CN115820608B - λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了λ‑卡拉胶酶突变体OUC‑CglA‑DPQQ，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因如SEQ ID NO.2所示。所述λ‑卡拉胶酶突变体OUC‑CglA‑DPQQ在降解卡拉胶/制备高聚合度λ‑卡拉胶寡糖中的应用。本发明还公开了一种利用λ‑卡拉胶酶突变体OUC‑CglA‑DPQQ降解卡拉胶/制备高聚合度λ‑卡拉胶寡糖的方法。本发明的λ‑卡拉胶酶突变体OUC‑CglA‑DPQQ可作用低粘度的卡拉胶，终产物λ‑卡拉胶寡糖聚合度为10～20。本发明的λ‑卡拉胶酶突变体具有优良的酶学性质和特异性，在酶法制备高聚合度λ‑卡拉胶寡糖中具有重要的工业应用价值以及经济价值。

Description

λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ及其应用

技术领域

本发明涉及λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ及其应用，属于功能酶技术领域。

背景技术

卡拉胶（Carrageenan）是自红藻中提取的一种酸性多糖，具有重复的α-1，4-D-半乳吡喃糖和β-1，3-D-半乳吡喃糖（或3，6-内醚-D-半乳吡喃糖）二糖单元骨架结构。卡拉胶寡糖是卡拉胶的降解产物，根据硫酸盐的结合形式不同，卡拉胶寡糖可分为十种不同的理想化重复双糖，它们是α-、β-、λ-、δ-、κ-、μ-、θ-、δ-、I-,ⅴ-卡拉胶寡糖，它们的区别主要在于它们的硫酸化程度和是否存在3，6-脱水半乳糖残基。

λ-卡拉胶寡糖具备抗凝、抗血栓、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等多种功效。近年来经研究证实，λ-卡拉胶寡糖在生物体抗氧化、自由基的清除方面也发挥着重要的作用。因此如何高效制备λ-卡拉胶寡糖日益成为人们研究的热点问题。

制备λ-卡拉胶寡糖的方法包括物理法、化学法和酶解法，其中，物理法主要是指超声、微波等物理学手段降解λ-卡拉胶的方法；化学法主要包括酸水解和氧化法降解；目前最为常见的降解方法是酸水解与酶水解，酶解法相比于酸解法具有反应温和、产物单一、易于分离等优点，但λ-卡拉胶酶在文献中记载的并不多，并且产物成分大多为低聚合度的寡糖。因此，发掘新的λ-卡拉胶酶并构建新的工程菌具有重大意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种可以降解卡拉胶产生λ-卡拉胶寡糖的新型降解酶——λ-卡拉胶酶突变OUC-CglA-DPQQ，其可以降解产生高聚合度的寡糖。本发明还提供了该突变酶的应用，以及一种降解卡拉胶/制备λ-卡拉胶寡糖的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ，其氨基酸序列如下所示，如SEQ ID NO.1所示。

λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ的氨基酸序列（SEQ ID NO.1）：

MRENNAPMYAVTVITKDKTPYIVCGGYDKNIYYLSSSGDLLKTIASKDYSVEKAKGANSKEVPTGNAHISNFIRTIKKADGSEVLAVQGVNHTMSIQARGSLYLFHPLDEKPFKTIDLEGKRLLGELKVVDVGLDGDQEIIAGSSTMIHESSLLKVDLETYEQELFEISKIKKKIDRFGYRVTQPEIITQNGKQSYFVLFGSRILLVPLDFNLEKTEVLVSKYSFNDMWKDGKGNIILASIQSGGSEIYVLNPNKPNWKQAYENLIPKGKIASIIANTKEVKEQLNVFTAPIEERKPLPVYLMSEGVPPSIKTLVDDIKENYKSPVFLNRSGSDKEKWDRSSIENEKYRDRRDRRMKYILSQDQVIKKITSKYKGGPGIAYWGGHGNDPYMYQLSTTKKVLNAAKGKKTVLIFPELEDHSDNFNYVMEDYFYPLAKHARETNANIYVRTKHAFWQANVYLPTWSRLVSGEFSDVFVPAMEETTDKSMDLSIAGRLGIWTSGATDSWGSRCARDNPSLDRLRQHSHQMLPNHFLRNMIYHVSSGAQYLDNFNVDQEYMSLLWELIAKGALYVPKRSEILSFSPVNLGMLSPDKHYLEESSNAKWTTFYDEEKEKNNPLVFSHLNGSWPGAPVTEWDFSKYAGGVQDRRLNFLPTYTNGLVLLTPPQNGIYADKKAKRGTLTSHLHPMYKNIMKEYYTDGRNYYSADGTQTYKANEYYKVIAKDIKDNAKKLPLTVSGDVAWVVAQSSPKHLRLTLIDGGYLNPDDREVTIQFNTVVPIKVTDLLSGEEFTPNANGELQIKVSCGLFRFIDIEFTGFKLE。

上述λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ的编码基因，其核苷酸序列如下所示，如SEQ ID NO.2所示。

λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ的编码基因的核苷酸序列（SEQ ID NO.2）：

5’-ATGCGCGAAAACAACGCGCCAATGTACGCAGTAACCGTTATTACCAAAGATAAAACCCCGTACATTGTATGCGGTGGTTATGACAAAAATATCTACTACCTGTCTAGTTCCGGCGATCTGCTGAAAACCATTGCGAGCAAAGACTATTCGGTTGAAAAAGCAAAAGGCGCGAACAGCAAAGAAGTGCCGACTGGCAACGCCCACATTTCCAACTTCATTCGCACCATCAAAAAAGCAGACGGTTCTGAAGTGCTGGCGGTTCAGGGCGTGAACCACACCATGTCCATCCAAGCTCGCGGTAGTCTGTACCTGTTCCATCCGCTGGACGAAAAACCGTTTAAAACCATTGATCTGGAAGGCAAACGTCTGCTGGGCGAACTGAAGGTGGTTGATGTTGGCCTGGACGGCGACCAGGAAATTATCGCGGGTTCTTCCACCATGATCCACGAATCTTCTCTGCTGAAAGTTGATCTGGAAACCTACGAACAGGAACTGTTCGAAATCAGCAAAATTAAAAAGAAAATCGATCGCTTCGGCTATCGCGTGACCCAGCCGGAAATCATTACTCAGAACGGTAAACAGTCTTACTTCGTGCTGTTCGGCAGCCGTATCCTGCTGGTGCCGCTGGATTTTAACCTCGAAAAAACCGAAGTTCTGGTTAGCAAATACAGCTTCAATGACATGTGGAAAGATGGCAAAGGCAATATCATCTTGGCGAGCATCCAGAGCGGTGGCTCTGAAATCTACGTTCTGAACCCGAACAAACCAAACTGGAAACAGGCGTACGAAAACCTGATCCCGAAAGGCAAAATCGCGAGCATTATCGCCAATACCAAAGAAGTTAAAGAACAGCTGAACGTTTTTACCGCGCCGATCGAAGAACGCAAACCGCTGCCGGTTTACCTGATGTCTGAGGGTGTGCCGCCGAGCATCAAAACGCTGGTTGATGATATCAAAGAAAACTACAAATCTCCGGTTTTCCTGAACCGCAGCGGTTCTGACAAAGAAAAATGGGATCGCTCCTCTATCGAAAACGAAAAATATCGTGATCGCCGCGACCGCCGTATGAAATACATTCTGTCTCAGGATCAGGTCATCAAGAAAATCACATCGAAATACAAAGGCGGTCCGGGCATCGCCTACTGGGGCGGTCACGGCAACGATCCGTACATGTACCAGCTGTCTACCACTAAGAAAGTGCTGAACGCTGCGAAAGGCAAGAAAACTGTGCTGATTTTCCCGGAATTGGAAGATCACTCTGATAATTTCAACTACGTTATGGAAGATTACTTCTACCCGCTGGCCAAACACGCTCGTGAAACCAACGCCAACATCTATGTTCGTACCAAGCACGCGTTTTGGCAGGCAAATGTGTATTTGCCGACCTGGTCCCGTCTGGTTTCGGGCGAGTTTTCTGATGTGTTTGTTCCGGCAATGGAAGAAACCACCGACAAGAGCATGGACCTGAGCATCGCGGGCCGTCTGGGCATTTGGACCAGCGGCGCTACCGACTCCTGGGGCAGCCGTTGCGCACGTGATAACCCGAGCCTGGATCGTCTGCGCCAGCATAGCCACCAGATGCTGCCGAACCACTTCCTGCGCAACATGATTTACCATGTTAGCTCCGGTGCGCAGTACCTGGATAACTTCAACGTGGACCAGGAATACATGAGCCTGCTGTGGGAACTGATTGCTAAAGGTGCACTGTACGTTCCGAAACGTAGTGAAATTCTGTCCTTCTCTCCGGTTAACCTGGGTATGCTGAGCCCGGATAAACACTACCTGGAGGAAAGCAGTAACGCGAAGTGGACCACCTTCTACGATGAAGAAAAAGAGAAAAACAACCCTCTGGTCTTTAGCCACCTGAACGGTTCTTGGCCGGGCGCACCCGTGACCGAATGGGATTTTTCTAAATATGCGGGTGGCGTGCAGGATCGTCGTCTGAACTTCCTGCCGACCTATACTAACGGCCTGGTACTGCTGACTCCGCCGCAGAACGGTATCTACGCTGATAAAAAAGCGAAACGTGGTACCCTGACTAGCCACCTGCACCCGATGTACAAAAACATTATGAAGGAATATTACACCGATGGCCGTAATTACTACAGCGCGGACGGCACCCAGACCTACAAAGCGAATGAATACTATAAAGTGATCGCAAAAGATATTAAAGATAACGCGAAAAAACTGCCGCTGACCGTTAGCGGTGACGTGGCGTGGGTTGTTGCGCAGAGCTCCCCGAAACATCTGCGTCTGACCCTGATCGACGGCGGCTACCTGAACCCGGACGACCGTGAAGTGACCATCCAGTTCAACACCGTGGTTCCGATTAAAGTTACTGACCTGCTGAGCGGTGAAGAATTCACTCCGAACGCTAACGGTGAACTGCAGATTAAAGTTAGTTGCGGCCTGTTCCGTTTCATTGACATCGAATTCACCGGCTTCAAACTCGAG-3’。

所述λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ在降解卡拉胶/制备λ-卡拉胶寡糖中的应用。所述λ-卡拉胶寡糖为高聚合度（10～20）的λ-卡拉胶寡糖。

一种降解卡拉胶/制备λ-卡拉胶寡糖的方法：采用上述λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ降解卡拉胶，得到高聚合度（10～20）的λ-卡拉胶寡糖，包含十糖、十二糖、十四糖、十六糖、十八糖、二十糖等长链寡糖中的任意一种或两种以上。

进一步地，所述制备λ-卡拉胶寡糖的方法具体为：将λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ加入到λ-卡拉胶溶液中，在10～25℃、pH 6.0～8.0条件下降解得到降解产物，即为高聚合度的λ-卡拉胶寡糖。

进一步地，所述λ-卡拉胶溶液中λ-卡拉胶的浓度为2～5 mg/ml，优选3 mg/ml。

进一步地，所述降解的温度为15℃。

进一步地，所述降解的pH值为7.0。

进一步地，所述降解的时间为1～12小时，优选4～6小时，更优选2小时。

进一步地，所述λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ以酶液的形式加入到λ-卡拉胶溶液中，加酶量为0.20～0.25 U，优选1.5 U。

所述λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ的编码基因在制备λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ中的应用。

一种重组表达载体，其携带有编码λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ的基因。

一种重组工程菌，其基因组中***有编码λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ的基因，能表达λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ。

所述重组表达载体、重组工程菌在制备λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ中的应用。

一种酶制剂，包括上述λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ。

所述酶制剂在降解卡拉胶/制备λ-卡拉胶寡糖中的应用。

本发明的λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ，在15℃和pH 7条件下，比酶活可达51.59 U/mg。可作用低粘度的λ-卡拉胶底物，终产物λ-卡拉胶寡糖聚合度为10～20。本发明构建了含λ-卡拉胶酶突变体编码基因的重组载体，实现了在大肠杆菌中的异源表达，同时为该酶的工业化生产和应用提供了良好的基础。本发明的λ-卡拉胶酶突变体反应条件温和，具有优良的酶学性质和特异性，对λ-卡拉胶有较好的降解效果，降解λ-卡拉胶生成十糖、十二糖等长链寡糖，可在制备抗菌剂、抗病毒剂、免疫调节剂、抗氧化剂等中应用，在酶法制备高聚合度λ-卡拉胶寡糖中具有重要的工业应用价值以及经济价值。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：λ-卡拉胶酶突变体的SDS-PAGE电泳图，其中，M为标准蛋白Marker；1为粗酶蛋白；2为粗酶穿透液蛋白；3为纯化浓缩后的λ-卡拉胶酶突变体蛋白。

图2：温度变化对相对酶活的影响示意图。

图3：pH变化对相对酶活的影响示意图。

图4：λ-卡拉胶酶突变体的酶解产物的液相图。

图5：λ-卡拉胶酶突变体酶解产物——长链寡糖的质谱图。

图6：改造前与改造后纯化所得酶蛋白含量对比图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。

实施例1 λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ的编码基因的克隆

本发明的发明人从NCBI基因库中比对已知较高活性的λ-卡拉胶酶，并成功挖掘到来源于Maribacter vaceletii的λ-卡拉胶酶基因OUC-CglA(序列号WP_121067947.1)，注意到该酶的结构域中含有PQQ相似结构域，并且在酶蛋白与底物的分子对接模型中该结构域可能会阻碍酶催化位点和底物的结合，所以猜测这段结构域可能对λ-卡拉胶酶活性有一定影响，故对该基因进行改造，删去了该酶的PQQ相似结构域部分所在的118个氨基酸。改造后，该基因在大肠杆菌中表达时形成的包涵体较少，经计算，改造后发酵所得酶蛋白的含量增加了3～4倍，如图6所示。改造后的基因包含有2454个碱基，如SEQ ID NO.2所示，编码818个氨基酸，如SEQ ID NO.1所示，命名为λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ。

人工合成OUC-CglA-DPQQ的基因片段，并以其为模板进行PCR扩增以得到SEQ IDNO.2所示的基因片段，扩增所用的特异性引物如SEQ ID NO.3、4所示。

上游引物：5’-AGATATACCATGCGCGAAAACAACGCGCCA-3’，如SEQ ID NO.3所示；

下游引物：5’-GCGTTGTTTTCGCGCATGGTATATCTCCTTC-3’， 如SEQ ID NO.4所示。

PCR反应体系为：2×PCR Buffer 25μl，dNTP 10μl，引物各1.5μl，模板1μl，KOD Fx酶1μl，无菌水10μl，总体系50μl。

PCR的反应条件为：94℃预变性5 min，95℃变性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸60s，反应30个循环，72℃后延伸10 min。

琼脂糖凝胶电泳后回收7.681 Kb（所设计的引物PCR得到的为突变体OUC-CglA-DPQQ整个质粒的全部DNA）的PCR产物片段。

实施例2 含λ-卡拉胶酶突变体编码基因的表达载体的构建

上述扩增的到的基因片段与pET-28a克隆载体采用无缝克隆技术进行连接，将连接产物转入E.coliDH5α感受态细胞，涂布于LB培养基固体平板（含有50μg/mL卡那霉素）上，37℃温箱中培养16小时后，挑取单克隆至含有50μg/mL卡那霉素LB液体培养基中，在转速为220 rpm的37℃摇床培养12小时。将单克隆进行阳性验证后测序，并命名为pET28a-OUC-CglA-DPQQ。质粒保存在-20℃备用。

实施例3 重组工程菌的构建

将实施例2中抽提的质粒转化至宿主E.coliBL21感受态细胞中，构建好的工程菌在硫酸卡那霉素抗性平板上长出，得到重组表达菌株。

实施例4 λ-卡拉胶酶突变体的制备

大肠杆菌重组表达菌株经在5 ml LB液体培养基（含有50μg/mL卡那霉素）中活化后，按1%的接种量接入含有硫酸卡那霉（50μg/mL）的LB培养基，37℃，200 rpm培养6 h，菌液OD（600）值为0.6时，加入1‰IPTG（100 mM/L），20℃低温诱导20 h，表达λ-卡拉胶酶突变体。

发酵结束后，菌液8000 g离心10分钟，收集菌体，重悬于50 mM的pH=8.0的Tirs-HCl缓冲液中，然后于冰水浴中超声破碎30 min（200 W，3 s开，3 s关），然后8000 g再次离心15 min，收集上清液，即为粗酶液。基于His标签融合的蛋白，粗酶液使用Ni-NTA柱进行亲和层析纯化，使用低浓度的10 mM咪唑溶液（10 mM咪唑，500 mM NaCl，50 mM Tris-HCl）平衡柱子，然后用20 mM咪唑溶液（20 mM咪唑，500 mM NaCl，50 mM Tris-HCl）洗脱结合力弱的杂蛋白，100 mM咪唑溶液（100 mM咪唑，500 mM NaCl，50 mM Tris-HCl）洗脱目的蛋白，收集此部分的缓冲液洗脱成分，得到纯化的λ-卡拉胶酶突变体的溶液（蛋白含量为0.5 mg/mL），作为酶液用于下述各实施例的研究。经SDS-PAGE检测蛋白纯度和分子量（结果如图1所示），结果显示重组蛋白经亲和柱纯化可得电泳纯蛋白，分子量大小约为93.7 Kda，与预测结果保持一致，即获得了目的蛋白。

实施例5 λ-卡拉胶酶突变体比酶活的测定

λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ活性的标准测定方法为：140微升的反应体系中，包含40μL酶液、100μL pH 7的磷酸盐缓冲液溶解的3 mg/ml（m/v，mg/ml）的λ-卡拉胶溶液，在15℃下反应1 h，反应样与200μL的DNS试剂混合，并在沸水浴中煮沸5 min进行显色，在540 nm处检测其吸光度。

酶活力定义为在标准条件下每min产生1μM还原糖所需要的酶量。经测定，实施例4纯化后的λ-卡拉胶酶突变体的活力可达51.59 U/mg。

实施例6 λ-卡拉胶酶突变体的最适反应条件的测定

将实施例4中得到的纯化λ-卡拉胶酶突变体在不同温度和pH下反应，测定温度和pH对酶活力的影响。

选取10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃的温度，按照实施例5的测定方法反应1 h测定最适温度。

在15℃条件下，选用pH为4.0～9.0的缓冲液作为酶反应的不同测定pH缓冲液，根据λ-卡拉胶酶突变体的酶活力，确定λ-卡拉胶酶突变体的最适pH。

以最高酶活力为100%，计算在不同条件下的相对酶活力，结果如图2、图3所示，λ-卡拉胶酶突变体的最适反应温度为15℃，最适pH为7，磷酸盐缓冲液可能对酶蛋白活性有不良影响。

实施例7 测定λ-卡拉胶酶突变体的降解产物

将40μL酶液加入到100μL pH 7的磷酸盐缓冲液溶解的3 mg/ml（m/v，mg/ml）的λ-卡拉胶溶液中，在15℃下反应12 h，通过高效液相色谱检测产物。结果如图4所示，结果表明产物中明显含有十糖、十二糖、十四糖等长链寡糖。

实施例8 定义λ-卡拉胶酶突变体产物聚合度组成

将40μL酶液加入到100μL pH 7的磷酸盐缓冲液溶解的3 mg/ml（m/v，mg/ml）的λ-卡拉胶溶液中，在15℃下反应12 h，通过ESI-MS检测产物。结果如图5所示，结果表明产物中含有的λ-卡拉胶寡糖有十糖、十二糖、十四糖等长链寡糖。

实施例9 酶制剂的制备

实施例4的酶液，用pH 7.0 Tris-HCl 缓冲液置换咪唑，冻干，得纯酶粉，保存。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

Claims (10)

1. λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述的λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ在降解卡拉胶/制备高聚合度λ-卡拉胶寡糖中的应用。

4.一种降解卡拉胶/制备高聚合度λ-卡拉胶寡糖的方法，其特征在于：采用权利要求1所述的λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ降解卡拉胶，得到高聚合度λ-卡拉胶寡糖。

5.根据权利要求4所述的降解卡拉胶/制备高聚合度λ-卡拉胶寡糖的方法，其特征在于：所述高聚合度λ-卡拉胶寡糖包括十糖、十二糖、十四糖、十六糖、十八糖、二十糖中的任意一种或两种以上。

6.根据权利要求4所述的降解卡拉胶/制备高聚合度λ-卡拉胶寡糖的方法，其特征在于：所述降解的条件为：在10～25℃、pH 6.0～8.0条件下降解1～12小时；

或：所述卡拉胶以溶液的形式存在，λ-卡拉胶的浓度为2～5 mg/ml，λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ的加酶量为0.20～0.25 U。

7.一种重组表达载体，其携带有权利要求2所述的λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ的编码基因。

8.一种重组工程菌，其基因组中***有权利要求2所述的λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ的编码基因，能表达λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ。

9.权利要求7所述的重组表达载体或权利要求8所述的重组工程菌在制备λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ中的应用。

10.一种酶制剂，包括权利要求1所述的λ-卡拉胶酶突变体OUC-CglA-DPQQ。