CN115768260A - 作为***活力增强剂的5-(1h-吲哚-3-基)-恶唑、-恶二唑和-呋喃衍生物 - Google Patents

作为***活力增强剂的5-(1h-吲哚-3-基)-恶唑、-恶二唑和-呋喃衍生物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及式(I)化合物、其立体异构体和生理学上可耐受的盐用于增强获自非人类哺乳动物的***的活力的用途：
Figure DDA0004020393600000011
其中在式I中：X是‑NR’‑(其中R’是H或C1‑3烷基，例如‑CH3)、‑O‑、‑S‑或‑CH2‑；Y是‑S‑、‑O‑、‑NR”‑(其中R”是H或C1‑3烷基，例如‑CH3)，或‑CH2‑；Z1和Z2独立地选自N和CH；R1至R3独立地选自氢、卤素、C1‑6烷基、C1‑6烷氧基、C1‑6卤代烷基、‑OH、‑CN、‑NO2和‑NR12R13；R4是氢、卤素、C1‑6烷基、C1‑6烷氧基、C1‑6卤代烷基或‑OH；R5为氢、卤素、C1‑6烷基、C1‑6烷氧基或C1‑6卤代烷基；R6和R7独立地选自氢、卤素、C1‑6烷基、C1‑6烷氧基、C1‑6卤代烷基、‑OH、‑CN、‑NO2和‑NR12R13；R8为氢、卤素、C1‑6烷基、C1‑6烷氧基、C1‑6卤代烷基、‑CN、‑NO2或‑NR12R13；R9为氢或C1‑4烷基；R10和R11独立地选自氢和C1‑3烷基；或R10和R11与介于其间的‑O‑和环原子一起连接形成二氧戊环；而R12和R13独立地选自H和C1‑3烷基。这些化合物在畜牧业中特别有用，可提高牲畜(尤其是猪)的人工授精的受精率。它们还可用于制备、预处理或储存***以用于人工授精程序。

Description

作为***活力增强剂的5-(1H-吲哚-3-基)-恶唑、-恶二唑和- 呋喃衍生物
技术领域
本发明涉及化合物增强***活力的用途。它特别适用于畜牧业，以提高牲畜(尤其是猪)的人工授精的受精率。本发明还可用于制备、预处理或储存用于人工授精程序的***。
背景技术
猪肉由于其价格低廉、营养成分高，是世界范围内消费最广泛的肉类，为了满足不断增长的需求，猪肉的生产率也在不断提高。
供人类消费的肉类(尤其是猪肉和牛肉)的全球生产依赖于人工授精方法来生产足够的牲畜以满足消费者的需求。自然繁殖需要更多的雄性动物，这对农民来说是劳动密集型的。然而，对雌性动物进行人工授精的人工繁殖需要较少的雄性，成功率更高，更省时，并降低了农民的成本。例如，人工授精还允许选择性繁殖，这可用于饲养家畜或对高价值动物(例如竞赛马)或濒危物种的繁殖。
人工授精通常用于繁殖家畜，尤其是猪和牛，并且通常需要在使用前将收集的***储存在液氮中，即冷冻保存。***的冷冻保存广泛用于牛肉行业，但在猪肉行业中不太常见，因为来自猪(即公猪)的***可能比公牛***对温度更敏感。例如，与种马、公牛或公羊***相比，公猪***的温度敏感性可能是因为胆固醇与磷脂的比例较低。较高的胆固醇含量导致对温度降低的敏感性降低。公猪***的冷冻保存可以改变其蛋白质谱。这可能导致***表面蛋白的丢失和膜结合酶的失活，从而可能导致***细胞活性和活力降低。冷冻保存还可能导致顶体反应的早期发生，这种反应在***接近卵子时发生在***的顶体中，这对于受精的发生至关重要。此外，在受精前冷冻保存公猪***可能会导致***细胞凋亡、DNA断裂和活性氧的产生。冷冻保存后，公猪***的受精率只有新鲜***的40～70％。
尽管存在这些问题，但在运输公猪***或需要长时间储存时仍必须使用冷冻保存。例如，可能需要储存以保存遗传变异和有价值的基因。此外，猪的生育能力取决于一年中的月份。在温暖的月份，猪产仔较少，而在这些月份收集的公猪***更容易受到冷冻的影响。年份内的这些波动导致猪肉行业的经济损失。为了减轻这种经济负担并提高猪的生活质量，需要其他不影响***质量(***数量、活力和活性)的公猪***保存方法。
为了能够将公猪***储存几天，在***样本中添加了增量剂(extender)。增量剂含有缓冲剂和营养物质，可延长***的半衰期，但与新鲜采集的***相比，它们并不能提高***细胞的活力。
增加受精和每窝产仔数的一种策略是增加***细胞的活力。Holt等人(J Androl1997,18:312-323)表明公猪的***活力和农场授精结果之间存在明显的相关性。如果***细胞具有更高的活力，它们将有更高的机会沿着雌性生殖道上行并到达卵子。***活力有不同的模式：过度活化(hyperactivation)、前向运动和标准运动。这三个参数在受精过程中都很重要。
本发明试图解决本领域中的这些问题中的至少一些，特别是提供能够增强***活力、功能和/或活性的化合物。更具体地，它试图提供可用于提高非人类哺乳动物(例如家畜)的人工授精中的受孕率和/或每窝产仔数的化合物。
发明内容
发明人现在惊奇地发现了某些充当“***活化剂”的化合物。当添加到新鲜公猪***或已在低温下储存数天的公猪***样品中时，已发现这些物质可增强***活力。还发现添加此类“活化剂”可提高猪人工授精的生育率和后代率。
本文公开的“活化剂”化合物特别适用于猪肉工业中的猪的繁殖和饲养。然而，预计发明人的发现将扩展到对来自其他家畜和其他非人类哺乳动物的***的治疗。因此，这些化合物也可用于其他肉类生产行业，例如饲养牛，以及繁殖高价值动物，例如马。虽然种马和公牛的***可以以比公猪***更高的生育率来进行冷冻保存，但通过添加“活化剂”来提高人工授精的成功率也将极大地有利于这些行业，尤其是因为种马和公牛的***剂量非常昂贵。
使用如本文所述的“活化剂”化合物来处理濒危哺乳动物的***，例如在冷冻保存之后，还可以增加人工授精中成功繁殖的机会。在可以长期储存***的情况下，甚至可以在雄性供体死亡后进行人工授精程序。
具体实施方式
在一方面，本发明提供了式(I)的化合物、其立体异构体或生理学上可耐受的盐用于增强获自非人类哺乳动物的***的活力的用途：
Figure BDA0004020393580000031
其中：
X是-NR’-(其中R’是H或C1-3烷基，例如-CH3)、-O-、-S-或-CH2-；
Y是-S-、-O-、-NR”-(其中R”是H或C1-3烷基，例如-CH3)或-CH2-；
Z1和Z2独立地选自N和CH；
R1至R3独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、-OH、-CN、-NO2和-NR12R13；
R4是氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基或-OH；
R5是氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基和C1-6卤代烷基；
R6和R7独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、-OH、-CN、-NO2和-NR12R13；
R8是氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、-CN、-NO2或-NR12R13；
R9是氢或C1-4烷基。
R10和R11独立地选自氢和C1-3烷基；
或R10和R11与介于其间的-O-和环原子一起连接形成二氧戊环；以及
R12和R13独立地选自H和C1-3烷基；
如本文所用，术语“烷基”是指单价饱和的直链或支链的碳链。烷基基团的实施例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基。烷基基团优选地含有1-6个碳原子，更优选地1-4个碳原子，例如1-3个碳原子。
术语“卤素”是指-F、-Cl、-Br或-I。此类基团的优选实施例是-F、-Cl和-Br。
术语“卤代烷基”是指如本文所定义的烷基基团，其中烷基基团的氢原子中的至少一个被卤素原子(优选地-F、-Cl或-Br)取代。此类基团的实施例包括但不限于-CH2F、-CHF2、-CF3、-CCl3、-CHCl2和-CH2CF3。
在式(I)的一个实施方式中，X是-NR’-(其中R’是H或C1-3烷基，例如，-CH3)、-O-或-CH2-。优选地，X是-NR’-(其中R’是H或-CH3)或-O-。更优选地，X是-NH-或-O-。还更优选地，X是-NH-。
在式(I)的一个实施方式中，Y是-S-、-O-、-NR”-(其中R”是H或-CH3)或-CH2-。优选地，Y是-S-。
在式(I)的一个实施方式中，X和Y可以不都是-CH2-。在一个实施方式中，X是-NR’-(其中R’如本文所定义)并且Y是-S-。
在一个实施方式中，用于本发明的化合物是式(II)化合物、它的立体异构体和其生理学上可耐受的盐：
Figure BDA0004020393580000051
(其中Z1、Z2，和R1到R11如本文所定义)。
在式(I)的一个实施方式中，Z1和Z2均为N，或Z1和Z2之一为N，而Z1和Z2中的另一个为CH。在一个实施方式中，Z1和Z2不都是CH。优选地，Z1和Z2都是N。
在一个实施方式中，用于本发明的化合物是式(III)的化合物、它的立体异构体和其生理学上可耐受的盐：
Figure BDA0004020393580000052
(其中X、Y，和R1到R11如本文所定义)。
在式(I)、(II)和(III)的一个实施方式中，R1至R3独立地选自氢、卤素(例如-F、-Cl或-Br)、C1-4烷基和C1-4卤代烷基(例如-CF3)。
在式(I)、(II)和(III)的一个实施方式中，R4是氢、卤素(例如-F、-Cl或-Br)、C1-4烷基或C1-4卤代烷基(例如-CF3)。
在式(I)、(II)和(III)的一个实施方式中，R5是氢、卤素(例如-Cl或-Br)、C1-4烷基或C1-4卤代烷基(例如-CF3)；
在式(I)、(II)和(III)的一个实施方式中，R6和R7独立地选自氢、卤素(例如-F、-Cl或-Br)、C1-4烷基和C1-4卤代烷基(例如-CF3)；
在式(I)、(II)和(III)的一个实施方式中，R8是氢、卤素(例如-F、-Cl或-Br)、C1-4烷基或C1-4卤代烷基(例如-CF3)。
在式(I)、(II)和(III)的一个实施方式中，R9是氢或-CH3。优选地，R9是氢。
在式(I)、(II)和(III)化合物的一个实施方式中，R10和R11独立地选自氢和-CH3。在另一实施方式中，R10和R11与介于期间的-O-和环原子一起连接形成二氧戊环环。
在一个实施方式中，用于本发明的化合物是式(IV)的化合物、它的立体异构体和其生理学上可耐受的盐：
Figure BDA0004020393580000061
(其中Z1、Z2、X、Y和R1至R9如本文所定义)。
在式(I)、(II)、(III)和(IV)化合物的一个实施方式中，R1至R4中只有一个不是氢。在式(I)、(II)、(III)和(IV)化合物的另一实施方式中，R1至R5中只有一个不是氢。
在式(I)、(II)、(III)和(IV)化合物的一个实施方式中，R6至R8中只有一个不是氢。
在式(I)、(II)、(III)和(IV)化合物的一个实施方式中，R1至R8独立地选自氢、-Cl、-CF3和-CH3。
在式(I)、(II)、(III)和(IV)化合物的一个实施方式中，R1至R8各自为氢。
用于本发明的化合物的实施例包括但不限于以下化合物、它的立体异构体和任何生理学上可耐受的盐：
Figure BDA0004020393580000071
本文所述的某些化合物是新的并且这些构成本发明的另一方面。
因此，在另一方面，本发明提供通式(I)的化合物或其立体异构体或生理学上可耐受的盐，其中所述化合物不是：
Figure BDA0004020393580000072
Figure BDA0004020393580000073
或者
Figure BDA0004020393580000074
本文所述的任何化合物都可以以生理学上可耐受的盐的形式使用。“生理学上可耐受的”是指适于施用至动物体的任何组分，特别是适于***内给药的任何组分。术语“生理学上可耐受的盐”是指本文所述的任何化合物的任何生理学上可耐受的有机或无机盐。这种盐可以包括一种或更多种附加分子，如抗衡离子。抗衡离子可以是稳定母体化合物上电荷的任何有机或无机基团。如果用于本发明的化合物是碱，那么可通过使游离碱与有机或无机酸反应来制备合适的药学上可接受的盐。如果用于本发明的化合物是酸，那么可通过使游离酸与有机或无机碱反应来制备合适的药学上可接受的盐。
本文所述的任何化合物可以利用无机或有机酸或碱转化为其盐，尤其是其生理学上可耐受的盐。用于盐形成的程序在本领域中是常规的。
例如，本文所述的化合物的合适的生理学上可耐受的盐是具有足够碱性的化合物的酸加成盐，例如，与如无机或有机酸的酸加成盐。可以用于此目的的酸包括盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磺酸、甲磺酸、磷酸、富马酸、琥珀酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、丙二酸、马来酸、乙酸、三氟乙酸和抗坏血酸、对甲苯磺酸、2-均三甲苯磺酸、1,2-乙二磺酸、脂肪酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、乙磺酸或烟酸。
此外，本文所述化合物的合适的生理学上可耐受的盐是，例如，具有足够酸性的化合物的碱加成盐，例如金属盐，例如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、锌盐或铝盐、铵盐或与提供生理学上可接受的阳离子的有机碱的盐，其包括氢氧化季铵，例如甲胺、乙胺、二乙胺、三甲胺、叔丁胺、三乙胺、二苄胺、N,N-二苄基乙胺，环己基乙胺、三-(2-羟乙基)胺、羟乙基二乙胺、(IR,2S)-2-羟基茚-1-胺、吗啉、N-甲基哌啶、N-乙基哌啶、哌嗪、甲基哌嗪、金刚胺、氢氧化胆碱、氢氧化四丁基铵、氢氧化三-(羟甲基)甲胺、L-精氨酸、N-甲基D-葡糖胺、赖氨酸或精氨酸，以及有机胺如二乙胺、三乙胺、乙醇胺、二乙醇胺，环己胺和二环己胺。
可以理解的是，本文所述的某些化合物可能含有一个或更多个立体中心，因此可能以不同的立体异构形式存在。术语“立体异构体”是指具有相同化学组成但是在原子或基团的空间布置方面不同的化合物。立体异构体的实施例是对映异构体和非对映异构体。术语“对映异构体”是指化合物的为彼此的不可重叠的镜像的两种立体异构体。术语“非对映异构体”是指具有两个或更多个立体中心的不是彼此的镜像的立体异构体。本发明被认为扩展到非对映异构体和对映异构体，以及比例不是1∶1的外消旋混合物和对映体富集混合物的用途。
本文所述的化合物可以拆分为其对映异构体和/或非对映异构体。例如，在这些化合物含有仅一个手性中心的情况下，这些化合物可以以外消旋体或外消旋混合物(50:50的对映异构体的混合物)的形式提供，或者可以以纯对映异构体形式，即R形式或S形式提供。以外消旋体形式出现的化合物中的任何化合物可以通过本领域已知的方法(如手性相上的柱分离)或通过从光学活性溶剂中重结晶分离成其对映异构体。具有至少两个非对称碳原子的那些化合物可以基于其物理化学差异使用本身已知的方法，例如通过色谱和/或分级结晶拆分为其非对映异构体，并且在获得呈外消旋形式的这些化合物的情况下，其以随后可以拆分为其对映异构体。
本文公开的化合物或者是本领域已知的，或者可以通过本领域的技术人员已知的方法制备。一些化合物是市售于包括Enamine在内的来源。例如，本文所述的1号化合物可从Enamine以目录号Z19304321获得。
本领域未知的本文所述的任何化合物可以使用本领域已知的合成方法(诸如在已知教科书中描述的那些，例如，Advanced Organic Chemistry(March,WileyInterscience,5th Ed.2001)或者Advanced Organic Chemistry(Carey和Sundberg,KA/PP,4th Ed.2001))从容易获得的起始原料来制备。
以下反应方案显示了制备式(I)化合物和关键中间体的一般方法。用作起始原料的化合物是文献中已知的或者可以是市售的。可替代地，这些化合物可以容易地通过文献中已知的方法获得。可以理解的是，在使用不同起始原料、不同试剂和/或不同反应条件时，可以使用其他合成路径来制备化合物。
Figure BDA0004020393580000101
其中
Ar1是
Figure BDA0004020393580000102
Ar2是
Figure BDA0004020393580000103
LG＝离去基团
R1-R10是如本文所定义的方案1
方案1显示了制备用于本发明的化合物的一般方法，其中：(a)(i)K2CO3，丙酮，回流；(b)(i)甲苯，回流；(c)(i)MeOH，NaI水溶液；(c)(ii)NaOH，H2O，加热；(d)(i)DCM或MeOH，室温；(d)(ii)NaOH，H2O，加热。
方案1中使用的起始原料可以由容易获得的起始原料和/或根据方案2中的方法来制备：
Figure BDA0004020393580000111
方案2
方案2显示了构建片段A的一般方法，其中：(a)(i)NEt3，DCM，室温(US2019/0031655)；(b)(i)NaNO2，HBF4，H2O，0℃，然后是CuSO4，Cu2O，rt；(ii)吡啶，DCM；(c)(i)NaNO2，HBF4，H2O，0℃，然后是K((CH＝CH2)(BF3))，Pd 2(μ-OAc)2(P(o-Tol)3)2，MeOH，室温；(c)(ii)9-BBN，THF，rt，然后是H2O2，NaOH，EtOH；(c)(iii)TEMPO，NaOCl，NaClO2，MeCN，室温；(c)(iv)iPrMgCl，THF，TBME，-10℃至室温，然后是2-氯-N-甲氧基-N-甲基乙酰胺，0℃(J.Org.Chem.2014,79:8917-8925)。6-氨基-3,4-苯并二恶烷和3,4-二甲氧基苯胺也是市售的；这些化合物的变体和其中一个芳族H被取代的苯并[1,3]二氧杂-5-胺可以是市售的，也可以根据本文所示的方法制备。
Figure BDA0004020393580000121
方案3
方案3显示了构建片段B的一般方法，其中：(a)(i)SOCl2，rt，然后是NH2NH2.H2O，THF，0℃(WO 2008/118745)(a)(ii)CS2，KOH，EtOH，回流(Chem.Pap.2019，73:17-25)；(b)(i)SOCl2，rt，然后是NH2NH2.H2O，THF，0℃(WO 2008/118745)；(b)(ii)三光气，DIPEA，DCM，室温；(c)(i)SOCl2，rt，然后是NH2NH2.H2O，THF，0℃(WO 2008/118745)；(c)(ii)BrCN，MeOH，回流；(d)(i)LiAlH4，THF，0℃至室温(J.Med.Chem.2013,56,3725-3732)；(d)(ii)MnO2，MeCN，室温(Tetrahedron 2002,58,2813-2819)；(d)(iii)TMSCN，MeCN，回流(Tetrahedron2002,58:2813-2819)；(d)(iv)DDQ，1,4-二恶烷(Tetrahedron 2018,74:217-223)；(v)Pd/C，H2，H3CCOOH，室温(Tetrahedron Lett.2009,50:4343-4345)；(d)(vi)CS2，Na2CO3，EtOH，回流；(e)(i)[Rh(OH)(cod)]2，DPPP，NaOH，H2O，PhMe，100℃(Org.Lett.2010,12:992-995)；(e)(ii)ClH2CCOCl，1,4-二恶烷，加热(.J.Heterocycl.Chem.2007,44:109-114)；(e)(iii)H2O，N2NCHO，110℃(J.Org.Chem.1988,53:5446-5453)；(e)(iv)H2NCN，EtOH，回流；(f)(i)tBuONO，CuCl2，加热；(f)(ii)H2O，LiOH，THF。其中一个芳族H已被取代的1H-吲哚-3-羧酸的变体是市售的，也可以根据本文所示的方法制备。吲哚N的烷基化可以根据方案12中的方法实现。
Figure BDA0004020393580000131
方案4
方案4显示了构建片段C的一般方法(如果相应的苯酚不市售)，其中：(i)NaNO2，HBF4，H2O，0℃，然后是CuSO4，Cu2O，室温。6-氨基-3,4-苯并二恶烷和3,4-二甲氧基苯胺也是市售的。这些化合物的变体和其中一个芳族H已被取代的苯并[1,3]二氧代-5-胺可以是市售的，也可以根据本文所示的方法制备。
Figure BDA0004020393580000141
方案5
方案5显示了构建片段D的一般方法，其中：(a)(i)SOCl2，室温，然后是NH2NH2.H2O，THF，0℃(WO 2008/118745)；(a)(ii)ClCH2COOH，POCl3，80℃(Eur.J.Med.Chem.2013,63,22-32)；(a)(iii)H2C(CO2Me)2，NaH，THF，0℃，然后是1H-吲哚-3-羧酸酰肼，NaI，室温；(a)(iv)LiOH，THF/MeOH/H2O，室温；(a)(v)DMF，加热；(a)(vi)SOCl2，甲苯，回流；(b)(i)SOCl2，室温；(b)(ii)5-氨基乙酰丙酸甲酯，NEt3，DCM，(b)(iii)伯吉斯试剂，NEt3，MeCN，回流；(b)(iv)LiOH，THF/MeOH/H2O，室温；(b)(v)SOCl2，甲苯，回流；(c)(i-v)见方案3d；(c)(vi)4-氯-4-氧代丁酸乙酯，吡啶，室温；(c)(vii)P2O5，CHCl3，加热；(c)(viii)LiOH，THF/MeOH/H2O，室温；(c)(ix)SOCl2，甲苯，回流。其中一个芳族H已被取代的1H-吲哚-3-羧酸的变体是市售的，也可以根据本文所示的方法制备。吲哚N的烷基化可以根据方案12中的方法实现。
Figure BDA0004020393580000151
方案6
方案6显示了构建片段E的一般方法(所有片段A化合物都可以用作起始原料)，其中：(i)NH3，EtOH，加热。其中一个芳族H被取代的这些化合物的变体可以是市售的，也可以根据本文所示的方法制备。
Figure BDA0004020393580000152
方案7
方案7显示了构建片段F的一般方法，其中：(i)NH3，CDI，DMF，室温(Chim.Acta1994,77,1886-1894)；(ii)Cl3CCHO，PhMe，加热；(iii)PCl5，Et2O；(iv)PPh3，PhH，加热。其中一个芳族H被取代的这些化合物的变体可以是市售的，也可以根据本文所示的方法制备。
Figure BDA0004020393580000153
方案8
方案8显示了构建片段G的一般方法(所有片段A化合物都可以用作起始原料)，其中：(a)(i)KI，丙酮，回流；(b)(i)Na2CO3，H2O，NMP，加热；(b)(ii)Tf2O，2,6-二甲基吡啶，DCM，-78℃(其中一个芳族H已被取代的这些化合物的变体可以是市售的，也可以根据本文所示的方法制备)。
Figure BDA0004020393580000161
方案9
方案9显示了构建片段H的一般方法，其中：(a)(i)Na2S，MeOH，室温；(b)(i)PhCOCH2Br，DCM，室温；(b)(ii)NaOMe，MeOH，室温(其中一个芳族H被取代的这些化合物的变体可以是市售的，也可以根据本文所示的方法制备)。
Figure BDA0004020393580000171
方案10
方案10显示了合成各种不市售的单取代1H-吲哚-3-羧酸的方法，其中：(a)(i)CBr4，PPh3，DCM，0℃(Tetrahedron Lett.2011,52:1815-1818)；(a)(ii)Cs2CO3，DMSO，120℃(Tetrahedron Lett.2011,52:1815-1818)；(b)(i)POCl3，DMF，0℃至40℃(US2017/0066717)；(b)(ii)NaOH，MeOH/THF，80℃(各异构体4-(三氟甲基)-1H-吲哚，6-(三氟甲基)-1H-吲哚和7-(三氟甲基)吲哚也可按照该顺序用作起始原料)(EP 1990335)；(c)(i)NEt3，THF，0℃(J.Org.Chem.2014,79:2105-2110)；(c)(ii)200℃(J.Org.Chem.2014,79:2105-2110)；(c)(iii)PhNH2，Pd2(dba)3，NaHCO3，新戊酸，DMA，120℃(CN104892485)；(c)(iv)NaOH，MeOH/THF，80℃；(d)(i)H2SO4，MeOH，回流；(d)(ii)Pd/C，H2，MeOH；(d)(iii)NaOH，MeOH/THF，80℃；(e)(i)H2SO4，MeOH，回流(Chem.Pap.2018,72:1369-1378)；(e)(ii)K((CH＝CH2)(BF3))，PdCl2，PPh3，Cs2CO3，THF/H2O，加热；(e)(iii)Pd/C，H2，MeOH，室温；(e)(iv)NaOH，MeOH/THF，80℃。可以使用不同地取代的溴吲哚获得其他取代模式；C3和C4烷基异构体可以使用合适的市售有机三氟硼酸盐或有机硼酸或酯以类似的方式并入；(f)(i)H2SO4，EtOH，回流；(f)(ii)EtI、K2CO3、丙酮、加热；(f)(iii)KOH、EtOH、加热(可通过使用不同地取代的羟基吲哚获得其他取代模式；其他C1-C4部分可使用适当的市售烷基碘或烷基溴并入。
Figure BDA0004020393580000181
方案11
方案11显示了制备N-烷基取代的吲哚的一般方法(5-和6-硝基-1H-吲哚-3-羧酸也是市售的，也可以按此顺序用作起始原料；其他烷基可以使用合适的醛或酮并入)，其中：(i)H2SO4，MeOH，回流；(ii)Pd/C，H2，MeOH，室温(Bioorg.Med.Chem.Lett.2011,21:1782-1785)；(iii)H3CCH2CHO，Pd/C，H2，MeOH，室温；(iv)NaOH，MeOH/THF，80℃。
Figure BDA0004020393580000182
方案12
方案12显示了制备N-烷基化吲哚的一般方法。(i)H2SO4，MeOH，回流(Org.Biomol.Chem.2012,10:6885-6892)；(ii)NaH，THF，然后是EtI，70℃(WO 2008/087529)(iii)NaOH，THF/MeOH(Bioorg.Med.Chem.Lett.2005,15:2734-2737)。其他C1-C4部分可以使用合适的市售烷基碘或烷基溴并入。
Figure BDA0004020393580000191
方案13
方案13显示了非市售的三氟甲基取代的苯胺的合成方法(一些未在此表示的只是在O上的取代基有所不同：这些取代可以通过在合成的适当的阶段应用方案20中所示的一般方法来实现)，其中：(a)(i)F2ClCCO2Me，KF，CuI，DMF，加热；(a)(ii)SnCl2.2H2O，EtOH，回流；(b)(i)F3CCOOH，XeF2，DCM，室温(J.Org.Chem.1988,53,4582-4585)(b)(ii)SnCl2.2H2O，EtOH，回流；(c)(i)NaClO2，磺酰胺，MeOH，H2O，0℃(EP2557082)；(ii)DPPA，NEt3，苯，回流，然后是LiOH，THF/H2O，室温。
Figure BDA0004020393580000192
方案14
方案14显示了非市售的氰基取代的苯胺的合成方法(2,3-二氢-苯并[1,4]二恶英-5-甲腈也是市售的，并且可以按照该序列用作起始原料；转化为相应的二氧戊环可以通过在合成的适当阶段应用方案20中所示的一般方法来实现)，其中：(i)三氟甲基磺酸酐，Me4N(NO3)，DCM(J.Org.Chem.2003,68,267-275)；(ii)Fe，H3CCOOH，iPrOH，加热(J.Heterocycl.Chem.1986,23:1821-1828)；(iii)Fe，HCl，EtOH，回流(WO 2018/232094)。
Figure BDA0004020393580000201
方案15
方案15显示了非市售的卤素取代的苯胺的合成方法(一些未在此表示的只是在O上的取代基有所不同：这些取代可以通过在合成的适当的阶段应用方案20中所示的一般方法来实现)，其中：(a)(i)Br2，H3CCOOH，室温(WO 2011/025798)；(a)(ii)BBr3，DCM；)a)(iii)CH2I2，K2CO3，DMF，加热；(a)(iv)Pd/C，H2，EtOH；(b)(i)Br2，H3CCOOH(TetrahedronLett.2008,49,5309-5311)；(b)(ii)硫酸二甲酯，K2CO3(Tetrahedron Lett.2008,49:5309-5311)；(b)(iii)Pd/C，H2，EtOH；(b)(iv)BBr3，DCM；(b)(v)CH2I2，K2CO3，DMF，加热；(b)(vi)Pd/C，H2，EtOH；(c)(i)DPPA，NEt3，PhMe，回流，然后是9-芴甲醇，回流，然后是哌啶，室温；(d)(i)HNO3，0-20℃(WO 2013/052568)；(d)(ii)Pd/C，H2，EtOH；(d)(iii)PtO2，H2，EtOH(WO2013/052568)。
Figure BDA0004020393580000211
方案16
方案16显示了非市售的羟基取代的和烷氧基取代的苯胺的方法(2H-苯并[d][1,3]二氧戊环-4-醇和2,3-二氢-1,4-苯并二恶英-5-醇也是市售的，可用作顺序a、b和e的起始原料；4,5-二甲氧基-2-硝基-苯酚和7-硝基-2,3-二氢-苯并[1,4]二恶英-6-醇也是市售的，可在顺序d中用作起始原料；2,3-二甲氧基苯酚和2,3-二氢-1，4-苯并二恶英-5-醇也可用作顺序e中的起始原料；其他C1-C4部分可以使用适当的市售烷基碘或烷基溴并入)。在该方案中：(a)(i)BnBr，K2CO3，MeCN，回流(Chem.:Eur.J.2016,22:15058-15068)；(a)(ii)HNO3，(CH3CO)2O，室温；(a)(iii)Pd/C，H2(20psi)，EtOH，室温(US6,048,866)；(b)(i)HNO3，H2O，H3CCOOH，5℃(US6,337,420)；(b)(ii)Pd/C，H2，MeOH；(c)(i)EtI，K2CO3，DMF，室温；(c)(ii)Pd/C，H2，MeOH；(d)(i)MeI，K2CO3，丙酮；(d)(ii)HNO3，(H3CCO)2O，室温(WO 2004/046120)；(d)(iii)Pd/C，H2，MeOH；(e)(i)HNO3，H2O，H3CCOOH，5℃(US6,337,420)；(e)(ii)硫酸二甲酯，K2CO3，二甲苯(J.Chem.Soc.1931,2542-2549)；(e)(iii)Sn，HCl(J.Chem.Soc.1931,2542-2549)。
Figure BDA0004020393580000221
方案17
方案17显示了非市售的硝基取代的苯胺的合成方法(一些未在此表示的只是在O上的取代基有所不同：这些取代可以通过在合成的适当的阶段应用方案20中所示的一般方法来实现)，其中：(a)(i)DPPA，NEt3，PhMe，回流，然后是9-芴甲醇，回流，然后是哌啶，室温；(b)(i)SOCl2，DMF，1,2-DCE，加热，然后是NaN3，丙酮/H2O，5℃，然后是H3CCOOH/H2O，加热(J.Med.Chem.1999,42:2373-2382)。
Figure BDA0004020393580000231
方案18
方案18显示了非市售的硝基取代的苯胺的合成方法(一些未在此表示的只是在O上的取代基有所不同：这些取代可以通过在合成的适当的阶段应用方案20中所示的一般方法来实现；其他C2-C4烷基异构体可以使用合适的市售有机三氟硼酸酯或有机硼酸或酯以类似的方式并入)。在这个方案中：(a)(i)HNO3，-10℃(Tetrahedron 1985,41:2355-2359)；(a)(ii)Pd/C，H2，MeOH，<586托，室温(Tetrahedron 1985,41:2355-2359)；(b)(i)异丙烯基硼酸频哪醇酯，Pd(dppf)Cl2，NaHCO3，1,4-二恶烷/H2O，100℃(WO 2017/160569)；(b)(ii)Pd/C，H2(50psi)，MeOH(WO 2017/160569)；(c)(i)NaOH，DMSO/H2O，90℃，然后是CH2I2(US2008/0234314)；(c)(ii)HNO3，(H3CCO)2O，-10℃(US 2008/0234314)：(c)(iii)Fe，HCl，EtOH/H2O，回流(US 2008/0234314)；(d)(i)异丙烯基硼酸频哪醇酯，Pd(dppf)Cl2，NaHCO3，1,4-二恶烷/H2O，100℃；(d)(ii)Pd/C，H2(50psi)，MeOH；(e)(i)NaH，然后是MeI(Czech.Chem.Commun.2000,65:924-940)；(e)(ii)MeCN，nBu4NClO4(Czech.Chem.Commun.2000,65:924-940)；(e)(iii)NaOH，EtOH/H2O，加热。
Figure BDA0004020393580000241
方案19
方案19显示了非市售的N取代的苯胺的合成方法(一些未在此表示的只是在O上的取代基有所不同：这些取代可以通过在合成的适当的阶段应用方案20中所示的一般方法来实现；其他烷基基团可以使用可以使用合适的醛、酮或烷基卤化物并入)。在该方案中：(a)和(b)(i)H3CCH2CHO，Pd/C，H2，MeOH，室温；(ii)NaOH，MeOH/THF，80℃；(iii)DPPA，NEt3，PhMe，回流，然后是9-芴甲醇，回流，然后是哌啶，室温；(iv)EtBr，NaOH，PhH，加热；(v)NaOH，MeOH/THF，80℃；(vi)DPPA，NEt3，PhMe，回流，然后是9-芴甲醇，回流，然后是哌啶，室温；(c)(i)HCl，MeOH/H2O(US 4,287,341)；(c)(ii)H3CCH2CHO，Pd/C，H2，MeOH，室温；(c)(iii)NaOH，MeOH/THF，80℃；(c)(iv)DPPA，NEt3，PhMe，回流，然后是9-芴甲醇，回流，然后是哌啶，室温；(c)(v)HCl，MeOH/H2O(US 4,287,341)；(c)(vi)EtBr，NaOH，PhH，加热；(c)(vii)NaOH，MeOH/THF，80℃；(c)(viii)DPPA，NEt3，PhMe，回流，然后是9-芴甲醇，回流，然后是哌啶，室温。具有NH2而不是被烷基化的化合物，可以通过在合成的适当阶段使用本文描述的示例性程序还原相应的NO2来获得。
Figure BDA0004020393580000251
方案20
方案20显示了1,2-二羟基苯部分上的取代基相互转化的一般方法，其中：(i)BBr3，DCM；(ii)硫酸二甲酯，K2CO3，丙酮，加热；(iii)BBr3，DCM；(iv)CH2 Br2，K2CO3，DMF，加热。
本文所述的化合物在提高***活力方面具有有用的特性。一方面，本发明提供了式(I)化合物、其立体异构体或生理学上可耐受的盐用于增强获自非人类哺乳动物的***的活力的用途。
***细胞显示出不同的运动模式，以适应其在空间和时间上的功能需求。例如，可以通过计算机辅助***分析仪(CASA)监测这些运动，该分析仪记录和分析***头部的运动。已经证明，像是平均路径速度(VAP)、曲线速度(VCL)、直线度(STR)、线性度(LIN)和横向头部位移幅度(ALH)等因素都与***质量直接相关。“***活力”在本文中定义为正在运动的***的百分比并且可以再划分为前向运动、非前向运动和不动(即没有运动)。在***中，***细胞大多表现出快速向前运动(称为“前向运动”)，这是细胞穿过子宫颈所必需的。“非前向运动”是指没有进行性的所有其他运动模式。***获能的复杂过程(哺乳动物***成熟的倒数第二个步骤是使它们能够使卵子受精所必需的)一旦细胞进入子宫就开始了。过度活化或“过度运动”是获能的标志并且观察到这种运动行为是一种有力且不对称的游动模式，这有助于***从输卵管上皮释放并随后穿透***。由于***活力会影响***通过女性生殖道(体内)或通过水(体外)到达卵子的能力，因此它是成功受精的一个因素。在哺乳动物中，***活力也有助于***通过卵丘和哺乳动物***周围的透明带。
本文所述的化合物在与成熟的哺乳动物***细胞接触时具有使一般***活力增强作用，即它们起到“***活化剂”的作用。特别是，它们能够增加***的前向运动。鉴于这些特性，这些化合物适用于在体内或体外增强卵子的受精，因此可用于生育程序。
本文对“增强***活力”的任何提及意指与未与本文所述化合物接触的对照哺乳动物(或来自同一哺乳动物)的***活力相比提高了***活力。本文中对化合物或组合物“增强***活力”的用途的任何提及应据此解释。
在一些实施方式中，本文所述的化合物能够增加所有形式的***活力。在一些实施方式中，所述化合物可以能够增加进行性和过度活化的运动。在一些实施方式中，它们可以能够增加前向运动。例如，在公猪中，进行性***可以定义为显示平均路径速度(VAP)大于45μm/s和直线度(STR)大于45％的那些细胞。例如，公猪***的过度活化运动可以根据Schmidt和Kamp(Induced Hyperactivity in Boar Spermatozoa and its Evaluation byComputer-Assisted Sperm Analysis,Reproduction,128:171-179,2004)中讨论的参数来定义。尤其是，公猪中过度活跃的***可以定义为显示曲线速度(VCL)大于97μm/s和线性度(LIN)小于32％以及平均头部横向位移(LHD平均值)大于3.5μm以及摆动(WOB)小于71％的那些细胞。
在一些实施方式中，本文所述的化合物能够将来自非人类哺乳动物的***样品中进行性和/或过度活化的成熟***细胞的比例增加高达20％，例如高达15％，例如10-15％。
在另一个方面，本发明提供了一种增强获自非人类哺乳动物的***活力的方法，所述方法包括使所述***体外与本文所述的有效量的式(I)化合物或立体异构体或其生理学上可耐受的盐接触的步骤。任选地，该方法可以额外包括从所述哺乳动物获得或收集***的步骤。这种方法在牲畜和其他动物的繁殖中是众所周知的。
如本文所用，术语“有效量”旨在表示***活力增强浓度。达到所需活性所需的浓度将取决于各种因素，诸如特定化合物及其预期用途，并且可以根据需要进行变化或调整。通常，所需的浓度可以在50至100μM的范围内，例如55至95μM、60至90μM、70至85μM或者75至80μM。
鉴于它们增加***活力的能力，例如增加进行性***活力，本文描述的化合物特别适用于人工授精方法。
为了根据本发明使用，本文所述的化合物与成熟的***细胞接触，从而增加它们的运动。例如，它们可以与取自非人类哺乳动物的***样品混合。在本文所述的任何用途或方法中，化合物通常配制成可添加到***(例如***样品)中以增强***活力的组合物。此类组合物可包含式(I)的活性化合物、其立体异构体或生理学上可接受的盐，与一种或更多种生理学上可耐受的载体、赋形剂或稀释剂结合。这样的组合物形成本发明的另一方面。为此目的可接受的载体、赋形剂和稀释剂在本领域中是众所周知的并且可以容易地选择。实施例包括溶剂、增溶剂、防腐剂(例如抗氧化剂)、***增量剂、缓冲剂(例如TRIS-(三(羟甲基)氨基甲烷))、pH调节剂(例如柠檬酸)、黏度改进剂、稳定剂和张度调节剂。例如，合适的载体可以包括DMSO、水、磷酸盐缓冲液和盐水。
在一个实施方式中，可将用于本发明的化合物配制成液体组合物，当与***样品混合时，该组合物适用于***给药。例如，化合物可以溶解或分散在合适的溶剂中。本领域技术人员在考虑到溶剂是生理学上可耐受的时可以容易地选择合适的这些溶剂。
如本文所用，关于任何化合物或组合物的术语“生理学上可耐受的”是指该化合物或组合物在化学和/或毒理学上与制剂的其他组分相容或与将对施用其的受试者相容。
如本文所用，术语“***增量剂”(或“增量剂”)是指能够维持***样品的活力，即保持其受精能力的任何组分或组分结合。它的作用是保护***细胞免受其自身有毒副产物的影响，同时还保护***细胞在冷藏和/或运输过程中免受冷休克和渗透休克。***的冷却会降低其新陈代谢，因此有助于其储存。例如，通常已知用作***增量剂的成分包括蛋黄、乳蛋白、膜保护剂、蛋白质、糖、抗氧化剂、抗生素(例如替卡西林、替美汀、硫酸阿米卡星、青霉素、庆大霉素、泰乐菌素、大观霉素、林可霉素、链霉素或其组合，或根据欧盟指令88/407的其他抗生素)、磷脂、甘油、缓冲液(例如TRIS)、柠檬酸及其组合。用于猪的市售***增量剂包括
Figure BDA0004020393580000281
(其中包含磷脂、TRIS、柠檬酸、糖、抗氧化剂、缓冲剂、甘油、水和抗生素)、
Figure BDA0004020393580000282
Figure BDA0004020393580000283
CCS和
Figure BDA0004020393580000284
(均含有TRIS、柠檬酸、糖、缓冲剂、甘油、水和符合欧盟指令88/407的抗生素(例如泰乐菌素、庆大霉素、大观霉素和林可霉素))。
根据本发明的组合物可以使用常规技术制备，诸如溶解和/或混合程序。
在一个实施方式中，可以在冷冻保存之前将活化剂化合物或含有本文所述化合物的组合物添加到***样品中。***的低温保存允许更长时间地储存***，例如，当需要运输以供使用时，或者将在以后使用时。当以这种方式使用时，低温组合物可以另外包括冷冻增量剂(通常也称为“冷冻保护剂”或“冷冻保存佐剂”)，其有助于在冷冻和随后的解冻过程中保护***。典型的冷冻保护剂包括，例如，甘油、甘露醇、蔗糖、海藻糖、DMSO和二甲基甲酰胺(DMF)。
在一个实施方式中，可以将活化剂化合物或含有本文所述化合物的组合物添加到新鲜***样品中。或者，这可以在解冻后添加到冷冻保存的***样本中。
为了用于人工授精，化合物和组合物可用于预处理或制备用于这种程序的***。例如，用于人工授精程序的***可以在***给药至雌性哺乳动物之前在体外与所述化合物或所述组合物接触(即“预处理”)。接触可以包括与所述化合物或所述组合物一起孵育。孵育时间可以变化，但可以在使用前约15至45分钟的范围内，例如在使用前约15至20分钟。孵育后，处理过的***样本是“即用”的。通过预处理打算在这种程序中使用的***，其有可能提高受精率和/或增加后代的数量。
在另一方面，本发明因此提供了一种处理或制备用于人工授精程序的***的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供来自哺乳动物男性受试者的***样本；和
(b)使所述***样品与本文所述的化合物或组合物接触。
***样本可以是新鲜的***样本，也可以是冷冻保存和解冻的***样本。通过这种方法获得或可获得的处理过的***也构成了本发明的一个方面。
在另一方面，本发明提供了一种非人类哺乳动物雌性人工授精的方法，所述方法包括用本文所述的处理过的***对所述雌性进行授精的步骤。可以理解的是，雌性将有生育能力。
为了用于人工授精，固定体积的***可以与单剂量的含有本文所述的活化剂化合物的组合物组合，并轻轻搅拌(例如小心地倒转)以确保充分混合以形成“活化”剂量的***。然后这可用于使用本领域常规方法对雌性进行授精。典型的固定体积的***可以在约70至100mL的范围内，例如80至95mL，优选地约90mL。例如，单剂量的组合物可以含有为20至100μL，优选30至80μL，例如约50μL的100mM的活化剂化合物溶液。
可以根据本发明进行处理的非人类哺乳动物受试者包括，尤其是农场动物(例如羊、牛、猪等)，但也可以是包括家畜(例如狗、猫等)和实验室动物(例如小鼠、大鼠、猴子等)。特别优选的哺乳动物是猪。可以从本发明受益的其他哺乳动物包括马(例如竞赛马)和濒危动物物种。
实施例
现在将通过以下非限制性实施例和示出以下参考附图更详细地描述本发明：
图1：A：在1号化合物存在下公猪***的％活化；以及B：在1号化合物存在下公猪***的活力和前向运动。
图2：将1号化合物添加到在18℃下储存1至8天的***样品中后，公猪***的前向运动和活力。
图3：与在1号化合物存在下孵育的小鼠***细胞接触的小鼠***的体外受精率(％受精)。
图4：不同浓度的1号化合物对人类T细胞的基因毒性。
图5：用未经处理的“对照”公猪***和用1号化合物(“活化剂”)孵育的公猪***进行人工授精后每头母猪的平均胚胎数。
实施例1-***活力和前向运动的测定
方法：
杜洛克公猪***样本来自Norsvin AS，其中包含来自三头公猪的混合***。使用前，在18℃下，将***样本储存在
Figure BDA0004020393580000301
增量剂(微型管)中。使用2倍系列稀释(包括从100μM开始的10个单独浓度)重复测试1号化合物。将995μL的***等分分装在Eppendorf管中，并加入5μL的稀释于DMSO中的1号化合物，达到所述最终浓度。将所得***样品轻轻混合，并在37℃水浴中孵育12分钟。随后，将10μL的每个***样本添加到计数室载玻片(Leja)中，并在37℃的平板培养箱中孵育。从14分钟开始，使用CASA(Hamilton Thorne)测定***活力、前向运动和曲线速度。对于每个腔室A和B，分析了15个单独的帧，并读出了活力和前向运动数据。使用仅DMSO对照(设置为100％活性)，通过确定相对于未添加1号化合物的对照样品的运动或前向运动的百分比增加，将数据转换为活化-％。为了确定EC50值，使用Prism8拟合数据(非线性拟合，绝对IC50，x是浓度，graphpad.com)。
结果：
对于不同的测试浓度(n＝6)，在1号化合物存在下公猪***的活化(“活化-％”)如图1A所示。用于确定EC50值的相应曲线拟合显示为活力和前向运动。绝对EC50活力：3.31μM；绝对EC50前向运动：11.17μM。如图1B所示，1号化合物以剂量依赖性方式(n＝4)增加活力和前向运动。
实施例2-长期储存的影响–公猪***
方法：
评估了1号化合物(“活化剂”)对公猪***保质期的影响。将1号化合物新加入到所储存的公猪***等分试样中。
***样本作为等分试样于18℃储存在Eppendorf试管(995μl)中。在一周的过程中，将5μl 10mM DMSO中的活化剂溶液(50μM的最终浓度)添加到一个等分试样中，并将所得溶液在37℃下的水浴中孵育12分钟。随后，取出10μl***样品并添加到计数室载玻片中，在37℃下孵育2分钟并如实施例1所述进行分析。
结果：
添加1号化合物后所储存的***样品的活力和前向运动如图2所示。结果表明，即使在储存7天后，在所储存的公猪***样本中添加活化剂溶液也会增加活力和前向运动，因此对公猪***的保质期产生积极影响。
实施例3-体外受精-小鼠
方法：
进行体外受精(IVF)研究以确定1号活化剂化合物是否对受精过程有任何副作用。处死雄性小鼠，打开附睾，将***释放到培养皿中的适当缓冲液中。在将等分试样转移到含有***的培养皿中之前，将***细胞与50μM的活化剂化合物一起孵育一小时。将细胞在37℃下再孵育，24小时后计数1-细胞/2-细胞卵。使用来自相同附睾的***和来自两只不同小鼠的***进行重复实验。
结果：
用1号化合物处理的***显示出与对照样品相当的生育率。结果在小鼠IVF的正常受精率50％到80％的范围内(见图3)。因此，1号化合物不会干扰受精过程。
实施例4-基因毒性
方法：
将人类T细胞(四种浓度的包括0μM的1号化合物；两次暴露时间)嵌入1％琼脂糖中，在pH 10，冷的2.5M的NaCl、0.1M的EDTA、10mM的Tris缓冲液和1％ Triton X-100中裂解。与二硫苏糖醇和二碘水杨酸锂一起孵育后，然后在冷的0.3M的NaOH和1M的EDTA中孵育20分钟，然后在冷室中以0.8V/cm电泳20分钟。在用PBS中和并用SYBRGold(Invitrogen)染色后，使用Comet Assay IV图像分析程序(感知仪器(erceptive Instruments))对载玻片进行评分。
结果：
结果总结在表1中，并以图形方式表示在图4中。没有观察到活化剂的遗传毒性作用。
表1
Figure BDA0004020393580000321
实施例5-现场试验性试点研究–用于家畜繁殖的母猪授精
方法：
试点现场研究包括27头母猪，其中13头接受未经处理的对照***，14头接受用1号化合物(“活化剂”)处理的***。在实验过程中，从相同的动物身上采集授精剂量，并包含来自三头公猪的混合***。在授精前将45μl100mM DMSO活化剂溶液直接添加到89ml的公猪***(最终浓度为50μM)中，授精在15至45分钟内进行。将***转移到授精瓶中，然后加入活化剂。将授精导管放入母猪宫颈后，连接瓶子，将***样本释放到母猪体内。母猪在随后的两天接受授精剂量。30至35天后处死动物，取出子宫并对所有30头母猪的胚胎进行计数。对来自5头接受活化剂的母猪和5头来自对照组的器官材料进行光学检查，并对来自子宫、子宫颈和***的样本进行***固定用于组织学检查。对照组和活化剂组的器官材料大多显示正常粘膜，宫颈、子宫和***没有病变迹象。将***标本切割并用苏木精伊红染色用于组织学检查。组织病理学评估包括对黏膜上皮和下层固有层的全面评估。在上皮和固有层中，特别强调急性变化。在上皮中，急性变化包括单细胞坏死/细胞凋亡和多形核白细胞浸润。在固有层中，认为多形核白细胞的浸润是最重要的急性变化。活化剂组五头母猪中的三头母猪和对照组一头母猪表现出主要在宫颈和子宫的大量多形核白细胞浸润。在对照组的一头母猪和接受活化剂组的一只母猪中检测到细胞坏死/细胞凋亡。
认为上皮和固有层中淋巴细胞的浸润是在所有个体的正常范围内。难以评估表面上皮变平和可能的损失部分。在几个个体中检测到固有层水肿和出血。发情和年龄是母猪白细胞浸润的指标，被认为是正常的。
测定对照组母猪(n＝11，授精后猪中11头母猪)和接受活化剂组(n＝13，授精后猪中13头母猪)的平均胚胎数。活化剂不仅提高了母猪的妊娠率，而且还导致每头母猪平均增加2个胚胎(见图5)。
实施例6-现场试验性研究
在实施例5中报告的试点研究成功之后，正在进行一项包括441头母猪的更大规模的现场试验性研究。224头母猪接受了未经处理的对照***，217头母猪接受了用1号化合物(“活化剂”)处理的***。这项更大型研究的结果显示，接受活化剂化合物处理的母猪的妊娠率增加了5％，每头母猪平均多产约1头活仔猪。通过提高受孕率和每头母猪所产仔猪的数量，使用***活化剂可以缩短断奶至成功配种间隔(“WSI”)，即连续怀孕之间的间隔。

Claims (25)

1.一种式(I)化合物、其立体异构体或生理学上可耐受的盐用于增强获自非人类哺乳动物的***活力的用途：
Figure FDA0004020393570000011
其中：
X是-NR’-(其中R’是H或C1-3烷基，例如-CH3)、-O-、-S-或-CH2-；
Y是-S-、-O-、-NR”-(其中R”是H或C1-3烷基，例如-CH3)或-CH2-；
Z1和Z2独立地选自N和CH；
R1至R3独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、-OH、-CN、-NO2和-NR12R13；
R4是氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基或-OH；
R5是氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基或C1-6卤代烷基；
R6和R7独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、-OH、-CN、-NO2和-NR12R13；
R8是氢、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、-CN、-NO2或-NR12R13；
R9是氢或C1-4烷基；
R10和R11独立地选自氢和C1-3烷基；
或R10和R11与介于其间的-O-和环原子一起连接形成二氧戊环；以及
R12和R13独立地选自H和C1-3烷基。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，X是-NR’-(其中R’是H或-CH3)或-O-，优选地其中，X是-NH-或-O-，例如-NH-。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，Y选自-S-、-O-、-NR”-(其中R”是H或-CH3)和-CH2-，优选地其中，Y是-S-。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述化合物为式(II)化合物或其立体异构体或生理学上可耐受的盐：
Figure FDA0004020393570000021
(其中Z1、Z2和R1至R11如权利要求1中所定义)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，Z1和Z2均为N，或Z1和Z2之一为N而Z1和Z2中的另一个为CH。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，Z1和Z2均为N。
7.根据权利要求1所述的用途，其中，所述化合物为式(III)化合物或其立体异构体或生理学上可耐受的盐：
Figure FDA0004020393570000022
(其中X、Y和R1至R11如权利要求1到3中任一项所定义)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，R1至R3独立地选自氢、卤素(例如-F、-Cl或-Br)、C1-4烷基和C1-4卤代烷基(例如-CF3)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，R4是氢、卤素(例如-F、-Cl或-Br)、C1-4烷基和C1-4卤代烷基(例如-CF3)。
10.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，R5是氢、卤素(例如-Cl或-Br)、C1-4烷基和C1-4卤代烷基(例如-CF3)。
11.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，R6至R7独立地选自氢、卤素(例如-F、-Cl或-Br)、C1-4烷基和C1-4卤代烷基(例如-CF3)。
12.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，R8是氢、卤素(例如-F、-Cl或-Br)、C1-4烷基和C1-4卤代烷基(例如-CF3)。
13.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，R9是氢或-CH3，优选地为氢。
14.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，R10和R11独立地选自氢和C1-3烷基(例如-CH3)。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的用途，其中，R10和R11与基于其间的-O-和环原子一起连接形成二氧戊环。
16.根据权利要求1所述的用途，其中，所述化合物为式(IV)的化合物或其立体异构体或生理学上可耐受的盐：
Figure FDA0004020393570000031
(其中Z1、Z2、X、Y和R1至R9如权利要求1至3、5、6和8至13中任一项所定义)。
17.根据权利要求1所述的用途，其中，所述式(I)的化合物是：
Figure FDA0004020393570000032
或其立体异构体或生理学上可耐受的盐。
18.一种根据前述权利要求中任一项在增强前向***活力中的用途。
19.一种组合物，其包含如权利要求1至17中任一项所定义的化合物，与一种或更多种生理学上可耐受的载体、赋形剂或稀释剂结合。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中，所述载体、赋形剂或稀释剂选自糖、抗生素、蛋白质、膜保护剂、抗氧化剂、磷脂、甘油、柠檬酸、溶剂(例如DMSO或水)和缓冲液。
21.一种根据权利要求19或20所述的组合物用于增强获自非人类哺乳动物的***的活力，例如增强所述***的前向运动的用途。
22.一种处理或制备用于人工授精程序的***的方法，所述方法包括：
(a)提供来自非人类哺乳动物男性受试者的***样本；以及
(b)使所述***样品与如权利要求1至17中任一项所定义的化合物或如权利要求19或权利要求20所定义的组合物接触。
23.一种人工授精方法，所述方法包括：
(a)提供来自非人类哺乳动物男性受试者的***样本；
(b)将所述***样品与如权利要求1至17中任一项所定义的化合物或如权利要求19或20所定义的组合物接触；以及
(c)将与所述化合物或组合物接触的所述***样品引入非人类哺乳动物女性受试者的***。
24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述***样品来自公羊、公牛或公猪，优选地来自公猪。
25.一种通式(I)的化合物或其立体异构体或生理学上可耐受的盐，其中，所述化合物不是：
Figure FDA0004020393570000041
Figure FDA0004020393570000042
或者
Figure FDA0004020393570000051
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