CN115746089A - 烯丙醇衍生物及其在蛋白修饰中的应用 - Google Patents
烯丙醇衍生物及其在蛋白修饰中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115746089A CN115746089A CN202211217174.4A CN202211217174A CN115746089A CN 115746089 A CN115746089 A CN 115746089A CN 202211217174 A CN202211217174 A CN 202211217174A CN 115746089 A CN115746089 A CN 115746089A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- residue
- group
- antibody
- protein
- formula
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明提供了烯丙醇衍生物及其在制备定点修饰蛋白或多肽N端的药物偶联物中的应用。本发明利用金属钯化合物与膦配体形成的配合物为催化剂，以烯丙醇衍生物为烯丙基钯前体实现对多肽、蛋白N端的修饰，制备得到新型多肽或蛋白N‑端偶联物。本发明方法条件温和，适用性广，效率高，选择性好。通过该方法可以在抗体的N‑端引入生物正交基团，利用生物正交反应来制备抗体药物偶联物，或是利用含有药物结构的烯丙醇衍生物来一步制备抗体药物偶联物。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及烯丙醇衍生物及其在制备定点修饰蛋白或多肽N端的药物偶联物中的应用。
背景技术
蛋白质的定点修饰为蛋白质的结构和功能研究提供了一种有力的手段，在生命科学和医药研究等领域有着诸多成功的应用。通过化学手段来实现蛋白质的定点修饰，可以避免基因突变等复杂手段的使用以及突变蛋白表达量低等潜在问题，具有简洁、高效、成本低等优点，一直受到科学家们的广泛关注。
由于蛋白质上同种氨基酸会重复出现多次，通过化学手段来实现蛋白质的定点修饰是一个极具挑战性的难题，且难度随着氨基酸丰度的增大呈几何数量级地增加。蛋白质的单链只有一个N-端位点，且N-端α-NH2的pKa性质与赖氨酸残基ε-NH2存在明显的差别，使得蛋白质的N-端选择性修饰成为可能，而实现N-端选择性修饰即可实现蛋白质的定点修饰。
目前，蛋白N-端修饰地策略主要包括以烯酮为前体或是基于醛捕获连接(Aldehyde Capture Ligation,ACL)策略而实现的蛋白质N-端酰化修饰；应用还原胺化反应来实现的蛋白质N-端烷基化修饰；利用仿生转氨化策略在蛋白质N-引入羰基实现进一步修饰；通过氧化偶联反应实现的蛋白质N-端修饰；以及基于蛋白质N-端与醛形成的亚胺中间体来实现的分子内环化修饰等等。尽管上述策略为蛋白质N-端修饰及相关的生物学、药学功能研究打下了很好的基础，但同时也存在诸如修饰效率不够高，N-端氨基酸适用范围有限以及N-端选择性欠佳等问题；因此，发展通用、高效、选择性好的N-端修饰策略依然具有重要的研究价值。
抗体药物偶联物是将细胞毒药物共价连接到抗体上，通过抗体的靶向作用将细胞毒药物输送到靶向部位发挥作用的药物治疗新策略。其中，定点偶联得到的抗体药物偶联物在药代动力学、药效学方面的研究中表现出明显的均一性和优势，且在生产过程中的质量控制中更为便利和可控，呈现出良好的应用前景。利用抗体N-端修饰的策略可以提供一种定点抗体药物偶联物的制备方法，具有较高的应用价值。
发明内容
本发明人为解决上述问题进行了广泛而深入的研究，发现了一种简单高效的多肽、蛋白N-端修饰新方法，可以合成多肽、蛋白N-端偶联物，同时可以应用到抗体药物偶联物的制备中。具体地，本发明提供了一类钯催化的烯丙醇衍生物与多肽、蛋白质的N-端选择性地反应来合成多肽、蛋白N-端偶联物的方法；同时，通过该方法可以在抗体的N-端引入生物正交基团，利用生物正交反应来制备抗体药物偶联物，或是利用含有药物结构的烯丙醇衍生物来一步制备抗体药物偶联物。
具体地，本发明包括以下实施方案。
本发明的第一方面，是提供了一种烯丙醇衍生物，其为结构式如式3和式4所示的化合物或其盐，或该化合物或其盐的水合物或溶剂合物：
其中，R1，R2，R3均选自下组：氢原子，或包含羟基、羧基、醚键、酰胺键、叠氮基、炔基、氨基、生物素、双键、三键以及具有双亲性聚乙二醇链的芳香基团和开链或者环状的烷基；
R5为多肽或蛋白N端氨基酸保护或未保护侧链，所述氨基酸为天然氨基酸残基或非天然氨基酸；
R6为多肽或蛋白除N-端氨基酸以外的部分。
在另一实施方案中，R5为多肽或蛋白N端氨基酸保护或未保护侧链，所述氨基酸选自20种天然氨基酸，包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸；所述的非天然氨基酸选自侧链含叠氮、炔基、硼酸等基团的非天然氨基酸。
在另一实施方案中，R6为多肽或蛋白除N-端氨基酸以外的部分,所述的蛋白质或多肽可以是天然的、修饰的或是人工合成的。蛋白质或多肽可以单独作为单体存在，或者可以与另一分子形成复合物。连接的方式没有特别限定，例如可以是氢键、静电力、范德华力、疏水作用、共价键、配位键等。在特别优选的实施方案中，所述的蛋白质为抗体、纳抗、双抗、Fab片段、酶、细胞因子等。
在本发明的优选的实施方案中，本发明提供了一种烯丙醇衍生物，其为结构式如式3和式4所示的化合物或其盐，或该化合物或其盐的水合物或溶剂合物：
其中，R2，R3为氢原子，R1为包含叠氮基的芳香基团、开链或者环状的烷基；
R5为多肽或蛋白N端氨基酸保护或未保护侧链，所述氨基酸选自20种天然氨基酸，包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸；
R6为多肽或蛋白除N-端氨基酸以外的部分。
在另一优选的实施方案中，结构式如式3或式4所示的烯丙醇衍生物中，R1基团为苯基或以下基团：
在另一实施方案中，本发明公开了如式3或式4所示的化合物，所述的化合物选自下组：
其中，结构式中的Protein是指烯丙醇衍生物单修饰至蛋白的N端，Ab是烯丙醇衍生物对称修饰至抗体重链或轻链的N端。
在特别优选的实施方案中，本发明公开了如式3或式4所示的化合物，所述的化合物选自下组：
本发明的第二方面，是提供了一种制备式3或4所示的蛋白或多肽N-端偶联物的方法，其包括如下步骤：
在溶液中，在钯金属化合物与膦配体形成的配合物为催化剂存在下，用烯丙基醇衍生物1选择性地与多肽或蛋白2的N-端进行反应，得到式3或式4所示的多肽/蛋白N端偶联物：
其中，R1，R2，R3均选自下组：氢原子，或包含羟基、羧基、醚键、酰胺键、叠氮基、炔基、氨基、生物素、双键、三键以及具有双亲性聚乙二醇链的芳香基团和开链或者环状的烷基；
R4表示R1，OR1,NR1；其中，R1如上所定义；
R5为多肽或蛋白N端氨基酸保护或未保护侧链，所述氨基酸为天然氨基酸残基或非天然氨基酸；其中，天然氨基酸包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸；
R6为多肽或蛋白除N-端氨基酸以外的部分。
在另一实施方案中，所述方法中，反应得到是独立存在的式3或式4所示的多肽/蛋白N端偶联物，或者3或4可同时存在。
在另一实施方案中，所述方法中，式1所示的烯丙基醇衍生物可用于将另一分子/物质连接到蛋白质或多肽的N-端，合成如式3或4所示的化合物或其盐，或该化合物或其盐的水合物或溶剂合物。因此，式1所示的烯丙基醇衍生物可以用作蛋白质和或多肽修饰试剂，该试剂中只要含有该烯丙醇衍生物的结构就没有特别限制，根据需要还可以含有具有生物活性和/或可检测的活性分子或基团。所述具有生物活性和/或可检测的活性基团选自：美登素、DM-1、DM-4、MMAE、MMAF、SN-38、Dxd、PBD及其类似物、鹅膏蕈碱、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、VP-16、喜树碱、紫杉醇、多烯紫杉醇、埃博霉素A、埃博霉素B、诺考达唑、秋水仙碱、雌莫司汀、西马多丁、艾榴塞洛素、荧光试剂、单糖、二糖、寡糖、多聚乙二醇(PEG)、免疫激动剂、细胞毒、放射性治疗物、分子影像试剂，或其组合。
在另一实施方案中，所述方法中，式1所示的烯丙基醇衍生物的优选为如下所示的化合物：
在另一实施方案中，所述方法中，本发明涉及到式2)所示的蛋白、多肽类化合物：
其中，R5为多肽或蛋白N端氨基酸残基保护或未保护侧链。氨基酸残基可以是天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基。实例中包括了20种天然氨基酸残基。
其中，R6为多肽或蛋白除N-端氨基酸以外的部分。蛋白质或多肽可以是天然的、修饰的或是人工合成的。蛋白质或多肽可以单独作为单体存在，或者可以与另一分子形成复合物。连接的方式没有特别限定，例如可以是氢键、静电力、范德华力、疏水作用、共价键、配位键等。所述方法中，其中的多肽或蛋白没有特殊限制，只要是N端可以参与反应，所述的多肽或蛋白质可以为抗体、纳抗、双抗、Fab片段、酶、细胞因子、短肽等，实施例具体示例了蛋白质为酶Rnase A和Rnase B。在特别优选的实施方案中，所述的蛋白质为抗体，所述抗体包括单克隆抗体、双功能抗体、含有Fc片段的纳米抗体、Fc融合蛋白或其组合，实施例具体示例了Her-2纳抗、PD-L1纳抗和曲妥珠单抗。
在另一实施方案中，所述方法中，本发明公开了如式2所示的蛋白，所述的蛋白为选自下组的抗体，所选抗体包括：Her-2纳抗、PD-L1纳抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、西妥昔单抗、莫罗单抗、吉妥珠单抗、阿昔单抗、达利珠单抗、阿达木单抗、帕利珠单抗、巴利昔单抗、贝伐珠单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、德尼单抗、迪西妥单抗、雷莫尼单抗、耐昔妥珠单抗、易普利姆玛、达雷木单抗、本妥昔单抗、阿仑单抗、埃罗妥珠单抗、博纳吐单抗、纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、特瑞普利单抗、卡妥索单抗、贝林妥欧单抗、艾美赛珠单抗、埃万妥单抗(Rybrevant)，或其组合。
在另一实施方案中，所述方法中，本发明公开了如式2所示的多肽，所述的多肽选自下组：
在另一实施方案中，所述方法中，按化合物1用量计，所述的金属钯催化剂用量为1～5000mol％；和/或膦配体用量为10～50000mol％。更优选按化合物1用量计，所述的金属钯催化剂用量为10～1000mol％；和/或膦配体用量为100～5000mol％。
在另一实施方案中，所述方法中，所述的金属钯化合物选自下组：Pd(OAc)2、PdCl2、Pd(PPh3)4、Pd(PPh3)2Cl2、Pd2(dba)3、Pd(dba)2、Pd(dppf)Cl2，或其组合。
在另一实施方案中，所述方法中，所述的膦配体具有如下结构式：
在另一实施方案中，所述方法中溶剂没有特殊限制，只要它不会对反应产生不利影响。优选的溶剂为水或缓冲液(如PB、PBS、HEPES、Tris、BES、MES等)，醇类溶剂(如甲醇、乙醇、三氟乙醇、异丙醇、正丁醇和乙二醇)，非质子极性溶剂(如乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜)，或其组合。
在另一实施方案中，所述方法中，反应温度可以在0℃到60℃，更优在20℃到40℃。
在另一实施方案中，所述方法中，反应时间可以为0.1到30小时，更优为0.5到24小时。
本发明的第三方面，是通过上述的方法制备了一种抗体药物偶联物，利用含有药物分子的烯丙基醇衍生物为修饰试剂，直接对抗体进行修饰来一步制备抗体药物偶联物。
在另一实施方案中，本发明提供了一种如式(I)所示的抗体药物偶联物，其结构式为：
((D-L2)x-L1-CH2NH)y-Ab(I)
其中，Ab为抗体，下标x为1-10的整数，下标y为1-8的整数，L1为含有碳碳双键结构的连接片段，L2为无或含两亲性的聚乙二醇链以及可裂解片段的连接片段，D各自独立地为相同或不同的具有生物活性和/或可检测的活性分子或基团，其选自：美登素、DM-1、DM-4、MMAE、MMAF、SN-38、Dxd、PBD及其类似物、鹅膏蕈碱、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、VP-16、喜树碱、紫杉醇、多烯紫杉醇、埃博霉素A、埃博霉素B、诺考达唑、秋水仙碱、雌莫司汀、西马多丁、艾榴塞洛素、荧光试剂、单糖、二糖、寡糖、多聚乙二醇(PEG)、免疫激动剂、细胞毒、放射性治疗物、分子影像试剂，或其组合；所述抗体药物偶联物偶联至抗体重链和/或轻链N-端。
在另一实施方案中，本发明提供了一种如式(II)所示的位点特异性的，双价或多价生物正交基团修饰的抗体药物偶联物，其结构式为：
((B-L2)x-L1-CH2NH)y-Ab(II)
其中，Ab为抗体，下标x为1-10的整数，下标y为1-8的整数；L1为含有碳碳双键结构的连接片段；L2为无或含两亲性的聚乙二醇链以及可裂解片段的连接片段；B为生物正交基团，多个B可以相同也可以独立不同，选自：叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基、共轭二烯残基、磷酸残基、环炔残基及环烯残基；所述带生物正交基团的偶联物偶联至抗体重链和/或轻链N-端。
在另一实施方案中，本发明提供了一种如式(III)所示的位点特异性的，双价或多价生物活性分子/基团修饰的抗体药物偶联物，其结构式为：
((D-L2-B’-L3)x-L1-CH2NH)y-Ab(III)
其中，Ab为抗体，下标x为1-10的整数，下标y为1-8的整数；L1为含有碳碳双键结构的连接片段；L2为无或含两亲性的聚乙二醇链以及可裂解片段的连接片段；B为生物正交基团，多个B可以相同也可以独立不同，选自：叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基、共轭二烯残基、磷酸残基、环炔残基及环烯残基；D各自独立地为相同或不同的具有生物活性和/或可检测的活性分子或基团，其选自：美登素、DM-1、DM-4、MMAE、MMAF、SN-38、Dxd、PBD及其类似物、鹅膏蕈碱、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、VP-16、喜树碱、紫杉醇、多烯紫杉醇、埃博霉素A、埃博霉素B、诺考达唑、秋水仙碱、雌莫司汀、西马多丁、艾榴塞洛素、荧光试剂、单糖、二糖、寡糖、多聚乙二醇(PEG)、免疫激动剂、细胞毒、放射性治疗物、分子影像试剂，或其组合；B’为B与D-L3进行正交反应形成的连接基团；L3为连接片段；上述生物活性分子/基团定点偶联至抗体重链和/或轻链N-端。
在另一实施方案中，上述的抗体偶联物中所述的Ab为抗体，所述抗体包括单克隆抗体、双功能抗体、含有Fc片段的纳米抗体、Fc融合蛋白或其组合。在另一实施方案中，所述的Ab为选自下组的抗体：Her-2纳抗、PD-L1纳抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、西妥昔单抗、莫罗单抗、吉妥珠单抗、阿昔单抗、达利珠单抗、阿达木单抗、帕利珠单抗、巴利昔单抗、贝伐珠单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、德尼单抗、迪西妥单抗、雷莫尼单抗、耐昔妥珠单抗、易普利姆玛、达雷木单抗、本妥昔单抗、阿仑单抗、埃罗妥珠单抗、博纳吐单抗、纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、特瑞普利单抗、卡妥索单抗、贝林妥欧单抗、艾美赛珠单抗、埃万妥单抗(Rybrevant)，或其组合。
在另一实施方案中，上述结构式I、II、III中的Ab也可表示为Protein，其表示烯丙醇衍生物单修饰至蛋白的N端，所述的Protein为抗体、纳抗、双抗、Fab片段、酶、细胞因子等。
在另一实施方案中，本发明公开的抗体药物偶联物结构式如下所示：
其中，结构式中的Protein是指烯丙醇衍生物单修饰至蛋白的N端，Ab是烯丙醇衍生物对称修饰至抗体重链或轻链的N端。
在特别优选的实施方案中，本发明公开的抗体药物偶联物结构式如下所示：
本发明提供了烯丙醇衍生物及其在制备定点修饰蛋白或多肽N端的药物偶联物中的应用。兹将本发明的技术方案总结如下：
1、一种烯丙醇衍生物，其为结构式如式3和式4所示的化合物或其盐，或该化合物或其盐的水合物或溶剂合物：
其中，R1，R2，R3均选自下组：氢原子，或包含羟基、羧基、醚键、酰胺键、叠氮基、炔基、氨基、生物素、双键、三键以及具有双亲性聚乙二醇链的芳香基团和开链或者环状的烷基；
R5为多肽或蛋白N端氨基酸保护或未保护侧链，所述氨基酸为天然氨基酸残基或非天然氨基酸；
R6为多肽或蛋白除N-端氨基酸以外的部分。
2、根据技术方案1所述的烯丙醇衍生物，其特征在于：所述结构式中R5为多肽或蛋白N端氨基酸保护或未保护侧链，所述氨基酸选自20种天然氨基酸，包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸；
3、根据技术方案1所述的烯丙醇衍生物，其特征在于：所述结构式中R5为多肽或蛋白N端氨基酸保护或未保护侧链，所述氨基酸选自侧链含叠氮、炔基、硼酸等基团的非天然氨基酸。
4、根据技术方案1所述的烯丙醇衍生物，其特征在于：所述结构式中R6为多肽或蛋白除N-端氨基酸以外的部分,所述的蛋白质或多肽可以是天然的、修饰的或是人工合成的；蛋白质或多肽可以单独作为单体存在，或者可以与另一分子形成复合物。
5、根据技术方案4所述的烯丙醇衍生物，其特征在于：所述的蛋白质为抗体、纳抗、双抗、Fab片段、酶、细胞因子等。
6、根据技术方案1所述的烯丙醇衍生物，其为结构式如式3和式4所示的化合物或其盐，或该化合物或其盐的水合物或溶剂合物：
其中，R2，R3为氢原子，R1为包含叠氮基的芳香基团、开链或者环状的烷基；
R5为多肽或蛋白N端氨基酸保护或未保护侧链，所述氨基酸选自20种天然氨基酸，包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸；
R6为多肽或蛋白除N-端氨基酸以外的部分，所述的蛋白质为抗体、纳抗、双抗、Fab片段、酶或细胞因子。
7、根据技术方案1所述的烯丙醇衍生物，其特征在于：结构式如式3或4所示的烯丙醇衍生物中，R1基团为苯基或以下基团：
8、根据技术方案1所述的烯丙醇衍生物，其特征在于：如式3或4所示的化合物选自下组：
其中，结构式中的Protein是指烯丙醇衍生物单修饰至蛋白的N端，Ab是烯丙醇衍生物对称修饰至抗体重链或轻链的N端。
9、根据技术方案8所述的烯丙醇衍生物，其特征在于：如式3或4所示的化合物选自下组：
10、制备式3或4所示的蛋白或多肽N-端偶联物的方法，其包括如下步骤：
在溶液中，在钯金属化合物与膦配体形成的配合物为催化剂存在下，用烯丙基醇衍生物1选择性地与多肽或蛋白2的N-端进行反应，得到式3或式4所示的多肽、蛋白N端偶联物：
其中，R1，R2，R3均选自下组：氢原子，或包含羟基、羧基、醚键、酰胺键、叠氮基、炔基、氨基、生物素、双键、三键以及具有双亲性聚乙二醇链的芳香基团和开链或者环状的烷基；
R4表示R1，OR1,NR1；其中，R1如上所定义；
R5为多肽或蛋白N端氨基酸保护或未保护侧链，所述氨基酸为天然氨基酸残基或非天然氨基酸；其中，天然氨基酸包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸；
R6为多肽或蛋白除N-端氨基酸以外的部分。
11、根据技术方案10所述的方法，其特征在于：所述方法中反应得到是独立存在的式3或式4所示的多肽/蛋白N端偶联物，或者3或4可同时存在。
12、根据技术方案10所述的方法，其特征在于：所述方法中式1所示的烯丙基醇衍生物根据需要还可以含有具有生物活性和/或可检测的活性分子或基团。
13、根据技术方案12所述的方法，其特征在于：所述的具有生物活性和/或可检测的活性基团选自：美登素、DM-1、DM-4、MMAE、MMAF、SN-38、Dxd、PBD及其类似物、鹅膏蕈碱、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、VP-16、喜树碱、紫杉醇、多烯紫杉醇、埃博霉素A、埃博霉素B、诺考达唑、秋水仙碱、雌莫司汀、西马多丁、艾榴塞洛素、荧光试剂、单糖、二糖、寡糖、多聚乙二醇(PEG)、免疫激动剂、细胞毒、放射性治疗物、分子影像试剂，或其组合。
14、根据技术方案10所述的方法，其特征在于：所述方法中式1所示的烯丙基醇衍生物选自如下所示的化合物：
15、根据技术方案10所述的方法，其特征在于：所述方法中式2所示的蛋白质或多肽可以是天然的、修饰的或是人工合成的；蛋白质或多肽可以单独作为单体存在，或者可以与另一分子形成复合物。
16、根据技术方案15所述的方法，其特征在于：所述方法中式2所示的蛋白质或多肽为抗体、纳抗、双抗、Fab片段、酶、细胞因子、短肽等。
17、根据技术方案16所述的方法，其特征在于：所述方法中式2所示的蛋白质为RNase A酶和RNase B酶。
18、根据技术方案15所述的方法，其特征在于：所述方法中式2所示的蛋白质为抗体，所述抗体包括单克隆抗体、双功能抗体、含有Fc片段的纳米抗体、Fc融合蛋白或其组合。
19、根据技术方案18所述的方法，其特征在于：所述方法中式2所示的蛋白质为选自下组的抗体，包括：Her-2纳抗、PD-L1纳抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、西妥昔单抗、莫罗单抗、吉妥珠单抗、阿昔单抗、达利珠单抗、阿达木单抗、帕利珠单抗、巴利昔单抗、贝伐珠单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、德尼单抗、迪西妥单抗、雷莫尼单抗、耐昔妥珠单抗、易普利姆玛、达雷木单抗、本妥昔单抗、阿仑单抗、埃罗妥珠单抗、博纳吐单抗、纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、特瑞普利单抗、卡妥索单抗、贝林妥欧单抗、艾美赛珠单抗、埃万妥单抗(Rybrevant)，或其组合。
20、根据技术方案10所述的方法，其特征在于：所述方法中式2所示的蛋白质或多肽为选自下组的多肽：
21、根据技术方案10所述的方法，其特征在于：所述方法中，按化合物1用量计，所述的金属钯催化剂用量为1～5000mol％；和/或膦配体用量为10～50000mol％。
22、根据技术方案21所述的方法，其特征在于：所述方法中，按化合物1用量计，所述的金属钯催化剂用量为10～1000mol％；和/或膦配体用量为100～5000mol％。
23、根据技术方案10所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述的金属钯化合物选自下组：Pd(OAc)2、PdCl2、Pd(PPh3)4、Pd(PPh3)2Cl2、Pd2(dba)3、Pd(dba)2、Pd(dppf)Cl2，或其组合。
24、根据技术方案10所述的方法，其特征在于：所述方法中，所述的膦配体具有如下结构式：
25、根据技术方案10所述的方法，其特征在于：所述方法中溶剂为水或缓冲液醇类溶剂、非质子极性溶剂或其组合。
26、根据技术方案25所述的方法，其特征在于：所述方法中溶剂为PB、PBS、HEPES、Tris、BES或MES缓冲液。
27、根据技术方案25所述的方法，其特征在于：所述方法中醇类溶剂为甲醇、乙醇、三氟乙醇、异丙醇、正丁醇和乙二醇)。
28、根据技术方案25所述的方法，其特征在于：所述方法中非质子极性溶剂为如乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺或二甲亚砜)。
29、根据技术方案10所述的方法，其特征在于：所述方法中反应温度在0℃到60℃。
30、根据技术方案29所述的方法，其特征在于：所述方法中反应温度在20℃到40℃。
31、根据技术方案10所述的方法，其特征在于：所述方法中，反应时间为0.1到30小时。
32、根据技术方案31所述的方法，其特征在于：所述方法中，反应时间为0.5到24小时。
33、一种如式(I)所示的抗体药物偶联物，其结构式为：
((D-L2)x-L1-CH2NH)y-Ab(I)
其中，Ab为抗体，下标x为1-10的整数，下标y为1-8的整数，L1为含有碳碳双键结构的连接片段，L2为无或含两亲性的聚乙二醇链以及可裂解片段的连接片段，D各自独立地为相同或不同的具有生物活性和/或可检测的活性分子或基团，其选自：美登素、DM-1、DM-4、MMAE、MMAF、SN-38、Dxd、PBD及其类似物、鹅膏蕈碱、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、VP-16、喜树碱、紫杉醇、多烯紫杉醇、埃博霉素A、埃博霉素B、诺考达唑、秋水仙碱、雌莫司汀、西马多丁、艾榴塞洛素、荧光试剂、单糖、二糖、寡糖、多聚乙二醇(PEG)、免疫激动剂、细胞毒、放射性治疗物、分子影像试剂，或其组合；所述抗体药物偶联物偶联至抗体重链和/或轻链N-端。
34、一种如式(II)所示的位点特异性的，双价或多价生物正交基团修饰的抗体药物偶联物，其结构式为：
((B-L2)x-L1-CH2NH)y-Ab(II)
其中，Ab为抗体，下标x为1-10的整数，下标y为1-8的整数；L1为含有碳碳双键结构的连接片段；L2为无或含两亲性的聚乙二醇链以及可裂解片段的连接片段；B为生物正交基团，多个B可以相同也可以独立不同，选自：叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基、共轭二烯残基、磷酸残基、环炔残基及环烯残基；所述带生物正交基团的偶联物偶联至抗体重链和/或轻链N-端。
35、一种如式(III)所示的位点特异性的，双价或多价生物活性分子/基团修饰的抗体药物偶联物，其结构式为：
((D-L2-B’-L3)x-L1-CH2NH)y-Ab(III)
其中，Ab为抗体，下标x为1-10的整数，下标y为1-8的整数；L1为含有碳碳双键结构的连接片段；L2为无或含两亲性的聚乙二醇链以及可裂解片段的连接片段；B为生物正交基团，多个B可以相同也可以独立不同，选自：叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基、共轭二烯残基、磷酸残基、环炔残基及环烯残基；D各自独立地为相同或不同的具有生物活性和/或可检测的活性分子或基团，其选自：美登素、DM-1、DM-4、MMAE、MMAF、SN-38、Dxd、PBD及其类似物、鹅膏蕈碱、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、VP-16、喜树碱、紫杉醇、多烯紫杉醇、埃博霉素A、埃博霉素B、诺考达唑、秋水仙碱、雌莫司汀、西马多丁、艾榴塞洛素、荧光试剂、单糖、二糖、寡糖、多聚乙二醇(PEG)、免疫激动剂、细胞毒、放射性治疗物、分子影像试剂，或其组合；B’为B与D-L3进行正交反应形成的连接基团；L3为连接片段；上述生物活性分子/基团定点偶联至抗体重链和/或轻链N-端。
36、根据技术方案33-35任一项所述的抗体药物偶联物，其特征在于：所述的Ab为抗体，所述抗体包括单克隆抗体、双功能抗体、含有Fc片段的纳米抗体、Fc融合蛋白或其组合。
37、根据技术方案36所述的抗体药物偶联物，其特征在于：所述的Ab为选自下组的抗体：Her-2纳抗、PD-L1纳抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、西妥昔单抗、莫罗单抗、吉妥珠单抗、阿昔单抗、达利珠单抗、阿达木单抗、帕利珠单抗、巴利昔单抗、贝伐珠单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、德尼单抗、迪西妥单抗、雷莫尼单抗、耐昔妥珠单抗、易普利姆玛、达雷木单抗、本妥昔单抗、阿仑单抗、埃罗妥珠单抗、博纳吐单抗、纳武单抗、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗、特瑞普利单抗、卡妥索单抗、贝林妥欧单抗、艾美赛珠单抗、埃万妥单抗(Rybrevant)，或其组合。
38、根据技术方案33-35任一项所述的抗体药物偶联物，其特征在于：所述结构式I、II、III中的Ab也可表示为Protein，其表示烯丙醇衍生物单修饰至蛋白的N端，所述的Protein为抗体、纳抗、双抗、Fab片段、酶、细胞因子等。
39、根据技术方案36或38所述的抗体药物偶联物，其特征在于：所述的抗体药物偶联物结构式如下所示：
其中，结构式中的Protein是指烯丙醇衍生物单修饰至蛋白的N端，Ab是烯丙醇衍生物对称修饰至抗体重链或轻链的N端。
40、根据技术方案39所述的抗体药物偶联物，其特征在于：所述的抗体药物偶联物结构式如下所示：
其中，所述的抗体Ab为曲妥珠单抗。
附图说明
图1为产物1d的氢谱图
图2为产物1d的碳谱图
图3为多肽AAF(2a)在钯催化下肉桂基化的HPLC图
图4为产物3a的氢谱图
图5为产物3a的碳谱谱图
图6为产物3a的碳谱DEPT图
图7为产物3a的氢氢相关(H-HCOSY)谱图
图8为产物3a的异核单量子关系(HSQC)谱图
图9为产物3a的异核多量子关系(HMBC)谱图
图10为产物3b的氢谱图
图11为产物3b的碳谱谱图
图12为产物3b的异核多量子关系(HMBC)谱图
图13为产物4b的氢谱图
图14为产物4b的碳谱谱图
图15为产物4b的异核多量子关系(HMBC)谱图
图16为9肽2B在钯催化下肉桂基化的HPLC图
图17为9肽2B的产物3B的LC-MS图
图18为9肽2B的产物4B的LC-MS图
图19为蛋白RibonucleaseA在钯催化下肉桂基化后的LC-MS图
图20为蛋白RibonucleaseB在钯催化下肉桂基化后的LC-MS图
图21为蛋白Her2的纳米抗体在钯催化下肉桂基化后的LC-MS图
图22为蛋白PD-L1的纳米抗体在钯催化下肉桂基化后的LC-MS图
图23为曲妥珠单抗及其N端偶联物1的LC-MS图
图24为曲妥珠单抗及其N端偶联物2轻重链分析的LC-MS图
图25为曲妥珠单抗N端偶联物2的LC-MS图
图26为曲妥珠单抗N端偶联物3的LC-MS图
图27为曲妥珠单抗N端偶联物4的LC-MS图
图28为曲妥珠单抗N端偶联物5的LC-MS图
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和分数是重量百分比和重量分数。
除非另有说明，各实施例中的检测方法和条件如下：
ESI-TOFMS
流动相A：0.1％FA的水溶液，流动相B：0.1％FA的乙腈溶液。
方法A：用于小分子化合物的质谱分析。使用C18色谱柱(ACQUITY UPLC BEH C18,1.7μm,2.1x 50mm)，其液相程序为0-0.2-1.5-1.8-2.0-2.5分钟时对应流动相B为10-10-70-70-10-10％，检测波长为214nm，柱温：35℃。
方法B：用于抗体及ADC分子的质谱分析。使用C4柱(ACQUITY UPLC Protein BEHC4,1.7μm,2.1mm x 50mm)，其液相程序为0-2.0-6.0-7.2-7.3-7.6-7.7-8.0-8.1-10.0分钟时对应流动相B为5-5-90-90-5-90-5-90-5-5％，检测波长为280nm，柱温：80℃。
I:烯丙醇衍生物的制备
实施例1：1d的合成
步骤1：称取对氨基肉桂酸乙酯S1(15.7mmol,1.0equiv)溶解在30mL二氯甲烷中，-78度下缓慢加入二异丁基氢化铝(39.3mmol,2.5equiv)的正己烷溶液，随后反应4小时。待反应完毕，加入氢氧化钠溶液淬灭反应，继续搅拌15分钟后，升至室温，加入硫酸镁后过滤；滤液以卤水洗涤后，柱层析纯化得2.1g灰黄色固体，90％收率。QTOF MS calcd.for C9H12NO+[M+H]+:150.0913；Found:150.0933.
步骤2：称取对氨基肉桂醇S2(2.1g,14.1mmol,1.0equiv)溶解于60毫升1，4-二氧六环和水的混合溶剂(1：1)。随后加入氯甲酸-9-芴基甲酯(Fmoc-Cl)(4g,15.5mmol,1.1equiv)和碳酸氢钠(11.8g,141mmol,10equiv)，室温下反应12小时。反应结束后，加入稀盐酸淬灭反应，二氯甲烷萃取，有机相卤水洗涤，浓缩后柱层析纯化得淡黄色固体3.7g，收率71％。QTOF MS calcd.for C24H21NO3Na+[M+Na]+:394.1414；Found:394.1422.1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.72(s,1H),7.91(d,J＝7.5Hz,2H),7.75(d,J＝7.5Hz,2H),7.52–7.26(m,8H),6.46(dt,J＝15.9,1.8Hz,1H),6.25(dt,J＝15.9,5.2Hz,1H),4.80(t,J＝5.5Hz,1H),4.49(d,J＝6.7Hz,2H),4.31(t,J＝6.6Hz,1H),4.09(td,J＝5.3,1.8Hz,2H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ153.82,144.25,141.29,138.59,131.71,129.51,128.61,128.16,127.60,127.04,125.59,120.67,118.81,66.03,62.05,47.10.
步骤3：称取S3(3g,8.1mmol,1.0equiv),Ac2O(1.65g,16.2mmol,2.0equiv),DMAP(0.1g,0.8mmol,0.1equiv)于吡啶中，室温下反应2小时。柱层析分离得淡黄色固体2.1g，收率63％。QTOF MS calcd.for C26H23NO4Na+[M+Na]+:436.1519；Found:436.1514.1H NMR(500MHz,DMSO)δ9.78(s,1H),7.91(d,J＝6.7Hz,2H),7.75(d,J＝7.4Hz,2H),7.48–7.31(m,8H),6.60(d,J＝15.9Hz,1H),6.24(dt,J＝15.9,6.4Hz,1H),4.65(d,J＝6.3Hz,2H),4.49(d,J＝6.7Hz,2H),4.31(t,J＝6.6Hz,1H),2.05(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ170.66,153.79,144.24,141.29,139.33,133.45,130.71,128.17,127.56,127.51,125.59,122.40,120.67,118.73,66.08,64.98,47.09,21.22.
步骤4：称取S4(2.1g,5.1mmol,1.0equiv)溶于20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺中，室温下反应30分钟。柱层析分离得0.92g产物，收率95％。
步骤5：称取S5(30mg,0.157mmol,1.0equiv)，叠氮乙酸(19mg,0.188mmol,1.2equiv)，HATU(71.6mg,0.188mmol,1.2equiv),DIPEA(48.6mg,0.377mmol,2.4equiv)于DMF，室温下反应2小时。柱层析分离得26mg产物1d，收率61％。QTOF MS calcd.forC13H14N4O3Na+[M+Na]+:297.0958；Found:297.0956.1H NMR(500MHz,DMSO)δ10.20(s,1H),7.57(d,J＝8.7Hz,2H),7.43(d,J＝8.7Hz,2H),6.63(d,J＝14.5Hz,1H),6.28(dt,J＝15.9,6.3Hz,1H),4.67(d,J＝6.3Hz,2H),4.04(s,2H),2.05(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ170.65,166.75,138.66,133.23,131.87,127.56,123.05,119.77,64.90,51.76,21.21.
实施例2：1e的合成
将实施例1中的叠氮乙酸换为生物素(46mg,0.188mmol,1.2equiv)，其余操作相同，得到30mg产物，收率46％。QTOF MS calcd.for C21H27N3O44SNa+[M+Na]+:440.1614；Found:440.1607.1H NMR(500MHz,DMSO)δ9.93(s,1H),7.57(d,J＝8.6Hz,2H),7.38(d,J＝8.7Hz,2H),6.60(d,J＝15.9Hz,1H),6.45(s,2H),6.25(dt,J＝15.9,6.4Hz,1H),4.66(dd,J＝6.4,1.4Hz,2H),4.31(dd,J＝7.8,5.0Hz,1H),4.14(dd,J＝7.8,4.4Hz,1H),3.12(ddd,J＝8.6,6.2,4.4Hz,1H),2.82(dd,J＝12.4,5.1Hz,1H),2.58(d,J＝12.4Hz,1H),2.30(t,J＝8.0Hz,2H),2.05(s,3H),1.71–1.30(m,7H),1.27(d,J＝6.7Hz,1H),1.12(d,J＝6.7Hz,1H).13C NMR(126MHz,DMSO)δ171.66,170.65,163.20,139.63,133.47,131.13,127.41,122.51,119.48,64.97,61.52,59.68,55.86,44.95,36.71,28.71,28.56,25.55,21.21(图1，2).
实施例3：三肽AAF的N端肉桂基化修饰
步骤：1μL1a(500mM in DMSO),1μL2a(50mM in H2O)和2μL Pd(OAc)2/TPPTScomplex(10mM in H2O)加入到96μL PB(50mM,pH 7.4)中，37度孵育10小时。HPLC监测反应(图3)，LC-MS和NMR确定产物结构(图4-9)，转化率3a(70％)和4a(20.7％)。ESI-MScalcd.for 3a C24H31N4O3 +[M+H]+m/z＝423.2391,found[M+H]+m/z＝423.2247；calcdfor4afor C33H39N4O3 +[M+H]+m/z＝539.3017,found[M+H]+m/z＝539.3033..
实施例4：三肽CAF的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为2b，其余操作相同，NMR确定产物结构(图10-15)，转化率3b(44％)和4b(50％)。ESI-MS calcd.for 3b C24H30N4O3S+[M+H]+m/z＝455.2111,found[M+H]+m/z＝455.2139；4bC33H39N4O3S+[M+H]+m/z＝571.2737,found[M+H]+m/z＝571.2746.
实施例5：三肽GAF的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为2c，其余操作相同，转化率3c(44％)和4c(84％)。ESI-MScalcd.for 3c C23H29N4O3 +[M+H]+m/z＝409.2234,found[M+H]+m/z＝409.2218；calcd.for4c C32H37N4O3 +[M+H]+m/z＝525.2860,found[M+H]+m/z＝525.2869。
实施例6：三肽LAF的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为2d，其余操作相同，转化率3d(65.5％)。ESI-MS calcd.for3d C27H37N4O3 +[M+H]+m/z＝465.2860,found[M+H]+m/z＝465.2887；
实施例7：三肽IAF的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为2e，其余操作相同，转化率3e(70.9％)。ESI-MS calcd.for3e C27H37N4O3 +[M+H]+m/z＝465.2860,found[M+H]+m/z＝465.2887；
实施例8：三肽VAF的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为2f，其余操作相同，转化率3f(77.8％)。ESI-MS calcd.for3f C26H35N4O3 +[M+H]+m/z＝451.2704,found[M+H]+m/z＝451.2626
实施例9：三肽FAF的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为2g，其余操作相同，转化率3g(74.1％)。ESI-MS calcd.for3gC30H35N4O3 +[M+H]+m/z＝499.2704,found[M+H]+m/z＝499.2729.
实施例10：三肽PAF的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为2h，其余操作相同，转化率3h(95.0％)。ESI-MS calcd.for3hC26H33N4O3 +[M+H]+m/z＝449.2547,found[M+H]+m/z＝449.2528.
实施例11：三肽MAF的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为2i，其余操作相同，转化率3i(54％)和4i(15.7％)。ESI-MScalcd.for 3iC26H35N4O3S+[M+H]+m/z＝483.2424,found[M+H]+m/z＝483.2412；calcd.for4i C35H43N4O3S+[M+H]+m/z＝599.3050,found[M+H]+m/z＝599.3086.
实施例12：三肽WAF的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为2j，其余操作相同，转化率3j(76.9％)。ESI-MS calcd.for3jC32H36N5O3 +[M+H]+m/z＝538.2813,found[M+H]+m/z＝538.2830.
实施例13：三肽SAF的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为2k，其余操作相同，转化率3k(74.3％)。ESI-MS calcd.for3k C24H31N4O4 +[M+H]+m/z＝439.2340,found[M+H]+m/z＝439.2328.
实施例14：三肽TAF的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为2l，其余操作相同，转化率3l(77.6％)。ESI-MS calcd.for3lC25H33N4O4 +[M+H]+m/z＝453.2496,found[M+H]+m/z＝453.2550.
实施例15：三肽QAF的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为2m，其余操作相同，转化率3m(45.8％)和4m(23.9)。ESI-MScalcd.for 3m C26H34N5O4 +[M+H]+m/z＝480..2605,found[M+H]+m/z＝480.2688；calcd.for4m C35H42N5O4 +[M+H]+m/z＝596..3231,found[M+H]+m/z＝596.3226.
实施例16：三肽NAF的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为2n，其余操作相同，转化率3n(53.2％)和4n(8.3％)。ESI-MScalcd.for 3nC25H32N5O4 +[M+H]+m/z＝466.2449,found[M+H]+m/z＝466.2379；calcd.for 4nC34H40N5O4 +[M+H]+m/z＝582.3075,found[M+H]+m/z＝582.3089.
实施例17：三肽YAF的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为2o，其余操作相同，转化率3o(56.4％)和4o(24.9％)。ESI-MS calcd.For 3oC30H35N4O4 +[M+H]+m/z＝515.2653,found[M+H]+m/z＝515.2626；calcd.for4o C39H43N4O4 +[M+H]+m/z＝631.3279,found[M+H]+m/z＝631.3323.
实施例18：三肽DAF的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为2p，其余操作相同，转化率3p(32.5％)和4p(6％)。ESI-MScalcd.for 3pC25H31N4O5 +[M+H]+m/z＝467.2289,found[M+H]+m/z＝467.2319；calcd.for 4pC34H39N4O5 +[M+H]+m/z＝583.2915,found[M+H]+m/z＝583.2895.
实施例19：三肽EAF的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为2q，其余操作相同，转化率3q(56.7％)和4q(6.7％)。ESI-MScalcd.for 3qC26H33N4O5 +[M+H]+m/z＝481.2445,found[M+H]+m/z＝481.2450；calcd.for 4qC35H41N4O5 +[M+H]+m/z＝597.3071,found[M+H]+m/z＝597.3092。
实施例20：三肽KAF的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为2r，其余操作相同，转化率3r(76.7％)和4r(18.6％)。ESI-MS calcd.for 3rC27H38N5O3 +[M+H]+m/z＝480.2969,found[M+H]+m/z＝409.2957；calcd.for4r C36H46N5O3 +[M+H]+m/z＝596.3595,found[M+H]+m/z＝525.3625.
实施例21：三肽RAF的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为2s，其余操作相同，转化率3s(69.7％)和4s(24.8％)。ESI-MS calcd.for 3sC27H38N7O3 +[M+H]+m/z＝508.3031,found[M+H]+m/z＝508.3043；calcd.for4s C36H46N7O3 +[M+H]+m/z＝624.3657,found[M+H]+m/z＝624.3642.
实施例22：三肽HAF的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为2t，其余操作相同，转化率3t(81.5％)和4t(7.5％)。ESI-MScalcd.for 3t C27H33N6O3 +[M+H]+m/z＝489.2609,found[M+H]+m/z＝489.2586；calcd.for4t C36H46N7O3 +[M+H]+m/z＝605.3235,found[M+H]+m/z＝605.3221.
实施例23：3u的合成
将实施例3中的2a换为2u，其余操作相同，转化率52％。ESI-MS calcd.for 3uC118H175N31O30S2 4+[M+4H]4+m/z＝642.5635,found m/z＝642.5642.
实施例24：药用肽的N端肉桂基化修饰
将实施例3中的2a换为下图中药用肽，其余操作相同，结果如下图所示。
实施例25：20种N端含不同天然氨基酸的9肽的N-端偶联物的合成
将实施例3中的2a换为下图中20种N端含不同天然氨基酸的9肽(2A-2T)，其余操作相同，结果如(图16-18)和下图所示。
a.孵育时间缩短为4h
b.反应体系中钯的当量提升一倍
c.半胱氨酸侧链巯基优先参与反应
实施例26：Ribonuclease AN-端偶联物的合成
步骤：将Ribonuclease A(50uM),1a(5mM)和Pd(OAc)2/TPPTS complex(0.2mM)于PB(50mM,pH 7.4)中37度孵育10小时。随后加入DCT淬灭反应，LC-MS进行确认(图19)，转化率83％。
实施例27：Ribonuclease B N-端偶联物的合成
步骤：将Ribonuclease B(50uM),1a(5mM)和Pd(OAc)2/TPPTS complex(0.2mM)于PB(50mM,pH 7.4)中37度孵育10小时。随后加入DCT淬灭反应，LC-MS进行确认(图20)，转化率71％。
实施例28：Her2纳米抗体N-端偶联物的合成
步骤：将Here2纳米抗体(50uM),1a(5mM)和Pd(OAc)2/TPPTS complex(0.2mM)于PB(50mM,pH 7.4)中37度孵育10小时。随后加入DCT淬灭反应，LC-MS进行确认(图21)，转化率43％。
实施例29：PDL1纳米抗体N-端偶联物的合成
步骤：将PDL1纳米抗体(50uM),1a(5mM)和Pd(OAc)2/TPPTS complex(0.2mM)于PB(50mM,pH 7.4)中37度孵育10小时。随后加入DCT淬灭反应，LC-MS进行确认(图22)，转化率84％。
实施例30：曲妥珠单抗N-端偶联物1的合成
步骤：将曲妥珠单抗(20uM),1a(5mM)和Pd(OAc)2/TPPTS complex(0.2mM)于PB(50mM,pH 7.4)中37度孵育6小时。随后加入DCT淬灭反应，LC-MS进行确认(图23)。
实施例31：曲妥珠单抗N-端偶联物2的合成
步骤：将曲妥珠单抗(20uM),1d(5mM)和Pd(OAc)2/TPPTS complex(0.2mM)于PB(50mM,pH 7.4)中37度孵育15小时。随后加入DCT淬灭反应，超声5分钟。向其中加入Endo S2(0.15mg/ml)孵育10分钟后，LC-MS进行确认(图24-25)。
实施例32：曲妥珠单抗N-端偶联物3的合成
步骤：将曲妥珠单抗(20uM),1e(5mM)和Pd(OAc)2/TPPTS complex(0.2mM)于PB(50mM,pH 7.4)中37度孵育15小时。随后加入DCT淬灭反应，超声5分钟。向其中加入Endo S2(0.15mg/ml)孵育10分钟后，LC-MS进行确认(图26)。
实施例33：曲妥珠单抗N-端偶联物4的合成
步骤：将曲妥珠单抗N-端偶联物2(5mg/ml)和DBCO-PEG4-MMAE(0.5mM)于1X PBS(pH 7.4)中37度孵育3小时，随后加入Endo S2(0.15mg/ml)脱去抗体糖链，LC-MS进行确认(图27)。
实施例34：曲妥珠单抗N-端偶联物5的合成
步骤：将曲妥珠单抗N-端偶联物2(5mg/ml)和DBCO-PEG4-Val-Cit-PAB-MMAE(0.5mM)于1X PBS(pH 7.4)中37度孵育3小时，随后加入Endo S2(0.15mg/ml)脱去抗体糖链，LC-MS进行确认(图28)。
Claims (10)
1.一种烯丙醇衍生物，其为结构式如式3和式4所示的化合物或其盐，或该化合物或其盐的水合物或溶剂合物：
其中，R1，R2，R3均选自下组：氢原子，或包含羟基、羧基、醚键、酰胺键、叠氮基、炔基、氨基、生物素、双键、三键以及具有双亲性聚乙二醇链的芳香基团和开链或者环状的烷基；
R5为多肽或蛋白N端氨基酸保护或未保护侧链，所述氨基酸为天然氨基酸残基或非天然氨基酸；
R6为多肽或蛋白除N-端氨基酸以外的部分。
2.根据权利要求1所述的烯丙醇衍生物，其特征在于：如式3所示的化合物选自下组：
其中，结构式中的Protein是指烯丙醇衍生物单修饰至蛋白的N端，Ab是烯丙醇衍生物对称修饰至抗体重链或轻链的N端。
3.制备式3或4所示的蛋白或多肽N-端偶联物的方法，其包括如下步骤：
在溶液中，在钯金属化合物与膦配体形成的配合物为催化剂存在下，用烯丙基醇衍生物1选择性地与多肽或蛋白2的N-端进行反应，得到式3或式4所示的多肽、蛋白N端偶联物：
其中，R1，R2，R3均选自下组：氢原子，或包含羟基、羧基、醚键、酰胺键、叠氮基、炔基、氨基、生物素、双键、三键以及具有双亲性聚乙二醇链的芳香基团和开链或者环状的烷基；
R4表示R1，OR1,NR1；其中，R1如上所定义；
R5为多肽或蛋白N端氨基酸保护或未保护侧链，所述氨基酸为天然氨基酸残基或非天然氨基酸；其中，天然氨基酸包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸；
R6为多肽或蛋白除N-端氨基酸以外的部分。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法中式1所示的烯丙基醇衍生物选自如下所示的化合物：
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法中式2所示的蛋白质或多肽为抗体、纳抗、双抗、Fab片段、酶、细胞因子、短肽等。
6.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述方法中式2所示的蛋白质或多肽为选自下组的多肽：
7.一种如式(I)所示的抗体药物偶联物，其结构式为：
((D-L2)x-L1-CH2NH)y-Ab (I)
其中，Ab为抗体，下标x为1-10的整数，下标y为1-8的整数，L1为含有碳碳双键结构的连接片段，L2为无或含两亲性的聚乙二醇链以及可裂解片段的连接片段，D各自独立地为相同或不同的具有生物活性和/或可检测的活性分子或基团，其选自：美登素、DM-1、DM-4、MMAE、MMAF、SN-38、Dxd、PBD及其类似物、鹅膏蕈碱、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、VP-16、喜树碱、紫杉醇、多烯紫杉醇、埃博霉素A、埃博霉素B、诺考达唑、秋水仙碱、雌莫司汀、西马多丁、艾榴塞洛素、荧光试剂、单糖、二糖、寡糖、多聚乙二醇(PEG)、免疫激动剂、细胞毒、放射性治疗物、分子影像试剂，或其组合；所述抗体药物偶联物偶联至抗体重链和/或轻链N-端。
8.一种如式(II)所示的位点特异性的，双价或多价生物正交基团修饰的抗体药物偶联物，其结构式为：
((B-L2)x-L1-CH2NH)y-Ab (II)
其中，Ab为抗体，下标x为1-10的整数，下标y为1-8的整数；L1为含有碳碳双键结构的连接片段；L2为无或含两亲性的聚乙二醇链以及可裂解片段的连接片段；B为生物正交基团，多个B可以相同也可以独立不同，选自：叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基、共轭二烯残基、磷酸残基、环炔残基及环烯残基；所述带生物正交基团的偶联物偶联至抗体重链和/或轻链N-端。
9.一种如式(III)所示的位点特异性的，双价或多价生物活性分子/基团修饰的抗体药物偶联物，其结构式为：
((D-L2-B’-L3)x-L1-CH2NH)y-Ab (III)
其中，Ab为抗体，下标x为1-10的整数，下标y为1-8的整数；L1为含有碳碳双键结构的连接片段；L2为无或含两亲性的聚乙二醇链以及可裂解片段的连接片段；B为生物正交基团，多个B可以相同也可以独立不同，选自：叠氮残基、醛残基、硫醇残基、炔烃残基、烯烃残基、卤素残基、四嗪残基、硝酮残基、羟胺残基、腈残基、肼残基、酮残基、硼酸残基、氰基苯并噻唑残基、烯丙基残基、膦残基、马来酰亚胺残基、二硫残基、硫酯残基、α-卤代羰基残基、异腈残基、斯德酮残基、硒残基、共轭二烯残基、磷酸残基、环炔残基及环烯残基；D各自独立地为相同或不同的具有生物活性和/或可检测的活性分子或基团，其选自：美登素、DM-1、DM-4、MMAE、MMAF、SN-38、Dxd、PBD及其类似物、鹅膏蕈碱、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、VP-16、喜树碱、紫杉醇、多烯紫杉醇、埃博霉素A、埃博霉素B、诺考达唑、秋水仙碱、雌莫司汀、西马多丁、艾榴塞洛素、荧光试剂、单糖、二糖、寡糖、多聚乙二醇(PEG)、免疫激动剂、细胞毒、放射性治疗物、分子影像试剂，或其组合；B’为B与D-L3进行正交反应形成的连接基团；L3为连接片段；上述生物活性分子/基团定点偶联至抗体重链和/或轻链N-端。
10.根据权利要求7-9任一项所述的抗体药物偶联物，其特征在于：所述的抗体药物偶联物结构式如下所示：
其中，所述的抗体Ab为曲妥珠单抗。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211217174.4A CN115746089A (zh) | 2022-10-01 | 2022-10-01 | 烯丙醇衍生物及其在蛋白修饰中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211217174.4A CN115746089A (zh) | 2022-10-01 | 2022-10-01 | 烯丙醇衍生物及其在蛋白修饰中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115746089A true CN115746089A (zh) | 2023-03-07 |
Family
ID=85352085
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211217174.4A Pending CN115746089A (zh) | 2022-10-01 | 2022-10-01 | 烯丙醇衍生物及其在蛋白修饰中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115746089A (zh) |
-
2022
- 2022-10-01 CN CN202211217174.4A patent/CN115746089A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2019202458B2 (en) | Stapled and stitched polypeptides and uses thereof | |
| JP6363122B2 (ja) | ステッチングされたポリペプチド | |
| JP7100034B2 (ja) | 多環式ペプチド及びそれらの調製方法 | |
| WO2019223653A1 (zh) | 一种抗体药物偶联物中间体的制备工艺 | |
| MX2015005652A (es) | Analogos de spliceostatina. | |
| JP7292751B2 (ja) | 抗体薬物複合体用薬物リンカーｍｃ－ｍｍａｆの調製方法及びその中間体 | |
| WO2012174423A1 (en) | Stabilized polypeptides as regulators of rab gtpase function | |
| DE112018007259T5 (de) | Antikörper-Wirkstoff-Konjugat mit einer säurebildenden Selbststabilisierungs-Anbindung | |
| CN1161697A (zh) | β,β'-二羟基中位取代的二氢卟酚、异细菌二氢卟酚、细菌二氢卟酚,和从β,β'-未取代的四吡咯大环制备所述化合物的方法 | |
| JP2019510740A (ja) | 抗体−リファマイシン複合体の製造プロセス | |
| CN109928908B (zh) | 一种用于抗体药物偶联物的药物-连接子mc-mmaf的制备方法及其中间体 | |
| JP2022514687A (ja) | Ｐｄ－ｌ１に特異的な二環式ペプチドリガンド | |
| CN109069581B (zh) | 锁环螺旋肽及合成方法 | |
| Busnel et al. | Preparation of new monomers aza-β3-aminoacids for solid-phase syntheses of aza-β3-peptides | |
| CN115746089A (zh) | 烯丙醇衍生物及其在蛋白修饰中的应用 | |
| WO2020181686A1 (zh) | 一种用于抗体药物偶联物的药物-连接子mc-mmaf的制备方法及其中间体 | |
| JP2022515721A (ja) | ＦＡＰαに特異的な二環式ペプチドリガンド | |
| EP4238979A1 (en) | Beta-strand type crosslinked peptide | |
| WO2022163041A1 (ja) | インドール構造選択的反応剤、インドール構造選択的架橋剤、及びこれらを用いた複合体の製造方法 | |
| CN117730076A (zh) | 含有四嗪部分的氨基酸 | |
| XI | Biological and chemical approaches toward site-directed protein modifications and a novel synthetic method to rhodamine B derivatives for protein labeling | |
| JP2000501068A (ja) | アクチノマイシンｄ類似体 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication |