CN115806890A - 一株高产3-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
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- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一株高产3‑岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其构建方法与应用。所述基因工程菌同时表达乳糖透性酶、GDP‑甘露糖脱氢酶、GDP‑岩藻糖合成酶和α‑1,3‑岩藻糖基转移酶。所述α‑1,3‑岩藻糖基转移酶为来自Neobacillus cucumis的α‑1,3‑岩藻糖基转移酶，其编码基因为Fut3Bc，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明构建的基因工程菌，由于α‑1,3‑岩藻糖基转移酶Fut3Bc为优化过的密码子，合成3‑FL的效率更高，且更加适合在酿酒酵母中表达，因此在使用该工程菌以乳糖和半乳糖为底物发酵生产3‑FL时，极大地提高了3‑FL的产量，产量可达0.93g/L，是已报道的常用合成3‑FL的α‑1,3‑FT FutA菌株的5.4倍，为3‑FL的工业化合成提供了重要参考和指导。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高产3-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
3-岩藻糖基乳糖(3-FL)为母乳寡糖中的重要组成部分，3-FL为母乳寡糖(HMOs)的重要组成部分，在18个月婴儿的母乳中占HMOs总量的25～55％。3-FL在促进人类健康中发挥着重要作用，例如，3-岩藻糖基乳糖特异性地抑制致病性大肠杆菌、诺如病毒与对应宿主受体的结合从而避免感染。3-岩藻糖基乳糖可以抑制绿脓杆菌与局部上皮细胞的相互作用，从而避免绿脓杆菌对胃肠道、尿道和呼吸***的感染。3-岩藻糖基乳糖还可以特异性地增殖肠道特定有益菌从而调节肠道菌群的结构与功能。此外，3-岩藻糖基乳糖通过上调肠道杯状细胞分泌相关基因的表达，促进肠道中有益微生物如双歧杆菌的生长。高产3-FL菌株的构建对3-FL功能的进一步研究以及工业化合成3-FL具有重要意义。
生物合成3-FL是一种行之有效的方法。3-FL的生物合成过程为一分子供体GDP-岩藻糖在α-1,3-岩藻糖基转移酶(α-1,3-fucosyltransferase，α-1,3-FT)的作用下与受体乳糖结合，产生一分子3-FL。已有研究构建了高产3-FL的大肠杆菌重组菌株。但是大肠杆菌可能产生内毒素，且发酵时易受到噬菌体的污染，使得大肠杆菌工业化合成3-FL受限。
酿酒酵母是被普遍认为安全的微生物，目前尚未有合成3-FL酿酒酵母的报道。但3-FL的结构类似物2’-FL已成功在酿酒酵母中合成，而3-FL与2’-FL合成所需底物相同，而催化3-FL合成的糖基转移酶为α-1,3-FT。
因此，寻找具有高活力的α-1,3-FT并在酿酒酵母中表达，构建一种合成3-岩藻糖基乳糖的重组酿酒酵母，有效促进3-岩藻糖基乳糖的发酵合成，并为未来规模化生产奠定坚实基础是本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一株高产3-岩藻糖基乳糖的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明通过代谢工程改造，使得酿酒酵母可以吸收乳糖并在胞内以GDP-甘露糖为前体合成GDP-岩藻糖，通过异源表达多种生物来源的α-1,3-岩藻糖基转移酶，以发掘在酿酒酵母中表达时高产3-FL的α-1,3-FT。从而提高3-FL的产量，并为工业化生产3-FL提供重要参考。
本发明的技术方案如下：
一株高产3-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，所述基因工程菌同时表达乳糖透性酶、GDP-甘露糖脱氢酶、GDP-岩藻糖合成酶和α-1,3-岩藻糖基转移酶。
根据本发明优选的，所述基因工程菌为重组的酿酒酵母，所述酿酒酵母为酿酒酵母W303-1a；所述酿酒酵母W303-1a的基因型为MATa ade2-1 can1-100 ura3-1 leu2-3,112his3-11,15。
根据本发明优选的，所述乳糖透性酶为来自克鲁维斯酵母的乳糖透性酶，其编码基因为Lac12，Genbank登录号为X06997.1。
根据本发明优选的，所述GDP-甘露糖脱氢酶为来自大肠杆菌K12的GDP-甘露糖脱氢酶，其编码基因为Gmd，Genbank登录号为WP_182915037.1。
根据本发明优选的，所述GDP-岩藻糖合成酶为来自大肠杆菌K12的GDP-岩藻糖合成酶，其编码基因为WcaG，Genbank登录号为WP_000043654.1。
根据本发明优选的，所述α-1,3-岩藻糖基转移酶为来自Neobacillus cucumis的α-1,3-岩藻糖基转移酶，其编码基因为Fut3Bc，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该酶的密码子经过优化设计，使其更适应酿酒酵母。
上述基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)将克鲁维斯酵母的乳糖透性酶基因Lac12***载体质粒pRS304中，构建表达载体pRS304-Lac12；
(2)将大肠杆菌K12的GDP-甘露糖脱氢酶基因Gmd和GDP-岩藻糖合成酶基因WcaG一起***载体质粒pRS306中，构建表达载体pRS306-Gmd-WcaG；
(3)将Neobacillus cucumis的α-1,3-岩藻糖基转移酶基因Fut3Bc***载体质粒pRS305中，构建表达载体pRS305-Fut3Bc；
(4)将表达载体pRS304-Lac12、pRS306-Gmd-WcaG和表达载体pRS305-Fut3Bc依次转化进酿酒酵母W303-1a中，挑选阳性重组子，得基因工程菌FL303。
根据本发明优选的，所述基因工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：
(1)以克鲁维斯酵母基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到乳糖透性酶Lac12，PCR引物序列如下：
gal1-LAC12-F：5′-GAAAAAACCCATGGCAGATCA TTCG-3′，
LAC12-cyc1-R：5′-AATTACATGATTAAACAGATTCTGCCTC-3′；
再通过融合PCR，以半乳糖诱导型启动子Pgal1和终止子Tcyc1构建表达盒Pgal1-lac12-Tcyc1，最后通过无缝融合将表达盒Pgal1-lac12-Tcyc1与pRS304连接，得到pRS304-Lac12质粒；
(2)以大肠杆菌K12基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到GDP-甘露糖脱氢酶Gmd和GDP-岩藻糖合成酶WcaG，PCR引物序列如下：
10-Gmd-F：5′-ACCTCATGTCAAAAGTCGCTCTCATCAC-3′，
Gmd-cyc-R：5′-CGGATTTATGACTCCAGCGCGATC-3′；
adh-WcaG-F：5′-CTCTGGCTTACCCCCGAAAGCGGTCTT-3′，
WcaG-10-R：5′-CGACGATAAGATGAGTAAACAACGAGTTTTTATTGCTG-3′；
再通过融合PCR，以半乳糖双向诱导型启动子Pgal1,10构建双向表达盒，最后通过无缝融合将双向表达盒与pRS306连接，得到pRS306-Gmd-WcaG质粒；
(3)人工合成密码子经过优化设计的α-1,3-岩藻糖基转移酶基因Fut3Bc，然后以该基因为模板进行PCR扩增，得到α-1,3-岩藻糖基转移酶Fut3Bc，PCR引物序列如下：
Fut3Bc-F：5′-GTCAAGGAGAAAAAACCCATGAAACCAAAAATTAAAATT-3′，
Fut3Bc-R：5′-TGACATAACTAATTACATGATTATCTTCTATCAATTTTTC-3′；
再通过融合PCR，以半乳糖诱导型启动子Pgal1和终止子Tcyc1构建表达盒Pgal1-fut3Bc-Tcyc1，最后通过无缝融合将表达盒Pgal1-fut3Bc-Tcyc1与pRS305连接，得到pRS305-Fut3Bc质粒；
(4)将步骤(1)得到的pRS304-Lac12质粒转化进酿酒酵母W303-1a中，得到菌株FL01；然后将步骤(2)得到的pRS306-Gmd-WcaG质粒转化进菌株FL01中，得到菌株FL03；最后将pRS305-Fut3Bc质粒转化进菌株FL03中，挑选阳性重组子，得基因工程菌FL303。
上述基因工程菌在生产3-岩藻糖基乳糖中的应用。
根据本发明优选的，所述应用是以乳糖和半乳糖为底物发酵生产3-岩藻糖基乳糖，具体生产工艺如下：
将上述基因工程菌在LB固体培养基上活化，挑取活化后的单菌落接种至YNB液体培养基中培养24h，然后将培养液转接至YPAD液体培养基中，调整初始接种量使发酵液的初始OD为0.25～0.35，在30℃、200r/min培养24h，补加25～35g/L半乳糖以及1～3g/L乳糖继续发酵，生产3-岩藻糖基乳糖。
其中，所述YNB液体培养基组成为：5g/L(NH4)2SO41.7 g/L Yeast Nitrogen Base(购自生工)，20g/L葡萄糖。
所述YPAD液体培养基组成为：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物20g/L葡萄糖，0.06g/L腺嘌呤硫酸盐。
本发明的有益效果：
本发明在酿酒酵母中同时表达了乳糖透性酶、GDP-甘露糖脱氢酶、GDP-岩藻糖合成酶和α-1,3-岩藻糖基转移酶，构建了新的基因工程菌，由于α-1,3-岩藻糖基转移酶Fut3Bc为优化过的密码子，合成3-FL的效率更高，且更加适合在酿酒酵母中表达，因此在使用该工程菌以乳糖和半乳糖为底物发酵生产3-FL时，极大地提高了3-FL的产量，产量可达0.93g/L，是已报道的常用合成3-FL的α-1,3-FT FutA菌株的5.4倍，为3-FL的工业化合成提供了重要参考和指导。
附图说明
图1为α-1，3-岩藻糖基转移酶FutA、Fut3和Fut3Bc序列比对分析图和氨基酸序列比对图(A)α-1，3-岩藻糖基转移酶进化树分析图(B)，来源于H.pylori 26695的α-1，2-岩藻糖基转移酶FutC为对照。
图2为表达不同生物来源α-1,3-岩藻糖基转移酶的基因工程菌PCR验证。
图3为表达不同生物来源α-1,3-岩藻糖基转移酶的基因工程菌中3-FL产量。
图4为菌株FL303发酵产物LC-MS分析图。
图5为菌株FL303发酵产物的1H-NMR分析图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂及药品，若无特殊说明，均为普通市售产品；实施例中涉及的实验操作，若无特殊说明，均为本领域常规操作。
本发明中使用的酿酒酵母W303-1a为普通市售菌种，可从微生物保藏中心或菌种销售公司购得。
实施例1：菌株FL01的构建
1、以酿酒酵母基因组DNA为模板进行扩增，得到半乳糖诱导型启动子Pgal1(BamHI-GAL1-F/GAL1-LAC12-R)和终止子Tcyc1的序列(lac12-CYC1-F/CYC1-XhoI-R)，PCR引物序列具体如下：
BamHI-GAL1-F：5′-GCTCTAGAACTAGTGCGCGGATCCAGTACGGATTA GAAG-3′，
GAL1-LAC12-R：5′-GATCTGCCATGGGTTTTTTCTCCTT-3′；
lac12-CYC1-F：5′-ATCTGTTTAATCATGTAATTAGTTATGTCACG-3′，
CYC1-XhoI-R：5′-GTACCGGGCCCCCCCCCGCTCGAGGCAAATTAAAGCCTT-3′。
使用购自Vazyme的高保真DNA聚合酶Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase进行PCR扩增，PCR扩增体系按照该试剂盒说明书配制。
PCR扩增程序：预变性95℃3min，变性95℃15s，复性55℃15s，延伸72℃1min/kb，30个循环，后延伸72℃5min，12℃保存。
所述启动子Pgal1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述终止子Tcyc1的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2、以克鲁维斯酵母基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到乳糖透性酶Lac12序列，PCR引物序列具体如下：
gal1-LAC12-F：5′-GAAAAAACCCATGGCAGATCA TTCG-3′，
LAC12-cyc1-R：5′-AATTACATGATTAAACAGATTCTGCCTC-3′；
使用购自Vazyme的高保真DNA聚合酶Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase进行PCR扩增，，PCR扩增体系按照该试剂盒说明书配制。
PCR扩增程序：预变性95℃3min，变性95℃15s，复性55℃15s，延伸72℃1min/kb，30个循环，后延伸72℃5min，12℃保存
3、以Vazyme的高保真DNA聚合酶Phanta Super-Fidelity DNA PolymerasePCR试剂盒为基础，将启动子Pgal1、Lac12序列和终止子Tcyc1以1：3：1的摩尔比添加至PCR体系中作为模板进行融合PCR，得到融合片段1。然后通过融合PCR，以融合片段1、启动子Pgal1和终止子Tcyc1构建表达盒Pgal1-lac12-Tcyc1。最后通过以T5外切酶为基础的无缝融合方法，将表达盒Pgal1-lac12-Tcyc1与pRS304连接，得到pRS304-Lac12质粒。
所述无缝融合方法可参考文献：Xia Y,Li K,Li J,Wang T,Gu L,Xun L.T5exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloningand site-directed mutagenesis.Nucleic acids research.2018；47:e15-e15。
将pRS304-Lac12质粒以限制性内切酶Bsu36I线性化后，通过醋酸锂转化法转入酿酒酵母W303-1a中，通过色氨酸缺陷的YNB固体培养基筛选得到阳性克隆，进一步PCR验证后，所得到的正确转化子命名为FL01。
本实施例得到的菌株FL01可以吸收胞外添加的乳糖。
实施例2：菌株FL03的构建
以酿酒酵母W303-1a基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到ADH1t序列(SacI-ADH1-F/ADH1-wcaG-R)、半乳糖双向诱导型启动子Pgal1,10(wcag-10-F/10-gmd-R)和CYC1t序列；以大肠杆菌K12基因组为模板进行PCR扩增，GDP-甘露糖脱氢酶Gmd序列(10-Gmd-F/Gmd-cyc-R)和GDP-岩藻糖合成酶WcaG序列(adh-WcaG-F/WcaG-10-R)。PCR引物序列具体如表1所示。
表1
使用购自Vazyme的高保真DNA聚合酶Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase进行PCR扩增，PCR扩增体系按照该试剂盒说明书配制。
PCR扩增程序：预变性95℃3min，变性95℃15s，复性55℃15s，延伸72℃1min/kb，30个循环，后延伸72℃5min，12℃保存。
所述启动子Pgal，10的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
将Gmd序列，启动子Pgal，10，WcaG序列以1：3：1的摩尔比添加至PCR体系中作为模板进行融合PCR，得到融合片段2。再将ADH1t序列、融合片段2和CYC1t序列以1：3：1的摩尔比添加至PCR体系中作为模板进行融合PCR，得到融合片段Pgal1，10-gmd-wcaG。然后通过融合PCR，以融合片段Pgal1，10-gmd-wcaG和半乳糖双向诱导型启动子Pgal1,10构建双向表达盒。最后通过以T5外切酶为基础的无缝融合方法将双向表达盒与pRS304连接，得到pRS306-Gmd-WcaG质粒。
将pRS306-Gmd-WcaG质粒以限制性内切酶NcoI线性化后，通过醋酸锂转化法转入菌株FL01中，通过色氨酸缺陷的YNB固体培养基筛选得到阳性克隆，进一步PCR验证后，所得到的正确转化子命名为FL03。
本实施例得到的菌株FL03可以吸收胞外的乳糖，同时可以以胞内的GDP-甘露糖为底物，合成GDP-岩藻糖。
实施例3：基因工程菌FL303的构建
1、发明人将人源的α-1,3-岩藻糖基转移酶基因Fut3和幽门螺杆菌来源的α-1,3-岩藻糖基转移酶基因FutA模板在NCBI数据库中进行比对，挖掘到了未报道的Neobacilluscucumis来源的基因Fut3Bc。NCBI Blast分析结果显示三者均属于GT10超家族，生物信息学预测基因Fut3Bc具有α-1，3-岩藻糖基转移酶的活性。Fut3Bc与人源的Fut3的氨基酸序列一致性仅为18.53％，而与H.pylori来源的FutA氨基酸序列一致性为36.43％(图1)。将以上蛋白的DNA序列进行密码子优化并在金唯智公司合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。该酶的密码子经过优化设计，使其更适应酿酒酵母。
然后分别以人源的α-1,3-岩藻糖基转移酶基因Fut3(SEQ ID NO.2)、幽门螺杆菌来源的α-1,3-岩藻糖基转移酶基因FutA(SEQ ID NO.3)为和密码子优化后的基因Fut3Bc(SEQ ID NO.1)为模板进行PCR扩增，分别扩增得到乳糖透性酶Fut3序列(Fut3 human-F/R)、FutA序列(FutA Hp-F/R)和Fut3Bc序列(Fut3Bc-F/R)；以酿酒酵母基因组DNA为模板进行扩增，得到启动子Pgal1(引物为pRS305-XbaI-gal1p-F/gal1p-R)和终止子Tcyc1序列(引物为cyc1t-F/pRS305-HindIII-Cyc1t-R)；具体PCR引物如表2所示。
使用购自Vazyme的高保真DNA聚合酶Phanta Super-Fidelity DNAPolymerase进行PCR扩增，PCR扩增体系按照该试剂盒说明书配制
PCR扩增程序：预变性95℃3min，变性95℃15s，复性55℃15s，延伸72℃1min/kb，30个循环，后延伸72℃5min，12℃保存
将启动子Pgal1，相应的α-1，3-糖基转移酶(Fut3、FutA和Fut3BC)和终止子Tcyc1以1：3：1的摩尔比添加在PCR体系中进行融合PCR，分别得到融合片段4、5、6。然后通过融合PCR，以融合片段4、5、6、启动子Pgal1和终止子Tcyc1分别构建表达盒Pgal1-fut3-Tcyc1、Pgal1-futA-Tcyc1和Pgal1-fut3Bc-Tcyc1，最后通过以T5外切酶为基础的无缝融合方法将表达盒表达盒Pgal1-fut3-Tcyc1、Pgal1-futA-Tcyc1和Pgal1-fut3Bc-Tcyc1分别与pRS304连接，得到pRS305-Pgal1-fut3-Tcyc1、pRS305-Pgal1-futA-Tcyc1和pRS305-Pgal1-fut3Bc-Tcyc1质粒。
表2
将pRS305-Pgal1-fut3-Tcyc1、pRS305-Pgal1-futA-Tcyc1和pRS305-Pgal1-fut3Bc-Tcyc1质粒以转入菌株FL03中，分别获得基因工程菌FL301(表达Fut3)，FL302(表达FutA)和FL303(表达Fut3Bc)，具体操作方法如下：
将pRS305-Pgal1-fut3-Tcyc1、pRS305-Pgal1-futA-Tcyc1和pRS305-Pgal1-fut3Bc-Tcyc1质粒以限制性内切酶BspTI酶进行酶切，通过胶回收获得线性化载体。将菌株FL03在色氨酸、尿嘧啶缺陷的酵母SC液体培养基中过夜培养至OD为0.6～0.8，收集菌体，以醋酸锂转化法分别将线性化的岩藻糖基转移酶载体转化入FL03，涂布于色氨酸、尿嘧啶和亮氨酸缺陷的酵母SC固体培养基上。待平板上长出转化子后，挑取转化子于对应营养缺陷的酵母SC液体培养基中，待菌株生长24h后，提取基因组DNA进行PCR验证，验证引物为pRS305-XbaI-gal1p-F和pRS305-HindIII-Cyc1t-R，将验证为阳性(图2)的菌株进行保藏，得到重组菌株FL301、FL302和FL303。
实施例4：重组菌株FL301、FL302和FL303合成3-岩藻糖基乳糖能力检测
1、3-岩藻糖基乳糖的发酵生产
发酵：将所保藏的菌株FL301、FL302和FL303接种于试管中，转接至带有20mL YPAD液体培养基(YP培养基，2％葡萄糖，0.06g/L腺嘌呤硫酸盐)的100mL三角瓶中，调整初始接种量使发酵液的初始OD为0.2。将摇瓶置于摇床中30℃下振荡(200rpm)培养。发酵24h后，补加30g/L半乳糖以及2g/L乳糖，继续发酵至96h，其中48h和72h时分别添加10g/L半乳糖，并取样进行检测。
发酵样品处理：收集1mL发酵液，6000×g离心8min，取上清以0.22μM微孔滤膜过滤，得到胞外样品。剩余的菌体以1mL蒸馏水洗2次后，加入与菌体等量的玻璃珠，1mL蒸馏水，均质器中6000rpm，45s循环5次，破碎细胞。将细胞破碎液13000×g离心10min，取上清，0.22μM微孔滤膜过滤后得到胞内样品。
发酵样品检测：使用岛津(Shimadzu)液相色谱仪进行检测。将待检测胞内外样品转移至液相小瓶中，分析时进样量为15μL。使用Rezex ROA-Organic Acid H+(8％)column(Phenomenex,Torrance,CA,USA)色谱柱进行检测，分析时柱温50℃，流动相为0.005NH2SO4，流速0.6mL/min。在此条件下，3-FL保留时间为约7.8min。
产量分析：以3-FL标准品峰面积为依据，对不同菌株中3-FL产量进行计算，结果如图3所示。由图3可知，表达人源α-1,3-岩藻糖基转移酶基因Fut3的菌株FL301中未检测到3-FL合成，表达α-1,3-岩藻糖基转移酶基因FutA的菌株FL302可合成少量的3-FL，胞内外总产量为约0.17g/L，其中胞内3-FL为0.12g/L，占总产量的71％；而表达本发明基因Fut3Bc的菌株FL303中3-FL总产量约为0.93g/L，其中胞内3-FL产量为约0.52g/L，占总产量的56％。FL303中的3-FL产量为FL302的5.4倍。
2、基因工程菌FL303发酵产物的鉴定
表达基因Fut3Bc的菌株FL303中虽然3-FL产量较高，但Fut3Bc为未报道的α-1,3-岩藻糖基转移酶，其在酿酒酵母中的催化产物虽然与3-岩藻糖基乳糖标准品HPLC中保留时间一致，以下实验进一步验证了FL303菌株中所检测到的产物结构，确认Fut3Bc的催化产物为3-岩藻糖基乳糖。
液质联用分析：将所得到的3-FL发酵胞外样品在液质联用分析仪(LTQ-Orbitrapvelos pro ETD)中进行分析，使用Rezex ROA-Organic Acid H+(8％)column(Phenomenex,Torrance,CA,USA)色谱柱进行检测，分析时柱温50℃，流动相为0.005M甲酸，流速0.6mL/min。在与3-FL保留时间一致的7.8min处，存在与3-FL分子量一致的[M+Na]+＝511.1629(图4)，这初步验证了表达Fut3Bc催化所得产物为3-FL。
1H-核磁共振分析：首先从FL303发酵样品中提取推测为3-FL的产物纯品。在发酵液中加入九倍体积预冷的乙醇，持续搅拌2h使溶液内的糖充分沉淀。随后将该混合液离心，所得到的沉淀充分混悬于3mL蒸馏水中，离心后取上清，得到混合的糖溶液。随后将混合糖溶液加在分子筛中，以10mM NH4HCO3进行洗脱，流速为约0.6mL/min，在1.5h后使用自动收集器收集，每隔5min收集一管，通过TLC检测确定3-FL的分布管数后，将仅含有3-FL管内溶液合并后冻干，得到3-FL产物纯品。将冻干的2’-FL纯品溶于600μL重水D2O中，冻干，反复溶解冻干3次后，再次溶于600μL D2O，加入0.1μL丙酮作为化学位移内参物，将溶液转移至核磁管中，用于核磁共振分析。产物的氢谱如图5所示。由图5可知，其特征峰的化学位移与3-FL标准品一致，证明了FutBc在酿酒酵母中的催化产物为3-FL。
Claims (10)
1.一株高产3-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌同时表达乳糖透性酶、GDP-甘露糖脱氢酶、GDP-岩藻糖合成酶和α-1,3-岩藻糖基转移酶。
2.如权利要求1所述的高产3-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为重组的酿酒酵母，所述酿酒酵母为酿酒酵母W303-1a。
3.如权利要求1所述的高产3-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，所述乳糖透性酶为来自克鲁维斯酵母的乳糖透性酶，其编码基因为Lac12，Genbank登录号为X06997.1。
4.如权利要求1所述的高产3-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，所述GDP-甘露糖脱氢酶为来自大肠杆菌K12的GDP-甘露糖脱氢酶，其编码基因为Gmd，Genbank登录号为WP_182915037.1。
5.如权利要求1所述的高产3-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，所述GDP-岩藻糖合成酶为来自大肠杆菌K12的GDP-岩藻糖合成酶，其编码基因为WcaG，Genbank登录号为WP_000043654.1。
6.如权利要求1所述的高产3-岩藻糖基乳糖的基因工程菌，其特征在于，所述α-1,3-岩藻糖基转移酶为来自Neobacillus cucumis的α-1,3-岩藻糖基转移酶，其编码基因为Fut3Bc，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
7.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将克鲁维斯酵母的乳糖透性酶基因Lac12***载体质粒pRS304中，构建表达载体pRS304-Lac12；
(2)将大肠杆菌K12的GDP-甘露糖脱氢酶基因Gmd和GDP-岩藻糖合成酶基因WcaG一起***载体质粒pRS306中，构建表达载体pRS306-Gmd-WcaG；
(3)将Neobacillus cucumis的α-1,3-岩藻糖基转移酶基因Fut3Bc***载体质粒pRS305中，构建表达载体pRS305-Fut3Bc；
(4)将表达载体pRS304-Lac12、pRS306-Gmd-WcaG和表达载体pRS305-Fut3Bc依次转化进酿酒酵母W303-1a中，挑选阳性重组子，得基因工程菌FL303。
8.如权利要求7所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)以克鲁维斯酵母基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到乳糖透性酶Lac12，PCR引物序列如下：
gal1-LAC12-F：5′-GAAAAAACCCATGGCAGATCATTCG-3′，
LAC12-cyc1-R：5′-AATTACATGATTAAACAGATTCTGCCTC-3′；
再通过融合PCR，以半乳糖诱导型启动子Pgal1和终止子Tcyc1构建表达盒Pgal1-lac12-Tcyc1，最后通过无缝融合将表达盒Pgal1-lac12-Tcyc1与pRS304连接，得到pRS304-Lac12质粒；
(2)以大肠杆菌K12基因组为模板进行PCR扩增，扩增得到GDP-甘露糖脱氢酶Gmd和GDP-岩藻糖合成酶WcaG，PCR引物序列如下：
10-Gmd-F：5′-ACCTCATGTCAAAAGTCGCTCTCATCAC-3′，
Gmd-cyc-R：5′-CGGATTTATGACTCCAGCGCGATC-3′；
adh-WcaG-F：5′-CTCTGGCTTACCCCCGAAAGCGGTCTT-3′，
WcaG-10-R：5′-CGACGATAAGATGAGTAAACAACGAGTTTTTATTGCTG-3′；
再通过融合PCR，以半乳糖双向诱导型启动子Pgal1,10构建双向表达盒，最后通过无缝融合将双向表达盒与pRS306连接，得到pRS306-Gmd-WcaG质粒；
(3)人工合成密码子经过优化设计的α-1,3-岩藻糖基转移酶基因Fut3Bc，然后以该基因为模板进行PCR扩增，得到α-1,3-岩藻糖基转移酶Fut3Bc，PCR引物序列如下：
Fut3Bc-F：5′-GTCAAGGAGAAAAAACCCATGAAACCAAAAATTAAAATT-3′，
Fut3Bc-R：5′-TGACATAACTAATTACATGATTATCTTCTATCAATTTTTC-3′；
再通过融合PCR，以半乳糖诱导型启动子Pgal1和终止子Tcyc1构建表达盒Pgal1-fut3Bc-Tcyc1，最后通过无缝融合将表达盒Pgal1-fut3Bc-Tcyc1与pRS305连接，得到pRS305-Fut3Bc质粒；
(4)将步骤(1)得到的pRS304-Lac12质粒转化进酿酒酵母W303-1a中，得到菌株FL01；然后将步骤(2)得到的pRS306-Gmd-WcaG质粒转化进菌株FL01中，得到菌株FL03；最后将pRS305-Fut3Bc质粒转化进菌株FL03中，挑选阳性重组子，得基因工程菌FL303。
9.权利要求1所述的基因工程菌在生产3-岩藻糖基乳糖中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用是以乳糖和半乳糖为底物发酵生产3-岩藻糖基乳糖，具体生产工艺如下：
将权利要求1所述的基因工程菌在LB固体培养基上活化，挑取活化后的单菌落接种至YNB液体培养基中培养24h，然后将培养液转接至YPAD液体培养基中，调整初始接种量使发酵液的初始OD为0.25～0.35，在30℃、200r/min培养24h，补加25～35g/L半乳糖以及1～3g/L乳糖继续发酵，生产3-岩藻糖基乳糖；
其中，所述YNB液体培养基组成为：5g/L(NH4)2SO41.7g/L Yeast Nitrogen Base(购自生工)，20g/L葡萄糖；
所述YPAD液体培养基组成为：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物20g/L葡萄糖，0.06g/L腺嘌呤硫酸盐。
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