CN115786318A - 褐藻胶裂解酶截短体Algt1及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及褐藻胶裂解酶截短体Algt1及其应用,属于基因工程和酶工程领域,所述截短体Algt1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示,其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。本发明还提供包含所述基因的重组表达载体和重组菌株;本发明截短体Algt1的酶活和热稳定性相较于野生型褐藻胶裂解酶Algt都得到提升。Algt1的酶活为Algt的3.43倍。Algt 35℃水浴2h保留60.33%初始酶活,Algt1 35℃水浴2h后能保留75.36%初始酶活。Algt1具有良好的热稳定性和钠离子抗性。同时Algt1具有内切和外切双功能,截短体可以在底物浓度为20%的条件下,高效制备褐藻胶寡糖,主要产物是聚合度为1‑4的褐藻胶寡糖。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程领域,具体涉及一种褐藻胶裂解酶截短体Algt1及其应用。
背景技术
褐藻胶是一种存在于褐藻细胞壁及细胞间质的水溶性酸性多糖,由β-D-甘露糖醛酸(β-D-mannuronic acid,简称M)及其C5差向异构体α-L-古洛糖醛酸(α-L-guluronicacid,简称G)两种糖醛酸单体通过1,4糖苷键随机聚合而成。人工养殖的海带是褐藻胶的主要来源,我国的褐藻胶生产总量位居世界前列。褐藻胶具有较强的吸水性,可以用于食品增稠、乳化等方面。但由于褐藻胶分子量较大,难以直接被人体吸收,限制了其在食品行业的应用。与褐藻胶对比,其降解产物褐藻胶寡糖分子量低、易被人体吸收。褐藻胶寡糖的功效受其聚合度影响,聚合度为1-4的褐藻胶寡糖具有抗肥胖、抗氧化和调节脂质代谢的作用,因此定向制备特定聚合度的褐藻胶寡糖具有重要意义。
目前褐藻胶寡糖的制备方法分为化学降解法、物理降解法和酶解法。其中化学降解法只能将褐藻胶进行初步降解并且反应不易控制,耗时较长,反应后酸不易被除去;物理降解法设备耗能高、产物分子量高;相对而言,酶解法反应温和、绿色环保,能制备特定聚合度的褐藻胶寡糖,是一种极具应用前景的褐藻胶寡糖制备方法。褐藻胶的高粘度性质限制了褐藻胶裂解酶的流动性以及酶与底物结合的能力,同时褐藻胶的粘度随着温度上升而降低,所以具有高酶活和良好热稳定性的褐藻胶裂解酶在工业生产上能克服褐藻胶的高粘度性质并更好地发挥作用。在工业生产上,越高的底物浓度代表消耗更少的水电和更小的反应容器从而减少经济成本,所以能在高底物浓度条件下生产褐藻胶寡糖的方法是极具实际意义的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种褐藻胶裂解酶截短体,对比野生型褐藻胶裂解酶,该截短体的酶活和热稳定性均得到提升,在制备褐藻胶寡糖方面具有更好的应用潜力和价值。
为实现上述目的,本发明采用技术方案为:
一种野生型褐藻胶裂解酶Algt,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
SEQ ID NO.1:
MKRFKATPAMTIGCAAFLSVYMAAANASIQNPGFESDWDNWTDSDPSAISGVAYSGSKSAKITGSGGRFEQQVSVQTGTNYRLTAYVNGDGTVGAVVNGTTYDADVSSSNWQAVNVEFNSGSAQSVTVFGAYNGGEGRFDNFTLEALGDSGSCQSGSNLSVSAAYDDGTNDGHGPANVLDGSLADESRWSSEGVKWITLDLGSVKNVEGVDIAWYKGDQRISYFYIETSTDNSNWTTVLSGGQSSGTSADMEHYDVSNIEARYVRLTGTGNSANSWNSILEFDVIGCGDGSDGGSSSGGGSSSGGGSSSGGSSGGSSSGSGNLDPTLPPSGNFELVDWYLSIPTDNDGNGKADSIKENELSGGYENSSYFYTASDGGMVFRCPIAGYKTSTNTSYTRTELREMLRRGDTSIDTQGVNKNNWVFGSAPSSARNAAGGVDGVLRATLAVNHVTTTGDSSQVGRVIIGQIHANDDEPLRLYYRKLPGNSKGSIYFAHEPEGGSDQWYEMIGSRSSSASDPADGIALNEVFSYEIKVVGNTLTVTISRDGKDDVVKSVDMSDSGYDSSDQYQYFKAGVYNQNNTGDDDDYVQATFYALENSHDGYPY
一种编码上述野生型褐藻胶裂解酶Algt的基因,其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
SEQ ID NO.2:
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一种褐藻胶裂解酶截短体Algt1,其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.3:
FELVDWYLSIPTDNDGNGKADSIKENELSGGYENSSYFYTASDGGMVFRCPIAGYKTSTNTSYTRTELREMLRRGDTSIDTQGVNKNNWVFGSAPSSARNAAGGVDGVLRATLAVNHVTTTGDSSQVGRVIIGQIHANDDEPLRLYYRKLPGNSKGSIYFAHEPEGGSDQWYEMIGSRSSSASDPADGIALNEVFSYEIKVVGNTLTVTISRDGKDDVVKSVDMSDSGYDSSDQYQYFKAGVYNQNNTGDDDDYVQATFYALENSHDGYPY
一种编码上述褐藻胶裂解酶截短体Algt1的基因,其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
SEQ ID NO.4:
cttcgagctggtggattggtacttgagcattcccaccgataacgatggcaacggtaaagccgactccatcaaggaaaacgagttgagcggcggatacgagaacagcagttatttctacactgcaagtgacggcggcatggtattccgttgccccatcgctggctataagacctccaccaacacctcttacacccgtaccgaactacgggaaatgctgcgccggggcgataccagtatcgatacccagggcgtcaacaaaaacaactgggtatttggtagtgcaccttcatccgcccgtaacgcagccggtggcgtggatggtgttttgcgcgcgacgctagcagtcaaccacgttaccaccacaggtgacagcagtcaggtcggtcgcgttatcatcgggcagatacacgctaatgatgacgaaccgctgcgcctctactaccgcaagttgccgggtaactctaagggctcgatctattttgcccatgagcctgaaggtggcagcgatcagtggtatgaaatgatcggcagccgctccagcagtgcctcggatcccgctgatggtatcgcgttgaacgaagtgttcagttatgaaattaaagtggtaggtaatacgctcaccgtcaccatttctcgcgatggcaaagacgatgtcgttaagagtgtcgacatgagtgatagcggctacgatagctcggatcaataccaatacttcaaggccggtgtgtataaccaaaataatacaggcgatgacgatgactatgtccaggcgacattttacgctctggaaaatagtcacgacggctatccctactga.
本发明还提供包含上述褐藻胶裂解酶截短体Algt1基因的重组表达载体。
本发明还提供包含上述褐藻胶裂解酶截短体Algt1的重组菌株,所述菌株为毕赤酵母GS115。
褐藻胶裂解酶截短体Algt1在制备小分子褐藻胶寡糖中的应用,所述应用为利用褐藻胶裂解酶截短体Algt1将褐藻胶降解为聚合度为1-4的褐藻胶寡糖。
进一步地,所述降解的条件为:底物浓度20%,温度为40℃,反应时间6h。
本发明与现有技术相比的有益效果:
所述褐藻胶裂解酶Algt与其截短体Algt1的酶活和热稳定性比较,发现截短体Algt1的酶活和热稳定性都得到提升。Algt1的酶活为Algt的3.43倍。Algt35℃水浴2h保留60.33%初始酶活,Algt1 35℃水浴2h后能保留75.36%初始酶活。
所述褐藻胶裂解酶截短体Algt1的酶学性质:最适温度为40℃,最适pH为7.0,能够降解海藻酸钠、Poly M和Poly G。具有良好的热稳定性和钠离子抗性。同时具有内切和外切双功能,Algt1可以在底物浓度为20%的条件下,高效降解褐藻胶,主要产物是聚合度为1-4的褐藻胶寡糖。
附图说明
图1:本发明实施例提供的褐藻胶裂解酶Algt和Algt1的基因注释结果;其中,A和B分别为Algt1和Algt。
图2:本发明的褐藻胶裂解酶纯化后的SDS-PAGE电泳图,其中1为Algt1粗酶液;2为Algt粗酶液;3为Algt1纯化蛋白;4为Algt纯化蛋白。
图3:本发明的褐藻胶裂解酶温度变化对相对酶活的影响示意图;其中,A和B分别为Algt1和Algt。
图4:本发明的褐藻胶裂解酶pH变化对相对酶活的影响示意图;其中,A和B分别为Algt1和Algt。
图5:本发明的褐藻胶裂解酶在不同温度下放置不同时间酶活变化图;其中,A和B分别为Algt1和Algt。
图6:本发明的褐藻胶裂解酶钠离子浓度变化对相对酶活的影响示意图;其中,A和B分别为Algt1和Algt。
图7:本发明的褐藻胶裂解酶降解海藻酸钠的产物TLC分析图;其中,A和B分别为Algt1和Algt。
图8:本发明的褐藻胶裂解酶Algt1降解底物浓度为20%的海藻酸钠、Poly M、PolyG的产物ESI-MS和FPLC分析图。其中A、B、C为降解海藻酸钠、Poly M、Poly G的ESI-MS图;D为降解不同底物的FPLC图。
具体实施方式
下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释,但本发明要保护的技术范围不受实施例任何形式上限制。
实施例1褐藻胶裂解酶的来源及序列分析
野生型褐藻胶裂解酶Algt来源于Microbulbifer thermotolerans DSM 19189,属于PL7家族,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。Algt含有3个结构域,CBM_4_9、F5_F8_type_C、Alginate_lyase2结构域。通过研究发现CBM_4_9和F5_F8_type_C区域的截短能增加褐藻胶裂解酶的酶活和热稳定性,所以将Algt的CBM_4_9和F5_F8_type_C结构域截短,并获得截短后的褐藻胶裂解酶Algt1,两个酶的结构域分析如图1所示。
实施例2褐藻胶裂解酶的表达及纯化
根据表达宿主毕赤酵母GS115的密码子偏好性,对SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.3进行优化并人工合成分别连接至pPIC9K载体。将载体采用热激法转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。使用含有氨苄青霉素的LB培养基平板进行筛选,挑选长出的单菌落进行测序,对测序结果正确的转换子进行收集,并将重组质粒命名为pPIC9K-Algt1和pPIC9K-Algt。将含pPIC9K-Algt1和pPIC9K-Algt质粒的DH5α单菌分别挑入LB培养基中培养20h,通过PlasmidDNA Kit试剂盒提取pPIC9K-Algt1和pPIC9K-Algt的质粒,并使用Sac1限制性内切酶对其进行线性化酶切处理,纯化处理后的产物将进行转化。将5μL需要转化的酶切产物转移至50μL毕赤酵母GS115感受态细胞中,并将上述混合样品转移至2mm电转杯中于冰上孵育15min,在工作电压为2kV、脉冲时间约为0.5ms的条件下进行电击,结束后立即加入预冷的1mL 1M山梨醇溶液,吸打混匀后转移至新的1.5mL离心管中,置于30℃培养箱中孵育1h,离心后涂布于MD培养基中,于30℃培养3-5天。将MD转化板上的转化子全部接于48孔板中发酵,条件为30℃、200rpm,每隔24h用1.0%甲醇诱导一次,共诱导三次。培养完成后对上清液测定酶活,选取酶活较高的转化子进行摇瓶发酵。采用DNS法验证所获蛋白是否具有酶活,1个酶活单位(U)定义为每1min产生1μmol还原糖所需的酶量。挑选所选阳性单菌落于20mL BMGY培养基中,使用甲醇诱导产酶。发酵条件为30℃、200rpm,从培养的第24h开始,每间隔24h添加1.0%的甲醇进行诱导表达,诱导三次后离心并收集上清液。
使用镍离子磁珠对摇瓶发酵酶液进行纯化,使用不同浓度梯度咪唑溶液洗脱。对所得纯化褐藻胶裂解酶酶液进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图2所示,纯化效果较为明显,纯化后的酶液用于后续实验。
实施例3Algt1和Algt酶学性质研究
(1)温度对酶活性的影响
用pH 7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液配制0.8%(w/v)的海藻酸钠,分别取100μL褐藻胶裂解酶Algt1和Algt的酶液,加入900μL上述海藻酸钠溶液并混合。取混合液分别置于30、35、40、45、50、55℃下反应30min,测定酶活。用DNS法测定Algt1的酶活,最适反应温度为酶活最高的测定温度并设其酶活为100%,其它温度下酶活与其的比值为该温度下的相对酶活。结果如图3所示,褐藻胶裂解酶Algt1和Algt的最适反应温度都为40℃,说明CBM_4_9和F5_F8_type_C结构域的截短不改变褐藻胶裂解酶的最适反应温度。
(2)pH对酶活性的影响
分别用CH3COOH-CH3COONa缓冲液(20mM,pH 4.0–6.0)、Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(20mM,pH 6.0–8.0)和、NaOH-glycine缓冲液(20mM,pH 8.0–10.0)配制不同pH的0.8%(w/v)海藻酸钠。分别取100μL褐藻胶裂解酶Algt1和Algt的酶液,加入900μL上述不同pH海藻酸钠溶液并混合,40℃条件下反应30min。用DNS法测定Algt1的酶活,最适反应pH为酶活最高的测定温度并设其酶活为100%,其它pH下酶活与其的比值为该温度下的相对酶活。结果如图4所示,褐藻胶裂解酶Algt1和Algt的最适反应pH都为7.0,说明CBM_4_9和F5_F8_type_C结构域的截短不改变褐藻胶裂解酶的最适反应pH。
(3)褐藻胶裂解酶的底物偏好性
以0.8%(w/v)的海藻酸钠、poly G、poly M为底物,取900μL不同底物,分别加入100μL褐藻胶裂解酶Algt1和Algt的酶液,置于最适反应条件(40℃、pH7.0)下反应30min,采用DNS法测定酶活。结果如表1所示,褐藻胶裂解酶Algt1和Algt都能降解海藻酸钠、poly G、poly M,Algt1对三种底物的酶活都高于Algt,说明CBM_4_9和F5_F8_type_C结构域的截短可以提高褐藻胶裂解酶的酶活。
表1褐藻胶裂解酶Algt和其截短体Algt1酶活差异
(4)褐藻胶裂解酶耐热性
以0.8%(w/v)的海藻酸钠为底物,取900μL底物,分别加入100μL褐藻胶裂解酶Algt1和Algt的酶液,分别在35℃、40℃、45℃和50℃孵育0–2h后,对Algt1和Algt的残留活性进行测定。结果如图5所示,Algt1和Algt在40℃孵育1h后还可以保留83.6%和73.3%的初始酶活。总体而言,Algt1的热稳定性优于Algt,说明CBM_4_9和F5_F8_type_C结构域的截短可以提高褐藻胶裂解酶热稳定性。
(5)钠离子对褐藻胶裂解酶酶活的影响
配制不同钠离子浓度的0.8%(w/v)海藻酸钠作为底物,钠离子浓度范围为0-1600mM。取900μL底物,加入100μL褐藻胶裂解酶置于40℃、pH7.0的条件下反应30min,采用DNS法测定酶活,设置其中最高酶活为100%。结果如图6所示,在200-1200mM钠离子浓度范围内,Algt1的酶活得到提高;在200-1400mM钠离子浓度范围内,Algt的酶活得到提高,说明CBM_4_9和F5_F8_type_C结构域的截短不改变褐藻胶裂解酶钠离子激活特性。
实施例4Algt1和Algt降解模式分析
以0.8%(w/v)的海藻酸钠为底物,取900μL不同底物,分别加入100μL褐藻胶裂解酶Algt1和Algt并置于40℃、pH7.0的条件下反应90min。取不同时间段的反应液进行TLC测定。TLC的展开剂为甲酸、正丁醇、水(6:4:1),显色剂为1mL盐酸、2mL苯胺、2g二苯胺、10mL磷酸溶于100mL丙酮中。将点样后的硅胶板放置于含有展开剂的容器中,重复展开两次。展开完毕后,喷洒显色剂,110℃显色10min。待显色效果明显后拍照记录,对照组为聚合度2-6的褐藻胶寡糖混合标准品。结果如图7所示,褐藻裂解酶Algt1和Algt的主要降解产物为褐藻胶单糖、二糖、三糖、四糖和DEH(4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid),DEH是由褐藻胶单糖非酶转化而形成的。Algt1和Algt都具有内切和外切功能,能同时获得褐藻胶单糖和褐藻胶寡糖,说明CBM_4_9和F5_F8_type_C结构域的截短不改变褐藻胶裂解酶降解模式。
实施案例5高底物浓度条件下,利用Algt1制备褐藻胶寡糖
称量200g海藻酸钠、Poly M和Poly G,分别倒入1000mL超纯水中,配制成不同底物原液,底物浓度为20%。向不同底物原液中加入50mL褐藻胶裂解酶Algt1,40℃条件下搅拌6h。为了去除杂质,将反应物以4000rpm离心10min,然后通过冷冻干燥纯化。在负离子模式下使用电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析纯化后的产物。同时,利用FPLC检测纯化产物:使用SuperdexTM 30Increase10/300GL column,流动相为0.2M NH4HCO3,流速为0.3mL/min,并使用可变波长检测器(VWD)在235nm处检测。结果如图8所示,褐藻胶裂解酶Algt1能在高底物浓度条件下,6h内将海藻酸钠、PolyM、PolyG降解成聚合度为1-4的褐藻胶寡糖。该结果说明褐藻胶裂解酶Algt1是一种有效制备褐藻胶寡糖的工具,在工业应用上极具前景。
Claims (6)
1.一种褐藻胶裂解酶截短体Algt1,其特征在于,所述截短体Algt1的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述截短体Algt1的基因,其特征在于,其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.包含权利要求2所述基因的重组表达载体。
4.一种重组菌株,其特征在于,所述重组菌株包含权利要求2所述基因,菌株为毕赤酵母GS115。
5.褐藻胶裂解酶截短体Algt1在制备小分子褐藻胶寡糖中的应用,其特征在于,所述应用为利用褐藻胶裂解酶截短体Algt1将褐藻胶降解为聚合度为1-4的褐藻胶寡糖。
6.根据权利要求5所述的应有,其特征在于,所述降解的条件为:底物浓度20%,温度为40℃,反应时间6h。
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