CN115747292A - 一种adc药物的体外药效检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种ADC药物的体外药效检测方法。将ADC药物与抗原阳性细胞和/或抗原阴性细胞在第一培养体系中共培养，检测抗原阳性细胞和/或抗原阴性细胞的细胞活力；将ADC药物与抗原阳性细胞和抗原阴性细胞，或将ADC药物与抗原高表达或中表达的阳性细胞和抗原低表达的阳性细胞在第二培养体系中共培养，检测ADC药物对抗原阴性细胞或抗原低表达的阳性细胞的旁杀伤率，共培养时，第一培养体系和第二培养体系中分别采用成球培养基使细胞悬浮生长成球状。本发明方法能够使体外ADC药物与细胞的作用情况接近它们在体内的作用情况，提高ADC药物体内外药效检测结果一致性和旁杀伤活性检测的灵敏度，操作简单、适用性广泛、通量高。

Description

一种ADC药物的体外药效检测方法

技术领域

本发明属于抗体偶联药物药效和特性检测的技术领域，具体涉及一种ADC药物的体外药效检测方法。

背景技术

抗体偶联药物 (antibody-drug conjugate，ADC) 是将单克隆抗体与小分子细胞毒素用连接子连接，其结合了单克隆抗体的高特异性和小分子毒素的细胞杀伤活性，提高了肿瘤药物的靶向性并减少了毒副作用。ADC药物杀伤肿瘤细胞的一般药理机制为ADC药物中的抗体特异性识别并结合肿瘤细胞表面的抗原，ADC药物被抗原阳性细胞内吞进入细胞内，并在细胞内降解释放出小分子细胞毒素，小分子细胞毒素杀伤该抗原阳性细胞。同时，ADC药物还存在旁杀伤或旁观者杀伤作用（bystander killing effect），即抗原阳性细胞被杀伤后，小分子毒素被释放到该肿瘤细胞周围，膜通透性强的小分子毒素可以通过透过周围其他细胞的细胞膜，进一步杀伤周围其他细胞，包括抗原低表达肿瘤细胞或者抗原阴性肿瘤细胞。

体外药效评估是ADC分子筛选的重要步骤，筛选所得的候选药物将被用于后续的体内药效和毒理研究。体外药效主要分为两个部分：第一，通过检测细胞增殖和细胞毒性来评价ADC药物对抗原阳性肿瘤细胞的杀伤能力，常用的检测试剂盒有MTT试剂盒、CCK-8试剂盒和CTG试剂盒等；第二，由于肿瘤异质性的广泛存在，以及肿瘤内部包含为肿瘤生长提供支持环境的***，评价ADC药物的旁杀伤作用也是当前评估ADC药物的重要指标之一。目前较为经典的ADC药物体外药效的检测方法有：1）基于传统细胞培养方式的CTG法，即基于ATP检测的细胞活力检测法；2）沿用第一三共株式会社用于检测Enhertu®旁杀伤作用的方法（抗原阳性细胞和阴性细胞共培养，ADC药物作用后，结合抗原阳性标记和细胞活力再分别统计抗原阳性细胞和抗原阴性细胞的数目）。随着重磅药Enhertu（德喜曲妥珠单抗，DS8201）的巨大成功，对于以拓扑异构酶1抑制剂依沙替康衍生物DXd及其类似分子作为小分子毒素的ADC药物的研究和应用大幅增加，对于具有旁杀伤作用的ADC药物的药效评价的需求也日益增加。但是随着研究的深入，渐渐发现使用上述检测方式时，ADC药物的体内外药效相差很大，包括出现体外检测无药效而体内有药效的情况，尤其在靶点中表达和低表达的阳性细胞上，现有体外检测方法很难检测出ADC药物活性，而在动物肿瘤模型中却显示出药效。由于体外药效检测往往是药物进行初步筛选的步骤，不理想的体外药效会导致此类ADC药物在进入体内药效评估环节前就被淘汰，进而错过较优的候选分子。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种检测结果与体内药效结果一致性更高的ADC药物的体外药效检测方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种ADC药物的体外药效检测方法，将ADC药物与抗原阳性细胞或抗原阴性细胞在第一培养体系中共培养，分别检测抗原阳性细胞或抗原阴性细胞的细胞活力；或，将ADC药物与抗原阳性细胞和抗原阴性细胞在第一培养体系中共培养，检测抗原阳性细胞和抗原阴性细胞的总活力；

将ADC药物与抗原阳性细胞和抗原阴性细胞在第二培养体系中共培养，检测ADC药物对抗原阴性细胞的旁杀伤率；或，将ADC药物与抗原高表达或抗原中表达的抗原阳性细胞和抗原低表达的抗原阳性细胞在第二培养体系中共培养，检测ADC药物对抗原低表达的抗原阳性细胞的旁杀伤率；

其中，所述抗原阴性细胞为所述抗原阴性细胞和浓度小于等于15nM的ADC药物共培养时，ADC药物对其无杀伤作用的细胞，

所述抗原低表达的抗原阳性细胞为所述抗原低表达的抗原阳性细胞和浓度小于等于15nM的ADC药物共培养时，ADC药物对其无杀伤作用且免疫组化实验测定为1+的细胞，

所述抗原高表达的抗原阳性细胞为所述抗原高表达的抗原阳性细胞和浓度小于等于15nM的ADC药物共培养时，ADC药物对其有杀伤作用且免疫组化实验测定为3+的细胞，

所述抗原中表达的抗原阳性细胞为所述抗原中表达的抗原阳性细胞和浓度小于等于15nM的ADC药物共培养时，ADC药物对其有杀伤作用且免疫组化实验测定为2+的细胞，

所述抗原阴性细胞和所述抗原低表达的抗原阳性细胞分别携带荧光素酶基因，所述抗原能够与所述ADC药物中的抗体进行特异性结合，

所述共培养时，所述第一培养体系和所述第二培养体系中分别采用低吸附性培养板，细胞悬浮生长成球状。

本发明中，免疫组化实验为本领域常规实验，利用组织细胞含有的抗原与相应单克隆抗体进行免疫结合，再用组织化学方法染色，显示细胞类型。其中，“免疫组化实验测定为1+”表示弱阳性：任何比例的细胞呈现微弱、不完整膜着色。“免疫组化实验测定为2+”表示阳性为：＞10%的细胞呈现弱至中等强度、完整但不均匀膜棕黄着色，或＜30%的细胞呈现强、完整膜棕褐色染色。“免疫组化实验测定为3+”表示强阳性：＞30%的细胞呈现强、完整膜棕褐色染色。

在一些实施方案中，所述杀伤作用是指药物处理后细胞活力相比相同培养条件下未使用药物处理的细胞活力低至少20%，30%，40%，或50%。

在一些实施方案中，所述无杀伤作用是指药物处理后细胞活力相比相同培养条件下未使用药物处理的细胞活力相差±10%及以内。

优选地，所述第一培养体系中抗原阳性细胞的接种数目为13000~20000个/孔，如13000，14000，15000，15500，16000，17000，18000，19000，20000个/孔。进一步优选地，所述第一培养体系中抗原阳性细胞的接种数目为13000~17000个/孔，更进一步优选为1400~16000个/孔。

优选地，所述第一培养体系中抗原阴性细胞的接种数目为13000~20000个/孔，如13000，14000，15000，15500，16000，17000，18000，19000，20000个/孔。进一步优选地，所述第一培养体系中抗原阴性细胞的接种数目为13000~17000个/孔，更进一步优选为1400~16000个/孔。

优选地，所述第一培养体系中抗原阳性细胞和抗原阴性细胞的接种总数目为20000~30000个/孔，如20000，21000，22000，23000，24000，25000，26000，27000，28000，29000，30000个/孔。

优选地，所述第一培养体系中所述抗原阳性细胞和所述抗原阴性细胞的接种数目比为（3~5）：1，例如3：1，3.1：1，3.3：1，3.5：1，3.7：1，3.9：1，4：1，4.1：1，4.2：1，4.3：1，4.4：1，4.6：1，4.7：1或5：1。

优选地，所述第二培养体系中所述抗原阳性细胞和所述抗原阴性细胞的接种总数目，或所述抗原高表达或抗原中表达的抗原阳性细胞和所述抗原低表达的抗原阳性细胞的接种总数目为20000~30000个/孔，如20000，22000，24000，26000，28000，30000个/孔。

优选地，所述第二培养体系中所述抗原阳性细胞和所述抗原阴性细胞的接种数目比，或所述抗原高表达或抗原中表达的抗原阳性细胞和所述抗原低表达的抗原阳性细胞的接种数目比为（3~5）：1，例如3：1，3.1：1，3.3：1，3.5：1，3.7：1，3.9：1，4：1，4.1：1，4.2：1，4.3：1，4.4：1，4.6：1，4.7：1或5：1。

在一些实施方案中，所述ADC药物在所述第一培养体系中的终浓度为0~10 nM且不为0 nM，如0.001 nM，0.02 nM，0.1 nM，1 nM，2 nM，3 nM，4 nM，5 nM，6 nM，7 nM，8 nM，9 nM或10 nM。在一些实施方案中，所述ADC药物在所述第二培养体系中的投加浓度为0~10 nM且不为0 nM，如0.001 nM，0.02 nM，0.1 nM，1 nM，2 nM，3 nM，4 nM，5 nM，6 nM，7 nM，8 nM，9nM或10 nM。

优选地，所述低吸附性培养板为孔板。

在一些实施例中，所述低吸附性培养板为水凝胶包被的细胞培养板。

在一些实施方案中，所述共培养时，所述第一培养体系和所述第二培养体系中采用的培养基分别为加入了肝素和氢化可的松的无血清培养基或加入了水凝胶的完全培养基。

优选地，当所述第一培养体系采用的培养基为加入了肝素和氢化可的松的无血清培养基时，所述抗原阳性细胞的接种数目为13000~20000个/孔，和/或所述抗原阴性细胞的接种数目为13000~20000个/孔，和/或抗原阴性细胞和抗原阴性细胞的接种总数目为20000~30000个/孔。

优选地，当所述第一培养体系采用的培养基为加入了水凝胶的完全培养基时，所述抗原阳性细胞的接种数目为13000~20000个/孔，和/或所述抗原阴性细胞的接种数目为13000~20000个/孔，和/或抗原阴性细胞和抗原阴性细胞的接种总数目为20000~30000个/孔。

具体地，所述无血清培养基包括但不限于MammoCult^TM培养基。

进一步优选地，所述肝素在所述无血清培养基中的浓度为0.3~8 μg/mL。在一些实施方案中，肝素的浓度为0.3 μg/mL，0.6 μg/mL，0.8 μg/mL，1 μg/mL，1.3 μg/mL，2 μg/mL，2.4 μg/mL，3 μg/mL，3.3 μg/mL，3.4 μg/mL，3.5 μg/mL，3.6 μg/mL，3.7 μg/mL，3.8 μg/mL，3.9 μg/mL，4 μg/mL，5 μg/mL，6 μg/mL，7 μg/mL或8 μg/mL。

进一步优选地，所述氢化可的松在所述无血清培养基中的浓度为0.1~4 μg/mL。在一些实施方案中，氢化可的松的浓度为0.1 μg/mL，0.2 μg/mL，0.3 μg/mL，0.35 μg/mL，0.4μg/mL，0.42 μg/mL，0.47 μg/mL，0.48 μg/mL，0.5 μg/mL，0.6 μg/mL，0.7 μg/mL，0.8 μg/mL，1 μg/mL，2 μg/mL，3 μg/mL或4 μg/mL。

在一些优选实施方案中，所述肝素在所述无血清培养基中的浓度为4 μg/mL，所述氢化可的松在所述无血清培养基中的浓度为0.48μg/mL。

在另一些实施方案中，采用的培养基为加入了水凝胶的完全培养基。优选地，所述完全培养基含有血清。进一步优选地，所述完全培养基为RPMI-1640（如，thermo、R&D、康宁）。优选地，所述完全培养基含有10% FBS血清（胎牛血清）。优选地，所述完全培养基和所述水凝胶体积比为0.8-1.2，如0.8，0.9，1.1或1.2。

具体地，所述加入了水凝胶的完全培养基为90%的RPMI-1640和10%的FBS血清的混合物。

优选地，所述第二培养体系中抗原阳性细胞和抗原阴性细胞的接种总数目，或抗原高表达或抗原中表达的抗原阳性细胞和抗原低表达的抗原阳性细胞的接种总数目为20000~30000个/孔。

在一些实施方案中，所述共培养时，所述第二培养体系采用的培养基为加入了肝素和氢化可的松的无血清培养基。

在一些实施方案中，所述第二培养体系采用的培养基为加入了水凝胶的完全培养基。优选地，所述完全培养基含有血清。优选地，所述完全培养基和所述水凝胶体积比为0.8~1.2，如0.8，0.9，1.1或1.2。

优选地，所述第二培养体系中所述抗原阳性细胞和所述抗原阴性细胞的接种数目比，或所述抗原高表达或抗原中表达的抗原阳性细胞和所述抗原低表达的抗原阳性细胞的接种数目比为（3~5）：1，例如3：1，3.1：1，3.3：1，3.5：1，3.7：1，3.9：1，4：1，4.1：1，4.2：1，4.3：1，4.4：1，4.6：1，4.7：1或5：1。

优选地，进行所述共培养时，在细胞接种后加入所述ADC药物。

优选地，在细胞接种的当天加入所述ADC药物，在所述ADC药物加入后继续培养96h~144 h，如96 h，100 h，106 h，110 h，115 h，120 h，126 h，133 h，137 h，141 h或144 h。

优选地，所述抗原包括肿瘤治疗靶点蛋白或免疫检查点蛋白。

优选地，所述ADC药物的抗体包括肿瘤治疗剂或免疫检查点抑制剂。

具体地，肿瘤治疗剂和免疫检查点抑制剂包括单抗、双抗、scFv片段或抗体融合蛋白。

具体地，肿瘤治疗靶点蛋白优选为肿瘤细胞中过表达的蛋白。

本发明中，肿瘤包括但不限于鼻咽癌、肠癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、胶质瘤、胃肠道间质瘤、***、卵巢癌、子宫内膜间质肉瘤、盆腔低分化腺癌或胆管癌。

优选地，所述抗原包括HER2、HER3、EGFR、TROP2、CEACEM5、CD22、SIRPα、PD-L2、PD-L1、TIM3、CTLA4、CD103、LAG3、TIGIT、CD47、B7H3、B7H4、OX40或VISTA。

优选地，所述抗原阳性细胞和所述抗原阴性细胞分别以永生化鼠类、人类或灵长类细胞为宿主细胞。

优选地，所述ADC药物中抗体为抗HER2抗体。优选地，毒素为DXd或其衍生物。

进一步优选地，所述ADC药物的抗体为曲妥珠单抗。

在一些实施方案中，所述抗原阳性细胞为癌细胞，所述抗原阴性细胞为癌细胞或非癌细胞（如HEK293细胞）。优选地，所述抗原阳性细胞或抗原阴性细胞为乳腺癌细胞，非小细胞肺癌，或胰腺癌细胞。

优选地，所述抗原阳性细胞选自SK-BR-3细胞、JIMT-1细胞、CFPAC-1细胞或NCI-H2110细胞。其中，SK-BR-3细胞为HER2抗原高表达的阳性细胞、JIMT-1细胞为HER2抗原中表达的阳性细胞、CFPAC-1细胞为HER2抗原低表达的阳性细胞、NCI-H2110细胞为HER2抗原低表达的阳性细胞。

在第二培养体系中，当采用抗原阳性细胞和抗原阴性细胞共培养时，优选所述抗原阳性细胞为SK-BR-3细胞，所述抗原阴性细胞为HEK293细胞。当采用抗原高表达的阳性细胞和抗原低表达的阳性细胞共培养时，优选所述抗原高表达的阳性细胞为SK-BR-3细胞，优选所述抗原低表达的阳性细胞为NCI-H2110细胞。

优选地，所述荧光素酶基因为萤火虫荧光素酶基因、叩头虫荧光素酶基因、海肾荧光素酶基因或高斯荧光素酶基因。

优选地，用于细胞活力检测的试剂盒包括但不限于MTT检测试剂盒、CCK-8检测试剂盒和CTG检测试剂盒。

在一些实施方案中，所述细胞活力的检测方法为：取抗原阳性细胞（优选融合度大于等于80%），消化，台盼蓝染色后接种于含有加入了肝素和氢化可的松的无血清培养基的低吸附性培养板（优选孔板）中，抗原阳性细胞成球状生长（悬浮非贴壁），培养板中细胞接种密度为13000~20000个/孔（如13000个/孔，14000个/孔，15000个/孔，16000个/孔，17000个/孔，18000个/孔，20000个/孔），药物处理孔加入终浓度为0~10 nM ADC药物，不加药对照孔加入等体积培养基，药物处理孔和不加药对照孔均培养96h~144h（如96h，100h，120h，130h，144h），采用检测试剂盒检测所述细胞活力。优选地，检测试剂盒为MTT检测试剂盒、CCK-8检测试剂盒或CTG检测试剂盒。

在另一些实施方式中，所述细胞活力的检测方法为：取抗原阴性细胞（优选融合度大于等于80%），消化，台盼蓝染色后接种于含有加入了肝素和氢化可的松的无血清培养基的低吸附性培养板（优选孔板）中，抗原阳性细胞成球状生长（悬浮非贴壁），培养板中细胞接种密度为13000~20000个/孔（如13000个/孔，14000个/孔，15000个/孔，16000个/孔，17000个/孔，18000个/孔，19000个/孔，20000个/孔），药物处理孔加入终浓度为0~10 nMADC药物，不加药对照孔加入等体积培养基，药物处理孔和不加药对照孔均培养96h~144h（如96h，100h，120h，130h，144h），采用检测试剂盒检测所述细胞活力。优选地，检测试剂盒为MTT检测试剂盒、CCK-8检测试剂盒或CTG检测试剂盒。

在另一些实施方式中，所述抗原阳性细胞和抗原阴性细胞的总活力的检测方法为：取抗原阳性细胞和抗原阴性细胞（优选融合度大于等于80%），消化，台盼蓝染色后接种于含有加入了肝素和氢化可的松的无血清培养基低吸附性培养板（优选孔板），抗原阳性细胞和抗原阴性细胞成球状生长（悬浮非贴壁），培养板的细胞密度为20000~30000个/孔（优选孔板中细胞接种总数目为20000~30000个/孔，如20000个/孔，21000个/孔，22000个/孔，23000个/孔，25000个/孔，27000个/孔，30000个/孔），药物处理孔加入终浓度为0~10 nMADC药物，不加药对照孔加入等体积培养基，药物处理孔和不加药对照孔均培养96h~144h（如96h，100h，120h，130h，144h），采用检测试剂盒检测所述抗原阳性细胞和抗原阴性细胞的总活力。优选地，检测试剂盒为MTT检测试剂盒、CCK8检测试剂盒或CTG检测试剂盒。

在另一些实施方案中，所述细胞活力的检测方法为：取抗原阳性细胞（优选融合度大于等于80%），消化，台盼蓝染色后接种于含有加入了水凝胶的完全培养基的低吸附性培养板（优选孔板）中，抗原阳性细胞成球状生长（悬浮非贴壁），培养板中细胞接种密度为13000~20000个/孔（如13000个/孔，14000个/孔，15000个/孔，16000个/孔，17000个/孔，18000个/孔，19000个/孔，20000个/孔），药物处理孔加入终浓度为0~10 nM ADC药物，不加药对照孔加入等体积培养基，药物处理孔和不加药对照孔均培养96h~144h（如96h，100h，120h，130h，144h），采用检测试剂盒检测所述细胞活力。优选地，检测试剂盒为MTT检测试剂盒、CCK-8检测试剂盒或CTG检测试剂盒。

在一些实施方案中，所述旁杀伤率的检测方法为：分别取抗原阳性细胞和抗原阴性细胞或抗原高表达或抗原中表达的抗原阳性细胞和抗原低表达的抗原阳性细胞，消化，台盼蓝染色，按照数量比为（3~5）：1的比例混合，然后接种于含有加入了肝素和氢化可的松的无血清培养基的低吸附性培养板（优选孔板）中，细胞成球状生长（悬浮非贴壁），培养板中细胞接种总数目为20000~30000个/孔（如20000个/孔，21000个/孔，22000个/孔，23000个/孔，25000个/孔，27000个/孔，30000个/孔），药物处理孔加入终浓度为0~10nM 的ADC药物，不加药对照孔加入等体积培养基，药物处理孔和不加药对照孔均培养96h~144h（如96h，100h，120h，130h，144h），培养结束后，使用细胞裂解液裂解药物处理孔细胞和不加药对照孔细胞，接着分别向药物处理孔和不加药对照孔中加入荧光素酶底物，检测药物处理孔细胞化学发光强度和不加药对照孔细胞化学发光强度，所述旁杀伤率＝[1-（药物处理孔化学发光强度/不加药对照孔细胞化学发光强度）]×100%。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

本发明的体外ADC药物活性检测方法，包括测定抗原阳性表达肿瘤细胞的抑制作用和/或旁杀伤活性，能够使体外ADC药物与细胞的作用情况接近体内情况，提高了ADC药物体内外药效检测结果一致性，同时细胞对旁杀伤作用更加敏感，提高了旁杀伤活性检测的灵敏度，更适用于ADC药物筛选。而且本发明方法操作简单、适用性广泛、通量高。

附图说明

图1为实施例1中不同浓度ADC药物对HER2高中低表达细胞系的细胞活性检测结果图；

图2为对比例1中不同浓度ADC药物对HER2高中低表达细胞系的细胞活性检测结果图；

图3为德喜曲妥珠单抗在HER2中等表达的小鼠CDX模型中的体内药效结果图；

图4为德喜曲妥珠单抗在HER2低表达的小鼠CDX模型中的体内药效结果图；

图5为实施例2中ADC药物对SK-BR-3细胞系的细胞活性检测结果图；

图6为实施例4中ADC药物对SK-BR-3细胞系的细胞活性检测结果图；

图7为实施例5中ADC药物对NCI-H2110-Luc-GFP细胞系的细胞活性检测结果图；

图8为实施例6中ADC药物对HEK293细胞活性检测结果图；

图9为分别采用实施例9、对比例6和对比例7的方法检测ADC药物的旁杀伤活性的结果对比图；

图10为实施例10中细胞共培养的旁杀伤检测结果图。

具体实施方式

本发明的说明书中公开了所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了相互排斥的特征或步骤以外，均可以以任何方式组合。下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明不应限于这些实施例，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中一个例子而已。在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

随着对ADC药物的体外药效评价的需求的增加以及对ADC药物体外药效评价方法的深入研究，本发明在验证现有体外ADC药物活性检测方法（包括测定抗原阳性表达肿瘤细胞的抑制作用和/或旁杀伤活性）的准确度的时候发现，现有检测方法测试得到的体外药效和体内药效检测结果相差很大。经过大量的研究，发明人发现造成体内外检测结果不一致的主要原因在于体外检测方法使用的阳性肿瘤细胞培养环境或阳性肿瘤细胞和阴性肿瘤细胞共培养环境与体内情况相差较大：现有技术中用于ADC药物体外检测的细胞是贴壁生长的，与体内肿瘤微环境相差很大。

此外，就旁杀伤检测而言，通常使用的流式检测法，步骤繁琐，很难同时处理大量样本、无法实现高通量；且细胞消化、计数、染色和流式检测均可能造成较大的误差，导致实验结果不准确，批次间重复性差。而荧光计数方法相比流式检测法，虽然在通量和一致性上有所提高，但需要特殊的仪器设备，且荧光拍照时间较长。而若直接将荧光计数换成荧光强度检测，则检测信号弱，灵敏度不高。

基于上述研究进展，本发明开发了一种体外ADC药物活性和旁杀伤活性检测方法，使体外ADC药物与细胞的作用方式接近它们体内的作用情况，提高ADC药物体内外药效检测结果一致性，在检测旁杀伤活性时，具有更高的灵敏度。本发明的检测方法还具有操作简单、适用性广泛、通量高等优点。

下面结合实施例对本发明作进一步描述。但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件，例如未注明的细胞培养条件、培养基等为常规条件和常规培养基。本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

Enhertu（购自无锡药明康德新药开发股份有限公司），也称德喜曲妥珠单抗（Trastuzumab-DXd）药物/抗体比率DAR值约为8，为HER2抗体和伊立替康类化疗药物的偶联药物。

Kadcyla（购自无锡药明康德新药开发股份有限公司），也称赫赛莱（Ado-trastuzumab Emtansine，T-DM1）药物/抗体比率DAR值约为4，为HER2抗体和美登素类生物碱的偶联药物。

无血清培养基为MammoCult^TM培养基，购自干细胞技术公司（STEMCELLTechnologies），型号：05620。

肝素购自干细胞技术公司（STEMCELL Technologies），型号：07980。

氢化可的松购自干细胞技术公司（STEMCELL Technologies），型号：07925。

实施例中使用的96孔板为水凝胶包被标准透明板（康宁Corning，3474）。

完全培养基为90% RPMI1640与10% FBS的混合物。RPMI1640培养基为购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司（ThermoFisher）的型号为11875093 RPMI 1640 培养基；FBS为购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司（ThermoFisher）的型号10099141C的澳洲胎牛血清。

水凝胶购自美国康宁Corning，型号：356234。

CTG法采用的试剂盒为普洛麦格公司（Promega）的型号为G7571的CellTiter-Glo®发光法细胞活力检测试剂盒（CellTiter-Glo^TM Luminescent Cell Viability Assay）。

体外ADC药物活性检测

实施例1：

本实施例分别在HER2高表达细胞系SK-BR-3、HER2中表达细胞系JIMT-1（乳腺癌细胞）和HER2低表达细胞系CFPAC-1（人胰腺癌细胞）上进行体外ADC药物活性检测。

（1）配制培养基：MammoCult^TM培养基，其中含有4μg/mL的肝素和0.48μg/mL的氢化可的松。

（2）设置最高检测的药物浓度为200nM，5倍进行连续8个梯度稀释。

（3）取融合度约80%，生长状态良好的肿瘤细胞，消化，台盼蓝染色，采用步骤（1）配制的培养基重悬，调整细胞密度，接种于96孔板(康宁低吸附板，3474)中，每孔中细胞总数为20000个。设置药物处理孔和不加药对照孔，向药物处理孔加入不同浓度的德喜曲妥珠单抗（Enhertu），不加药对照孔加入等体积MammoCult^TM培养基（含有肝素和氢化可的松）代替德喜曲妥珠单抗。在37℃，5%CO₂培养箱内孵育120h后，采用CTG法检测药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用。细胞活力计算公式：细胞活力=（RLU(X)-RLU(背景)）/（RLU(对照)-RLU(背景)）×100%，结果根据4-参数虚拟方程进行计算，以Prism 8(棱镜)软件进行绘图。其中RLU(X)为药物处理孔的读值，RLU(对照)为不加药对照孔的读值，RLU(背景)为细胞全部死亡时的基线读值。

检测结果见图1，图1中A为不同德喜曲妥珠单抗处理浓度下，HER2高表达细胞系SK-BR-3的细胞活力；B为不同德喜曲妥珠单抗处理浓度下，HER2中表达细胞系JIMT-1的细胞活力；C为不同德喜曲妥珠单抗处理浓度下，HER2低表达细胞系CFPAC-1的细胞活力。体外测试结果显示，德喜曲妥珠单抗对HER2高表达细胞、HER2中表达细胞和HER2低表达细胞均表现出明显的杀伤作用。

对比例1：

本对比例分别在HER2高表达细胞系SK-BR-3、HER2中表达细胞系JIMT-1和HER2低表达细胞系CFPAC-1上进行体外ADC药物活性检测。

（1）本对比例中使用的培养基为完全培养基（90% RPMI1640与10% FBS的混合物）。

（2）设置最高检测的药物浓度为200nM，5倍进行连续8个梯度稀释。

（3）取融合度约80%，生长状态良好的肿瘤细胞，消化，台盼蓝染色，采用步骤（1）的完全培养基重悬，调整细胞密度，接种于96孔板（康宁，3603；器皿经过表面的改性处理，适合贴壁细胞的培养）中，每孔细胞铺板总数为：SK-BR-3：每孔5000个细胞；JIMT-1：每孔3000个细胞；CFPAC-1：每孔5000个细胞。设置药物处理孔和不加药对照孔，细胞过夜贴壁之后，向药物处理孔加入不同浓度的德喜曲妥珠单抗，不加药对照孔加入等体积完全培养基代替德喜曲妥珠单抗。在37℃、5%CO₂培养箱内孵育120h后，CTG法检测药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用。细胞活力计算公式：细胞活力=（RLU(X)-RLU(背景)）/（RLU(对照)-RLU(背景)）×100%，结果根据4-参数虚拟方程进行计算，以Prism 8(棱镜)软件进行绘图请。其中RLU(X)为药物处理孔的读值，RLU(对照)为不加药对照孔的读值，RLU(背景)为细胞全部死亡时的基线读值。

检测结果见图2，图2中A为不同德喜曲妥珠单抗处理浓度下，HER2高表达细胞系SK-BR-3的细胞活力；B为不同德喜曲妥珠单抗处理浓度下，HER2中表达细胞系JIMT-1的细胞活力；C为不同德喜曲妥珠单抗处理浓度下，HER2低表达细胞系CFPAC-1的细胞活力。体外测试结果显示，德喜曲妥珠单抗对HER2高表达细胞表现出明显的杀伤作用，对HER2中表达细胞和HER2低表达细胞均没有表现出杀伤作用。

检测结果验证：

在小鼠肿瘤模型中评估ADC药物的体内药效，对比体外检测结果与体内结果是否一致。

1. 德喜曲妥珠单抗在HER2中表达CDX小鼠模型中的药效评价

将0.2 mL (5×10⁶个) JIMT-1细胞皮下接种于每只裸小鼠的右后背（JIMT-1细胞采用体积比为1:1的PBS和基质胶的混合物重悬）。细胞接种后第7天，肿瘤平均体积达到142mm³时开始分组给药。统计肿瘤体积变化，结果如图3所示，IV表示尾静脉给药，n=5表示每组有5只荷瘤小鼠。开始给药后35天，溶媒对照组荷瘤鼠的瘤体积达到1,513 mm³。与溶媒对照组相比，受试物德喜曲妥珠单抗在5 mg/kg剂量下显示明显抑瘤作用，肿瘤体积在相同时间达到702 mm³，肿瘤生长抑制率（TGI）为59.16%。德喜曲妥珠单抗在HER2中表达的动物肿瘤模型中显示出药效，体内药效实验结论与实施例1一致，与对比例1不一致。

2. 德喜曲妥珠单抗在HER2低表达CDX小鼠模型中的药效评价

将0.2 mL (5×10⁶个) Capan-1细胞（人胰腺癌细胞）皮下接种于每只裸小鼠的右后背（Capan-1细胞采用体积比为1:1的PBS和基质胶的混合物重悬）。细胞接种后第8天，肿瘤平均体积达到179 mm³时开始分组给药。统计肿瘤体积变化，结果如图4所示，IV表是尾静脉给药，n=5表示每组有5只荷瘤小鼠。开始给药后49天，溶媒对照组荷瘤鼠的瘤体积达到2,043 mm³。与溶媒对照组相比，受试物德喜曲妥珠单抗在5mg/kg剂量下可显著抑制Capan-1肿瘤生长，肿瘤体积分别为391 mm³，肿瘤生长抑制率（TGI）为88.69%。德喜曲妥珠单抗在HER2低表达的动物肿瘤模型中显示出药效，体内药效实验结论与实施例1一致，与对比例1不一致。

由此可见，实施例1中的检测方法采用低吸附的孔板及优化的培养方式，使体外细胞生长环境更类似于体内；这对ADC药物的活性评估更接近于动物模型体内药效结果，与德喜曲妥珠单抗公布的临床数据一致。

实施例2：

本实施例分别检测德喜曲妥珠单抗（DAR值约为8）和赫赛莱（DAR值约为4）的体外药物活性，测试细胞为HER2高表达细胞系SK-BR-3，测试方法同实施例1，每孔中细胞总数为20000个，检测结果见图5，赫赛莱和德喜曲妥珠单抗对HER2阳性细胞SK-BR-3的杀伤作用明显，最大抑制率约为80%，IC50值分别为0.2352nM和0.5009nM，对不同DAR值的药物的区分度好。

另取融合度约80%，生长状态良好的SK-BR-3细胞，接种于96孔板(康宁，3474)中（培养基同实施例1），每孔细胞铺板总数为20000个，培养120h，在第120h，收集细胞，染细胞死活染料（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，L34955），FACS检测细胞自然死亡情况，计算死细胞数占总细胞数的比例，经计算，本实施例的细胞培养方法的自然死亡率为9.9%。

实施例3：

基本与实施例2相同，区别仅在于每孔细胞铺板总数为15000个，统计细胞自然死亡率为9.39%，与实施例2相差不大，适用于体外ADC药物活性检测。

对比例2：

基本与实施例2相同，区别仅在于每孔细胞铺板总数为30000个，统计细胞自然死亡率为14%，明显高于实施例2，不适合用于体外ADC药物活性检测。

实施例4：

本实施例分别检测德喜曲妥珠单抗和赫赛莱的体外药物活性。

（1）本实施例中使用的培养细胞的培养基为完全培养基（90% RPMI1640与10% FBS的混合物）和水凝胶（康宁，356234）按照体积比为1:1混合。

（2）取融合度约80%，生长状态良好的SK-BR-3细胞，消化，台盼蓝染色计数，使用完全培养基重悬调整细胞密度，并与步骤（1）的培养基混合后接种于96孔板(康宁，3474)中，含水凝胶的步骤需在冰上操作，铺板完成后37℃放置30min凝固，加入150μL完全培养基封顶。培养过夜，弃顶部完全培养基，设置药物处理孔和不加药对照孔，检测结果如图6所示，在HER2阳性细胞SK-BR-3上的杀伤作用明显，最大抑制率约为80%，赫赛莱的IC50为0.08984nM，德喜曲妥珠单抗的IC50为0.1938nM。

本实施例也可用于检测ADC药物对肿瘤细胞的增值抑制作用，但由于水凝胶形成了固态支架（细胞分散在液体水凝胶中，用以模拟天然细胞外基质(ECM)对细胞的存活、增殖、分化和迁移的作用），需考虑光学散射、穿透性等问题，要求较高成像配置***才能实现可视化，且整个实验过程必须在冰上操作，极不方便。此外，在旁杀伤检测中需要回收并裂解细胞，需要复溶凝胶，并使用PBS清洗、稀释凝胶，直至在室温不会凝固，这些操作步骤会增加实验误差，随着实验步骤的增加以及复杂度提高，将会使体外检测结果与体内实际情况差异越来越大。因此，水凝胶培养法（实施例4）和细胞低吸附培养法（实施例1）均可用于检测ADC药物活性，其中细胞低吸附培养法更优。

实施例5：

本实施例分别检测德喜曲妥珠单抗和赫赛莱的体外药物活性，测试细胞为荧光素酶标记的HER2低表达细胞系NCI-H2110-Luc-GFP，测试方法基本同于实施例1，每孔中细胞总数为15000个，检测结果见图7，Kadcyla对NCI-H2110-Luc-GFP细胞没有杀伤作用，德喜曲妥珠单抗对NCI-H2110-Luc-GFP细胞具有微弱杀伤作用（低剂量无杀伤作用）；德喜曲妥珠单抗和赫赛莱对NCI-H2110-Luc-GFP无杀伤作用，可作为测定旁杀伤作用的抗原低表达的抗原阳性细胞。其中NCI-H2110-Luc-GFP的构建方法参考专利CN202210034497.3中MDA-MB-Luc-GFP的制备方法，区别仅在于将MDA-MB-468细胞换成NCI-H2110细胞（人非小细胞肺癌）。

取融合度约80%，生长状态良好的NCI-H2110-Luc-GFP细胞，接种于96孔板(康宁，3474)中（培养基同实施例1），每孔细胞铺板总数为15000个，在培养第120h和第192h，收集细胞，染细胞死活染料（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，L34955），FACS检测细胞自然死亡情况，计算死细胞数占总细胞数的比例，经计算，本实施例的细胞培养方法在第120h的自然死亡率为4.87%，在第192h的自然死亡率为36.5%。

对比例3：

基本同实施例4，区别仅在于每孔细胞铺板总数为30000个，统计第120h的自然死亡率为38.3%，在第192h的自然死亡率为53.1%，不适合用于体外ADC药物活性检测。

对比例4：

基本同实施例4，区别仅在于每孔细胞铺板总数为10000个，统计第120h的自然死亡率为16.2%，在第192h的自然死亡率为30.8%，不适合用于体外ADC药物活性检测。

实施例6：

本实施例分别检测德喜曲妥珠单抗和赫赛莱的体外药物活性，测试细胞为HER阴性的HEK293细胞，测试方法基体同实施例1，每孔中细胞总数为20000个，检测结果见图8，赫赛莱对HER阴性的HEK293细胞没有杀伤作用；德喜曲妥珠单抗对HER阴性的HEK293细胞具有微弱杀伤作用。

取融合度约80%，生长状态良好的HEK293细胞，接种于(康宁，3474)中（培养基同实施例1），每孔细胞铺板总数为20000个，在培养第120h，收集细胞，染细胞死活染料（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，L34955），FACS检测细胞自然死亡情况，计算死细胞数占总细胞数的比例，经计算，本实施例的细胞培养方法在第120h的自然死亡率为0.84%。

实施例7：

基本同实施例6，区别仅在于每孔细胞铺板总数为12000个，统计第120h的自然死亡率分别为0.64%，该实施例的每孔细胞铺板总数可用于培养时间为120h的体外ADC药物活性检测。

实施例8：

基本同实施例6，区别仅在于每孔细胞铺板总数为16000个，统计第120h的自然死亡率分别为0.88%，该实施例的每孔细胞铺板总数可用于培养时间为120h的体外ADC药物活性检测。

体外ADC药物旁杀伤活性检测

实施例9：

本实施例提供一种体外ADC药物旁杀伤活性检测的优选实施方式。

本实施例分别检测了德喜曲妥珠单抗和赫赛莱旁杀伤活性。

（1）取生长状态良好的SK-BR-3和NCI-H2110-Luc-GFP细胞，消化，台盼蓝染色计数，按SK-BR-3：NCI-H2110-Luc-GFP=4：1比例（细胞数量比）混合，接种于96孔板(康宁，3474)中，每孔中细胞总数为30000个（MammoCult^TM培养基添加有肝素和氢化可的松）。设置药物处理孔和不加药对照孔，药物处理孔加入终浓度为1nM的ADC药物，不加药对照孔加入等体积培养基代替ADC药物，37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养120h。

（2）1500rpm离心5min，弃150μL上清，每孔分别加入100μL细胞裂解液，37℃裂解10min或至细胞完全裂解，再每孔加入100μL萤火虫荧光素酶底物，使用Cytation™ 3多功能酶标仪的检测化学发光，导出结果，根据药物组中NCI-H2110-Luc-GFP细胞化学发光强度与对照孔中该细胞的化学发光强度的比例，计算旁杀伤率，计算公式为：细胞旁杀伤率＝[1-（药物处理孔细胞化学发光强度/不加药对照孔细胞化学发光强度）]*100%。

对比例5：

本对比例分别检测了德喜曲妥珠单抗和赫赛莱旁杀伤活性。

（1）取生长状态良好的SK-BR-3和NCI-H2110-Luc-GFP细胞，消化，台盼蓝染色计数，按SK-BR-3：NCI-H2110-Luc-GFP=4：1比例混合，接种于96孔板（康宁，3603）中，每孔细胞铺板总数为10,000个细胞，细胞过夜培养（细胞贴壁生长）。设置药物处理孔和不加药对照孔，药物处理孔加入终浓度为1nM的ADC药物，不加药对照孔加入等体积完全培养基代替ADC药物。37℃ 5%CO₂细胞培养箱中培养120h。

（2）1500rpm离心5min，弃上清，用PBS清洗一遍，每孔加入100μL细胞裂解液，37℃裂解10min或至细胞完全裂解，每孔加入100μL萤火虫荧光素酶底物，使用Cytation™ 3多功能酶标仪检测化学发光，导出结果，根据药物组中NCI-H2110-Luc-GFP细胞化学发光强度与对照孔中该细胞的化学发光强度的比例，计算旁杀伤率。

对比例6：

本对比例采用细胞成像的荧光细胞计数法分别检测了德喜曲妥珠单抗和赫赛莱的旁杀伤活性。

本对比例的实验步骤同对比例5，区别在于采用细胞成像的荧光细胞计数方法检测（可参考专利CN202210034497.3）：使用Cytation™ 3多功能酶标仪的细胞成像模块，GFP通道拍照，设置阈值参数（Threshold）选择自动（Auto）并设置值为18、细胞大小设置5-100μm，应用于所有孔，导出细胞计数结果，根据药物处理孔中NCI-H2110-Luc-GFP细胞的数量与不加药对照孔中该细胞数量的比例，计算旁杀伤的效果。

实施例9、对比例5和对比例6的检测结果见图9，图9中ADC（8）表示德喜曲妥珠单抗，ADC（4）表示赫赛莱。图9显示，低吸附培养荧光素酶法（实施例9）比一般荧光素酶法（对比例6）对ADC药物旁杀伤检测更为灵敏；与细胞计数法（对比例6）相比，结果更为灵敏，同时不同的ADC药物区分度更好；并且，与细胞计数法相比，低吸附培养荧光素酶法检测更为快速、方便。

综上，低吸附培养荧光素酶法更为方便快捷，灵敏度更高，且对不同ADC药物旁杀伤效果的区分度更好。

实施例10：

取生长状态良好的SK-BR-3细胞和NCI-H2110-Luc-GFP细胞，消化，台盼蓝染色计数，按SK-BR-3：NCI-H2110-Luc-GFP=4：1比例（细胞数量比）混合，接种于96孔板(康宁，3474)中（培养基同实施例8），每孔中细胞总数为10000，20000，30000和40000个。设置两组给药时间，即铺板当天给药和铺板培养3天后给药。加入德喜曲妥珠单抗药物，使其终浓度为1nM和0.1nM，对照组加入等体积细胞培养基，37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养120h。弃上清，用PBS清洗一遍，每孔加入100μL细胞裂解液，37℃裂解10min或至细胞完全裂解，每孔加入100μL萤火虫荧光素酶底物，使用Cytation™ 3多功能酶标仪检测化学发光，导出结果，根据药物组中H2110-Luc-GFP细胞化学发光强度与对照孔中该细胞的化学发光强度的比例，计算旁杀伤率。

结果如图10所示，A为铺板当天给药，培养120h的旁杀伤结果；B为铺板培养3天后给药，培养120h的旁杀伤结果；结果显示，铺板10000个细胞，旁杀伤效果较差；铺板20000、30000、40000个细胞均具有不错的旁杀伤检测能力。在相同铺板和药物处理条件下，铺板当天给药和铺板培养3天后给药所显示出的旁杀伤效果类似，且铺板当天给药的旁杀伤效果更优。

另取融合度约80%，生长状态良好的SK-BR-3细胞和NCI-H2110-Luc-GFP细胞，消化，台盼蓝染色计数，按SK-BR-3：NCI-H2110-Luc-GFP=4：1比例混合，接种于96孔板水凝胶包被标准透明板(康宁，3474)中（培养基同实施例8），每孔细胞铺板总数为30000个，铺板当天给药后再培养120h（即共培养120h）或铺板培养3天后给药再培养120h（即共培养192h），收集细胞，染细胞死活染料（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，L34955），FACS检测细胞自然死亡情况，计算死细胞数占总细胞数的比例，经计算，本实施例的细胞培养方法在第120h的自然死亡率为8.3%，在第192h的自然死亡率为18.2%，用于体外ADC药物活性检测时优选培养时间为120h。

实施例11：

基本同实施例10，区别在于每孔细胞铺板总数为20000个，铺板当天给药，统计在第120h的自然死亡率为7.5%，在第192h的自然死亡率为19%，适合培养时间为120h的体外ADC药物旁杀伤活性检测。

对比例7：

基本同实施例10，区别在于每孔细胞铺板总数为10000个，铺板当天给药，统计在第120h的自然死亡率为14.6%，在第192h的自然死亡率为22.5%，不适合用于体外ADC药物旁杀伤活性检测。

对比例8：

基本同实施例10，区别仅在于每孔细胞铺板总数为40000个，铺板当天给药，统计在第120h的自然死亡率为19.8%，在第192h的自然死亡率为17.1%，不适合用于体外ADC药物旁杀伤活性检测。

综合，实施例10、实施例11、对比例7和对比例8，共培养时，按SK-BR-3：NCI-H2110-lLuc-GFP=4：1比例混合，每孔细胞铺板总数为20000~30000个左右，培养时间为120h，检测的旁杀伤灵敏度较高。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种ADC药物的体外药效检测方法，其特征在于，

将ADC药物与抗原阳性细胞或抗原阴性细胞在第一培养体系中共培养，分别检测抗原阳性细胞或抗原阴性细胞的细胞活力；或，将ADC药物与抗原阳性细胞和抗原阴性细胞在第一培养体系中共培养，检测抗原阳性细胞和抗原阴性细胞的总活力；

将ADC药物与抗原阳性细胞和抗原阴性细胞在第二培养体系中共培养，检测ADC药物对抗原阴性细胞的旁杀伤率；或，将ADC药物与抗原高表达或抗原中表达的抗原阳性细胞和抗原低表达的抗原阳性细胞在第二培养体系中共培养，检测ADC药物对抗原低表达的抗原阳性细胞的旁杀伤率；

其中，所述抗原阴性细胞为所述抗原阴性细胞和浓度小于等于15nM的ADC药物共培养时，ADC药物对其无杀伤作用的细胞，

所述抗原低表达的抗原阳性细胞为所述抗原低表达的抗原阳性细胞和浓度小于等于15nM的ADC药物共培养时，ADC药物对其无杀伤作用且免疫组化实验测定为1+的细胞，

所述抗原高表达的抗原阳性细胞为所述抗原高表达的抗原阳性细胞和浓度小于等于15nM的ADC药物共培养时，ADC药物对其有杀伤作用且免疫组化实验测定为3+的细胞，

所述抗原中表达的抗原阳性细胞为所述抗原中表达的抗原阳性细胞和浓度小于等于15nM的ADC药物共培养时，ADC药物对其有杀伤作用且免疫组化实验测定为2+的细胞，

所述抗原阴性细胞和所述抗原低表达的抗原阳性细胞分别携带荧光素酶基因，所述抗原能够与所述ADC药物中的抗体进行特异性结合，

所述共培养时，所述第一培养体系和所述第二培养体系中分别采用低吸附性培养板，细胞悬浮生长成球状。

2.根据权利要求1所述的ADC药物的体外药效检测方法，其特征在于，所述共培养时，所述第一培养体系和所述第二培养体系中采用的培养基分别为加入了肝素和氢化可的松的无血清培养基或加入了水凝胶的完全培养基；

和/或，所述低吸附性培养板为水凝胶包被的细胞培养板。

3.根据权利要求1或2所述的ADC药物的体外药效检测方法，其特征在于，所述第一培养体系中抗原阳性细胞的接种数目为13000~20000个/孔；

和/或，所述第一培养体系中抗原阴性细胞的接种数目为13000~20000个/孔；

和/或，所述第一培养体系中抗原阳性细胞和抗原阴性细胞的接种总数目为20000~30000个/孔；

和/或，所述第二培养体系中所述抗原阳性细胞和所述抗原阴性细胞的接种总数目，或所述抗原高表达或抗原中表达的抗原阳性细胞和所述抗原低表达的抗原阳性细胞的接种总数目为20000~30000个/孔；

和/或，所述第二培养体系中所述抗原阳性细胞和所述抗原阴性细胞的接种数目比，或所述抗原高表达或抗原中表达的抗原阳性细胞和所述抗原低表达的抗原阳性细胞的接种数目比为（3~5）：1。

4.根据权利要求1所述的ADC药物的体外药效检测方法，其特征在于，在细胞接种后加入所述ADC药物。

5.根据权利要求4所述的ADC药物的体外药效检测方法，其特征在于，在细胞接种的当天加入所述ADC药物，且在加入所述ADC药物后继续培养96 h~144 h。

6.根据权利要求1所述的ADC药物的体外药效检测方法，其特征在于，所述抗原包括肿瘤治疗靶点蛋白或免疫检查点蛋白；

和/或，所述抗原包括HER2、HER3、EGFR、TROP2、CEACEM5、CD22、SIRPα、PD-L2、PD-L1、TIM3、CTLA4、CD103、LAG3、TIGIT、CD47、B7H3、B7H4、OX40或VISTA。

7.根据权利要求1所述的ADC药物的体外药效检测方法，其特征在于，所述抗原阳性细胞和所述抗原阴性细胞分别以永生化鼠类、人类或灵长类细胞为宿主细胞。

8.根据权利要求1所述的ADC药物的体外药效检测方法，其特征在于，所述ADC药物为HER2作为抗原、DXd作为毒素的药物。

9.根据权利要求5所述的ADC药物的体外药效检测方法，其特征在于，所述ADC药物的抗体为曲妥珠单抗；

和/或，所述抗原阳性细胞选自SK-BR-3细胞、JIMT-1细胞、CFPAC-1细胞或NCI-H2110细胞；

和/或，所述抗原高表达的抗原阳性细胞为SK-BR-3细胞，所述抗原中表达的抗原阳性细胞为JIMT-1细胞，所述抗原低表达的抗原阳性细胞为NCI-H2110细胞；

和/或，所述抗原阴性细胞为HEK293细胞或癌细胞。

10.根据权利要求1所述的ADC药物的体外药效检测方法，其特征在于，所述荧光素酶基因为萤火虫荧光素酶基因、叩头虫荧光素酶基因、海肾荧光素酶基因或高斯荧光素酶基因。

11.根据权利要求1所述的ADC药物的体外药效检测方法，其特征在于，所述细胞活力的检测方法为：取融合度大于等于80%的抗原阳性细胞和/或抗原阴性细胞，消化，台盼蓝染色后使用培养基重悬，然后接种至低吸附性培养板中，药物处理孔加入ADC药物，不加药对照孔加入等体积但是不含ADC药物的培养基，药物处理孔和不加药对照孔均培养96 h~144 h，检测所述抗原阳性细胞和/或所述抗原阴性细胞的细胞活力；

其中，所述培养基为加入了肝素和氢化可的松的无血清培养基或所述培养基为加入了水凝胶的完全培养基，所述抗原阳性细胞的接种数目为13000~20000个/孔，或所述抗原阴性细胞的接种数目为13000~20000个/孔，或所述抗原阳性细胞和所述抗原阴性细胞的接种总数目为20000~30000个/孔。

12.根据权利要求1所述的ADC药物的体外药效检测方法，其特征在于，所述旁杀伤率的检测方法为：分别取所述抗原阳性细胞和所述抗原阴性细胞，或所述抗原高表达或抗原中表达的抗原阳性细胞和所述抗原低表达的抗原阳性细胞，消化，台盼蓝染色后将所述抗原阳性细胞和所述抗原阴性细胞，或所述抗原高表达或抗原中表达的抗原阳性细胞和所述抗原低表达的抗原阳性细胞按照数量比为（3~5）:1的比例混合形成细胞混合物，然后使用培养基重悬，接着按照所述第二培养体系中所述抗原阳性细胞和所述抗原阴性细胞的接种总数目，或所述抗原高表达或抗原中表达的抗原阳性细胞和所述抗原低表达的抗原阳性细胞的接种总数目为20000~30000个/孔，将所述细胞混合物接种至低吸附性培养板中，药物处理孔加入终浓度为0~10 nM且不为0 nM的ADC药物，不加药对照孔加入等体积但是不含ADC药物的培养基，药物处理孔和不加药对照孔均培养96h~144h，培养结束后，使用细胞裂解液裂解药物处理孔细胞和不加药对照孔细胞，接着分别向药物处理孔和不加药对照孔中加入荧光素酶底物，检测药物处理孔细胞化学发光强度和不加药对照孔细胞化学发光强度，所述旁杀伤率＝[1-（药物处理孔细胞化学发光强度/不加药对照孔细胞化学发光强度）]×100%，

其中，所述培养基为加入了肝素和氢化可的松的无血清培养基。

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