同时包含NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-S、NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-H和NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-L三种工程菌。

在本发明的第七方面，本发明提供了一种表达权上述第五方面中所述的激发机体抗PRRSV GP3感染的蛋白的方法，其包括：构建含有基因Nyc1-S、Nyc1-H或Nyc1-L的表达载体，再将构建的表达载体导入宿主细胞获得重组菌株，培养该重组菌株，最后从培养物中分离蛋白Nyc1-S、Nyc1-H或Nyc1-L。

在本发明的第八方面，本发明提供了上述第一方面中所述的基因或上述第四方面中所述的工程菌或上述第五方面中所述的激发机体抗PRRSV GP3感染的蛋白在制备预防和/或治疗猪繁殖与呼吸综合征的疫苗或药物或饲料中的应用。

相较于现有技术，本发明的优势在于：

本发明设计并提供了三组基因Nyc1-S、Nyc1-H和Nyc1-L，并以pSIP409-pgsA’为载体构建了含有上述基因的重组质粒，以植物乳杆菌NC8作为外源蛋白的表达递送载体，应用同源重组及分子克隆技术成功构建三株表达蛋白Nyc1-S(756bp)、Nyc1-H(1392bp)或Nyc1-L(681bp)的重组植物乳杆菌NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-S(E)、NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-H(E)、NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-L(E)，经Western blot验证，重组蛋白可与His标签鼠源单抗特异性结合，说明蛋白得到完整表达。

本发明还对上述蛋白进行了原核表达及体外抗病毒效果研究，以pET28a作为表达载体进行原核表达，构建表达Nyc1-S、Nyc1-H或Nyc1-L蛋白的重组大肠杆菌，经诱导成功纯化并复性三组蛋白；通过CCK-8细胞毒性实验验证三种蛋白对MARC-145细胞无细胞毒性。并开展体外细胞实验，验证其对PRRSV的中和活性，结果表明Nyc1-S、Nyc1-H蛋白能有效中和PRRSV，抑制病毒在MARC-145细胞中复制，抑制PRRSV的感染。

本发明研究了含有三组基因Nyc1-S、Nyc1-H和Nyc1-L的重组植物乳杆菌及其复合菌株对PRRSV攻毒仔猪的免疫效果，结果表明重组植物乳杆菌能够有效缓解PRRSV-JXA1株感染断奶仔猪的临床症状，维持仔猪正常体温、体重和正常采食；攻毒后不同时间血清样本和不同脏器样本中病毒载量在实验组(单菌株组和复合菌株组，简称为LP/PRRSV)和对照组(PBS组，简称为PBS/PRRSV组)间存在显著差异，且对照组肺脏、肠系膜***和肺门***样本中病毒载量极高；对照组与实验组病毒荧光强度有差异，组织病理学观察显示对照组各组织发生病变，而实验组组未见明显病变。实验组可显著提升实验猪CD3+CD8+T细胞水平，攻毒后实验组CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞水平均显著高于对照组。以上结果表明，本发明提供的重组植物乳杆菌及其复合菌株可显著降低攻毒后仔猪不同时期血液样本和各脏器各样本中病毒载量，有效缓解感染后仔猪发病症状，对攻毒后仔猪起较好的攻毒保护作用，可显著激活仔猪T细胞免疫水平，尤其是CD3+CD8+T细胞，在PRRSV对T淋巴细胞的消耗过程中有抑制作用，T细胞免疫对PRRSV病毒的清除有促进作用。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：

图1：质粒pSIP409-pgsA’-(E)载体框架PCR结果(A)其中，M：DL10000 marker；1：ZT引物PCR扩增载体片段；质粒pET28-Nyc1-S目的片段PCR结果(B)，M：DL10000 marker；1：S引物PCR扩增目的片段；质粒pET28-Nyc1-H目的片段PCR结果(C)，M：DL10000 marker；1：H引物PCR扩增目的片段；质粒pET28-Nyc1-L目的片段PCR结果(D)，M：DL10000 marker；1：L引物PCR扩增目的片段。

图2：质粒NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-S(E)图谱及酶切鉴定(A)，M：DL10000marker；1、2：XbaI/HindⅢ双酶切鉴定产物。质粒NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-H(E)图谱及酶切鉴定(B)，M：DL10000 marker；1、2：XbaI/HindⅢ双酶切鉴定产物。质粒NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-L(E)图谱及酶切鉴定(C)，M：DL10000 marker；1、2：XbaI/HindⅢ双酶切鉴定产物。

图3：Western blot检测Nyc1-S蛋白表达结果(A)，M：蛋白marker；1：NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-S(E)菌株。：western blot检测Nyc1-H蛋白表达结果(B)，M：蛋白marker；1：NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-S(E)菌株。Western blot检测Nyc1-L蛋白表达结果(C)，M：蛋白marker；1：NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-L(E)菌株。

图4：重组大肠杆菌质粒BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-S的双酶切验证(A)，M：DL10000DNA Marker；1：重组质粒的双酶切验证。重组大肠杆菌质粒BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-H的双酶切验证(B)，M：DL10000 DNA Marker；1：重组质粒的双酶切验证。重组大肠杆菌质粒BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-L的双酶切验证(C)，M：DL10000 DNA Marker；1：重组质粒的双酶切验证。

图5：BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-S诱导条件优化。M:180kDa Marker；1：未诱导BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-S；2至7:17℃诱导BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-S 6h、8h、10h、12h、14h、16h。

图6：BL21(DE3)pET28a-Nyc1-H诱导条件优化。M:180kDa Marker；1：未诱导BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-H；2至8:37℃BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-H 1h-7h。

图7：BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-L诱导条件优化。M:180kDa Marker；1：未诱导BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-L；2、3:37℃诱导BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-L 6h、8h。

图8：Nyc1-S蛋白的纯化(左)，其中，M:180kDa Marker；1：未诱导BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-S；2:17℃诱导BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-S；3:超声后上清；4:包涵体；5:流穿液；6:洗杂蛋白；7:Nyc1-S蛋白；8、9：洗柱液；Nyc1-S蛋白的复性(右)，其中，M:180kDaMarker；1：复性的Nyc1-S。

图9：Nyc1-H蛋白的纯化(左)，其中，M:180kDa Marker；1：未诱导BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-H；2:17℃诱导BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-H；3:超声后上清；4:包涵体；5:流穿液；6:洗杂蛋白；7:Nyc1-H蛋白；8、9：洗柱液；Nyc1-H蛋白的复性(右)，其中，M:180kDaMarker；1：复性的Nyc1-H。

图10：Nyc1-L蛋白的纯化(左)，其中，M:180kDa Marker；1：未诱导BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-L；2:37℃诱导BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-L；3:超声后上清；4:包涵体；5:流穿液；6:洗杂蛋白；7:Nyc1-H蛋白；8、9：洗柱液；Nyc1-H蛋白的复性(右)，其中，M:180kDaMarker；1：复性的Nyc1-L。

图11：PRRSV感染MARC-145后的细胞病变。

图12：三组蛋白对MARC-145的细胞活性影响。

图13：Nyc1-S组病毒载量，Nyc1-H组病毒载量，Nyc1-L组病毒载量。

图14：攻毒后实验猪只临床表征。

图15：攻毒后实验猪只体温变化；MOCK(0号)，PBS/PRRSV(1-3号)，LP/PRRSV(4-6号)，S/PRRSV(7-9号)，H/PRRSV(10-12号)，L/PRRSV(13-15号)。

图16：攻毒后实验猪只体重变化；MOCK(0号)，PBS/PRRSV(1-3号)，LP/PRRSV(4-6号)，S/PRRSV(7-9号)，H/PRRSV(10-12号)，L/PRRSV(13-15号)。

图17：各脏器病理变化。

图18：5dpi、10dpi各组血清样本病毒定量结果(A)，实验猪死亡后肺脏、肺门淋巴、肠系膜***病毒定量结果(B)。

图19：各组组织样品病毒荧光染色结果。

图20：各脏器组织病理学观察。

图21：免疫第7天血液T淋巴细胞流式检测结果；PBS：对照组：LP：实验组。

图22：免疫第14天血液T淋巴细胞流式检测结果，PBS：对照组：LP：实验组。

图23：5dpi血液T淋巴细胞流式检测结果，MOCK:空白组(未攻毒)；PBS/PRRSV:对照组(PBS+攻毒)；LP/PRRSV:实验组(复合乳杆菌+攻毒)。

图24：10dpi血液T淋巴细胞流式检测结果，MOCK:空白组(未攻毒)；PBS/PRRSV:对照组(PBS+攻毒)；LP/PRRSV:实验组(复合乳杆菌+攻毒)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1重组植物乳杆菌的构建

1、载体、菌株及目的片段：载体pSIP409-pgsA’(E)、DH5α大肠杆菌感受态、NC8植物乳杆菌感受态皆由吉林农业大学微生态制剂工程研究中心保存并提供，Nyc1-S、Nyc1-H、Nyc1-L三组目的基因委托金斯瑞生物科技股份有限公司合成至pET28a载体。

Nyc1-S基因序列如SEQ ID NO：1所示；Nyc1-H基因序列如SEQ ID NO：2所示；Nyc1-L基因序列如SEQ ID NO：3所示。

2、主要试剂及耗材：DNA质粒小提试剂盒购于康为世纪公司；纯化试剂盒购于Omega Bio-Tek；硫酸卡那霉素及红霉素、5×SDS PAGE Loading Buffer购于索莱宝科技有限公司(北京)；DL2000 marker、DL5000 marker、DL10000 marker、限制性内切酶XbaI、HindIII、Prime STAR Max Premix(2×)购于(TaKaRa)宝生生物工程有限公司(大连)；ClonExpress II One Step Cloning Kit购于诺唯赞生物科技有限公司(南京)；电击杯购于Bio-Rad公司；Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody购自sigma公司(美国)；诱导肽Sppip由吉林农业大学微生态制剂工程研究中心保存。

3、主要仪器：全自动高压灭菌器GR85DA(德国Sigma公司)；化学发光成像***Amersham Imager 600(GE公司)；凝胶成像分析***(Universal Hood II)；-80℃超低温冰箱DW-86L626(海尔公司)；分析天平ME204E(瑞士梅特勒公司)；制冷型金属浴(TANGEN公司)。梯度PCR仪、移液器(德国Eppendorf公司)；摇床(上海STIK公司)；4℃低温离心机(Centrifuge 5427R)；电泳仪(041BR 02682)；AI600(Amersham Imager 600RGB)化学发光成像***(GE公司)；凝胶成像分析***(Universal Hood II)；全自动高压灭菌器GR85DA(德国Sigma公司)；CO₂培养箱Heratherm IGS180(美国Thermo Scientific公司)；电穿孔仪(Gene Pulser Xcell TM System)；流式细胞仪LSRFortessaTM(美国BD公司)。

4、实验所需试剂

配置LB培养基：NaCl 10.0g，胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g。121℃高温灭菌20min。

配置MRS培养基：牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，酵母提取物0.05g，吐温-80 1.0g，磷酸氢钾2.0g，柠檬酸三胺2.0g，七水硫酸镁0.2g，硫酸锰5.0g，蒸馏水1L。115℃高温灭菌15min。配置固体培养基需按照50:0.75的比例向液体培养基里加入琼脂粉。

其他试剂的配置：

(1)硫酸卡那溶液(50mg/mL)：硫酸卡那(Kana)粉末1000mg，超纯水定容至20mL，涡旋至彻底溶解，使用0.22μm滤器除菌，无菌分装保存在-20℃冰箱。

(2)红霉素溶液(10mg/mL)：红霉素(Erm)粉末200mg，无水乙醇定容至20mL，涡旋至彻底溶解，使用0.22μm滤器除菌，无菌分装，保存在-20℃冰箱。

(3)50×TAE缓冲液：Tris 24.2g，冰乙酸5.71mL，0.5mol/L EDTA(8.0)10mL充分搅拌后，加入去双蒸水定容至1000mL。

(4)1％琼脂糖凝胶：琼脂糖100mg，加入100mL 1×TAE缓冲液加热融解，待冷却至40℃左右时加10μL GV-II，混匀。

(5)5×SDS-PAGE电泳缓冲液：Tris 1.51g，甘氨酸9.4g，SDS 0.5g，于60mL双蒸水中完全溶解，定容至100mL，保存于室温，使用需5倍稀释。

(6)转膜液：Glycine 1.45g，Tris 2.9g，SDS 0.185g，加入0.3L去离子水，完全溶解后定容至0.4L，补加0.2L甲醇，保存于室温。

(7)TBST buffer：NaCl 8.8g，1M Tris-HCl(PH8.0)20mL，使用去离子水定容到0.8L，加0.5mL-20吐温混匀后，补加0.2L去离子水，4℃保存。

(8)TES溶液：10×TE Buffer 0.8mL，溶菌酶10.6mg，蔗糖2.7g，RNA酶A32μL，补加7.2mL去离子水，待完全溶解后，保存于-20℃冰箱中。

(9)溶菌酶溶液(20mg/mL)：溶菌酶1g，加入去离子水50mL完全溶解，4℃保存，随用随配。

5、实验方法

1)载体框架及目的片段的获取

为构建重组质粒pSIP409-pgsA’-Nyc1-S(E)、pSIP409-pgsA’-Nyc1-H(E)、pSIP409-pgsA’-Nyc1-L(E)，使用Primer5.2软件设计Nyc1-S、Nyc1-H、Nyc1-L三组目的片段的无缝克隆引物以及pSIP409-pgsA’(E)载体XbaI和HindIII两端序列无缝克隆引物，由生工生物工程股份有限公司合成。无缝克隆引物名称及序列，见表1-1。无缝克隆载体框架pcr扩增，见表1-2。无缝克隆目的片段PCR扩增体系，见表1-3。

表1-1引物序列

注：同源臂序列为下划线部分。

表1-2PCR体系

经98℃，10s；(98℃，10s；56℃，5s；72℃，60s)×30循环；72℃，5min扩增。

表1-3PCR体系

模板pET28-Nyc1-S经98℃，10s；(98℃，10s；56℃，5s；72℃，8s)×30循环；72℃，5min扩增。

模板pET28-Nyc1-H经98℃，10s；(98℃，10s；56℃，5s；72℃，15s)×30循环；72℃，5min扩增。

模板pET28-Nyc1-L经98℃，10s；(98℃，10s；56℃，5s；72℃，8s)×30循环；72℃，5min扩增。

纯化上述扩增产物，使用酶标仪测定其浓度。使用诺唯赞无缝克隆试剂盒，将载体及目的片段按照说明书中最适体系与Express II及CE II Buffer混合，体系见表1-4。

表1-4无缝克隆体系

37℃金属浴连接30min。将10μL产物轻轻加入DH5α感受态中，普转后，在LB(E)固体培养基中37℃过夜，挑取单克隆小量培养，抽提质粒后经XbaI和HindIII进行双酶切鉴定，见表1-5。

表1-5酶切体系

37℃酶切4h后经琼脂糖凝胶电泳检测。

6、三株重组植物乳杆菌的构建与鉴定

质粒pSIP409-pgsA’-Nyc1-S(E)、pSIP409-pgsA’-Nyc1-H(E)、pSIP409-pgsA’-Nyc1-L(E)经电转化方法转入植物乳杆菌NC8感受态中，30℃水浴3h后于MRS(E)固体培养基中培养，37℃厌氧培养过夜，挑取单克隆小量培养，抽提质粒后经XbaI和HindIII双酶切鉴定，见表1-6。

表1-6酶切体系

37℃酶切4h后经琼脂糖凝胶电泳检测。

7、三株重组植物乳杆菌的Western blot检测

1)蛋白样品的制备

将冻存的重组植物乳杆菌NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-S(E)、NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-H(E)、NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-L(E)于MRS(E)固体培养基活化，37℃厌氧培养，挑取单菌落于MRS(E)液体培养基中培养，按菌液:培养基＝1:100的比例转接至MRS(E)液体培养基中，OD600≈0.3时，加入终浓度为50ng/mL的SppIP诱导肽，37℃厌氧培养6-8h，利用反复冻融法获取蛋白。

蛋白样品处理方法：对5mL菌液进行离心收集菌体沉淀，经无菌预冷PBS洗涤，重复两次，使用1mL TES吹悬菌体，37℃孵育0.5h，2500×g，4℃离心10min弃上清，经1mL预冷PBS洗涤一次，2500×g，4℃离心5min，使用500μL ddH2O重悬菌体，于-80℃超低温冰箱冷冻7min后37℃水浴快速溶解，反复冻融6次。21000×g，4℃离心1h后，加入40μL PBS吹悬沉淀，并用10μL 5×SDS蛋白上样缓冲液将样品混匀，于100℃沸水中高温变性10min。12000rpm 4℃离心3min，以备后续试验。

2)SDS-PAGE检测：配置两块12％下层分离胶、上层5％浓缩胶的凝胶；取25μL样品上清液上样，电泳仪按照80V电压工作50min待蛋白Maker分散均匀，改为120v电压工作30min-40min后结束程序；考马斯亮兰染色凝胶待30min后；使用DDW脱色过夜，及时更换DDW，等待上机检测。

3)转膜：在上述试验结束后，将另一块凝胶取出，并准备与凝胶相同面积的PVDF膜，经甲醇激活30s后与滤纸共同浸泡在转膜液中，将海绵、两层滤纸、凝胶、膜、两层滤纸、海绵按照顺序排放在转印夹中，用滚棒除去气泡，冰上转膜程序为300mA 1.5h。

4)封闭：将PVDF膜浸于封闭液中，置于摇床封闭1.5h。

5)抗体孵育：使用TBST稀释液按1：5000比例稀释鼠源His标签单抗，将PVDF膜浸于抗体稀释液中，置于4℃摇床中孵育12h后，使用TBST润洗6min，重复润洗3次。

6)ECL显色：将ECL显色试剂盒中A液与B液按照1：1比例混合，分别检测重组植物乳杆菌中Nyc1-S、Nyc1-H、Nyc1-L三种蛋白的表达。

8、结果

1)载体框架及目的片段PCR扩增结果：利用对应的无缝克隆引物，分别以pSIP409-pgsA’-(E)为模板，PCR扩增载体片段；以pET28-Nyc1-S、pET28-Nyc1-H、pET28-Nyc1-L为模板，PCR扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳检测。可见6167bp的载体片段序列条带，和400bp、1400bp、700bp左右的三个目的片段序列条带，结果如图1A、图1B、图1C、图1D。

2)重组质粒pSIP409-pgsA’-Nyc1-S(E)、pSIP409-pgsA’-Nyc1-H(E)、pSIP409-pgsA’-Nyc1-L(E)的双酶切验证结果：通过无缝克隆技术构建重组质粒，将构建的三个重组质粒经XbaI和HindIII双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测，可见与预期大小相符的目的条带。

3)重组质粒转化植物乳杆菌NC8后质粒双酶切验证结果：分别将三个重组质粒电转至NC8感受态中，涂布于MRS(E)固体培养基中，37℃厌氧培养，挑单菌落小量培养，质粒抽提后进行XbaI/HindIII双酶切，样品经琼脂糖凝胶电泳检测，得到符合预期大小的6167bp载体条带和400bp、1400bp、700bp左右的目的片段条带，结果见图2A、图2B、图2C。

4)重组植物乳杆菌NC8表达蛋白Western blot检测结果：pSIP409-pgsA’载体属于细胞膜锚定表达载体，因此通过反复冻融方法获得菌体蛋白，并对样品进行处理(方法同上)，利用Western blot检测，并经His标签鼠源单抗孵育后，分别可见与预期大小相符的21KDa(Nyc1-S)、51KDa(Nyc1-H)、25KDa(Nyc1-L)蛋白条带，结果见图3A、图3B、图3C。

5)Nyc1-S、Nyc1-H、Nyc1-L三组蛋白的氨基酸序列：Nyc1-S(SEQ ID NO:4)：GGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCVQGTHFLYTFGGGTKLEIK。Nyc1-H(SEQ IDNO:5)：SRMQVQLQQSGDDLVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWINWIKQRPGQGLEWIGRIAPGSGSTYYNEMFKGKATLTVDTSSSTAYIQLSSLSSEDSAVYFCARNELGQAMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGCGDTTGSSVTLGCLVKGYFPESVTVTWNSGSLSNSVHTFPALLQSGLYTMSSSVTVPSSTWPSQTVTCSVAHPASSTTVDKKLEPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPSPIERTISKIKGLVRAPQVYILPPPAEQLSRKDVSLTCLVVGFNPGDISVEWTSNGHTEENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWENTDPFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGKHHHHHH。Nyc1-L(SEQ ID NO:6)：SRMDVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLYSNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYYCVQGTHFLYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLSSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNECHHHHHH。

综合以上，本实施例成功构建pSIP409-pgsA’-Nyc1-S(E)、pSIP409-pgsA’-Nyc1-H(E)、pSIP409-pgsA’-Nyc1-L(E)重组质粒，并在植物乳杆菌NC8中得到了鉴定。经Westernblot检测，3组蛋白皆可与His标签鼠源单抗特异性结合；重组蛋白得到完整表达。

实施例2目的蛋白的原核表达及体外抗病毒效果研究

本实施例将pET28a-Nyc1-S、pET28a-Nyc1-H、pET28a-Nyc1-L质粒转化至BL21(DE3)中，经IPTG诱导，纯化并复性后得到Nyc1-S、Nyc1-H、Nyc1-L三组目的蛋白，通过SDS-PAGE试验检测蛋白表达情况。为验证Nyc1-S、Nyc1-H、Nyc1-L三组蛋白的中和活性，在MARC-145细胞中开展三组蛋白与病毒的中和实验，并通过RT-PCR技术检测细胞上清液中的病毒载量，以分析三组蛋白对病毒的中和活性。

1、实验质粒、菌株、细胞株及毒株

pET28a-Nyc1-S、pET28a-Nyc1-H、pET28a-Nyc1-L由金斯瑞生物科技股份有限公司合成，BL21(DE3)感受态细胞购于北京全式金生物技术有限公司，非洲绿猴胚胎肾细胞(MARC-145细胞株)、PRRSV-JXA1(GenBank:EF112445.1)由军事兽医研究所(长春)金宁一教授团队惠赠。

2、主要试剂及耗材：蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)购于康为世纪有限公司；病毒RNA提取试剂盒、反转录试剂盒均购于(Takara)宝生生物工程有限公司(大连)；蛋白透析袋购于索莱宝公司；IPTG、PerfectStart Green qPCR Super Mix DyeII购于全式金生物技术有限公司(北京)；DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)、PBS磷酸盐缓冲液购于Gibco公司(美国)；0.25％胰蛋白酶购于TBD公司；青霉素-链霉素溶液(双抗)购于Hyclone公司；其它试剂和耗材参照第一章。

3、主要仪器：-80℃超低温冰箱(海尔公司)；金属浴(Thermo Scientific公司)；细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)电泳仪(041BR 02682)；分析天平ME204E(梅特勒公司)，摇床(上海STIK公司)；其它仪器参照第一章。

4、实验所需试剂

(1)Equp Buffer：尿素96g，咪唑0.272g，PBS(0.02M)定容至200mL，PH调至7.4。

(2)Wash Buffer：尿素96g，咪唑0.544g，PBS(0.02M)定容至200mL，PH调至7.0。

(3)Elution Buffer：尿素48g，咪唑3.4g，PBS(0.02M)定容至100mL，PH调至7.4。

(4)透析液1：尿素360.36g，Nacl 29.22g，Tris 2.422g，DDW定容至1000mL。

(5)透析液2：尿素240.24g，Nacl 29.22g，Tris 2.422g，DDW定容至1000mL。

(6)透析液3：尿素120.12g，Nacl 29.22g，Tris 2.422g，DDW定容至1000mL。

(7)透析液4：Nacl 29.22g，Tris 2.422g，DDW定容至1000mL。

(8)完全培养基：含10％胎牛血清、1％双抗的DMEM(H)。

5、实验方法

1)三组质粒的转化及鉴定

取5μL pET28a-Nyc1-S、pET28a-Nyc1-H、pET28a-Nyc1-L质粒分别加入BL21(DE3)感受态细胞中，经普转后涂布于LB(K)固体培养基中，37℃培养，挑取单克隆，小量培养，抽提质粒，经Nde I与Xho I双酶切验证。酶切体系如表2-1所示。

表2-1酶切体系

37℃金属浴4h，产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

2)目的蛋白的表达条件优化

取出-80℃冰箱中保存的BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-S、BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-H、BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-L菌液，在LB(K)固体培养基中划线，挑取单克隆，小量37℃培养，再按照(菌液:培养基＝1:50)比例将菌液转接至5mL LB(K)液体培养基中，待菌液OD600≈0.6-1.0时，按照0.5mMIPTG的终浓度进行菌体诱导，在不同温度(17℃、37℃)及不同诱导时间(1h-16h)的条件下诱导，探索、优化三组蛋白的最适表达条件。

3)目的蛋白的纯化

分别按照三株菌的最适诱导条件大量培养，使用50mL离心管分装菌液，4℃离心15min。使用适量预冷的10mM Tris缓冲液润洗菌体沉淀，重复润洗2次，最后依据菌量进行分管，每管加20mL Tris缓冲液悬起菌体沉淀。超声破碎功率为150w，工作时间为30min。处理样品经4℃12000rpm离心10min，收集上清备用，用10mL Equp Buffer重悬沉淀，4℃过夜溶解后，经两次4℃12000rpm离心10min收集上清液，并经过0.22μm滤器过滤，去除大分子及杂质后，将样品负载上柱，置于4℃摇床，结合6h后，6mL Wash Buffer反复洗脱5次，洗去杂蛋白，6mL Elution Buffer反复洗脱10次得到目的蛋白，分别用6mL Equp Buffer和6mLDDW洗柱2次。收集上述各步骤的样品，以备后续的蛋白纯化验证，样品制备以及SDS-PAGE鉴定方法同实施例1。

4)测定蛋白浓度：按照BCA蛋白浓度测定试剂盒测其浓度。

5)PRRSV的扩增及病毒滴度测定

PRRSV的扩增：在培养瓶中培养MARC-145细胞，待细胞长成单层且长至80％-90％时，用PBS润洗两次备用。取出冻存在-80℃冰箱中的PRRSV，低温完全解冻，病毒液用含1％双抗的DMEM(高糖)维持液稀释，并加入细胞培养瓶中，轻轻晃动培养瓶使病毒液均匀充分覆盖细胞，37℃孵育1h，加入含4％ FBS、1％双抗的等体积DMEM(高糖)维持液，37℃5％CO2培养3-5天，每天三次观察，直至80％细胞发生病变时，利用反复冻融的方法释放病毒粒子，即-80℃冷冻30min，室温融化，反复三次，收取病毒液，4℃1000rpm离心10min，低温环境中收取上清并分装，-80℃冻存。

PRRSV滴度测定：MARC-145细胞以2.5×10⁴/孔的细胞量铺于96孔细胞培养板中，贴合并长至90％，小心吸弃培养基，用PBS轻轻润洗后备用。在0.9mL DMEM(高糖)中加入0.1mL病毒液，轻轻混匀，进行十倍梯度稀释至10^-7。分别向96孔板的细胞中加入稀释倍数为10^-1至10^-7的7个不同浓度的病毒稀释液，100μL/孔，每组浓度做8个重复，在细胞中加入等体积含1％双抗的DMEM(高糖)作为对照组，在细胞中加入等体积病毒原液作为阳性对照组。置于37℃细胞培养箱中，3-7天内时刻仔细观察细胞病变情况。根据公式lgTCID50＝L-d(s-0.5)，计算每0.1mL的TCID50，其中L为最高稀释度的对数，D为稀释度对数之间的差，S为阳性孔比率总和。

6)荧光定量PCR检测方法的建立

质粒标准品的构建：基于PRRSV-JXA1(GenBank:EF112445.1)的保守区基因序列，通过生工生物技术合成JXA1(13578-13717)大小为140bp的目的基因并克隆至pUC-GW-Kan载体作为RT-PCR绝对定量的标准质粒，依据JXA1(13578-13717)基因序列，设计并合成RT-PCR引物，引物名称及序列见表2-2。

表2-2引物序列

标准曲线的建立：将标准质粒pUC-GW-JXA1-Kan浓度稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5ng/μL，应用全式金公司荧光定量试剂盒(Perfect Start Green qPCR Super MixDyeII)RT-PCR扩增5个浓度的标准质粒，每个浓度做3个复孔，并设置阳性、阴性及空白对照。得出PRRSV扩增标准曲线。拷贝数计算公式：copies/μL＝(6.02×10²³拷贝数/摩尔)x(ng/μL×10-9)/(DNA/bp×660)。RT-PCR反应体系如表2-3所示：

表2-3RT-PCR反应体系

RT-PCR反应条件：94℃，30s；(94℃，5s；60℃，34s)×40。

7)三组蛋白对MARC-145细胞毒性试验

Nyc1-S、Nyc1-H、Nyc1-L三组蛋白使用0.22μm滤器过滤除菌，并使用DMEM(高糖)按照1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64，1：128、1：256的比例稀释。将MARC-145于96孔板培养至细胞80％汇合时，用含1％双抗的维持液轻轻润洗两次，每孔分别加入上述不同浓度的稀释蛋白50μL后，每孔补加50μL，置于37℃细胞培养箱培养72h，向每孔中加入10μL CCK-8检测试剂，37℃避光孵育3h左右，OD450nm读数，检测三组蛋白对细胞活力的影响。

8)三组蛋白抗PRRSV效果研究

Nyc1-S、Nyc1-H、Nyc1-L三组蛋白使用0.22μm滤器过滤除菌，并使用DMEM(高糖)按照1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64，1：128、1：256的比例稀释。将PRRSV病毒液稀释至200TCID50/50μL。各浓度蛋白均按照50μL/孔病毒稀释液与50μL/孔蛋白稀释液混合，37℃孵育1h。将前期于96孔板中培养至80％的MARC-145，用含1％双抗的维持液轻轻润洗两次备用，将病毒与蛋白混合物按照100μL/孔加入细胞中，一组蛋白浓度重复6孔，37℃孵育1h后，补加含4％ FBS和1％双抗的DMEM(H)100μL/孔；试验设置阴性对照及阳性对照孔，37℃培养箱孵育72h，收取细胞上清液，保存于-80℃冰箱中。

使用病毒RNA提取试剂对样品进行病毒RNA提取，并测定其浓度，经反转录获得cDNA。应用RT-PCR检测各组样品中PRRSV载量，分析纯化复性后Nyc1-S、Nyc1-H、Nyc1-L三组蛋白的对PRRSV的中和作用。

6、结果

1)BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-S、BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-H、BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-L双酶切鉴定

将三组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，挑取单克隆，小量培养，提取质粒后进行Nde I和Xho I双酶切鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测，可见与预期400bp、1400bp、700bp大小相符的目的条带，结果如图4A、图4B、图4C。

2)三组蛋白表达鉴定

使用IPTG分别以不同温度及时间对BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-S、BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-H、BL21(DE3)/pET28a-Nyc1-L三组蛋白进行诱导，处理成蛋白样品后进行SDS-PAGE检测。结果可见，分别在21kDa、51kDa、25kDa处有清晰蛋白条带，条带符合预期大小，结果见图5、图6、图7。

3)三组蛋白的纯化及复性检测

按照上述试验的最适诱导条件，诱导并纯化三组目的蛋白，方法见上文所述的目的蛋白的纯化，进行SDS-PAGE检测，结果显示，在21kDa、51kDa、25kDa处有清晰的蛋白条带，符合预期条带大小，成功纯化并复性符合目的蛋白大小的条带，结果见图8、图9、图10。

4)三组蛋白的浓度检测

使用BCA蛋白浓度试剂盒，测定三组复性蛋白浓度，ODnm读数，制备浓度标准曲线，并计算出Nyc1-S蛋白浓度为0.3mg/mL，Nyc1-H蛋白浓度为0.37mg/mL，Nyc1-L蛋白浓度为0.26mg/mL。

5)PRRSV扩增及TCID50测定：结果见图11。

6)PRRSV的TCID50测定：测得扩增PRRSV病毒滴度为5.25×10⁵TCID50。

7)RT-PCR标准曲线建立：pJXA1引物定量分析标准曲线表明RT-PCR反应体系质控合格。

8)三组白细胞毒性试验：在MARC-145细胞中，通过实验组与对照组OD450nm值的比值，在各个浓度下，MARC-145无明显细胞毒性。见图12。

9)三组蛋白抗PRRSV效果

为检测不同浓度的Nyc1-S蛋白、Nyc1-H蛋白、Nyc1-H蛋白三组蛋白对PRRSV的中和作用，本实验用不同浓度蛋白与病毒在MARC-145细胞中进行中和试验，结果如下：

Nyc1-S蛋白对PRRSV的中和作用：Nyc1-S蛋白在1：2浓度下与对照组差异显著(P＜0.01)，Nyc1-S蛋白在1：16浓度下与对照组差异显著(P＜0.05)。可见其在MARC-145细胞中对PRRSV具有中和作用，如图13。

Nyc1-H蛋白对PRRSV的中和作用：Nyc1-H蛋白在1：2浓度下与对照组差异显著(P＜0.05)。可见其在MARC-145细胞中对PRRSV具有中和作用，如图13。

Nyc1-L蛋白对PRRSV的中和作用：Nyc1-L蛋白在各浓度下与对照组均没有差异。因此，Nyc1-L蛋白可能在MARC-145细胞中对PRRSV不具有中和作用。如图13。

本实施例选取pET28a作为表达载体进行原核表达，构建表达Nyc1-S、Nyc1-H、Nyc1-L蛋白的重组大肠杆菌，经诱导纯化得到三组蛋白；开展CCK-8细胞毒性试验，发现MARC-145细胞没有出现明显的皱缩和死亡，证明三组蛋白皆无细胞毒性。后开展体外细胞实验，验证其对PRRSV的中和活性；通过PT-PCR技术对细胞上清液进行病毒载量分析，结果表明Nyc1-S组在1：2和1：16浓度条件下，实验组与对照组差异显著，并存在剂量依赖性；Nyc1-H组在1：2浓度条件下，实验组与对照组差异显著；证明了Nyc1-S和Nyc1-H蛋白能有效中和PRRSV，抑制PRRSV的感染。

综合以上，本实施例成功将pET28-Nyc1-S、pET28-Nyc1-H、pET28-Nyc1-L质粒转入BL21(DE3)中；成功优化三株重组大肠杆菌的诱导条件；成功纯化并复性三组目的蛋白。成功扩增PRRSV，并测其病毒滴度为5.25×10⁵TCID50。复性的Nyc1-S、Nyc1-H蛋白在MARC-145细胞中具有针对PRRSV的中和活性。

实施例3重组植物乳杆菌对PRRSV攻毒仔猪免疫效果评价

本实施例应用实施例1构建的三株重组植物乳杆菌NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-S(E)、NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-H(E)、NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-L(E)，分别及复合后灌喂免疫仔猪后，观察感染仔猪的临床体征，流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群变化，剖检后通过RT-PCR技术分析猪血清及各脏器的病毒载量，并对仔猪各脏器进行病理组织学观察及病毒免疫荧光试验，综合评价重组植物乳杆菌对攻毒仔猪的免疫效果。

1、实验菌株：

实施例1构建的3株重组植物乳杆菌，分别是：NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-S(E)、NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-H(E)、NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-L(E)。PRRSV-JXA1由于军事医学科学院军事兽医研究所(长春)金宁一教授团队惠赠。

2、实验动物：16头4周龄PRRSV抗原抗体阴性的健康长白仔猪，购于吉林省长春市私人猪场。

3、主要材料和试剂：猪源CD3-PE-Cy7抗体、CD4-PE抗体、CD8-FITC抗体(BD公司)；1640细胞培养液(Hyclone)；封闭小鼠血清由实验室保存；抗体稀释液：1％ BSA；红细胞裂解液、Fluor 488标记山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天生物技术有限公司)；FACS溶液(1000mL培养细胞用PBS，10mL FBS，0.9g叠氮钠)；AXYGEN PCR STRIP TUBES(美国康宁公司)；MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver5.0(Code No.9766 Takara)；封闭用山羊血清；DAPI染液；抗淬灭封片剂；4％多聚甲醛溶液；柠檬酸钠抗原修复液；PRRSV-N蛋白兔源单抗(Gene Tex)；其它材料和试剂参照第一章。

4、主要实验器材：ABI Prism7500QT-qPCR仪器(美国)ABI公司；肝素钠抗凝管、促凝管购于(江苏)康健医疗用品有限公司；组织包埋机、石蜡切片机、DMi8荧光倒置显微镜购于(德国)徕卡仪器有限公司；组织匀浆机国产。

5、实验方法：

1)实验方案

实验动物分组：空白组(MOCK，n＝1，0号)，对照组(PBS/PRRSV，n＝3，1号、2号、3号)，实验组(LP/PRRSV，n＝3，4号、5号、6号)；实验组(S/PRRSV，n＝3，7号、8号、9号)；实验组(H/PRRSV，n＝3，10号、11号、12号)；实验组(L/PRRSV，n＝3，13号、14号、15号)公母随机分配，分组见下表3-1：

表3-1动物试验分组

免疫及攻毒程序：实验仔猪适应饲养2天后，将实施例1构建的3株重组植物乳杆菌活化并诱导表达蛋白，混合并按终浓度1×10⁹CFU/mL、10mL/头复合灌喂仔猪。在免疫过程中，固定仔猪头部及四肢，使其口鼻呈45°向上，使用灌喂器少量多次推入乳杆菌，免疫完成后固定30s至1min，防止菌液损失。在第1、3、5、7、9、11、13天进行免疫。在第16天进行PRRSV-JXA1攻毒试验，采用滴鼻的攻毒方式，模拟自然感染过程，将仔猪仰卧位固定头部和四肢，每鼻腔各给入1mL 10⁴TCID50 PRRSV病毒稀释液后，用手捂住猪口鼻30秒，避免流出。

样品的采集及处理：免疫7、14天采猪外周血，5mL/头，血样做抗凝处理。每天同一时间测量攻毒后仔猪的体温和体重，记录发病过程和观察临床症状。5dpi、10dpi采猪外血，5mL/头，3mL血样做抗凝处理，2mL血样加入促凝管中分离血清，以备病毒载量的检测。

攻毒第14天处死全部仔猪，仔猪电击处死后立即对前腔静脉放血处理，解剖胸腔和腹腔，通过钝性分离取出各脏器(包括心、肝、脾、肺、肾、肠道、***)，对心、肝、脾、肺、肾、肠道进行拍照记录。取各脏器组织样品，并分为两份：一份样品存放于-80℃冰箱中，通过RT-PCR技术分析各组织的病毒载量；一份组织样品浸泡于4％多聚甲醛中，后期制成组织切片，进行病理组织学观察及免疫荧光染色试验。

2)病理解剖学观察

对PRRSV攻毒仔猪进行病理学观察，以探究喷鼻免疫复合重组植物乳杆菌能否发挥保护作用。剖杀取样时，仔细观察并记录心、肝、脾、肺、肾等脏器病变情况，并进行拍照记录。

3)攻毒后各脏器及血清PRRSV病毒载量检测

攻毒后感染仔猪体内病毒载量的变化，能反映出病毒在体内的复制程度，体现仔猪的感染状态，同样反映复合重组植物乳杆菌对病毒入侵机体的中和作用。因此，本试验利用RT-PCR技术，进行攻毒后仔猪血清及脏器病毒载量测定。

血清样品的处理与RNA提取：将-80℃冰箱中冻存的血清取出，低温解冻后，按照提取病毒RNA说明书提取样品中病毒RNA，测定浓度后，通过反转录，获取cDNA。

各组织样品的处理与RNA提取：-80℃冰箱各脏器组织取出，用无菌PBS洗净后称取约200mg左右，用预冷的研磨器充分研磨成匀浆，将样品吸取至无菌无酶的1.5mL EP管中，按照提取病毒RNA说明书提取样品中病毒RNA，测定浓度后，通过反转录，获取cDNA。

使用荧光定量试剂盒(Perfect Start Green qPCR Super Mix DyeII)对血清样品cDNA和各组织样品cDNA进行定量分析，标准曲线的建立同实施例2。

4)仔猪攻毒前后血液T淋巴细胞检测

在灌喂复合植物乳杆菌的第7、14天；攻毒后第5、10天采集猪前腔静脉全血5mL，并做抗凝处理。在0.3mL抗凝血中加入0.9mL红细胞裂解液，轻轻吹匀，置于室温下裂解10min，400g，4℃离心5min；小心吸弃上清，加入0.6mL红细胞裂解液，轻轻吹匀，置于室温下裂解10min，再次4℃离心400g 5min；小心吸弃上清，加入0.5mL1640完全培养基轻轻吹悬细胞沉淀，在显微镜下进行细胞计数。并吸取细胞悬液(细胞量2×10⁶个)备用。

流式细胞术抗体染色：按抗体滴定稀释比例稀释抗体，每2×10⁶个细胞加入10μL抗体(CD3-PE-cy7，CD4-APC，CD8-PE)，4℃避光孵育20min，400g，4℃离心5min，小心吸弃上清，用1mL FACS轻轻吹悬细胞沉淀，400g，4℃离心5min，此步重复进行两次，以300μL FACS重悬细胞，转入流式管待上机检测。检测样品使用BD流式细胞仪，数据分析及图形处理使用FlowJo_v10.6.2软件。

5)组织病理学观察及免疫荧光染色

石蜡切片制作：切取适宜大小的固定在4％多聚甲醛中的各脏器，放入组织包埋盒中，流水不停冲洗10h-12h后，进行接下来的脱水、透明、侵蜡、切片、烤片等程序，操作如下：

(1)脱水：将样品包埋盒浸于不同浓度酒精中。按照70％酒精2h、80％酒精2h、85％酒精12h、90％酒精2h、95％酒精I和95％酒精II各1.5h、100％酒精I和100％酒精II各1h的程序进行组织脱水。

(2)透明：将组织包埋盒浸于100％二甲苯I中2min，后转移至100％二甲苯II中2min。

(3)侵蜡：将样品包埋盒浸于在56℃-60℃中融化的石蜡和I石蜡II中各40min。

(4)包埋：将包埋机中的液体石蜡加入包埋盒中，并注意组织样品摆放位置，等待蜡液冷却凝固进行后续处理。

(5)切片：将经过包埋的组织蜡块置于切片机中固定，调整厚度至2.5μm进行切片，切下的石蜡组织样品摊开在42℃水槽中，最后用载玻片小心快速捞起。

(6)烤片：将载玻片置于染色架，放入80℃温箱中1h。

免疫荧光染色：

(1)在2.1.2.7.2中切片后，进行60℃烤片2h。

(2)脱蜡：3次二甲苯脱蜡，每次15分钟。

(3)水化：依次经过不同浓度乙醇即无水乙醇、95％、90％、80％、70％乙醇、蒸馏水各5min；PBS润洗5min，重复润洗3次。

(4)修复抗原：92-95℃煮沸枸橼酸修复液，煮沸样品15min，室温下冷却后经PBS润洗5min，润洗3次；

(5)山羊血清封闭：37℃封闭20min；PBS润洗5min，润洗3次。

(6)一抗孵育：37℃孵育1.5h；PBS润洗10min，润洗3次。

(7)二抗孵育：室温孵育1h；PBS润洗10min，润洗3次。

(8)细胞核染色：按照1:1000的比例稀释DAPI染色液，室温孵育3min；PBS润洗10min，润洗3次。

(9)封片：使用抗淬灭封片剂对样品进行封片，准备镜下观察。

6)数据统计分析

流式细胞术应用Flowjo_v10.6.2分析软件，数据统计应用Graphpad Prism8软件，数据差异性统计分析应用t检验法分析。

6、结果

1)攻毒后实验猪临床表征变化

监测攻毒后实验仔猪体温及体重变化，记录仔猪临床表征变化。PBS/PRRSV组在3dpi出现临床症状，表现为喜卧、呼吸窘迫，同时PBS/PRRSV组中的2号仔猪体温突然升高至40℃；在4dpi出现气喘，2号试验猪体温略有降低，但体温均高于LP/PRRSV组；6dpi仔猪体温均达到40℃，同时出现食欲减退、精神沉郁、流鼻涕、呼吸问题加重等典型症状；7dpi开始仔猪出现食欲废绝、嗜睡、眼睑水肿、高热且最高体温达到41.1℃；12dpi仔猪体温略有下降但仍高于40℃；实验组尤其LP/PRRSV组、S/PRRSV组、H/PRRSV组未见明显病症。PBS/PRRSV组因感染引发食欲废绝，表现为体重逐渐下降，实验组体重逐步增长。临床表征、体温及体重变化分别见图14、图15、图16。

2)攻毒后实验猪剖检评价结果

14dpi，处死实验仔猪，进行解剖学观察，拍照记录各脏器病理变化。如图17。结果发现PBS/PRRSV组肺脏有多处出血点，且水肿明显，肺小叶实变；而各实验组、特别是LP/PRRSV组未见明显病变。

3)攻毒后各组织样本及血清病毒载量测定结果

提取攻毒后各组仔猪血清及处死仔猪各脏器样本的病毒核酸，通过RT-PCR技术进行病毒定量分析。

攻毒后血清病毒载量测定结果：PRRSV病毒粒子在靶细胞完成复制扩增后，随血液循环抵达各脏器。血清中病毒载量反映病毒在靶细胞复制并释放入血的情况。在5dpi、10dpi采集仔猪外周血，分离血清后进行病毒核酸提取和定量分析。

RT-PCR标准曲线建立：RT-PCR标准曲线的建立方法同实施例2，pJXA1引物定量分析标准曲线表明RT-PCR反应体系质控合格。

攻毒后第5天血清病毒载量测定结果：5dpi时，PBS/PRRSV组血清样本病毒载量达到1.6×10⁴个/200μL至2.2×10⁴个/μL。S/PRRSV组、H/PRRSV组和L/PRRSV组均低于PBS/PRRSV组，而且S/PRRSV组、H/PRRSV组低于L/PRRSV组，LP/PRRSV组血清病毒载量显著低于(p＜0.05)PBS/PRRSV组，且显著低于另外三组实验组，攻毒后第10天血清病毒载量测定结果：10dpi时，LP/PRRSV组血清病毒载量下降至0.1×10⁴个/μL至0.6×10⁴个/μL，S/PRRSV组、H/PRRSV组和L/PRRSV组也略有下降，对照组各猪血清样本病毒载量呈现显著持续升高趋势，LP/PRRSV组血清病毒载量显著(p＜0.01)低于PBS/PRRSV组。病毒定量结果见图18A。

对5dpi、10dpi各组血清载量结果分析，表明实验组在感染中期可抑制病毒释放入血，尤其复合重组植物乳杆菌的效果尤为显著，LP/PRRSV组在感染中期可显著抑制病毒释放入血。因此，下方结果分析主要以PBS/PRRSV组和LP/PRRSV组展开讨论。

4)各器官病毒定量结果

脏器病毒载量可以反映出病毒侵袭宿主和在宿主体内的复制的能力。PRRSV感染后在靶细胞内复制释放后，随血液扩散至全身各脏器和组织。基于此，提取处死猪各剖检器官样本的病毒，进行定量分析。本实验对肺、肠系膜***、肺门***样品进行病毒核酸提取并定量分析。

实验猪死亡后肺脏病毒载量测定结果见图18B。其中，对肺脏样品进行病毒核酸提取并定量分析，结果显示，PBS/PRRSV组肺脏样本病毒载量显著高于(p＜0.01)LP/PRRSV组，表明复合重组植物乳杆菌可降低感染猪肺脏中病毒载量。实验猪死亡后对肺门***样品进行病毒核酸提取并定量分析，结果显示，PBS/PRRSV组肺脏样本病毒载量显著高于(p＜0.05)LP/PRRSV组，表明复合重组植物乳杆菌可降低感染猪肺门***中病毒载量。实验猪死亡后对肠系膜***样品进行病毒核酸提取并定量分析，结果显示，PBS/PRRSV组肺脏样本病毒载量极显著高于(p＜0.001)LP/PRRSV组。表明复合重组植物乳杆菌可显著降低感染肠系膜***中病毒载量。

4)免疫荧光法对病毒的定位

对PRRSV感染后病变明显的心脏、脾脏、肺脏、肾脏、肺门***、肠系膜淋巴等进行免疫荧光检测，观察各组PRRSV荧光强度，分析复合重组植物乳杆菌抗病毒感染各脏器的情况。DAPI对细胞核进行染色(蓝色)，一抗为PRRSV-N蛋白兔源单抗，二抗为Alexa Fluor488标记山羊抗兔IgG(H⁺L)(绿色)。空白组MOCK；对照组PBS/PRRSV；实验组LP/PRRSV。

免疫荧光结果见图19，结果显示，感染后期PBS/PRRSV组实验猪脏器病毒荧光强度高于LP/PRRSV组，其中肺脏、肺门***、肠系膜淋巴荧光强度较高。试验表明，复合重组植物乳杆菌在感染中后期可有效保护仔猪各脏器免受PRRSV病毒侵袭。

5)实验猪死亡后组织病理学观察

为了检测重组植物乳杆菌对实验猪的保护效果，取处死实验猪各脏器，制作病理切片，进行组织病理学观察。结果见图20，结果发现，PBS/PRRSV组肺脏出现水肿及间质性肺炎，脾脏红细胞浸润；LP/PRRSV组均无明显病理变化，表明灌喂复合重组植物乳杆菌，对攻毒实验仔猪提供有效保护。

6)实验猪攻毒前后外周血T淋巴细胞流式检测结果

T淋巴细胞在预防PRRSV感染中发挥重要作用，尤其是CD3⁺CD8⁺T淋巴细胞具有清除PRRSV的作用，以此保护机体免受病毒的侵害。利用流式细胞术对攻毒前(PBS组3头仔猪，LP组3头仔猪)及攻毒后(MOCK组1头仔猪，PBS组/PRRSV组3头仔猪，LP组PRRSV组3头仔猪)在不同时间所采集的猪外周血样本进行T淋巴细胞亚群的检测，检测并分析CD3⁺CD4⁺T细胞、CD3⁺CD8⁺T细胞变化。

免疫第7、14天猪外周血T淋巴细胞流式检测结果：免疫第7、14天PBS组和LP组猪外周血T淋巴细胞流式检测结果显示，攻毒前免疫第7天猪外周血样品的流式检测中PBS组CD3⁺CD8⁺T细胞占比约为33.1％，LP组CD3⁺CD8⁺T细胞占比高达40.0％，LP组显著高于(p＜0.01)PBS组；LP组与PBS组CD3⁺CD4⁺T细胞占比未见明显差异(p＞0.05)。免疫第14天猪外周血样品的流式检测，PBS组CD3⁺CD8⁺T细胞占比约为39.8％，LP组CD3⁺CD8⁺T细胞占比约为45.1％，LP组显著高于(p＜0.01)PBS组；LP组与PBS组CD3⁺CD4⁺T细胞占比同样无明显差异(p＞0.05)。LP组在第14天和第7天CD3⁺CD8⁺T细胞占比持续提升。结果表明，复合重组植物乳杆菌能够显著提高猪外周血中CD3⁺CD8⁺T细胞占比，而这类细胞有助于机体抵抗PRRSV的感染，对机体的免疫保护发挥积极作用。见图21、图22。

攻毒后第5、10天猪外周血T淋巴细胞流式检测结果：对前期PBS组3头仔猪和LP组3头仔猪进行攻毒，设置MOCK组1头仔猪作为纯空白对照。对攻毒后第5、10天MOCK组、PBS/PRRSV组和LP/PRRSV组猪外周血样品进行T淋巴细胞流式检测。

结果显示，5dpi时MOCK组、PBS/PRRSV组和LP/PRRSV组CD3⁺CD4⁺T细胞占比分别约为17.8％、13.6％、20.3％，PBS/PRRSV组CD3⁺CD4⁺T细胞占比显著(p＜0.05)低于MOCK组，LP/PRRSV组CD3⁺CD4⁺T细胞占比极显著(p＜0.001)高于PBS/PRRSV组；LP/PRRSV组CD3⁺CD4⁺T细胞占比较MOCK组未见明显差异(p＞0.05)。MOCK组、PBS/PRRSV组和LP/PRRSV组CD3⁺CD8⁺T细胞占比约为39.0％、32.7％、45.8％，LP/PRRSV组CD3⁺CD8⁺T细胞占比显著(p＜0.05)高于MOCK组且极显著(p＜0.001)高于PBS/PRRSV组，而PBS/PRRSV组CD3⁺CD8⁺T细胞占比较MOCK组有下降趋势，但未见明显差异(p＞0.05)。结果表明，复合重组植物乳杆菌能够维持攻毒后仔猪外周血液中CD3⁺CD4⁺T细胞和CD3⁺CD8⁺T细胞占比，这两类细胞在防御PRRSV感染中发挥举足轻重的作用。见图23。

10dpi时MOCK组、PBS/PRRSV组和LP/PRRSV组猪外周血样品进行T淋巴细胞流式检测。结果显示，MOCK组、PBS/PRRSV组和LP/PRRSV组CD3⁺CD4⁺T细胞占比分别约为25.9％、14.6％、18.9％，MOCK组CD3⁺CD4⁺T细胞占比极显著(p＜0.001)高于PBS/PRRSV组且显著(p＜0.01)高于LP/PRRSV组，而LP/PRRSV组CD3⁺CD4⁺T细胞占比显著(p＜0.05)高于PBS/PRRSV组。MOCK组、PBS/PRRSV组和LP/PRRSV组CD3⁺CD8⁺T细胞占比分别约为38.8％、27.6％、42.0％，PBS/PRRSV组CD3⁺CD8⁺T细胞占比极显著(p＜0.001)低于LP/PRRSV组且显著(p＜0.01)低于MOCK组，而LP/PRRSV组CD3⁺CD8⁺T细胞占比较PBS/PRRSV组有明显升高趋势，但不具备统计学上的显著意义(p＞0.05)。分析结果发现，10dpi时，PBS/PRRSV组仔猪T细胞受PRRSV感染导致免疫功能受损，T淋巴细胞有显著减少，而LP/PRRSV组CD3⁺CD4⁺T细胞和CD3⁺CD8⁺T细胞皆维持在一定水平，在抵抗PRRSV对机体的侵害过程中发挥着十分重要的作用。结果表明，复合重组植物乳杆菌可显著抑制病毒对攻毒仔猪T淋巴细胞的消耗，对PRRSV清除过程中发挥积极作用。见图24。

综合以上，重组植物乳杆菌及其复合形式能够有效缓解PRRSV-JXA1株感染断奶仔猪的临床症状，维持仔猪正常体温、体重和正常采食。攻毒后不同时间血清样本和不同脏器样本中病毒载量在PBS/PRRSV组与LP/PRRSV组间存在显著差异，且PBS/PRRSV组肺脏、肠系膜***和肺门***样本中病毒载量极高；PBS/PRRSV组与LP/PRRSV组病毒荧光强度有差异，组织病理学观察显示PBS/PRRSV组各组织病变，而LP/PRRSV组未见明显病变。复合重组植物乳杆菌可显著提升实验猪CD3⁺CD8⁺T细胞水平，攻毒后LP/PRRSV组CD3⁺CD4⁺T细胞和CD3⁺CD8⁺T细胞水平均显著高于PBS/PRRSV组。

本实施例选择灌喂重组植物乳杆菌或其复合的方式，回归本体实验动物，开展对PRRS免疫保护效果研究。将重组植物乳杆菌以10⁹CPU/mL，10mL/头的剂量灌喂仔猪；免疫时，固定仔猪头部及四肢，使猪口鼻呈45°向上，少量多次灌喂，灌喂后固定30s至1min，防止菌液损失同时有利于仔猪充分吸收。动物模型的建立对实验同样重要，模拟PRRSV自然感染过程在第16天采用滴鼻途径，对PBS组及LP组实验仔猪进行攻毒试验，选用PRRSV强毒株JXA1株，攻毒剂量为10⁴TCID50，2mL/头操作时注意避免病毒液损失。

检测灌喂复合重组植物乳杆菌第7、14天仔猪外周血液中T淋巴细胞变化，结果表明LP组CD3⁺CD8⁺T细胞占比显著(p＜0.01)高于PBS组，且第7天至第14天CD3⁺CD8⁺T细胞占比持续升高，而CD3⁺CD4⁺T细胞无明显差异(p＞0.05)，结果说明复合重组植物乳杆菌能够显著提高猪外周血中CD3⁺CD8⁺T细胞占比；T细胞介导的细胞免疫在抗病毒感染过程中发挥积极作用，CD3⁺CD8⁺T细胞主要参与细胞毒作用(CTL)。PRRSV能够影响猪的外周血T细胞亚群的变化，据报道丹麦PRRSV分离株感染4周龄SPF猪，CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺T细胞下降后迅速回升。李华等用PRRRS VBJ24株感染3周龄SPF仔猪发现CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺T细胞的表达在感染初期下降，7dpi左右这种下调出现逆转。PRRSV China 92-1株感染8周龄SPF及HPCD仔猪，CD4⁺细胞从3dpi持续到感染14dpi，CD8⁺细胞在3dpi时下降，后期缓慢回升。随后，检测5dpi、10dpi仔猪外周血液中T细胞变化，结果显示，5dpi、10dpi，PBS/PRRSV组CD3⁺CD4⁺T细胞占比显著(p＜0.05)、极显著(p＜0.001)低于MOCK组，且占比持续降低；10dpi PBS/PRRSV组CD3⁺CD8⁺T细胞占比显著(p＜0.01)低于MOCK组；PRRSV感染导致仔猪T淋巴细胞显著减少。这说明复合重组植物乳杆菌可显著抑制病毒对攻毒仔猪T淋巴细胞的消耗。宋腾飞发现mAb2-5G2及其scFv在0.25uM/鼠的免疫剂量中可显著提高外周血中CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺T细胞比例，增强小鼠免疫***针对PRRSV的细胞免疫反应。然而也有不同的结论报道，导致这一差异很可能是因为毒株、毒力、攻毒剂量和检测方法不同。

为验证灌喂复合重组植物乳杆菌对感染仔猪的保护效果，利用RT-PCR技术检测5dpi、10dpi血清中病毒载量，结果显示，5dpi LP/PRRSV组与PBS/PRRSV组病毒载量差异显著(P＜0.05)，10dpi两组间病毒载量差异显著(P＜0.01)，结果表明复合重组植物乳杆菌能够降低或延缓靶细胞释放病毒粒子入血。对处死猪各脏器病毒载量分析结果表明结果显示，PBS/PRRSV组肺脏、肺门***样本病毒载量与LP/PRRSV组差异显著(P＜0.01)，两组间肠系膜***样本病毒载量差异极显著(P＜0.001)。随后发明人进行了对病毒N抗原免疫荧光染色结果表明LP/PRRSV组与PBS/PRRSV组荧光强度有明显差异；尤其是靶器官肺脏、肠系膜***、肺门***差异明显。和组织病理学观察发现PBS/PRRSV组靶器官肺部肺泡增宽、呈现间质性肺炎，而LP/PRRSV组未见明显病变。

本实施例证明了三株重组植物乳杆菌尤其是NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-S(E)、NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-H(E)、NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-L(E)可起到一定的抑制病毒释放入血的作用，尤其是三株重组植物乳杆菌的复合形式可以刺激CD3⁺CD8⁺T细胞的活化，延缓病毒被靶细胞释放入血，造成的仔猪感染，复合重组植物乳杆菌对PRRSV感染仔猪发挥了积极的免疫保护作用。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1. 一种激发机体抗PRRSV GP3感染的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中，核苷酸序列对应的基因命名为Nyc1-S。

2.含有权利要求1中所述基因的表达载体。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pSIP409-pgsA’-Nyc1-S，其由载体片段pSIP409-pgsA’与权利要求1中所述的基因Nyc1-S连接得到。

4.含有权利要求1所述的基因的工程菌，其特征在于，所述工程菌表达激发机体抗PRRSV GP3感染的蛋白。

5.根据权利要求4所述的工程菌，其以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) 为出发菌株。

6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) NC8。

7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌为重组植物乳杆菌NC8/pSIP409-pgsA’-Nyc1-S。

8.一种激发机体抗PRRSV GP3感染的蛋白，其由权利要求1中所述的基因编码或由权利要求4-7中任一项所述的工程菌表达产生。

9.一种药物组合物或药物制剂或饲料，其包含权利要求8中所述的激发机体抗PRRSVGP3感染的蛋白或者包含权利要求4-7中任一项所述的工程菌。

10.一种表达权利要求8中所述的激发机体抗PRRSV GP3感染的蛋白的方法，其包括：构建含有权利要求1中所述基因的表达载体，再将构建的表达载体导入宿主细胞获得重组菌株，培养该重组菌株，最后从培养物中分离蛋白。

11.权利要求1所述的基因或权利要求4-7中任一项所述的工程菌或权利要求8中所述的激发机体抗PRRSV GP3感染的蛋白在制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒疫苗或药物中的应用或在制备预防猪繁殖与呼吸综合征的疫苗或药物中的应用。