CN115798588A

CN115798588A - 一种基于生物信息学手段进行可促进乌拉尔甘草根部活性产物积累的内生菌理性筛选方法

Info

Publication number: CN115798588A
Application number: CN202210020900.7A
Authority: CN
Inventors: 胡冰; 李春; 刘子迪; 李楠楠
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT
Priority date: 2022-01-10
Filing date: 2022-01-10
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2042-01-10
Also published as: CN115798588B

Abstract

本发明提供了一种基于生物信息学手段进行可促进乌拉尔甘草根部活性产物积累的内生菌理性筛选方法，所述方法先通过对我国西北八地采集的42株乌拉尔甘草对应的环境因子数据、内生菌群落结构、甘草根部天然产物成分的Spearman关联性分析中识别可能具有促进甘草活性产物积累作用的34个内生菌属。再利用特定培养基，从甘草根部分离培养目标内生菌。利用上述方法，发明人分离出一株根瘤菌菌株Rhizobium rhizolycopersici GHU21，通过甘草幼苗盆栽实验，发明人证明R.rhizolycopersici GHU21可促进甘草植株生长，同时促进其根部异甘草苷和甘草酸的积累，且促进效果在较低温度（21̊C）和较高浇水量（1000 mL/we）时较为显著，这些结果有效验证了上述理性筛选方法的可行性。

Description

一种基于生物信息学手段进行可促进乌拉尔甘草根部活性产物积累的内生菌理性筛选方法

技术领域

本发明涉及生物信息学、农学、微生物学领域，具体涉及通过对甘草取样地环境因子、根部内生菌群落结构、根部黄酮类物质组成的生物信息学分析，结合经典的微生物分离培养方法，筛选出可促进甘草根部活性产物积累的内生菌。

背景技术

甘草适宜生长于干旱、半干旱砂质土壤中，其根茎发达、入土深，可用于防风固沙，对我国西北地区有重要的生态意义；同时，甘草根部富含萜类和黄酮类天然产物，大多具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗抑郁等药用功效，因此广泛应用于医药行业。但是，不断攀升的市场需求导致了我国野生甘草资源濒临枯竭。我国已于2000年将甘草列为了国家紧控物资，禁止随意采挖、销售野生甘草及其制品。因此，人工栽培种植成为了甘草植株及其活性成分提取制品的主要来源。我国主要种植的是乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensisFisch.)，其根部甘草酸和甘草黄酮类物质的含量相对较高。

目前，乌拉尔甘草人工种植技术尚不成熟，面临种植周期长、根茎品质低、易染病烂根等问题。甘草类药用植物中的有效成分积累由甘草根部组织的代谢决定，而植物根内代谢通常与根际内生菌群落关联，尤其是内生菌。植物内生菌是一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌，普遍存在于高等植物，如木本、草本、单子叶植物和双子叶植物细胞或细胞间隙中。甘草内含有大量值得探索的内生菌，例如前人在新疆干旱地区采挖的野生甘草中分离出116株内生菌，其中芽孢杆菌属细菌和无镉菌属真菌可有效提高乌拉尔甘草根中三萜类化合物——甘草酸的含量。另外，有研究表明乌拉尔甘草内生菌群落结构会受到环境因素影响，进而影响植物宿主次级代谢产物的积累。因此，可筛选甘草内生菌，利用环境因子——内生菌——甘草相互作用来有效提高植物次级代谢产物的积累。目前，人们主要是通过传统的环境微生物分离纯化、盆栽实验或植物组织培养实验来获取特定功能的土壤微生物，上述方法面临筛选效率低、成本高、机理不清晰等问题。因此，该领域亟待开发一种内生菌理性筛选方法，以及相应的植株培养策略，以实现内生菌促进乌拉尔甘草次级代谢产物积累的作用。

发明内容

为解决上述问题，本发明开发了一种基于生物信息学手段进行可促进乌拉尔甘草根部活性产物积累的内生菌理性筛选方法。

本发明采取的技术方案如下：首先，对从我国西北地区多地采集的乌拉尔甘草根系微生物群落进行16s rDNA扩增子测序后分析细菌群落结构，并与环境因子和甘草根部黄酮类代谢物含量联立后分析其相互关联，找出与环境因子或甘草次级代谢产物含量显著相关的内生菌。然后，利用特定培养基从甘草根部分离出目标菌属，并结合其与环境因子的关系，建立可有效提升乌拉尔甘草根部次级代谢产物积累的植物培养策略。

所述生物信息学分析方法发现甘草根系土壤温度与湿度对其根部内生菌群落结构及异甘草苷含量有显著影响，其中土壤温度为负相关、土壤湿度为正相关。基于上述关联关系，本发明从采集的乌拉尔甘草内生细菌群落中识别到34个符合上述相关性规律，即与异甘草苷正相关、与土壤湿度正相关、与土壤温度负相关的内生菌属。

本发明针对上述34个内生细菌属设计了10种筛选培养基(含微量甘草根粉末)，然后利用上述固体培养基富集到了1个目标属的内生菌，通过16s rDNA保守序列扩增并测序定性后命名为Rhizobium rhizolycopersici GUH21，其菌种保藏号为CGMCC No:24152。

参考本发明中生物信息学分析方法提供的内生菌与土壤温度、土壤湿度、根部异甘草苷含量的相关性，本发明设计了植株培养策略，将发明所述内生菌R.rhizolycopersici GUH21施加至人工栽培的乌拉尔甘草幼苗盆栽中(含无菌基质)，并设置两种环境温度(26℃和21℃)、两种浇水量(1000mL/周和800mL/周)，设置空白对照组与施加菌剂组。通过两个月的接种后，测定甘草生长参数，并检测甘草根中的活性产物含量。结果显示，在温度较低、浇水量较高的条件下，接种了R.rhizolycopersici GUH21的乌拉尔甘草植株的根直径为5.27±1.18cm，比未施加菌剂组及其他培养条件组显著增加至少2.30倍；同时，根中异甘草苷含量为0.95±0.20mg/g、甘草酸含量为5.43±1.06mg/g，比未施加菌剂组及其他培养条件组显著提升至少2.21 倍和1.76倍。

菌种保藏名称：GUH21

保藏号：CGMCC No:24152

分类命名：根瘤菌

拉丁名：Rhizobium rhizolycopersici

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2021年12月20日

附图说明

图1为乌拉尔甘草采样点分布图

图2为甘草盆栽实验结果中甘草生长参数结果图

图3为甘草盆栽实验结果中甘草次级代谢产物结果图

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明。

实验所用的磷酸、乙腈均为HPLC级，由市场购入。

1.乌拉尔甘草根及根际土采样

根据前期文献调研，于2020年6月前往我国的乌拉尔甘草主产地宁夏省盐池、宁夏省红寺堡、甘肃省民勤、甘肃省酒泉、甘肃省张掖、甘肃省榆中、内蒙古自治区杭锦旗进行乌拉尔甘草主根及根际土采样工作(图1)，并在每个采样点记录当地经纬度、海拔高度，将采集的甘草根表面清洗消毒、标记后，连同土壤样品一起置于冰盒，干冰保存邮寄至实验室进行后续实验。

2.土壤理化性质检测

取5g左右土壤进行干燥处理，记录干燥前的土壤质量w₀，对干燥后的土壤进行称重，记录土壤干重 w₀’，按公式1计算土壤湿度(Moisture)：

对烘干后的土壤进行无机碳去除实验，即使用1mol/L的盐酸处理干燥后土壤，直到不产生气泡为止，再次烘干土壤，记录反应后质量w₁，使用元素分析仪(Eurovecter Spa,EA3000)分析无机碳去除前后的土壤样品，获得土壤中总碳(TC)、总氮(TN)、有机碳(OC)元素相对含量f_C、f_N、f_OC，通过下面的公式计算出土壤总碳含量(TC)，通过公式3计算土壤总氮含量(TN)，通过公式4计算出土壤有机碳含量(OC)：

TC(mg/g)＝f_C (2)

TN(mg/g)＝f_N (3)

3.甘草根部活性产物含量检测

取少量甘草根冷冻干燥后研磨成粉末，取约2g冻干后的甘草根样品，用少量70％乙醇超声20min进行活性物质抽提，抽提液体变为棕黄色后倒入100mL容量瓶中，重复上述步骤，直至乙醇液体无明显颜色变化，用70％无水乙醇定容至100mL。然后，利用高效液相色谱(HPLC)对抽提液进行物质分离与定量检测。色谱检测条件包括：色谱柱Agilent ZorboaxODS3-C18(250*4.6mm，5um)；流动相为0.05％磷酸和乙腈；体积流量为1mL/min；检测波长为380nm、254nm；温度为40℃。

4.DNA提取和PCR扩增

取少量冻存的甘草根，根据

soil DNA kit(Omega Bio-Tek，Norcross，GA，U.S.A)说明书进行内生菌群落总DNA提取。使用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，并使用NanoDrop2000测定DNA浓度和纯度。使用16s rDNA常用引物799F(AACMGGATTAGATACCCKG)和1193R (ACGTCATCCCCACCTTCC)对提取物中16S rDNA基因进行PCR扩增。PCR反应体系为：5×TransStart FastPfu缓冲液4μL，2.5mM dNTPs 2μL，上游引物(5uM)0.8μL，下游引物(5uM)0.8μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4μL，模板DNA 10ng，ddH₂O补足至20μL。每个样本3个重复。扩增程序如下： 95℃预变性3min，27个循环(95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s)，然后72℃稳定延伸10min，最后在4℃进行保存。

5.甘草根内生菌16s rDNA扩增子测序

将同一样本的PCR产物混合后使用2％琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNAGel Extraction Kit(Axygen Biosciences，Union City，CA，U.S.A)进行回收产物纯化。然后，用2％琼脂糖凝胶电泳进行回收DNA质量检测，并用Quantus^TM Fluorometer(Promega，Madison，WI，USA)对回收产物进行定量检测。使用NEXTflex^TM Rapid DNA-Seq Kit(BiooScientific，Austin，TX，U.S.A)进行建库:(1)接头链接； (2)使用磁珠筛选去除接头自连片段；(3)利用PCR扩增进行文库模板的富集；(4)磁珠回收PCR产物得到最终的文库。利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。使用UPARSE软件(http://drive5.com/uparse/，version 7.1)，根据97％的相似度对序列进行操作分类单元(OTU)聚类并剔除嵌合体。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/，version 2.2)对每条序列进行物种分类注释，比对Silva 16S rRNA数据库(version 138)，设置比对阈值为70％。扩增子测序后的原始数据已上传至国家微生物科学数据中心，数据登记号为NMDC4001443。

6.生物信息学分析

记录采样点环境因子数据，将所测得的环境因子(如土壤温度、土壤湿度、土壤总碳及有机碳含量、土壤总氮含量，等)与甘草根部次级代谢产物含量进行线性拟合。结果发现活性产物含量异甘草苷与土壤温度负相关性最强、与土壤湿度正相关性最大(表1)。同时，利用R Project软件(v3.6.2)的stats 程序包对内生菌群落组成的影响因素判别时，发现上述两个环境因子显著影响了样品乌拉尔甘草内生细菌群落结构。因此，推断土壤温度、湿度可能通过内生菌影响了乌拉尔甘草根部异甘草苷的积累。基于以上设想，发明中利用RProject软件的vegan程序包进行土壤温度、土壤湿度、异甘草苷含量与乌拉尔甘草内生菌丰度的Spearman关联性分析，以期得到与异甘草苷正相关、与土壤湿度正相关、与土壤温度负相关的目标内生菌，筛选结果与相关性系数如表2所示，共获得34个内生菌属，大大减小了筛选范围。

7.内生菌的分离与鉴定

参考德国微生物国家菌种保藏中心DSMZ的菌种保藏培养基列表(https://www.dsmz.de/)，根据目标菌株的生长特性，得到目标种属微生物的最佳生长培养基，并在培养基中添加冻干甘草根粉末，使内生菌更适应培养基生长特性，能够加快生长，更易从甘草根中分离纯化。具体操作如下：取新鲜的乌拉尔甘草根，自来水冲洗干净置超净台晾干，取其中没有明显损伤的一段去皮，后续工作需在超净台上进行。用无菌刀切成0.5cm×0.5cm的小块。将处理过的甘草依次放在75％乙醇中浸泡1分钟，无菌水冲3次，5％次氯酸钠溶液浸泡5分钟，再用无菌水冲洗3次，用75％乙醇漂洗30s、无菌水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干表面水分。然后，利用内表面无菌的搅拌机将表面消毒后的新鲜甘草搅碎，再加入3mL无菌水。吸取200μL重悬液涂布在目标种属最佳生长培养基上，用于内生细菌的筛选，每种甘草做3个平行。另外吸取200μL最后用于清洗甘草的无菌水涂布于细菌固体培养基上用作对照，以检查甘草根部表面消毒是否彻底。用酒精灯外焰轻烧平板***再用封口膜封口。将上述平板置于30℃恒温培养箱中培养1～2天，将长出的菌落转接至对应液体培养基，30℃、200rpm振荡培养48h，用于菌种保藏和DNA提取。对分离得到的内生细菌菌株进行细菌保守区16S rDNA扩增及测序，以进行种属鉴定。所用引物是27F (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)、1492R(TACGGYTACCTTGTTAYGACTT)。PCR反应体系为2×Taqmix 7.5μL、ddH₂O 5.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL。

PCR产物经苏州金唯智生物科技有限公司Illumina MiSeq平台纯化并测序。PCR的反应条件：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，T_m55℃退火30秒，72℃延伸(1kb/15秒)，30个循环，72℃延伸7分钟，16℃保存。通过测序，发现筛选到的内生细菌中有一株目标菌株，为Rhizobium rhizolycopersici GUH21，其16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

8.甘草盆栽实验

在筛选到目标菌株以后，进行乌拉尔甘草盆栽实验，以期验证前期环境因子及目标内生菌对植物次级代谢产物积累的效果。实验中，乌拉尔甘草种子经过盐酸浸泡后，均匀播种至8盆含有无菌基质的盆栽中进行发芽培养。待盆栽发芽后，4盆甘草幼苗接种R.rhizolycopersici GUH21菌株，另外4盆为非接种对照组(CK)。然后各组4盆植株设定不同培养条件：21L(21℃、每周灌溉800mL无菌水)、21H(21℃、每周灌溉1000mL无菌水)、26L(26℃、每周灌溉800mL无菌水)、26H(21℃、每周灌溉1000mL无菌水)。在播种之前，所有花盆都要灌溉一次，以确保种子的正常萌发，然后在作物生长期间按照农艺实践定期浇水。2个月后，分别将甘草植株连根拔起，从盆栽中仔细采集植株，采用公制尺度测量不同的每根植株根长、根直径、主叶片面积和小叶面积等植株参数将植物样品置于80℃烘箱中烘干24小时，直至恒重，计算植物样品地上干重和地下干重部分。

9.甘草盆栽实验结果

经过60天的盆栽实验，在甘草植物生长活性方面：与相同培养条件下的对照组相比，接种R. rhizolycopersici GUH21可显著提高乌拉尔甘草植株的地上和地下部分生长量，以及甘草根部异甘草苷和甘草酸含量。在对照组中，温度设置为21℃、浇水量为1000mL/周比其他培养条件更利于次级代谢产物积累。上述培养条件与R.rhizolycopersici GUH21同时存在，可进一步促进甘草植株生长(图2)及根部甘草苷和甘草酸积累(图3)。21H接种内生菌组的根直径为5.27±1.18cm，显著高于其他组植株至少2.30倍；根中异甘草苷含量为0.95±0.20mg/g，比其他各组高至少2.21倍；根中甘草酸含量为5.43±1.06mg/g，比其他组显著提升至少1.76倍。因此，通过内生菌的筛选和定殖实验证明前期环境因素对乌拉尔甘草的影响，即在土壤温度相对较低、土壤湿度相对较高的条件下，内生细菌菌株R.rhizolycopersici GUH21处理的乌拉尔甘草植株生长及根部次级代谢产物积累效果最佳。

表1环境因子与乌拉尔甘草样品中异甘草苷含量的线性关系

表2土壤湿度、土壤温度及异甘草苷含量与内生菌丰度的Spearman相关性系数列表

以上内容对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定的实施方法，本领域技术人员可以在权利要求范围内做出修改，并不影响本发明的实质内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京理工大学

<120> 一种基于生物信息学手段进行可促进乌拉尔甘草根部活性产物积累的内生菌理性筛选方法

<130> 0

<140> 202210020900.7

<141> 2022-01-09

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<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1387

<212> DNA

<213> Rhizobium .sp

<400> 1

gctggcggcg gcttaccatg caagtcgagc gccccgcaag gggagcggca gacgggtgag 60

taacgcgtgg gaacgtaccc tttactacgg aatagctccg ggaaactgga attaataccg 120

tatgtgccct tcgggggaaa gatttatcgg taaaggatcg gcccgcgttg gattagctag 180

ttggtggggt aaaggcctac caaggcgacg atccatagct ggtctgagag gatgatcagc 240

cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga 300

caatgggcgc aagcctgatc cagccatgcc gcgtgagtga tgaaggcctt agggttgtaa 360

agctctttca ccggtgaaga taatgacggt aaccggagaa gaagccccgg ctaacttcgt 420

gccagcagcc gcggtaatac gaagggggct agcgttgttc ggaattactg ggcgtaaagc 480

gcacgtaggc gggtatttaa gtcaggggtg aaatcccaga gctcaactct ggaactgcct 540

ttgatactgg gtacctagag tatggaagag gtgagtggaa ttccgagtgt agaggtgaaa 600

ttcgtagata ttcggaggaa caccagtggc gaaggcggct cactggtcca ttactgacgc 660

tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa 720

cgatgaatgt tagccgtcgg gcagtttact gttcggtggc gcagctaacg cattaaacat 780

tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 840

agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgcaga accttaccag cccttgacat 900

cccgatcgcg gttagtggag acactatcct tcagttcggc tggatcggag acaggtgctg 960

catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1020

ctcgccctta gttgccagca ttcagttggg cactctaagg ggactgccgg tgataagccg 1080

agaggaaggt ggggatgacg tcaagtcctc atggccctta cgggctgggc tacacacgtg 1140

ctacaatggt ggtgacagtg ggcagcgaga ccgcgaggtc gagctaatct ccaaaagcca 1200

tctcagttcg gattgcactc tgcaactcga gtgcatgaag ttggaatcgc tagtaatcgc 1260

ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat 1320

gggagttggt tttacccgaa ggtagtgtgc taaccgcaag gaggcagcta accacggtag 1380

gtccgca 1387

Claims

1.一种基于生物信息学的甘草根系微生物筛选方法，其特征在于，先通过对我国西北多地区环境因子数据、内生菌群落结构、甘草根部天然产物成分的关联性分析，剖析出环境因子——内生菌群落——甘草次级代谢产物的互作关系，再根据该互作关系，从Spearman关联性网络中识别可能具有促进甘草活性产物积累作用的内生菌种属，最后，利用特定培养基从甘草根部分离培养目标内生菌种属，以减少相关功能内生菌的筛选工作量。

2.根据权利要求1所述筛选到的甘草内生菌菌株Rhizobium rhizolycopersici GHU21(菌种保藏号CGMCC No:24152)，其特征在于，利用130#最佳生长培养基，从采自内蒙古杭锦旗的乌拉尔甘草主根内部分离得到，该菌株接种到人工栽培的乌拉尔甘草幼苗并持续培养2个月后，植株生长参数、根部甘草素与甘草酸含量均显著增加。

3.权利要求2所述的R.rhizolycopersici GHU21在乌拉尔甘草植株培养中的促生及促根部活性产物积累的应用。