CN115725607B - 一种鼻疽诺卡菌的致病靶基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种鼻疽诺卡菌的致病靶基因及其应用。本发明首次发现并验证了鼻疽诺卡菌的关键毒力基因NFA_RS03155，通过小鼠毒力实验进行了体内验证，明确了该基因的关键作用，为今后特异性的靶向药物研发提供了理论依据。该基因是目前为止发现的与毒力最直接相关的关键基因，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种鼻疽诺卡菌的致病靶基因及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
诺卡氏菌属(Nocardia)广泛存在于土壤、海水、淡水、尘埃等自然环境中，是一类长期被人忽视的条件致病菌，根据研究发现，其易感人群主要是免疫低下和免疫缺陷人群。目前我国临床上较为常见的诺卡氏菌主要为鼻疽诺卡氏菌(Nocardia farcinica)、盖尔森基兴诺卡氏菌(Nocardia cyriacigeorgica)和星形诺卡氏菌(Nocardia asteroides)。根据相关统计，上述三种诺卡氏菌引起疾病约占诺卡氏菌病的50％以上。该菌属主要引起诸如肺脓肿，部分也能引起脑脓肿、皮肤脓肿，甚至诱发全身散播性疾病。且同时由于临床症状相对复杂，且不同菌种具有不同的致病特点以及药敏模式，而且还容易与结核病、肺部其他细菌感染性疾病及真菌病等发生混淆，诊疗难度相对较大，容易出现延误治疗现象，从而导致住院病死率较高。且目前各种因素也导致并发诺卡氏菌的感染机会逐渐增加，因此研发针对诺卡氏菌的相关药物特别是特效药物迫在眉睫。
发明人发现，目前针对鼻疽诺卡菌毒力相关的基因研究较少，针对鼻疽诺卡菌毒力基因尚不清楚，且针对感染尚无特异性的靶向药物或小分子化合物，而靶向关键的毒力基因可特异性治疗该菌的感染。因此探究鼻疽诺卡菌的关键毒力基因对特异性靶向药物研发具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种鼻疽诺卡菌的致病靶基因及其应用。本发明首次发现并验证了鼻疽诺卡菌的一种关键毒力基因NFA_RS03155，通过小鼠毒力实验进行了体内验证，明确该基因的关键作用，为今后特异性靶向药物的研发提供了理论依据，因此具有良好的实际应用之价值。
具体地，本发明的技术方案如下所示：
本发明的第一个方面，提供一种鼻疽诺卡菌的致病靶基因，所述鼻疽诺卡菌的致病靶基因具有(a1)-(a3)中任一所述核苷酸序列：
(a1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(a2)如(a1)所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或***形成的序列；
(a3)在严格条件下能够与如(a1)或(a2)所述的核苷酸序列杂交并编码相同功能蛋白的核苷酸序列。
其中，将该基因命名为NFA_RS03155。
本发明的第二个方面，提供抑制上述致病靶基因及其表达产物和/或活性降低的物质在如下任意一种或多种中的应用：
b1)降低鼻疽诺卡菌毒力或制备降低鼻疽诺卡菌毒力的产品；
b2)提高感染鼻疽诺卡菌受试者生存期或制备提高感染鼻疽诺卡菌受试者生存期的产品；
b3)降低感染鼻疽诺卡菌受试者死亡率或制备降低感染鼻疽诺卡菌受试者死亡率的产品；
b4)治疗鼻疽诺卡菌感染相关疾病或制备鼻疽诺卡菌感染相关疾病的产品。
其中，所述抑制上述致病靶基因及其表达产物和/或活性降低的物质包括但不限于针对靶基因的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，实施慢病毒感染或基因敲除的物质以及针对靶基因表达产物本身或其上下游分子的特异性抗体。
所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。
本发明的第三个方面，提供一种产品，所述产品包含抑制上述致病靶基因及其表达产物和/或活性降低的物质。
所述产品具有如下任意一种或多种用途：
b1)降低鼻疽诺卡菌毒力；
b2)提高感染鼻疽诺卡菌受试者生存期；
b3)降低感染鼻疽诺卡菌受试者死亡率；
b4)治疗鼻疽诺卡菌感染相关疾病。
所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。
其中，所述抑制上述致病靶基因及其表达产物和/或活性降低的物质包括但不限于针对靶基因的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，实施慢病毒感染或基因敲除的物质以及针对靶基因表达产物本身或其上下游分子的特异性抗体。
本发明的第四个方面，提供一种治疗鼻疽诺卡菌感染相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用上述抑制上述致病靶基因及其表达产物和/或活性降低的物质。
上述一个或多个技术方案的有益效果为：
针对诺卡菌毒力基因尚不清楚的现状，靶向关键的毒力基因可特异性的治疗该菌的感染。上述技术方案发现并验证了鼻疽诺卡菌的关键毒力基因NFA_RS03155，通过小鼠毒力实验进行了体内验证，明确了该基因的关键作用，为今后特异性的靶向药物研发提供了理论依据。该基因是目前为止发现的与毒力最直接相关的关键基因，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例中PCR验证NFA_RS03155基因敲除成功；
图2为本发明实施例中野生株和基因敲除株鼻疽诺卡菌感染小鼠后的状态，其中，A为野生株感染小鼠，B为基因敲除株感染小鼠；
图3为本发明实施例中感染野生株和不同毒力基因敲除株后的小鼠生存曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种鼻疽诺卡菌的致病靶基因，所述鼻疽诺卡菌的致病靶基因具有(a1)-(a3)中任一所述核苷酸序列：
(a1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(a2)如(a1)所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或***形成的序列；
(a3)在严格条件下能够与如(a1)或(a2)所述的核苷酸序列杂交并编码相同功能蛋白的核苷酸序列。
其中，将该基因命名为NFA_RS03155，所述基因其核苷酸序列具体如下所示：
TTGTCGACCACGGACGAGCGCTCGCGCGTTGAGTATGTGACCGATCCGGCGGCAGCGATGTCCCGGTTGGCGTCGGCGGACCGGTTCGGCGAATACGTGATGTACGAGCGCCCCGGGCAATGGGTGTTCGCGGCCGACCCGATCGGCAGCATCGAACTCGACGCCAGCGAACTGCGGGTCACGTGGGAAGGCGAGACCACGGTGTCGCGGTGGGAGGGCTCGCCCGCGCGCGCCCTGGACCGCGCGCTCGGCATGCTTCCCGCGGGCTCGGCCAAGGCCTACGGCTGGATCGGTTTCGAGTTCTGCGCGTGGGCGCTCGCGGCCACCGACCACGTCGACGAGCGGACCTCGCTGGCGCACCTGATGATTCCGCGCATCGAGGTGGTCGTGGACGAGTCCGGCGTGCGGATCGGCGGCGCGACGCCCTCGGAGACCGCCGACATCCACGATCTGATCGCGGCCGCCCAGGACACCGAGCTGCCGCAGCCGCATCCGATCGACGTGCGCATCGATCCCACCGGCTATCGGGACCGGGTGGCCGAGGCGGTCGCCGAGATCGGCGCGGGCCGCTACCAGAAGGTGATCCTGTCGCGGAAGGTCGACCTGCCCTTTACCGTCGACGTGCCCGCCACCTACCGGCTCGGCCGCGCGAACAACACGCCCGCGCGCTCGTTCCTGCTGCGGCTGGGCGGCCTGGAATCGGCGGGCTTCAGCCCCGAACTGGTCGCCTCCGTCGACGAGGACCGGGTGGTCACCACCGAGCCGCTGGCGGGCACCCGCGCCTTCGGCCGCGGCCACGAGGTCGACATGGCCGCCCGCGCCGACCTGGTGAGCGACCCGAAAGAGATCGTGGAGCACGCCATCTCGGTGCAGACCTCCTTCGCCGAGATCAGCGCGGTCGCCGATCCGGGCACCCCCGCGGTGTCGGACTTCATGGCCGTGCGCGAGCGCGGCAGCGTGCAGCACCTGGCCTCGACCGTGCGCGGCAGGCTCGCGGCCGACCGCTCCAGCTGGGATGCCCTGGAAGTGCTGTTCCCGTCGGTCACCGCGTCGGGCATCCCCAAGCGCGAGGGCGTCGACTCGGTCTTCCGGCTCGACGGCGCACCGCGCGGCCTGTACTCCGGTGCGGTGGTGACCGTTTCGCCGACCACCGGCGCGCTGGAGGCGACGCTGGTGCTGCGGGCGGTCTACCAGACCGCCGAGGGCGCGTGGCTGCGCGCGGGCGCGGGTGTGGTCGGGCAGTCGCGGCCGGAGCGGGAATTCGAGGAGACCTGCGAAAAGCTCGGCAGCATCGCGCCCTACGTGGTCAAGGCCTGA(SEQ ID NO.1)。
本发明的又一具体实施方式中，抑制上述致病靶基因及其表达产物和/或活性降低的物质在如下任意一种或多种中的应用：
b1)降低鼻疽诺卡菌毒力或制备降低鼻疽诺卡菌毒力的产品；
b2)提高感染鼻疽诺卡菌受试者生存期或制备提高感染鼻疽诺卡菌受试者生存期的产品；
b3)降低感染鼻疽诺卡菌受试者死亡率或制备降低感染鼻疽诺卡菌受试者死亡率的产品；
b4)治疗鼻疽诺卡菌感染相关疾病或制备鼻疽诺卡菌感染相关疾病的产品。
其中，所述抑制上述致病靶基因及其表达产物和/或活性降低的物质包括但不限于针对靶基因的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，实施慢病毒感染或基因敲除的物质以及针对靶基因表达产物本身或其上下游分子的特异性抗体。
本发明的又一具体实施方式中，所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。
根据本发明，当所述产品为药物时，所述药物还包括至少一种药物非活性成分。
所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂、外用剂、栓剂及无菌注射溶液形式的剂型使用。
所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、***胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。
本发明的又一具体实施方式中，本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。
本发明的又一具体实施方式中，所述药物施用对象可以是人和非人哺乳动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猴、猩猩等，优选为人。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，所述产品包含抑制上述致病靶基因及其表达产物和/或活性降低的物质。
所述产品具有如下任意一种或多种用途：
b1)降低鼻疽诺卡菌毒力；
b2)提高感染鼻疽诺卡菌受试者生存期；
b3)降低感染鼻疽诺卡菌受试者死亡率；
b4)治疗鼻疽诺卡菌感染相关疾病。
所述产品可以为药物或者实验试剂，所述实验试剂可供基础研究使用。
其中，所述抑制上述致病靶基因及其表达产物和/或活性降低的物质包括但不限于针对靶基因的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂、siRNA，实施慢病毒感染或基因敲除的物质以及针对靶基因表达产物本身或其上下游分子的特异性抗体。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种治疗鼻疽诺卡菌感染相关疾病的方法，所述方法包括向受试者施用上述抑制上述致病靶基因及其表达产物和/或活性降低的物质。
需要说明的是，上述技术方案中虽然以鼻疽诺卡菌为例，验证了NFA_RS03155是鼻疽诺卡菌关键毒力基因，但是基于本申请的发明构思，以该毒力基因为靶点，针对其他诺卡菌种(如盖尔森基兴诺卡氏菌、星形诺卡氏菌等)研发特异性靶向药物用于相关诺卡菌种感染的防治同样在本申请的保护范围之内。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例
本实施例通过基因敲除和小鼠毒力实验验证分析了RS03155基因在感染中的关键作用。
基因名称：NFA_RS03155
基因序列：
TTGTCGACCACGGACGAGCGCTCGCGCGTTGAGTATGTGACCGATCCGGCGGCAGCGATGTCCCGGTTGGCGTCGGCGGACCGGTTCGGCGAATACGTGATGTACGAGCGCCCCGGGCAATGGGTGTTCGCGGCCGACCCGATCGGCAGCATCGAACTCGACGCCAGCGAACTGCGGGTCACGTGGGAAGGCGAGACCACGGTGTCGCGGTGGGAGGGCTCGCCCGCGCGCGCCCTGGACCGCGCGCTCGGCATGCTTCCCGCGGGCTCGGCCAAGGCCTACGGCTGGATCGGTTTCGAGTTCTGCGCGTGGGCGCTCGCGGCCACCGACCACGTCGACGAGCGGACCTCGCTGGCGCACCTGATGATTCCGCGCATCGAGGTGGTCGTGGACGAGTCCGGCGTGCGGATCGGCGGCGCGACGCCCTCGGAGACCGCCGACATCCACGATCTGATCGCGGCCGCCCAGGACACCGAGCTGCCGCAGCCGCATCCGATCGACGTGCGCATCGATCCCACCGGCTATCGGGACCGGGTGGCCGAGGCGGTCGCCGAGATCGGCGCGGGCCGCTACCAGAAGGTGATCCTGTCGCGGAAGGTCGACCTGCCCTTTACCGTCGACGTGCCCGCCACCTACCGGCTCGGCCGCGCGAACAACACGCCCGCGCGCTCGTTCCTGCTGCGGCTGGGCGGCCTGGAATCGGCGGGCTTCAGCCCCGAACTGGTCGCCTCCGTCGACGAGGACCGGGTGGTCACCACCGAGCCGCTGGCGGGCACCCGCGCCTTCGGCCGCGGCCACGAGGTCGACATGGCCGCCCGCGCCGACCTGGTGAGCGACCCGAAAGAGATCGTGGAGCACGCCATCTCGGTGCAGACCTCCTTCGCCGAGATCAGCGCGGTCGCCGATCCGGGCACCCCCGCGGTGTCGGACTTCATGGCCGTGCGCGAGCGCGGCAGCGTGCAGCACCTGGCCTCGACCGTGCGCGGCAGGCTCGCGGCCGACCGCTCCAGCTGGGATGCCCTGGAAGTGCTGTTCCCGTCGGTCACCGCGTCGGGCATCCCCAAGCGCGAGGGCGTCGACTCGGTCTTCCGGCTCGACGGCGCACCGCGCGGCCTGTACTCCGGTGCGGTGGTGACCGTTTCGCCGACCACCGGCGCGCTGGAGGCGACGCTGGTGCTGCGGGCGGTCTACCAGACCGCCGAGGGCGCGTGGCTGCGCGCGGGCGCGGGTGTGGTCGGGCAGTCGCGGCCGGAGCGGGAATTCGAGGAGACCTGCGAAAAGCTCGGCAGCATCGCGCCCTACGTGGTCAAGGCCTGA(SEQ ID NO.1)
菌株：
鼻疽诺卡菌
细菌培养：
鼻疽诺卡菌在BHI固体培养基培养后，挑去单菌落后在液体BHI培养基里扩大培养，PBS润洗3次后备用；
基因敲除：
(1)通过同源重组方法将鼻疽诺卡菌NFA_RS03155基因敲除：以鼻疽诺卡菌基因组DNA为模板,分别用表中引物(NFA_RS03155上臂和NFA_RS03155下臂)进行NFA_RS03155基因上、下游同源臂的PCR扩增，分别得到基因片段NFA_RS03155上臂、NFA_RS03155下臂。然后将上下游片段混和均匀作为模板，NFA_RS03155上臂-F、NFA_RS03155下臂-R为引物，进行PCR，将上下游同源臂连接为一条。扩增步骤：第一步，PCR不加入引物，PCR参数为98℃3min，98℃30s，50℃30s，72℃1.5min，共10个循环,72℃8min；第二步，加入引物，PCR参数为98℃3min，98℃30s，50℃30s，72℃1.5min，共20～30个循环，72℃8min。将PCR产物切胶回收并测定浓度及纯度。
(2)敲除质粒构建。将上述融合片段、质粒载体pk18mobsacB分别经限制性内切酶EcoR I和Hind III酶切，纯化回收酶切产物，回收的片段与线性化的pk18mobsacB混合后，在DNA连接酶作用下形成重组***质粒pk18mobsacB-NFA_RS03155，最后导入E.coli DH5α大肠杆菌中。
(3)NFA_RS03895敲除株构建。诺卡菌在10ml BHI中37℃，180r/min。培养至对数期。5ml预冷的无菌水洗涤2次，重悬于50μl预冷的10％甘油中，将重悬液全部吸入2mm的电转杯中，加入0.3～0.5μg的***质粒。12.25kV/cm，25μF，200Ω参数对混悬液进行电击转化，电击后立即加入900μl BHI，37℃，180r/min培养2h后涂布于含100μg/ml的新霉素的BHI平板上，放入细菌培养箱培养2～3d至单克隆形成。
(4)NFA_RS03155敲除株筛选与鉴定：取抗生素平板上的单克隆,煮沸法提取核酸，作为同源一次重组PCR鉴定的模板，表1中NFA_RS03155-F/R为引物进行扩增验证。然后将阳性菌落接种于含10％蔗糖的BHI平板进行蔗糖致死反向筛选，同时将单菌落接种至抗生素平板中，在蔗糖平板上正常生长但抗生素平板上无法生长的菌株即为缺失株。菌落PCR鉴定得到单一扩增产物310bp，表明基因敲除成功，如图1所示。
表1NFA_RS03155基因敲除和鉴定引物序列
小鼠感染实验：
野生株鼻疽诺卡菌和NFA_RS03155基因敲除株，通过尾静脉感染小鼠(6-8周雌性C57BL6J)，感染剂量为5×105CFU；
观察：
1、野生株感染后10天小鼠死亡率为100％，该基因敲除后无死亡，生存曲线如下图所示；
2、野生株感染小鼠后出现明显的临床症状，消瘦、精神差、弓背和歪头等病态(图2A)，而该基因敲除后小鼠健康，无任何病态症状(图2B)。
3、其他毒力基因(NFA_RS03935，NFA_RS48610)敲除后小鼠均出现不同程度的死亡，死亡率均在40％以上，结果见图3，因此NFA_RS03155基因是首次发现的诺卡菌最关键毒力基因。
应注意的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实施例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
Claims (1)
1.一种构建鼻疽诺卡菌减毒菌株的方法，其特征在于，敲除鼻疽诺卡菌中核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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