CN115746061B - 一种光照释放no的多吡啶钌配合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种光照释放NO的多吡啶钌配合物，其具有如下式I所述的结构：其中，选自或
Description
技术领域
本发明涉及药物化学技术领域，具体地涉及到一种光照释放NO的多吡啶钌配合物及其制备方法和应用。
背景技术
癌症(或恶性肿瘤)和细菌感染性疾病目前已经严重危害人类的生命健康。癌症是全球第二大致死原因。据统计，2018年全球范围内约有1810万癌症新发病例和960万癌症死亡病例。化疗和放疗是临床癌症治疗的主要手段，但患者往往会出现严重的副作用。随着科学技术的发展，肿瘤的治疗手段有了很大的进步，但肿瘤致死率极高的现状仍然无法改变。另外，据世界卫生组织报道，细菌感染性疾病占全部疾病死因的25％以上，每年有约1300万儿童死于感染性疾病。抗菌药物的研发和使用在人类对抗细菌感染中发挥了十分重要的作用。但抗生素的长时间使用会导致细菌发生药物耐受，致病菌的耐药性目前已成为全球面临的严峻挑战。迫切需要开发对抗癌症和细菌感染的新药物和新方法。
光控或光激活抗肿瘤和抗菌疗法，特别是光动力疗法，作为抑制肿瘤生长和控制细菌感染的替代策略已经引起了越来越多的兴趣。其中，光动力疗法是一种精准、高效、低毒的新型治疗手段，具有选择性好、非侵入性、微创性等优点。该疗法是通过特定波长的激光照射光敏剂诱导产生活性氧，对肿瘤或细菌相关的分子靶标(如蛋白质、脂质和核酸等)造成不可逆转的损害，从而达到杀灭癌细胞和细菌的效果。但是传统的光动力疗法产生活性氧杀死癌细胞或细菌的过程需要不断消耗氧气，结果造成治疗部位的氧分压迅速下降，而且肿瘤本身就处于乏氧环境，因此会很大程度上限制光动力疗法的治疗效果。
一氧化氮(NO)是许多生理过程的关键调节因子，普遍存在于生物体中，具有多种生物学功能。除了在正常生理活动中的作用外，NO在抗肿瘤和抗菌方面也有一定的作用。研究发现，NO可以与细胞内的氧自由基反应，生成毒性更高的羟自由基，可以抑制肿瘤细胞的许多代谢活动，如蛋白质合成、DNA复制等，还可以使肿瘤对化疗、放射或免疫疗法敏感，逆转化疗的耐药性。此外，外源性NO的添加可以刺激铜绿假单胞菌的运动和生物膜的扩散。因此，能同时产生单线态氧和NO的多吡啶钌配合物在光动力抗肿瘤或抗菌方面具有很好的应用潜力。
发明内容
本发明的第一个目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种光照释放NO的多吡啶钌配合物。
本发明的第二个目的在于提供上述光照释放NO的多吡啶钌配合物的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供上述光照释放NO的多吡啶钌配合物在制备抗肿瘤和抗菌药物中的应用。
为达到上述第一个目的，本发明所采取的技术方案是：
一种光照释放NO的多吡啶钌配合物，其具有如下式I所述的结构：
其中/>选自/>X-表示平衡电荷的一价阴离子。
在一些实例中，所述配合物的阳离子部分具有Ru-1或Ru-2所示的结构：
在一些实例中，所述一价阴离子选自(PF6)-、Cl-、(ClO4)-、(NO3)-中的一种。
为达到上述第二个目的，本发明所采取的技术方案是：
所述光照释放NO的多吡啶钌配合物的制备方法，具体包括以下步骤：
1)配体L的合成：将5,6-二氨基-1，10-邻菲罗啉和4-硝基-3-三氟甲基苯甲醛混合于有机溶剂中加热，反应完成后减压过滤干燥得到配体L；
2)前体的制备：将钌原料与氯化锂混合于有机溶剂中，然后再加入2,2'-联吡啶或1,10- 菲罗啉，加热回流，反应结束后蒸馏浓缩，加水沉淀，过滤洗涤干燥得到前体；
3)配合物的制备：将步骤1合成得到的配体L和步骤2合成的前体混合于有机溶剂中，在惰性气体保护下加热回流，反应结束后蒸馏浓缩，再向浓缩液加入饱和水溶性盐溶液进行抽滤，经过柱层析纯化分离得到产物。
在一些实例中，步骤1)中，所述溶剂为无水乙醇，反应的温度为75～85℃，时间为10～ 14h。
在一些实例中，步骤2)中，所述溶剂为N,N-二甲基甲酰胺，反应的温度为130～140℃，时间为6～8h。
在一些实例中，步骤3)中，所述溶剂为甲醇和水混合物，体积比为3:1，反应时间为7～ 9h。
在一些实例中，步骤3)中的阴离子交换溶液选自NH4PF6、NaClO4或NaNO3。此时，制备得到的配合物中阴离子分别为PF6 -、ClO4 -或NO3 -。
在一些实例中，所述的步骤3)中的提纯的条件为：在中性氧化铝层析柱上用二氯甲烷和乙腈的混合溶剂(体积比从纯二氯甲烷逐渐增加乙腈按照10％的增加比例直至纯乙腈)作为洗脱剂洗脱提纯。
为达到上述第三个目的，本发明还提供上述第一个目的提供的多吡啶钌配合物在制备光动力抗肿瘤药物和抗菌药物中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明中所述的多吡啶钌配合物在光照条件下能同时产生单线态氧和释放出NO。通过单线态氧和NO的协同治疗作用，增强抗肿瘤和抗菌效果，同时克服了传统的光动力疗法完全依赖于单线态氧的产生、受限于肿瘤乏氧环境的不足。
该类配合物具有良好生物相容性，在黑暗条件下基本没有细胞毒性，在可见光(425nm) 光照下能有效杀伤癌细胞和细菌。此类能同时产生单线态氧和NO的多吡啶钌配合物在光动力抗肿瘤或抗菌方面具有很好的应用潜力。
附图说明
图1是实施例1光照产生单线态氧能力测试图。
图2是实施例2光照产生单线态氧能力测试图。
图3是实施例1和实施例2光照产生NO的检测图。
具体实施方式
下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方案。
实施例1
配体L的合成：
将5,6-二氨基-1,10-邻菲罗啉(210mg,1mmol)和4-硝基-3-三氟甲基苯甲醛(219mg,1 mmol)混合于15mL无水乙醇中，80℃回流反应过夜。反应完成之后，有大量的黄色固体产物析出。减压过滤得到固体，用无水乙醇洗涤固体3次，再用无水***洗涤固体3次，干燥即得到配体L。
配合物的合成：
第一步：制备Ru(bpy)2Cl2前体。将2,2'-联吡啶(3.44g,22mmol)，三氯化钌水合物(2.07 g,10mmol)和氯化锂(2.12g,50mmol)混合于15mL N,N-二甲基甲酰胺中，135℃回流反应7h，再通过减压旋转蒸发除去大部分的溶剂。再加入一定体积的水，有沉淀析出。过滤得到固体，用大量水洗涤，直至滤液没有颜色，干燥得到Ru(bpy)2Cl2前体。
第二步：制备配合物Ru1。将上一步合成得到的前体Ru(bpy)2Cl2(97mg,0.2mmol)和配体L(83mg,0.2mmol)溶解于12ml的甲醇和水混合溶剂(体积比为3:1)中。在氮气保护下加热回流反应8h，得到澄清的红色溶液。将此溶液旋转蒸发浓缩至2mL，再向其中加入饱和的NH4PF6溶液即产生大量絮状沉淀。抽滤，沉淀分别用水、***洗涤数次后真空干燥。得到的粗产品用少量乙腈溶解，用二氯甲烷和乙腈作为洗脱剂经中性氧化铝柱层析分离，干燥后得到0.155g红色固体，产率为70％。
配合物Ru1的核磁氢谱数据：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.98(d,J＝8.2Hz,2H),8.87 (s,1H),8.76(d,J＝8.2Hz,5H),8.39(s,4H),8.31(dd,J＝8.5,5.3Hz,1H),8.11(dd,J＝13.9,5.2 Hz,4H),7.84(d,J＝4.7Hz,2H),7.78(td,J＝8.5,5.3Hz,4H),7.67(dd,J＝7.9,5.4Hz,2H)。
实施例2
配体L的合成与实施例1相同。
配合物的合成：
第一步：制备Ru(phen)2Cl2前体。将1,10-菲罗啉(3.96g,22mmol)、三氯化钌水合物(2.07g,10mmol)和氯化锂(2.12g,50mmol)混合于15mL N,N-二甲基甲酰胺中，135℃回流反应7h，再通过减压旋转蒸发除去大部分的溶剂。再加入一定体积的水，有沉淀析出。过滤得到固体，用大量水洗涤，直至滤液没有颜色，干燥得到Ru(phen)2Cl2前体。
第二步：制备配合物Ru2。将上一步合成得到的前体Ru(phen)2Cl2(107mg,0.2mmol)和配体L(83mg,0.2mmol)溶解于12ml的甲醇和水的混合溶剂(体积比为3:1)中。在氮气保护下回流反应8h，得到澄清的红色溶液。将此溶液旋转蒸发浓缩至2mL，再向其中加入饱和的NH4PF6溶液即产生大量絮状沉淀。抽滤，沉淀分别用水、***洗涤数次后真空干燥。得到的粗产品用少量乙腈溶解，用二氯甲烷和乙腈作为洗脱剂经中性氧化铝柱层析分离，干燥后得到0.166g红色固体，产率为72％。
配合物Ru2的核磁氢谱数据：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.01(d,J＝8.0Hz,2H),8.86 (dd,J＝18.4,8.2Hz,5H),8.78(d,J＝8.5Hz,1H),8.37-8.29(m,1H),8.21(t,J＝7.9Hz,2H),8.10 (t,J＝7.9Hz,2H),7.89(s,2H),7.86(d,J＝5.5Hz,2H),7.80(s,2H),7.59(dd,J＝14.8,6.4Hz,4H), 7.40-7.34(m,2H)。
单线态氧产生能力检测
使用稳态法测定实施例制备的配合物在PBS缓冲溶液中的单线态氧量子产率。以9,10- 蒽基-双(亚甲基)二甲酸(ADBA)作为单线态氧探针，[Ru(bpy)3]Cl2作为标准参照物，其在空气饱和的水中的单线态氧产率(ФΔ)为0.18。首先将含待测样品或参照物和ABDA(100μM) 的缓冲溶液在黑暗中通气10分钟使其与空气平衡，然后使用波长为425nm的LED灯进行光照。每光照80s扫描一次ABDA的紫外吸收光谱。待测样品和参照物在波长425nm处的紫外吸光度需调节在0.15左右。待测样品的单线态氧量子产率根据文献公式计算得到(Chem. Sci.,2015,6,5409–5418)。
结果如图1和图2所示，两个配合物在光照条件下均能产生单线态氧降解ABDA。通过计算可得到它们在PBS中的单线态氧量子产率分别为0.40和0.44，远高于参照物[Ru(bpy)3]Cl2 (0.18)，表明这两个实施例具有非常优秀的单线态氧产生能力。
光照释放NO检测
本实验采用碧云天试剂公司的Griess试剂盒检测实施例1和实施例2在光照条件下产生NO的情况。首先，每孔加入50μl浓度为100μM的配合物甲醇溶液于96孔板中，同时选用甲醇溶剂作为对照且每个光照时间具有三个复孔。随后各实验组分别光照20min、40min以及 60min。光照结束后，向每孔先后添加50μl的Griess Reagent I、Griess ReagentⅡ，充分震荡混匀。最后通过，溶液的颜色变化，判断NO产生情况。
结果如图3所示，光照后溶液颜色加深，证明实施例1和实施例2在光照条件下能够产生NO。
多吡啶钌配合物对肿瘤细胞抑制活性测试
用MTT法测定了实施例1和实施例2对3种肿瘤细胞株的抑制活性，包括***细胞株(HeLa)、乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)和肺癌细胞株(A549)。具体操作步骤如下：
暗毒性测试：将细胞消化收集并重悬成单细胞悬液，通过细胞计数将细胞浓度调整为 5×104/mL并接种于96孔培养板，每孔160μL。在37℃、含5％CO2的培养箱中培养24h后，再分别加入不同浓度的实施例1和实施例2，继续孵育48h，在结束前4h每孔加入20 μLMTT(5mg/mL)，4h后小心除去上清液，每孔加入150μL DMSO，将培养板于室温振荡10分钟，再用酶标仪测定每孔在波长为490nm处的OD值。细胞存活率通过以下公式进行计算，然后再通过作图求得半数杀伤浓度(IC50)。
细胞存活率％＝加药孔平均OD值/对照孔平均OD值×100％
光毒性测试：前面部分处理与暗毒性相同，在细胞加入不同浓度的配合物Ru1和Ru2处理后，在黑暗条件下孵育12h后用波长为425nm的LED光源(5mW·cm-2)照射15分钟。在黑暗条件下继续孵育32h后加入MTT。后续处理与暗毒性测试一致。
计算得到的IC50值如表1所示：
表1.在黑暗和光照条件下，配合物对不同癌细胞的半抑制浓度(IC50,μM)
由表1数据可以看出，实施例1和实施例2光照条件下表现出良好的抗肿瘤活性，尤其是对***细胞(HeLa)和乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)。同时，在黑暗条件下的细胞毒性较低，表明其具有良好的生物相容性。
多吡啶钌配合物对金黄色葡萄球菌抑制活性测试
采用微量肉汤二倍稀释法研究了实施例1和实施例2对金黄色葡萄球菌的抑制活性。从接有菌株的平板上挑取活化好的的菌株于10mL的LB肉汤培养基中，吹打均匀。随后将其放置在37℃的恒温培养箱中，培养18-20小时。结束孵育后，取适量菌液于PBS缓冲液中制备成菌悬液，并用细菌计数板进行计数。根据计数结果对菌液进行稀释，获得1×104CFU mL-1的菌液，并将菌液移入96孔板中。配制配合物母液浓度为400μg/mL(待测浓度为200μg/mL-3.125μg/mL)，将配制好的配合物溶液按二倍稀释法加入到96孔板中，在37℃条件下孵育12h，光照20min分钟后再孵育36h。根据其96孔板底部是否有菌落生成判断其最小抑菌浓度(MIC)。
结果显示，在黑暗条件下，两个配合物对金黄色葡萄球菌的抑制活性较小，MIC分别为 100μg/mL和>200μg/mL。而通过425nm的光照射后，两个配合物对金黄色葡萄球菌均表现出很高的抑制活性，MIC分别为12.5μg/mL和6.25μg/mL。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种光照释放NO的多吡啶钌配合物，其特征在于，所述配合物具有式I所示的结构：
式I，其中选自/>X-表示平衡电荷的一价阴离子。
2.根据权利要求1所述的多吡啶钌配合物，其特征在于，所述配合物的阳离子部分具有Ru-1或Ru-2所示的结构：Ru-1，Ru-2。
3.根据权利要求1所述的多吡啶钌配合物，其特征在于，所述配合物的阴离子部分选自PF6 -、Cl-、ClO4 -、NO3 -中的一种。
4.一种如权利要求1～3所述的多吡啶钌配合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)配体L的合成：将5,6-二氨基-1，10-邻菲罗啉和4-硝基-3-三氟甲基苯甲醛混合于有机溶剂中加热，反应完成后减压过滤干燥得到配体L；
2)前体的制备：将钌原料与氯化锂混合于有机溶剂中，然后再加入2,2'-联吡啶或1,10-菲罗啉，加热回流，反应结束后蒸馏浓缩，加水沉淀，过滤洗涤干燥得到前体；
3)配合物的制备：将步骤1合成得到的配体L和步骤2合成的前体混合于有机溶剂中，
在惰性气体保护下加热回流，反应结束后蒸馏浓缩，再向浓缩液加入阴离子交换溶液进行抽滤，经过柱层析纯化分离得到产物。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的反应的温度为75～85℃，时间为10～14h。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的反应的温度为130～140℃，时间为6～8h。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3中柱层析分离纯化采用的层析柱为中性氧化铝柱，洗脱剂为二氯甲烷和乙腈的混合液。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤3中的阴离子交换溶液选自NH4PF6、NaClO4或NaNO3中的一种。
9.权利要求1～3任一项所述的多吡啶钌配合物在制备光动力抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为***、乳腺癌或者肺癌。
10.权利要求1～3任一项所述的多吡啶钌配合物在制备抗菌药物中的应用，其特征在于，所述菌种为金黄色葡萄球菌。
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