CN111100854B - 一种适冷性海带淀粉酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术及生化检测技术领域，尤其涉及一种适冷性海带淀粉酶及其应用。海带淀粉酶Lam16A_Wa具有新颖的氨基酸序列及良好的酶学性质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。以Lam16A_Wa为基础，本发明建立了一种海带淀粉的定量检测方法：将海带淀粉酶Lam16A_Wa与待测样品进行混合反应，使样品中含有的海带淀粉水解为还原糖，加入对羟基苯甲酰肼(pHBH)与还原糖发生显色反应，将显色吸光值代入标准曲线，即可得知样品中的海带淀粉含量。该检测方法具有快速、准确、特异性强等优点。

Description

一种适冷性海带淀粉酶及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术及生化检测技术领域，尤其涉及一种适冷性海带淀粉酶及其应用。
背景技术
海带淀粉是海洋褐藻和硅藻的重要储藏多糖，主要结构为线性的β-1,3-葡聚糖主链及其上β-1,6-键连接的支链，据报道，海带淀粉具有抗病原体、免疫调节、抗氧化等生物活性。而由海带淀粉降解得到的海带淀粉寡糖也被证实有抗细胞凋亡、激活单核细胞、抗肿瘤及诱导植物产生抗病性等活性。
海带淀粉的定量检测是海带淀粉质量控制、功能研究、产品开发中的基础环节。目前，常用的海带淀粉定量检测方法是苯酚-硫酸法和高效液相色谱法等。苯酚-硫酸法灵敏度高，且不需贵重仪器，但准确性和重现性受试验条件影响较大，且耗费时间，样品和试剂消耗较多。高效液相色谱法通过对样品进行水解、衍生及预处理，通过测定海带淀粉组成单糖的含量合计得到海带淀粉含量，该方法灵敏度高、准确性好，但仪器成本高、操作繁琐。
海带淀粉酶能特异性降解海带淀粉中β-1,3-键。在GH16家族海带淀粉酶的研究中，对来自超嗜热菌和嗜温菌的海带淀粉酶的性质、晶体结构、热稳定性及其影响因素有广泛的研究。相比之下，具有适冷性的海带淀粉酶的性质研究较少，而适冷性又是实际应用的良好性状。目前大多数已性质研究的海带淀粉酶具有较高的最适温度(50℃以上)，反应需要消耗热能，且多数酶在高温下不稳定，失活快，实际应用时具有很大的局限性。
对羟基苯甲酰肼(pHBH)是一种芳香族酰肼类化合物，在强碱性条件下能与β-二酮类化合物生成黄色产物。有研究表明，pHBH在高温及碱性条件下，可与葡萄糖等还原糖反应产生相似的黄色物质，反应后颜色深浅与还原糖浓度成正比，且该反应的灵敏度较高。
所以，找到一种具有适冷性的海带淀粉酶，对于海带淀粉的定量检测具有非常重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是大多数已性质研究的海带淀粉酶具有较高的最适温度(50℃以上)，反应需要消耗热能，且多数酶在高温下不稳定，失活快，实际应用时具有很大的局限性。
为解决上述问题，本发明提供一种序列新颖、酶学性质良好、活力高的适冷性海带淀粉酶Lam16A_Wa，并基于该酶提供一种检测样品中海带淀粉含量的方法，该方法具有特异、快速、简便等优点。
为达到上述目的，本发明通过以下技术方案实现：
一种适冷性海带淀粉酶，为海带淀粉酶Lam16A_Wa，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
SEQ ID NO.1：
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSKDKVAVNDTTEPTVDCPGKITNAVPKGNNNVLVWSDEFNTAGSPCTENWTYDIGNSGWGNNELQYYTRDNAVVENGILKITAKKETYRGAPYTSARMKTQDRFSFTYGKVEVRAKLPYGLGTWPAIWMLGDNISTVGWPTCGEIDIMERAGTSSANLKITTSAIHNSSGYGNTPYVGENEPKEDLSTEFHLYSINWTADKIEFMVDNVVHYTYQPATKDAANWPFDKNQFVILNVAMGGTLGGNVDPDFTESAMEIDYVRVYQ
该酶与其他已知酶的序列相似度最高仅为55％。利用MEGA6将Lam16A_Wa与GH16家族已研究过的海带淀粉酶序列构建***发育树，结果如图3所示：可以看出海带淀粉酶Lam16A_Wa处于GH16家族海带淀粉酶的***发育树中。因此，Lam16A_Wa是海带淀粉酶GH16家族的一个新成员。将海带淀粉酶Lam16A_Wa氨基酸序列进行Blast分析并利用ClustalX2将Lam16A_Wa与GH16家族已知的具有晶体结构的7条海带淀粉酶序列进行多序列比对，结果如图4所示：这7个海带淀粉酶分别是来源于Nocardiopsis sp.F96的BglF(GenbankBAE54302.1)，来源于Cellulosimicrobium cellulans LL-G109/DSM10297/DK-1的BglII(Genbank AAC38290.1)，来源于Zobellia galactanivorans DsijT的ZgLamC(GenbankCAZ95067.1)，来源于Rhodothermus marinus ITI278的LamR(GenbankAAC69707.1)，来源于Thermotoga maritima MSB8的TmLam(GenbankAAD35118.1)，来源于Thermotogapetrophila RKU-1的TpLam(Genbank ABQ46917.1)与来源于Zobellia galactanivoransDsijT的ZgLamA(Genbank CAZ96583.1)。由图4可知，Lam16A_Wa除在关键催化位点严格保守外，在其他位点均显示不同程度的特异性，且Blast证实Lam16A_Wa与Formosa algae KMM3553所产的Orf00540序列相比，仅具有55％的最高相似度，表明Lam16A_Wa是GH16家族中一种新颖的海带淀粉酶。
上述海带淀粉酶Lam16A_Wa对于海带淀粉具有高活力，但对于其他海洋多糖，如琼胶、褐藻胶、卡拉胶等均无降解作用。其最适反应温度为35℃，远低于其他已进行过性质研究的海带淀粉酶，在室温下仍能保持80％以上的活力，具有良好的适冷性，其最适反应pH值为6.0，且在pH 3.0-11.0的pH值范围内基本保持稳定(酶活残余率大于80％)，酶动力学常数Km为1.29mg/mL，Kcat为111.89s-1，Vmax为203.01U/mg。以上可知，相较于其他海带淀粉酶，本发明的海带淀粉酶Lam16A_Wa酶学性质优良、稳定性好、容易贮藏，特别是适冷性质优良，同时对于底物结合的特异性强、酶解速率快，是用于检测海带淀粉定量检测的理想的酶。
一种编码上述海带淀粉酶Lam16A_Wa的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2及可翻译出SEQ ID NO.1的所有基因。
SEQ ID NO.2：
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCATAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCAAAGACAAAGTAGCAGTAAATGATACTACAGAACCTACAGTAGATTGTCCTGGAAAAATAACCAATGCAGTTCCAAAGGGAAATAATAACGTATTGGTTTGGTCTGATGAGTTTAATACAGCAGGATCTCCTTGTACAGAAAACTGGACTTACGACATAGGAAACAGTGGTTGGGGAAATAATGAACTTCAATATTACACAAGAGATAATGCAGTGGTTGAGAACGGAATTTTAAAAATTACGGCAAAAAAAGAAACCTATAGAGGAGCTCCATATACATCTGCAAGAATGAAAACTCAAGACAGATTTAGTTTTACTTACGGTAAAGTAGAAGTACGTGCAAAATTACCTTATGGTTTAGGTACTTGGCCTGCTATATGGATGTTGGGAGATAATATTAGTACAGTAGGGTGGCCAACCTGTGGAGAAATAGATATTATGGAACGTGCCGGAACTAGTTCAGCTAATTTAAAAATTACCACAAGTGCTATTCATAATTCTTCTGGATATGGAAACACACCTTACGTAGGAGAAAATGAACCTAAAGAAGATTTGTCTACAGAATTTCATTTGTATTCCATTAACTGGACAGCAGATAAGATTGAATTTATGGTAGATAATGTAGTGCATTATACCTATCAGCCTGCTACAAAAGATGCAGCTAATTGGCCTTTTGATAAAAATCAATTTGTCATTTTAAATGTAGCTATGGGTGGAACTTTAGGAGGTAATGTTGATCCTGATTTTACAGAATCGGCAATGGAAATAGATTATGTAAGAGTATATCAATAG
依据上述发现，本发明基于Lam16A_Wa建立了一种海带淀粉的定量检测方法，采用酶Lam16A_Wa与样品反应，测定400-420nm处的吸光值，具有特异、快速、简便等优点。
进一步的，测定时采用对羟基苯甲酰肼(pHBH)作为显色剂。
具体包括如下及同等作用步骤：
(1)海带淀粉溶液的配制：称取化学级或以上纯度的海带淀粉溶于缓冲液，制备具有浓度梯度的海带淀粉标准溶液；
(2)pHBH溶液的配制：称取pHBH溶于HCl中，然后加入NaOH调溶液pH至碱性，制备成10-100mg/mL的pHBH溶液。
(3)定量标准曲线的绘制：取步骤(1)配制的不同浓度海带淀粉溶液分别与适量的Lam16A_Wa酶液混合进行反应，酶的添加量为1-1000U，反应时间为10-30min，反应温度为20-50℃；反应后于100℃金属浴放置5-10min使酶灭活；再加入pHBH溶液，于100℃金属浴中显色5-10min，迅速冷却至室温后离心取上清液，测定上清液的吸光值，检测波长为400-420nm(pHBH与还原糖的反应产物在这个波长范围内线性关系好，精准度高)；将相同浓度梯度的海带淀粉溶液与灭活酶液混合重复上述反应，测定其吸光值作为对照，然后计算出不同浓度海带淀粉溶液所对应的吸光值增量；以海带淀粉标准溶液浓度为横坐标，以各浓度海带淀粉的吸光值增量为纵坐标，通过线性拟合得出特定反应条件下的标准曲线；
酶的添加量为1-1000U：保证酶是过量的且不形成资源浪费。过多会浪费，过少会导致酶解不充分，从而影响定量结果。
反应时间为10-30min：小于10min可能导致酶解不充分，且检测线性关系不好，大于30min则浪费时间。酶的添加量与反应时间需相互对应，加酶量少则增加反应时间才能保证样品酶解彻底。
反应温度为20-50℃：最适温度为35℃，20-50℃该酶酶活较高，有利于充分酶解。
反应后于100℃金属浴放置5-10min使酶灭活：100℃是灭酶的常用温度，小于5min可能导致灭酶不完全，大于10min浪费时间。
(4)样品测定：对样品进行适当前处理后向样品溶液中加入一定量Lam16A_Wa重复步骤(3)的反应；将吸光值增量代入相应加酶量、反应时间、反应温度、反应pH等条件下的标准曲线，计算出反应体系中的海带淀粉浓度，进而可得到样品中的海带淀粉含量。
进一步的，步骤(1)中的缓冲液pH为7.0-11.0。该酶在这个pH范围内酶活较高。
进一步的，步骤(4)测定前按照国标GB5009.88—2014方法，除去样品中的还原糖。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供了一种适冷性海带淀粉酶，该酶与其他已知酶的序列相似度最高仅为55％。其酶学性质优良、稳定性好、容易贮藏，特别是适冷性质优良，同时对于底物结合的特异性强、酶解速率快，是用于检测海带淀粉定量检测的理想的酶。
(2)本发明的适冷性海带淀粉酶对于海带淀粉具有高活力，但对于其他海洋多糖，如琼胶、褐藻胶、卡拉胶等均无降解作用。
(3)本发明海带淀粉的定量检测方法利用适冷性海带淀粉酶在较低温度下降解样品中的海带淀粉形成还原糖，还原糖可与pHBH发生显色反应，且溶液颜色与还原糖浓度成正比，通过检测反应液反应前后的吸光值增量，即可得知检测样品中的海带淀粉含量。该检测方法操作简单、线性范围好，准确度高，可在市场中推广使用。
附图说明
图1：目的基因琼脂糖凝胶电泳图；
图2：本发明的海带淀粉酶Lam16A_Wa纯化后的电泳图；
图3：Lam16A_Wa与所有已知GH16家族海带淀粉酶构建的***发育树；其中，箭头指向为海带淀粉酶Lam16A_Wa；
图4：Lam16A_Wa多序列比对结果；其中，黑框白字为Lam16A_Wa的保守残基。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：海带淀粉酶Lam16A_Wa在大肠杆菌中克隆表达及获取
在2216E培养基中培养Wenyingzhuangia aestuarii OF219直至对数末期并提取全基因组DNA，根据目的基因设计上下游引物(5’-GACACGGATCCAAAGACAAAGTAGCAGTAAATGATACTACA；5’-GACACCTCGAGCTATTGATATACTCTTACATAATCTATTTC)，以全基因组为模板进行PCR，PCR反应条件为：95℃3min，95℃20s，42℃22s，72℃60s，22个循环，最后72℃持续5min，得到了海带淀粉酶Lam16A_Wa基因片段，连接至pET-28a(+)载体，构成重组质粒。将重组质粒导入BL21(DE3)感受态细胞中构成重组菌株。在含卡那霉素的LB培养基中利用异丙基硫代半乳糖苷进行诱导表达，诱导温度为17℃，诱导时间为12h。离心收集菌体，加入一定量的20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(Na2HPO4-NaH2PO4)缓冲液悬浮，然后在冰水浴中进行超声破碎(功率400W，工作2s，间隙6s，循环99次)，离心收集上清，此即为海带淀粉酶Lam16A_Wa的粗酶液。
将超声破碎后的胞内上清酶液，以HisTrapTM HP色谱柱对上清液中的目标蛋白进行亲和层析纯化，SDS-PAGE分析结果如图2所示，纯化后酶蛋白为单一条带，表明其纯度良好。纯化后酶的活力为77.14U/mg(1U活力定义为1min内生成1μmol还原糖的活力)。
实施例2：海带淀粉酶Lam16A_Wa在枯草芽孢杆菌中克隆表达及获取
在2216E培养基中培养Wenyingzhuangia aestuarii OF219直至对数末期并提取全基因组DNA，根据目的基因设计上下游引物(5’-GGCTAATGGGCAGCAGCCATCATCA；5’-AATGAATTATGTAAGAGTATATCAATAG，以全基因组为模板如实施例1进行PCR，得到海带淀粉酶Lam16A_Wa基因片段，连接至pHT01载体，构成重组质粒。将重组质粒转化入枯草芽孢杆菌感受态细胞中，筛选阳性克隆并利用异丙基硫代半乳糖苷在LB培养液中进行诱导表达，诱导温度为37℃，诱导时间为12h。离心收集菌体，加入一定量的20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液悬浮，然后在冰水浴中进行超声破碎(功率400W，工作2s，间隙6s，循环99次)，离心收集上清，此即为褐藻胶裂解酶Aly7A的粗酶液。重复实施例1中纯化操作，获取纯酶液，检测重组酶发酵液的活力为140.71U/mg。
实施例3：海带淀粉酶Lam16A_Wa在毕赤酵母中克隆表达及获取
在2216E培养基中培养Wenyingzhuangia aestuarii OF219直至对数末期并提取全基因组DNA，根据目的基因设计上下游引物(5’-TTATAAATGGGCAGCAGCCATCATCA；5’-GCATGCAGATTATGTAAGAGTATATCAATAG)，以全基因组为模板如实施例1进行PCR，得到海带淀粉酶Lam16A_Wa基因片段，连接至pPIC9k载体，构成重组质粒，加入到毕赤酵母GS115感受态细胞中构成重组细胞；筛选阳性克隆并接种于YPD培养基中，30℃培养20h，然后接种于BMGY培养基，30℃、200rpm下摇床培养至OD600＝2.0，离心收集菌体，弃上清，用BMMY培养基重悬沉淀，29℃下200rpm用甲醇诱导培养72h。诱导结束后，离心收集上清液，即为粗酶液。检测重组酶发酵液的活力为105.86U/mg。
实施例4：对本发明方法进行准确性验证
利用本发明方法与苯酚-硫酸法测定某样品中海带淀粉含量：
(1)海带淀粉溶液的配制：称取化学级的海带淀粉溶于pH8.0的20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，制备浓度分别为2.00mg/mL、3.00mg/mL、4.00mg/mL、5.00mg/mL、6.00mg/mL的海带淀粉标准溶液；
(2)pHBH溶液的配制：称取pHBH溶于2mol/LHCl中，制备200mg/mL的pHBH母液，将母液与2mol/LNaOH溶液按1：9混匀，制备成20mg/mLpHBH溶液。
(3)定量标准曲线的绘制：取375μL上述配制的不同浓度海带淀粉溶液分别与100ULam16A_Wa(缓冲液补足至375μL)于25℃反应25min。反应后于100℃金属浴放置10min使酶灭活，加入250μLpHBH溶液于100℃金属浴中显色8min，迅速冷却至室温后离心取上清液，测定上清液在415nm处的吸光值；同时，将相同浓度梯度的灭活酶液与海带淀粉溶液混合重复上操作，测定其吸光值作为对照，从而计算出不同浓度溶液所对应的吸光值增量；以海带淀粉标准溶液的浓度为横坐标，以对应的吸光值增量为纵坐标，通过线性拟合得出特定反应条件下的标准曲线为y＝1.3426x+0.0158，R2值为0.9994。
(4)样品测定：称取适量样品，磨碎后用85％乙醇溶液冲洗以除去还原糖，弃乙醇溶液，连续3次。脱糖后将试样置于40℃烘箱内干燥过夜，烘干后将样品溶于缓冲液中。取375μL样品溶液，重复步骤三所述操作，将吸光值增量代入标准曲线y＝1.3426x+0.0158，计算出反应体系中的海带淀粉浓度，进而折算出样品中的海带淀粉含量。
(5)根据国标SN/T 4260-2015中苯酚-硫酸法测定样品中的海带淀粉含量。
每种方法分别进行三次平行测定，结果如下表所示。
本发明方法 苯酚-硫酸法
测定平行1(mg/mL) 8.12 7.98
测定平行2(mg/mL) 8.02 8.11
测定平行3(mg/mL) 7.98 8.06
测定平均值(mg/mL) 8.04 8.05
从以上结果可以看出，本发明方法测定结果与苯酚-硫酸法测定结果基本没有偏差，说明本发明方法具有良好的准确性。
实施例5：对本发明方法进行特异性验证
用本发明方法分别对三种混合溶液中的海带淀粉进行定量。
步骤一，海带淀粉溶液的配制：称取化学级的海带淀粉溶于pH7.0的20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，制备浓度为2.00mg/mL的海带淀粉溶液；同时制备浓度均为2.00mg/mL的琼胶、卡拉胶、褐藻胶溶液；将琼胶、卡拉胶、褐藻胶溶液分别与海带淀粉溶液等体积混匀制备成混合溶液，混合溶液的海带淀粉浓度为1.00mg/mL。
步骤二，pHBH溶液的配制：称取pHBH溶于2mol/LHCl中，制备200mg/mL的pHBH母液，将母液与2mol/LNaOH溶液按1：9混匀，制备成20mg/mLpHBH溶液。
步骤三，定量标准曲线的绘制：取375μL上述配制的不同浓度海带淀粉溶液分别与50U Lam16A_Wa(缓冲液补足至375μL)于25℃反应25min。反应后于100℃金属浴放置8min使酶灭活，加入250μLpHBH溶液于100℃金属浴中显色5min，迅速冷却至室温后离心取上清液，测定上清液在400nm处的吸光值；同时，将相同浓度梯度的灭活酶液与海带淀粉溶液混合重复上操作，测定其吸光值作为对照，从而计算出不同浓度溶液所对应的吸光值增量；以海带淀粉标准溶液的浓度为横坐标，以对应的吸光值增量为纵坐标，通过线性拟合得出特定反应条件下的标准曲线为y＝1.3844x+0.0226，R2值为0.9990。
步骤四，样品测定：分别取375μL混合溶液，重复步骤三所述操作，将吸光值增量代入标准曲线y＝1.3844x+0.0226，计算出反应体系中的海带淀粉浓度，进而折算出混合溶液中的海带淀粉含量。
平行测定三次，测定结果如下。
海带淀粉、琼胶 海带淀粉、卡拉胶 海带淀粉、褐藻胶
测定平行1(mg/mL) 1.05 1.08 0.98
测定平行2(mg/mL) 1.02 0.99 1.04
测定平行3(mg/mL) 1.04 0.95 1.04
测定平均值(mg/mL) 1.04 1.01 1.02
相对误差(％) 4％ 1％ 2％
从以上结果可以看出，本发明方法具有良好的特异性。
实施例6：测定一种海带原料中的海带淀粉含量
(1)海带淀粉溶液的配制：称取化学级的海带淀粉溶于pH8.0的20mM Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，制备浓度分别为0.10mg/mL、0.20mg/mL、0.30mg/mL、0.40mg/mL、0.50mg/mL的海带淀粉标准溶液；
(2)pHBH溶液的配制：称取pHBH溶于2mol/LHCl中，制备200mg/mL的pHBH母液，将母液与2mol/LNaOH溶液按1：9混匀，制备成20mg/mLpHBH溶液。
(3)定量标准曲线的绘制：取375μL上述配制的不同浓度海带淀粉溶液分别与20ULam16A_Wa(缓冲液补足至375μL)于35℃反应10min。反应后于100℃金属浴放置5min使酶灭活，加入250μLpHBH溶液于100℃金属浴中显色5min，迅速冷却至室温后离心取上清液，测定上清液在410nm处的吸光值；同时，将相同浓度梯度的灭活酶液与海带淀粉溶液混合重复上操作，测定其吸光值作为对照，从而计算出不同浓度溶液所对应的吸光值增量；以海带淀粉标准溶液的浓度为横坐标，以对应的吸光值增量为纵坐标，通过线性拟合得出特定反应条件下的标准曲线为y＝1.3828x+0.0357，R2值为0.9992。
(4)样品测定：称取适量样品，磨碎后用85％乙醇溶液冲洗以除去还原糖，弃乙醇溶液，连续3次。脱糖后将试样置于40℃烘箱内干燥过夜，烘干后将样品溶于缓冲液中。取375μL样品溶液，重复步骤三所述步骤，将吸光值增量代入标准曲线y＝1.3828x+0.0357，计算出反应体系中的海带淀粉浓度，进而折算出样品中的海带淀粉含量。海带中海带淀粉含量为48.55±0.48mg/mL(53.19％)。
最后需要说明，以上实施例虽然描述了本发明的具体实施方式，但是并非限制本发明；本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书所限定的。而一切进行修改或等同替换，其均应包含在本发明的保护范围中。
Figure BDA0002336803040000091
Figure BDA0002336803040000101
Figure BDA0002336803040000111
Figure BDA0002336803040000121
Figure BDA0002336803040000131
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 一种适冷性海带淀粉酶及其应用
<130> 中国海洋大学
<140> 1
<141> 2019-11-20
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg
20 25 30
Gly Ser Lys Asp Lys Val Ala Val Asn Asp Thr Thr Glu Pro Thr Val
35 40 45
Asp Cys Pro Gly Lys Ile Thr Asn Ala Val Pro Lys Gly Asn Asn Asn
50 55 60
Val Leu Val Trp Ser Asp Glu Phe Asn Thr Ala Gly Ser Pro Cys Thr
65 70 75 80
Glu Asn Trp Thr Tyr Asp Ile Gly Asn Ser Gly Trp Gly Asn Asn Glu
85 90 95
Leu Gln Tyr Tyr Thr Arg Asp Asn Ala Val Val Glu Asn Gly Ile Leu
100 105 110
Lys Ile Thr Ala Lys Lys Glu Thr Tyr Arg Gly Ala Pro Tyr Thr Ser
115 120 125
Ala Arg Met Lys Thr Gln Asp Arg Phe Ser Phe Thr Tyr Gly Lys Val
130 135 140
Glu Val Arg Ala Lys Leu Pro Tyr Gly Leu Gly Thr Trp Pro Ala Ile
145 150 155 160
Trp Met Leu Gly Asp Asn Ile Ser Thr Val Gly Trp Pro Thr Cys Gly
165 170 175
Glu Ile Asp Ile Met Glu Arg Ala Gly Thr Ser Ser Ala Asn Leu Lys
180 185 190
Ile Thr Thr Ser Ala Ile His Asn Ser Ser Gly Tyr Gly Asn Thr Pro
195 200 205
Tyr Val Gly Glu Asn Glu Pro Lys Glu Asp Leu Ser Thr Glu Phe His
210 215 220
Leu Tyr Ser Ile Asn Trp Thr Ala Asp Lys Ile Glu Phe Met Val Asp
225 230 235 240
Asn Val Val His Tyr Thr Tyr Gln Pro Ala Thr Lys Asp Ala Ala Asn
245 250 255
Trp Pro Phe Asp Lys Asn Gln Phe Val Ile Leu Asn Val Ala Met Gly
260 265 270
Gly Thr Leu Gly Gly Asn Val Asp Pro Asp Phe Thr Glu Ser Ala Met
275 280 285
Glu Ile Asp Tyr Val Arg Val Tyr Gln
290 295
<210> 2
<211> 894
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgggcagca gccatcatca tcatcatcat agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccaaagacaa agtagcagta 120
aatgatacta cagaacctac agtagattgt cctggaaaaa taaccaatgc agttccaaag 180
ggaaataata acgtattggt ttggtctgat gagtttaata cagcaggatc tccttgtaca 240
gaaaactgga cttacgacat aggaaacagt ggttggggaa ataatgaact tcaatattac 300
acaagagata atgcagtggt tgagaacgga attttaaaaa ttacggcaaa aaaagaaacc 360
tatagaggag ctccatatac atctgcaaga atgaaaactc aagacagatt tagttttact 420
tacggtaaag tagaagtacg tgcaaaatta ccttatggtt taggtacttg gcctgctata 480
tggatgttgg gagataatat tagtacagta gggtggccaa cctgtggaga aatagatatt 540
atggaacgtg ccggaactag ttcagctaat ttaaaaatta ccacaagtgc tattcataat 600
tcttctggat atggaaacac accttacgta ggagaaaatg aacctaaaga agatttgtct 660
acagaatttc atttgtattc cattaactgg acagcagata agattgaatt tatggtagat 720
aatgtagtgc attataccta tcagcctgct acaaaagatg cagctaattg gccttttgat 780
aaaaatcaat ttgtcatttt aaatgtagct atgggtggaa ctttaggagg taatgttgat 840
cctgatttta cagaatcggc aatggaaata gattatgtaa gagtatatca atag 894

Claims (6)

1.一种适冷性海带淀粉酶的应用，其特征在于：海带淀粉酶Lam16A_Wa，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 1；所述海带淀粉酶Lam16A_Wa的最适反应温度为35℃，在室温下仍能保持80%以上的活力；最适反应pH值为6.0，且在pH 3.0-11.0的pH值范围内基本保持稳定，酶动力学常数Km为1.29mg/mL， Kcat为111.89 s-1，Vmax为203.01 U/mg；应用在海带淀粉定量检测中。
2.一种海带淀粉的定量检测方法，其特征在于：采用权力要求1中所述的海带淀粉酶Lam16A_Wa与样品反应，测定400-420nm处的吸光值。
3.如权利要求2所述的海带淀粉的定量检测方法，其特征在于：检测时采用对羟基苯甲酰肼（pHBH）作为显色剂。
4.如权利要求3所述的海带淀粉的定量检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）海带淀粉溶液的配制：称取化学级或以上纯度的海带淀粉溶于缓冲液，制备具有浓度梯度的海带淀粉标准溶液；
（2）pHBH溶液的配制：称取pHBH溶于HCl中，然后加入NaOH调溶液pH至碱性，制备成pHBH溶液。
（3）定量标准曲线的绘制：取步骤（1）配制的不同浓度海带淀粉溶液分别与适量的Lam16A_Wa酶液混合进行反应，酶的添加量为5-20μL，反应时间为10-30min，反应温度为20-50℃；反应后于100℃金属浴放置5-10min使酶灭活；再加入pHBH溶液，于100℃金属浴中显色5-10min，迅速冷却至室温后离心取上清液，测定上清液的吸光值，检测波长为400-420nm；将相同浓度梯度的海带淀粉溶液与灭活酶液混合重复上述反应，测定其吸光值作为对照，然后计算出不同浓度海带淀粉溶液所对应的吸光值增量；以海带淀粉标准溶液浓度为横坐标，以各浓度海带淀粉的吸光值增量为纵坐标，通过线性拟合得出特定反应条件下的标准曲线；
（4）样品测定：向样品中加入一定量Lam16A_Wa重复步骤（3）的反应；将吸光值增量代入相应加酶量、反应时间、反应温度、反应pH等条件下的标准曲线，计算出反应体系中的海带淀粉浓度，进而可得到样品中的海带淀粉含量。
5.如权利要求4所述的海带淀粉的定量检测方法，其特征在于：步骤（1）中的缓冲液pH为7.0-11.0。
6.如权利要求4所述的海带淀粉的定量检测方法，其特征在于：步骤（4）测定前按照国标GB5009.88—2014方法，除去样品中的还原糖。
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Wenyingzhuangia sp. OF219 laminarinase (Lam16A) mRNA，partial cds;MK522485.1;《GenBank》;20190729;第1页 *
糖激酶活性检测方法进展;关婉怡等;《河北师范大学学报 自然科学版》;20151130;第39卷(第6期);第534页2.2部分 *

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